CN110117652A

CN110117652A - 肝癌早期诊断方法

Info

Publication number: CN110117652A
Application number: CN201910109795.2A
Authority: CN
Inventors: 钱朝阳; 厉国忠
Original assignee: Qijian Technology (tianjin) Co Ltd
Current assignee: Qijian Technology (tianjin) Co Ltd
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2019-02-11
Publication date: 2019-08-13

Abstract

本发明涉及一种方法，其包括对来自受试者的核酸样品进行测序，将测序数据与受试者参考基因组和HBV参考基因组数据库中的序列进行比对，以鉴定所述核酸样品是否存在肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异或HBV整合位点，其中如果所述核酸样品存在所述原癌基因变异、抑癌基因变异和HBV整合位点中的一种或多种，则提示所述受试者患有肝癌或处于患有肝癌的风险中。

Description

肝癌早期诊断方法

技术领域

发明背景

流行病数据显示，我国是一个肝癌高发国家，乙肝病毒携带者达9000万，肝癌例数占全球54％，每年死于肝癌的患者有37万，肝癌是一个严重威胁我国人民生命健康的疾病(参见例如，苏勤.乙型肝炎病毒慢性感染和肝癌发生[J].世界华人消化杂志,2003,11(6):791-795)。由于起病隐匿，确诊时多属中晚期，肝癌治疗效果较差，预后恶劣，因此早期诊断、及早治疗是延长肝癌患者寿命的重要手段。然而由于肝脏隐匿在上腹深部，肿大早期不易发现，而且肝脏有强大的代偿能力，早期常无症状，这也给肝癌的早期诊断带来一定的困难。肝癌的症状出现，常常已属晚期，这时治疗效果欠佳，且难以进行手术。肝癌早期诊断最直接的效果是：1.增加了病人手术切除的机会：肝癌普查所检出的病例由于多属早期，癌体积较小，常可作局部切除；2.减少肿瘤扩散的几率：早期肝癌多具有较完整的包膜，肝内播散发生的机会少。据相关资料显示，直径小于5厘米的小肝癌根治性手术切除后的5年生存率达72.9％，直径小于2厘米的肝癌手术切除后的5年生存率达86.4％，而总体临床病例的5年生存率，则只有20％左右。

目前肝癌早期诊断的主要手段包括甲胎蛋白(AFP)检测和B型超声波检查、CT、肝动脉造影、PET-CT等，也包括DNA、DNA甲基化、miRNA、蛋白质等分子标记物检测。甲胎蛋白AFP作为广泛使用的原发性肝癌肿瘤标志物，大于400ug/L或含量不断上升时，比较有确定的诊断意义。小肝癌病人中有40％左右甲胎蛋白含量为正常水平，所以以甲胎蛋白为指标会造成大量小肝癌的漏诊。而且非恶性疾病，如急慢性肝炎、重症肝炎恢复期、肝硬化、先天性胆管闭塞，也会导致甲胎蛋白升高。由于存在较多的假阳性结果，以及敏感性和特异性均不高，因此甲胎蛋白无法用于准确的早期诊断以及大样本筛查工作(参见例如，徐海峰,杨华瑜,张宏冰,等.改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物[J].基础医学与临床,2008,28(01):104-108)。影像学方法包括B超、CT、肝动脉造影、PET-CT等，是诊断小肝癌的重要手段，但是其各自也有一定的局限性。B超往往难以确定肿块的性质，且肝右叶膈面及肝门部的病变容易漏诊。用CT可检出直径1.0cm左右的微小癌灶，但当肝癌组织密度近似正常肝实质，肝癌呈弥漫性时，CT不易发现。肝动脉造影是一种有创伤性检查，有发生出血、栓塞等并发症危险。PET-CT(计算机体层显像)将PET和CT有机结合在一起，可反映肝脏占位组织的生化代谢信息，是早期肝癌的检查方法之一，但价格昂贵，辐射大，多次检测对人体健康存在一定的危害性，而且PET-CT目前只在少数医院开展。影像学检查结果容易受到检查者主观经验和分辨的限制，也会影响诊断结果，且难以分辨良性病变与肝癌。更重要的是，常规影像学检查需要占用宝贵的医疗资源，需要有经验的医生，且受限于影像学仪器的较低通量。在目前医疗资源紧张的大环境下，影像学手段不适用于大样本量的早期诊断和筛查工作。

近年来研究显示细胞外游离核酸是对高危个体的诊断、疾病分期和预后有效的非侵袭性的肿瘤标志物。将肿瘤标志物与临床检验结合起来，可以为肝癌的早期诊断提供重要线索，并可为肝癌的早期筛查提供重要判断依据。被誉为“下一代测序技术”的NGS技术(next-generation sequencing)是一种鉴定核酸序列的有力工具，已广泛应用于全基因组、外显子组、转录组和表观基因组的研究中，为癌症研究和医疗模式带来了革命性的变化(参见例如，Mwenifumbo JC,Marra MA.Cancer genome-sequencing study design.NatRev Genet.2013,14(5)；321-332)。然而由于血液或尿液中细胞外游离DNA含量有限，且肝癌发病早期细胞外游离DNA中的肿瘤细胞DNA含量很低，且目前测序技术本身存在一定的错误率，采用传统的测序方法将无法分辨测序错误和肿瘤来源的低频变异，尤其是当采用血液或尿液中的游离DNA进行无创性筛查和监测时，难以灵敏地检测出低频变异，这是当前的主要瓶颈(参见例如，Schmitt MW,Kennedy SR,Salk JJ,et al.Detection of ultra-raremutations by next-generation sequencing.PNAS.2012,109(36):14508-14513和KindeI,Wu J,Papadopoulos N,Kinzler KW,Vogelstein B.Detection and quantification ofrare mutations with massively parallel sequencing.PNAS.2011,108(23):9530-9535)。

因此，本领域仍然需要一种无创、低成本、高敏感度和特异性、适于大规模筛查的准确的早期肝癌诊断方法。

发明内容

在一个方面，本发明涉及对核酸样品进行测序的试剂在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于通过包括以下步骤的方法来鉴定受试者是否患有肝癌或处于患有肝癌的风险中：对来自受试者的核酸样品进行测序，将测序数据与受试者参考基因组和HBV参考基因组数据库中的序列进行比对，以鉴定所述核酸样品是否存在肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异或HBV整合位点，其中如果所述核酸样品存在所述原癌基因变异、抑癌基因变异和HBV整合位点中的一种或多种，则提示所述受试者患有肝癌或处于患有肝癌的风险中。

在具体的实施方案中，本发明提供了包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列的探针在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于通过包括以下步骤的方法分析核酸样品：

a.提供来自受试者的包含核酸分子的核酸样品，

b.提供包含探针的试剂，其中所述探针包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列，其中所述目标核酸序列选自肝癌相关的原癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段、肝癌相关的抑癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段和/或HBV基因组的序列或其特异性区段，

c.使所述核酸样品与所述包含探针的试剂接触，其中所述探针与包含目标核酸序列的核酸分子杂交以形成探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物，

d.分离步骤c中形成的所述探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物，

e.从所述探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物释放包含目标核酸序列的核酸分子，

f.对释放的包含目标核酸序列的核酸分子进行测序，

g.将测序数据与受试者参考基因组和HBV参考基因组数据库中的序列进行比对，以鉴定所述包含目标核酸序列的核酸分子是否存在肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异或HBV整合位点，

其中如果所述包含目标核酸序列的核酸分子存在所述原癌基因变异、抑癌基因变异和HBV整合位点中的一种或多种，则提示所述受试者患有肝癌或处于患有肝癌的风险中。

在一些实施方案中，所述用途可用于对受试者进行肝癌诊断，优选早期诊断，特别是用于对乙肝携带者、乙肝患者及肝硬化患者等肝癌高危人群进行肝癌诊断，优选早期诊断。

在一些实施方案中，所述用途还可包括基于所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点的鉴定结果，对肝癌患者进行肿瘤分级或用药指导。例如，可以根据所鉴定的原癌基因或抑癌基因变异，使用针对该原癌基因或抑癌基因变异的药物来治疗受试者。

在一些实施方案中，所述用途还可用于肝癌预防疫苗适用人群的判断，其中如果所述包含目标核酸序列的核酸分子不存在所述原癌基因变异、抑癌基因变异和HBV整合位点中的任一种，则提示所述受试者适用于肝癌预防疫苗。

在一些实施方案中，所述用途还可用于肝癌治疗疫苗有效性的判断，这包括根据所述分析核酸样品的步骤(包括步骤a-g)鉴定来自同一受试者在接受肝癌治疗疫苗之前和之后的核酸样品或来自接受和未接受肝癌治疗疫苗的不同受试者的核酸样品中的所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异或HBV整合位点，其中如果所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点在接受肝癌治疗疫苗之后或在接受肝癌治疗疫苗的受试者中减少或不存在，则判断肝癌治疗疫苗是有效的。

在一些实施方案中，所述用途还可用于肝癌患者在药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗或肝癌切除术后的动态监控和预后判断，这包括对来自经受药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗或肝癌切除术的肝癌患者的核酸样品执行所述分析核酸样品的步骤(包括步骤a-g)，以鉴定核酸样品中是否存在肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点。

在一些实施方案中，所述用途还可用于体液(例如血液或尿液)中肿瘤细胞核酸分子的定量，这包括对来自体液的核酸样品执行所述分析核酸样品的步骤(包括步骤a-g)，并基于所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点的鉴定结果定量体液中的肿瘤细胞核酸分子。

如本文所用，术语“核酸样品”是指包含核酸的样品。如本文所用，“样品”可指从受试者中分离的任何生物学样品。样品可包括，但不限于，体液、全血、血小板、血清、血浆、红细胞、白细胞或白血球、内皮细胞、组织活检、滑液、淋巴液、腹水及间质液或细胞外液。术语“样品”也可包含细胞间隙中的液体，包括齿龈缝液、骨髓、脑脊液(CSF)、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿或任何其他体液。“血液样品”可指全血或其任何组分，包括血细胞、红细胞、白细胞或白血球、血小板、血清和血浆。样品可来自体液。样品可以是血浆样品。样品可以是血清样品。样品可以是肿瘤样品。样品可通过包括但不限于静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活检、针抽、灌洗、刮、外科切开、或介入等手段或本领域已知的其他手段从受试者获得。

在一个实施方案中，核酸样品可以是包含来自基因组的核酸的样品。

在优选的实施方案中，核酸样品可以是包含细胞外游离核酸的样品。

如本文所用，术语“核酸”与“核酸分子“可互换使用，其可以是任何类型的核酸，例如核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物，其可以与“多核苷酸”互换使用。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。核酸可以是来自基因组的核酸或细胞外游离核酸。

如本文所用，术语“来自基因组的核酸”指细胞中的核酸，它可以是基因组本身的核酸，也可以是从基因组衍生(例如转录)的核酸。来自基因组的核酸还指提供病毒信息的病毒核酸。来自基因组的核酸可以包含或可以是例如但不限于DNA，RNA，诸如cDNA、mRNA、miRNA、circRNA或tRNA等。来自基因组的核酸的优选的类型是存在于真核细胞的细胞核中的核酸。来自基因组的核酸可以是双链或单链、或部分双链、或部分单链或发夹分子。来自基因组的核酸可以是完整的或片段化的(例如用限制性内切酶消化、或用超声或应用剪切力用本领域已知的方法)。在某些情况下，来自基因组的核酸可包括来自单个基因的全部或一部分的序列或来自多个基因的序列、来自一个或更多个染色体的序列或来自细胞所有染色体的序列。

如本文所用，术语“细胞外游离核酸”是指存在于细胞外的核酸，例如存在于循环系统(例如，血液或血液制品例如血浆)中的核酸。细胞外游离核酸可通过从细胞直接分泌、通过细胞坏死或通过细胞凋亡进入细胞外环境。细胞外游离核酸可以包含或可以是例如但不限于DNA，RNA，诸如cDNA、mRNA、miRNA、circRNA或tRNA等。细胞外游离核酸可以是双链或单链、或部分双链、或部分单链或发夹分子。细胞外游离核酸通常是核酸片段(例如约100-200个核苷酸，特别是约160个核苷酸)。在某些情况下，细胞外游离核酸可包括来自单个基因的全部或一部分的序列或来自多个基因的序列或来自一个或更多个染色体的序列。

如本文所用的包含细胞外游离核酸的核酸样品可以获自任何来源。这样的来源包括但不限于受试者的体液，更特别地，包括但不限于血液(包括但不限于全血、血清、血浆)、尿液、泪液、唾液、汗液、耳液(earflow)、粘液、痰、淋巴液、滑液、骨髓悬浮液、精液、阴道液(vaginalfluid)、脑脊液、脑液、腹水、乳汁、呼吸道的分泌物、肠道或泌尿生殖道液体、组织或器官(例如肺)或已从器官(诸如乳腺、肺、肠、皮肤、子宫颈、前列腺、胰腺、心脏、肝和胃)移除的组织的灌洗物。优选地，包含细胞外游离核酸的核酸样品获自受试者的血液、尿液、泪液、唾液、汗液、耳液、淋巴液、精液或阴道液。样品可通过包括但不限于静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活检、针抽、灌洗、刮或外科手术切开等手段或本领域已知的其他手段从受试者获得。

如本文所用，“受试者”意指人或非人生物体。术语“非人”系指所有非人动物和实体，包括但不限于，脊椎动物例如啮齿动物、非人灵长动物、绵羊、牛、反刍动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等等。非人生物体还包括无脊椎动物和原核生物，例如细菌、植物、酵母、病毒等等。在优选的实施方案中，受试者是人。

如本文所用，“探针”意指与目标核酸序列至少部分互补从而能够与目标核酸序列杂交的寡核苷酸分子(例如核苷酸序列)。在一些情况下，探针可以被称为“捕获探针”。探针可以天然存在于纯化的限制性消化物中或者由合成、重组或PCR扩增产生。探针可以是单链或双链。探针可用于特定基因的序列的检测、鉴别和分离。在本发明的实施方案中，探针可以包含多种不同的探针。探针可以例如溶解在任何合适的无机或有机溶液中，包括但不限于水溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)、EB缓冲液、TE缓冲液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0)等。

探针的设计和合成的具体方法不受限制，并且可以根据目标核酸序列，使用本领域中任何适宜的方法来进行。例如，可以从商业公司(包括但不限于ThermoFisherScientific，Agilent、Nimblegen、IDT等)订购针对感兴趣的目标核酸序列定制的探针。

探针的长度不受限制，其是可变化的，并通常取决于实验设计。例如，探针的平均长度可以是约20到约200个核苷酸，约50到约200个核苷酸，约20到约100个核苷酸，优选约40到约85个核苷酸，优选约45到约75个核苷酸，例如45个核苷酸，但是可选地还可以多于200个核苷酸，例如约250个核苷酸或更长。

如本文所用，“目标核酸序列”可以是任何感兴趣的核酸序列。在一些实施方案中，目标核酸序列选自肝癌相关的原癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段和/或肝癌相关的抑癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段。在一些实施方案中，目标核酸序列选自HBV基因组的序列或其特异性区段。在一些实施方案中，目标核酸序列选自肝癌相关的原癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段、肝癌相关的抑癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段和HBV基因组的序列或其特异性区段。

如本文所用，肝癌相关的原癌基因或抑癌基因的“邻近序列”意指在基因组中与所述原癌基因或抑癌基因邻接的序列。所述邻近序列的长度可以是例如但不限于1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200或更多个核苷酸或前述数值之间的任何长度。本领域技术人员将理解，邻近序列将允许与其杂交的探针捕获与其相邻的序列，以使得可对该相邻的序列进行测序。如本文所用，基因组或基因的序列的“特异性区段”意指该基因组或基因的序列中的任何区段，其是该基因组或基因所特有的区段，换句话说，这样的区段对于所指代的基因组或基因是独特的。

如本文所用，术语“原癌基因”意指当发生突变或过度表达时可导致细胞癌变的基因。如本文所用，术语“抑癌基因”也称肿瘤抑制基因，或抗癌基因，其意指可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。肝癌相关的原癌基因和抑癌基因是本领域已知的，例如可以根据癌症基因数据库(包括但不限于dbSNP、COSMIC、千人基因组数据库和TCGA数据库)确定。在优选的实施方案中，肝癌相关的原癌基因和抑癌基因选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、TERT、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、ATM、CREBBP、NRAS、HRAS、SMAD4、GNAS、FLT4、IGF1R和KRAS。在优选的实施方案中，肝癌相关的原癌基因选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：SF3B1、IDH1、CTNNB1、PIK3CA、TERT、NRAS、HRAS、FLT4、IGF1R、GNAS和KRAS。在优选的实施方案中，肝癌相关的抑癌基因选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、PTEN、ARID2、RB1、AXIN1、TP53、FBXW7、KEAP1、NFE2L2、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、SMAD4、ATM和CREBBP。原癌基因和抑癌基因的序列是本领域已知的，例如可以获自Genebank。

如本文所用，“HBV”意指乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)。HBV基因组的序列是本领域已知的，例如可以获自Genebank。

在优选的实施方案中，探针包含多种不同的探针。在优选的实施方案中，所述多种不同的探针各自包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列，其中所述目标核酸序列选自肝癌相关的原癌基因序列、其邻近序列或其特异性区段、肝癌相关的抑癌基因序列、其邻近序列或其特异性区段和/或HBV基因组序列或其特异性区段。

在优选的实施方案中，所述多种不同的探针各自包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列，所述目标核酸序列选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、TERT、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、ATM、CREBBP、NRAS、HRAS、SMAD4、GNAS、FLT4、IGF1R和KRAS。在优选的实施方案中，所述目标核酸序列选自或除了上述基因外进一步选自HBV基因组的序列或其特异性区段。

在更优选的实施方案中，所述多种不同的探针各自包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列，所述目标核酸序列选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、SMAD4、GNAS和TERT及其启动子序列。在优选的实施方案中，所述目标核酸序列选自或除了上述基因以外进一步选自HBV基因组的序列或其特异性区段。

如本文所用，分离探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物的方法可以是本领域已知的任何合适的方法。例如，可以采用电泳(例如非变性凝胶电泳)分离的方法。又例如，可以将形成的探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物吸附至固相载体上，随后分离固相载体，从而分离探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物。一种这样的方法可以是利用链霉亲和素磁珠来分离生物素化的探针，从而分离探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物。又例如，可以使探针预先附接到固相载体例如磁珠上，然后在形成探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物之后，利用适宜的缓冲液(例如PBS溶液，TE缓冲液等)洗涤固相载体，从而分离探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物。应理解，本发明的分离探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物的方法不局限于上文列举的示例性方法，而是可以采用能够实现此效果的任何方法。

如本文所用，从所述探针与包含目标核酸序列的核酸分子的复合物释放包含目标核酸序列的核酸分子是指使杂交的包含目标核酸序列的核酸分子与探针解离。可以使用本领域已知的任何方法来使杂交的包含目标核酸序列的核酸分子与探针解离，例如使用加热变性的方法。

在优选的实施方案中，将捕获的包含目标核酸序列的核酸分子与探针解离后，还对其进行扩增，例如进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。

在一些实施方案中，可以在核酸分子(包括包含目标核酸序列的核酸分子)的一端或两端连接接头分子(也称为衔接子)。所述接头分子允许对捕获的包含目标核酸序列的核酸分子进行扩增。扩增包括使用包含与所述接头分子的序列至少部分互补的序列的引物来执行扩增(例如PCR)。接头分子可以例如是至少约10-100个碱基对的双链寡核苷酸，例如10、20、30、40、50、60、70个碱基对，优选58或66个碱基对。可以采用平末端连接法或粘性末端互补连接法将接头分子连接到双链的核酸分子上。作为示例性描述，平末端连接法可以包括例如对双链的核酸分子在脱氧核苷三磷酸存在下使用DNA聚合酶，例如T4-DNA聚合酶或Klenow聚合酶进行末端修复反应，其产生平端核酸分子；然后可根据本领域已知的任何方法，优选地通过T4-DNA连接酶反应的方法将平末端的接头分子与修饰的核酸分子连接。作为示例性描述，粘性末端互补连接法可以包括例如对双链核酸分子进行末端修复，然后根据本领域已知的任何方法对核酸分子的一条或两条链加多聚A尾部，并根据本领域已知的任何方法，优选地通过T4-DNA连接酶反应与一端为多聚T尾部的接头分子进行连接。应理解，在核酸分子的一端或两端上连接接头分子的方法不局限于上文列举的示例性方法，而是可以采用能够实现此效果的任何方法。接头分子的连接可以在核酸分子捕获至探针之前或之后进行。如果是后者，则以单链形式释放的核酸分子通常应当首先重新复性，然后进行所述连接。

如本文所用，术语“互补”或“基本互补”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对或者双链体形成。如果在一个给定位置上一个核酸的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置上是彼此互补的。互补核苷酸一般是A和T(或A和U)或者C和G。当在最佳地比对和比较并适当地进行了核苷酸插入或缺失的情况下，一条链的核苷酸与另一条链的至少大约80％、通常至少大约90％到约95％，甚至大约98％到100％配对时，这两个单链RNA或DNA分子被称为基本互补。

如本文所用，术语“杂交”是指两个单链核酸通过碱基互补配对形成双链结构。杂交可发生于完全互补的核酸链之间或存在少量错配区的“基本互补”核酸链之间。只能在完全互补核酸链间发生杂交的条件称为“严格杂交条件”或“序列特异杂交条件”。基本互补序列的稳定双螺旋体可在非严格杂交条件下获得。耐受的错配程度可通过适当调节杂交条件控制。本领域的技术人员通过考虑一些变量能凭经验可以确定双螺旋的稳定性。这些变量包括：寡核苷酸的长度和碱基对的浓度、离子强度、碱基对错配率。建立用于设计本发明的寡核苷酸或探针的严格和非严格杂交条件的定性和定量考虑事项可参见，例如，Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(4th ed.，John Wiley&Sons 1999)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press2001)：Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.，IRL Press 1985)。

如本文所用，对核酸分子进行“测序”意指测定核酸的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何核酸测序方法来执行所述测序。在优选的实施方案中，所述测序选自电泳测序、合成法测序、连接法测序、联合探针锚定聚合测序、杂交测序、单分子测序和实时测序方法。在优选的实施方案中，所述测序可以选自但不限于Illumina的SBS测序技术、LifeTechnologies公司的半导体测序技术、ABI公司开发的SOLiD测序和BGI的联合探针锚定聚合技术(cPAS)和联合探针锚定连接技术(cPAL)、HelicosHeliscope技术、PacBioSMRT技术、Oxfordnanopore技术等。

如本文所用，受试者(例如人)参考基因组和HBV参考基因组数据库的序列信息可以获自本领域已知的任何数据库，例如可以获自NCBI。

如本文所用，基于核酸的测序数据，鉴定包含目标核酸序列的核酸分子是否存在原癌基因和/或抑癌基因变异和/或HBV整合位点可以使用本领域已知的任何合适的分析方法(参见例如Kinde I,Wu J,Papadopoulos N,Kinzler KW,&Vogelstein B(2011)Detection and quantification of rare mutations with massively parallelsequencing.Proc Natl Acad Sci U S A 108(23):9530-9535；Schmitt MW等人(2012)Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.Proc NatlAcad Sci U S A 109(36):14508-14513.)。下面以人为例，介绍用于鉴定原癌基因和/或抑癌基因变异和/或HBV整合位点的示例性分析方法。

适合于基于核酸的测序数据，鉴定所述包含目标核酸序列的核酸分子是否存在原癌基因和/或抑癌基因变异可以包括以下分析步骤：将比对位置完全一致的序列识别为一个序列簇，筛选该序列簇以选择至少包含一条正链序列和一条负链序列并且最小比对质量不小于20(例如不小于21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40)的序列簇，根据筛选后的序列簇生成简并序列，将简并序列与受试者参考基因组进行比较，以识别序列变异，根据癌症基因数据库，将序列变异对应的变异基因鉴定为原癌基因和/或抑癌基因。

在优选的实施方案中，癌症基因数据库是选自dbSNP、COSMIC、千人基因组数据库和TCGA数据库中的至少一个数据库。

在优选的实施方案中，鉴定出的原癌基因变异在COSMIC数据库中被记录10-20次以上。

在优选的实施方案中，鉴定出的抑癌基因变异改变蛋白质的氨基酸序列。

具体地，基于核酸的测序数据，鉴定包含目标核酸序列的核酸分子是否存在原癌基因和/或抑癌基因变异可以包括以下分析步骤：将测序数据比对到人类基因组后进行排序(例如使用BWA和Samtools软件)，将一对PE比对位置均完全一致的序列识别为一簇PCR重复序列。对上一步中得到的PCR重复序列的簇进行筛选，选择至少包含一条正链序列和一条负链序列的簇，且该簇序列的最小比对质量应不小于20(例如不小于21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40)；对于上一步筛选的序列簇，对该簇序列的每个碱基位置，分别根据该簇所有正链序列和负链序列的碱基分布以及测序质量值，进行极大似然估计，并将该位置所有这一簇序列的碱基简并成一个碱基。如果该位置上存在“A”、“T”、“C”、“G”中的某一个碱基，且其在所有正链序列以及负链序列该位置上的似然值均高于拥有第二似然值的碱基1000倍以上，则简并碱基为该碱基；如果不存在这样的碱基，则简并碱基为“N”；将这一簇PCR重复序列每个位置上简并后的碱基按照位置串联起来，生成一条新的简并序列，丢弃N的数量占10％以上的简并序列。将这一簇序列中任一序列的比对tag记为该简并序列的比对tag。在所有序列简并完成之后，将所有简并序列的碱基根据每个碱基的的比对位置统计成捕获目标区域上每个基因组位点所覆盖序列的碱基型分布(A、T、C、G、N)的信息表。利用碱基分布信息表进行低频变异检测，首先确定每个基因组位置的野生型碱基型(目标核酸参考序列的碱基型)，与野生型碱基型不一致的碱基型即为变异碱基型；如果一个插入缺失变异或者碱基替换变异得到2条以上不同的DNA片段支持，则该变异作为最终检测到的变异。对变异位点过滤dbSNP数据库、千人基因组计划标准变异集数据库中的人群多态性变异位点，根据体细胞变异数据库COSMIC、以及dbNSFP等数据库变异位点进行基因结构、功能、临床表型三个层次的注释。若满足以下条件之一，则提示可能发生肝癌：(1)检测出原癌基因变异，且该变异在COSMIC数据库中被记录10-20次以上；(2)检测出抑癌基因变异，且该变异改变蛋白质的氨基酸序列。

适合于基于核酸的测序数据，鉴定包含目标核酸序列的核酸分子是否存在HBV整合位点可以包括以下分析步骤：从测序数据中筛选出能够至少部分比对到HBV参考基因组上的序列，

从上述筛选出的序列中筛选出能够至少在30个(例如至少35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100或更多个)碱基上比对到受试者参考基因组的序列，

从筛选出的序列中进一步筛选具有如下特征的序列：整个序列中能够比对到HBV基因组或者受试者基因组的部分相加至少占序列长度的80％(例如至少85％、90％、95％、98％、99％或100％)，

根据比对到HBV和受试者基因组的断点位置进行聚类，得到HBV整合位点。

具体地，基于核酸的测序数据，鉴定包含目标核酸序列的核酸分子是否存在HBV整合位点可以包括以下分析步骤：

将测序数据比对到HBV基因组上，挑选出一对PE序列至少有一条能够部分比对到HBV基因组的DNA序列；

将上述挑选出的序列比对到人类基因组参考序列上，并在其中挑选出一对PE序列至少有一条能够部分比对上人类基因组的序列。其中比对上人类基因组的片段长度至少为30个(例如至少35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100或更多个)碱基；

对上述挑选出的序列进行筛选，并根据序列比对到人类和HBV参考序列的匹配部分进一步挑选出序列，其特征为：整个序列中能够比对到HBV基因组或者人类基因组的部分相加至少占序列长度的80％(例如至少85％、90％、95％、98％、99％或100％)；

对上一步骤挑选出的序列根据比对到HBV和人类基因组的断点位置进行聚类，得到HBV整合位点，具体步骤包括：

将在HBV基因组和人类基因组上比对位置和断点均完全相同的序列识别为一类重复序列，每一类重复序列只保留其中一条序列；

对上一步得到的序列在HBV和人类基因组上的断点进行统计，将在人类和HBV基因组上断点均相同且人类序列部分和HBV序列部分的比对正负链均相同的序列归为一类；

对上一步得到的断点进行再聚类，将在人类基因组上和HBV基因组上的断点均相距10bp以内且其人类序列部分和HBV序列部分的正负链均一致的序列进一步归为一组整合位点；

选择至少有两条不同序列支持的整合位点作为最终检测到的病毒整合位点。

应当理解，适合于本发明目的的分析方法并不局限于上文示例性描述的具体方法。本领域技术人员能够容易地确定其它类似的分析方法或对本文所描述的生物信息学方法进行任何合适的改变。

在另一个方面，本发明还鉴定了一组肝癌生物标志物，其可特别有效地用于肝癌诊断，尤其是早期诊断。该肝癌生物标志物包含以下的一种或多种或全部基因或由其组成：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、TERT、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、ATM、CREBBP、NRAS、HRAS、SMAD4、GNAS、FLT4、IGF1R和KRAS。在优选的实施方案中，肝癌生物标志物包含以下的一种或多种或全部基因序列或由其组成：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、SMAD4、GNAS和TERT及其启动子序列。

因此，在另一个方面，本发明涉及包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列的探针在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于通过包括以下步骤的方法分析核酸样品：

a.提供来自受试者的包含核酸分子的核酸样品，

b.提供包含探针的试剂，其中所述探针包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列，其中所述目标核酸序列选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、TERT、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、ATM、CREBBP、NRAS、HRAS、SMAD4、GNAS、FLT4、IGF1R和KRAS，和/或HBV基因组的序列或其特异性区段，

优选地，其中所述目标核酸序列选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、SMAD4、GNAS和TERT及其启动子序列中的一种或多种，和/或HBV基因组的序列或其特异性区段，

更优选地，所述目标核酸序列是TP53或其邻近序列或其特异性区段，和/或HBV基因组的序列或其特异性区段，

f.对释放的包含目标核酸序列的核酸分子进行测序，

在一个实施方案中，核酸样品可以是包含经片段化的来自基因组的核酸的样品。

在优选的实施方案中，核酸样品获自受试者的体液，例如血液、尿液、泪液、唾液、汗液、耳液、淋巴液、精液或阴道液。

在优选的实施方案中，在包含目标核酸序列的核酸分子的一端或两端连接接头分子。

在优选的实施方案中，在测序之前，对释放的包含目标核酸序列的核酸分子进行扩增。

在优选的实施方案中，测序选自电泳测序、合成法测序、连接法测序、联合探针锚定聚合测序、杂交测序、单分子测序和实时测序方法。

在一些实施方案中，所述用途还可包括基于所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点的鉴定结果，对肝癌患者进行肿瘤分级或用药指导。

在优选的实施方案中，鉴定所述包含目标核酸序列的核酸分子是否存在序列变异包括以下分析步骤：

将比对位置完全一致的序列识别为一个序列簇，

筛选该序列簇以选择至少包含一条正链序列和一条负链序列并且最小比对质量不小于20(例如不小于21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40)的序列簇，

根据筛选后的序列簇生成简并序列，

将简并序列与受试者参考基因组中的目标核酸参考序列进行比较，识别序列变异。

在优选的实施方案中，识别出在COSMIC数据库中被记录10-20次以上的原癌基因变异，和/或识别出改变蛋白质的氨基酸序列的抑癌基因变异。

在优选的实施方案中，鉴定所述包含目标核酸序列的核酸分子是否存在HBV整合位点包括以下分析步骤：

从测序数据中筛选出能够至少部分比对到HBV参考基因组上的序列，

从筛选出的序列中筛选出能够至少在30个(例如至少35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100或更多个)碱基上比对到受试者参考基因组的序列，

在其它方面，本发明还涉及一种用于分析核酸样品的试剂或试剂组合，其包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的探针，所述目标核酸序列选自肝癌相关的原癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段、肝癌相关的抑癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段和/或HBV基因组的序列或其特异性区段。在优选的实施方案中，肝癌相关的原癌基因选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：SF3B1、IDH1、CTNNB1、PIK3CA、TERT、NRAS、HRAS、FLT4、IGF1R、GNAS和KRAS。在优选的实施方案中，肝癌相关的抑癌基因选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、PTEN、ARID2、RB1、AXIN1、TP53、FBXW7、KEAP1、NFE2L2、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、SMAD4、ATM和CREBBP。在更优选的实施方案中，所述目标核酸序列选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、SMAD4、GNAS、TERT及其启动子序列和/或HBV基因组的序列或其特异性区段。

在其它方面，本发明还涉及一种用于分析核酸样品的试剂或试剂组合，其包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的探针，所述目标核酸序列选自以下一种或多种基因的序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、TERT、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、ATM、CREBBP、NRAS、HRAS、SMAD4、GNAS、FLT4、IGF1R和KRAS。在优选的实施方案中，所述目标核酸序列选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、SMAD4、GNAS和TERT及其启动子序列。

在优选的实施方案中，试剂组合还包含用于对核酸进行PCR扩增的试剂。

在优选的实施方案中，试剂组合还包含用于分离和纯化核酸的试剂。

在优选的实施方案中，试剂组合还包含用于对测序数据进行如本文所述的测序数据分析的说明书。

在优选的实施方案中，本发明的试剂或试剂组合或肝癌生物标志物可用于分析核酸样品，特别是用于肝癌诊断，优选早期诊断，特别是用于对乙肝携带者、乙肝患者及肝硬化患者等肝癌高危人群进行肝癌诊断，优选早期诊断，用于肝癌患者的肿瘤分级、用药指导，用于肝癌预防疫苗适用人群的判断，用于肝癌治疗疫苗有效性的判断，用于肝癌患者药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗和肝癌切除术后的动态监控和预后判断，用于血液或尿液中肿瘤细胞核酸分子的定量。

在其它方面，本发明还涉及如本文所述的试剂或试剂组合或肝癌生物标志物的用途，其用于分析核酸样品，特别是用于肝癌诊断，优选早期诊断，特别是用于对乙肝携带者、乙肝患者及肝硬化患者等肝癌高危人群进行肝癌诊断，优选早期诊断，用于肝癌患者的肿瘤分级、用药指导，用于肝癌预防疫苗适用人群的判断，用于肝癌治疗疫苗有效性的判断，用于肝癌患者药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗和肝癌切除术后的动态监控和预后判断，用于血液或尿液中肿瘤细胞核酸分子的定量。

在其它方面，本发明还涉及如本文所述的试剂或试剂组合或肝癌生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于如本文所述任何方法中。

本发明至少具有以下有益的技术效果：

本发明人创新性地将肝癌低频变异检测与HBV整合检测结合起来，并令人惊讶地发现本发明能够以高灵敏度和特异性检测到基因组中极其微量的病毒整合信息以及低频变异，从而实现肝癌的早期诊断。

相较于目前肝癌早期诊断的主要手段(包括甲胎蛋白(AFP)检测和B型超声波检查、CT、肝动脉造影、PET-CT等)，本发明的方法更适合用于肝癌的诊断(尤其是早期诊断)，具有更高的灵敏度、特异性以及准确性。特别是可大大提高小肝癌的检出率，同时对于非肿瘤患者保持极高(甚至高达100％)的阴性率，从而避免了对于非肝癌患者的假阳性诊断给其带来沉重的心理负担和不必要的经济损失。

本发明还尤其适合用于通过检测患者的细胞外游离核酸样品(例如外周血液或尿液)，实现无创高深度准确测序，在循环肿瘤核酸含量很低的情况下，检测到早期肝癌发病相关的分子标记物，从而应用到肝癌的早期筛查诊断中，实现肝癌的早期预防。

本发明发现的一种新的肝癌生物标志物组合可以以高特异性和灵敏度实现肝癌的早期鉴定。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明的肝癌早期诊断方法的流程图。

图2是本发明实施例1所示的肝癌早期诊断方法与AFP在肝癌真实临床样本的检测结果对比图。

图3是本发明实施例2所示的肝癌早期诊断方法与AFP在肝癌真实临床样本的检测结果对比图。

具体实施方式

实施例1

采用40例肝癌临床样本以及12例乙肝非肝癌患者的血液游离DNA，用以证明本发明所述技术在肝癌检测方面的灵敏性和特异性。其中，40例肝癌患者包括病灶最大径<5cm及>＝5cm两组样本各20例，用以评估本方法的灵敏性。12例乙肝非肝癌患者为肝癌高危人群，用以评估本方法的特异性。

具体实施步骤如下：

1.样品文库的制备：对于40例肝癌患者和12例乙肝非肝癌患者，每人用Streck管分别采集5ml外周血，并分离血浆中提取的cf-DNA，利用Qubit核酸定量仪对cf-DNA样本进行质量浓度测定，选取40ng cf-DNA并使用Agilent 2100Bioanalyzer检测ctDNA的片段分布，从而排除基因组DNA污染。按照KAPA LTP文库制备试剂盒建库说明书，进行3步酶促反应。

1)末端修复

之后加入Agencourt AMPure XP reagent 120μL，进行磁珠纯化，回溶于42ulddH2O，带磁珠进行下一步反应。

2)加A

之后加入PEG/NaCl SPRI Solution 90μL，充分混合，进行磁珠纯化，回溶于(35-Adapter)μL ddH2O，带磁珠进行下一步反应。

3)接头连接

接头为illumina测序平台的adapter序列，如采用其他测序平台，可替换为其他平台对应的adapter序列。

接头序列为：

F1(5’-3’):

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

R1(5’-3’):

GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

接头序列F1和R1中，下划线标注的为与下文所述F1和R1引物对应的部分，用于文库扩增。

接头序列R1中，XXXXXXXX表示index标签序列，作用是标记同一个样本的所有分子，当有多个样本同时测序时，可通过index标签序列来区分样本。index标签序列长度为4-8bp。

反应体系为

之后分别加入PEG/NaCl SPRI Solution 50μL 2次，进行2次磁珠纯化，回溶于25ul ddH20。

接头连接后进行PCR扩增，扩增采用引物序列为

引物序列为：

F1引物:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATC-3’

R1引物:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’

PCR体系

PCR程序：

2.芯片杂交捕获

本实施例中采用合成的肝癌早筛芯片，参照芯片制造商提供的说明书进行杂交捕获。洗脱回溶于21ul ddH2O(带杂交洗脱磁珠)。

芯片主要设计过程分为2步：

1、将TP53基因外显子序列按照坐标依次切分成90bp的序列，并根据每个90bp的序列合成探针。

2、将环形HBV序列按照坐标依次切分成90bp的序列，并根据每个90bp的序列合成探针。将人类TP53基因探针与HBV探针按照摩尔浓度等量混合，得到最终的捕获芯片。

3.杂交后PCR

PCR采用通用引物，引物序列为：

F1引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATC-3’

R1引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’

PCR体系

PCR程序：

先除去上一步磁珠，然后重新加入Agencourt AMPure XP reagent 50μL，进行磁珠纯化，回溶于25ul ddH2O，进行QC及上机。

4.上机测序：

对本实施例中52例临床真实样品，采用Hiseq2500PE101+8+101程序进行上机测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书(参见Illumina官方公布的cBot)进行上机测序操作。

5.数据分析：

为了实现本发明目的，本发明基于低频变异位点检测分析方法，包括如下步骤：

检测HBV整合位点：

1)将测序数据用BWA软件比对到HBV基因组上，对比对后的序列进行筛选，其条件为：一对PE序列至少有一条能够部分比对到HBV基因组。保留满足条件的序列，并输出成fastq格式文件。

2)将上述挑选出的序列用BWA软件比对到人类基因组参考序列上，并对比对后的序列进行筛选。其条件为：一对PE序列至少有一条能够部分比对上人类基因组，且比对上人类基因组的片段长度至少为30个(例如至少35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100或更多个)碱基。

3)分析上述挑选出的序列在HBV病毒和人类基因组上的比对情况，并根据序列比对到人类和HBV参考序列的匹配部分对序列进行进一步筛选，其条件为：整个序列中比对到HBV基因组或者人类基因组的部分相加至少占序列总长度的80％(例如至少85％、90％、95％、98％、99％或100％)。

4)对上一步骤挑选出的序列根据比对到HBV和人类基因组的断点位置进行聚类并去除重复序列，得到HBV整合位点，具体步骤包括：

4.1)将在人类基因组和HBV基因组上比对位置和断点完全相同的序列归为一类重复序列，一类重复序列只保留一条序列。

4.2)对序列在HBV和人类基因组上的断点进行聚类，将在人类基因组上的断点和比对正负链方向相同，且同时在HBV基因组上的断点和比对正负链方向相同的序列归为一类。

4.3)对上一步得到的断点进行再聚类，将在人类基因组上和HBV基因组上的断点均相距10bp以内且其人类序列部分和HBV序列部分的正负链均一致的序列进一步归为一组新的整合位点。

4.4)选择至少有两条不同序列支持的整合位点组作为最终检测到的病毒整合位点。

5)将测序序列用BWA软件比对到人类参考基因组上获得bam格式的比对文件，并用Samtools软件对bam格式文件进行排序。

6)读取已排序的bam格式的比对文件，把比对完毕的测序序列按照两端的比对位置进行归类，把一对paired-end序列两端比对位置均完全相同的序列归为一簇序列家族。

7)对序列家族进行筛选，规则包括：(1)该序列簇至少包含一个正链来源序列和一个负链来源序列；(2)该序列簇的正链序列reads最小比对质量和负链序列reads最小比对质量均不小于20(例如不小于21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40)。

8)对于通过上述筛选的所有序列簇创建一致性序列，排除由于建库过程或者PCR过程中引入的假阳性变异。具体规则为：遍历该簇序列家族的所有比对碱基位置，对于序列簇每一位置的碱基，对其在该序列簇所有正链序列及所有负链序列中根据测序碱基类型以及测序质量进行极大似然估计，若某一碱基类型(A、T、C、G)在正链和负链序列中，其似然值均高于第二碱基似然值1000倍，则该碱基型为一致性序列在该碱基位置的碱基型。如果不存在某一碱基型满足上述条件，则一致性序列的该碱基位置记为N。

9)将这一簇PCR重复序列每个位置上简并后的碱基按照位置串联起来，生成一条新的双链一致性序列。对双链一致性序列进行过滤，如果序列中含有的N碱基超过10％则该序列丢弃。如果序列合格则进入以下步骤。

10)将这一簇序列中任一序列的比对tag记为双链一致性序列的比对tag，并根据一致性序列的每个碱基的比对位置统计入捕获目标区域上每个基因组位点所覆盖序列的碱基型分布(A、T、C、G、N)的信息表。

11)得到每个位点的碱基型分布，利用碱基分布信息表进行低频变异检测，首先确定每个基因组位置的野生型碱基型(目标核酸参考序列的碱基型)，与野生型碱基型不一致的碱基型即为变异碱基型。如果一个插入缺失变异或者碱基替换变异得到2条以上不同的DNA双链一致性序列支持，则该变异作为最终检测到的变异。

12)对变异位点过滤dbSNP数据库、千人基因组计划标准变异集数据库中的人群多态性变异位点，根据体细胞变异数据库COSMIC、以及dbNSFP等数据库变异位点进行基因结构、功能、临床表型三个层次的注释。

6.结果判断：

对上述步骤检测到的HBV整合位点以及人类基因组变异进行分析，若满足以下条件之一，则提示可能发生肝癌：

(1)检测出任意HBV病毒整合位点。

(2)检测出TP53基因变异，且该变异改变蛋白质的氨基酸序列。

本实施例中检测结果见表1、表2和图2。本发明方法对肝癌患者检出率达到67.5％，显著高于AFP的42.5％；对于最大径大于5厘米的肝癌患者，本发明方法检出率达到85％，显著高于AFP的50％。

表1肝癌患者检测结果

注：-表示否/无

表2乙肝非肝癌患者检测结果

注：-表示否/无

实施例2：

本发明实施例2是对实施例1进行进一步优化，采用与实施例1相同的样本，并将捕获芯片中包含的人类基因组部分由TP53基因扩大为若干肝癌高频变异基因。

1)芯片主要设计过程分为2步：

1、基于TCGA、COSMIC数据库中有关肝癌病人在肝癌高发变异基因上每个外显子区域变异样本数、人群频率以及变异人群密度(变异样本人群频率/外显子长度)，并根据变异人群密度值降序排列。之后采用迭代算法：将变异密度最大的外显子列为筛选到的捕获区间，以变异密度最大的外显子涵盖的样本作为初始样本数据库，统计样本数据库之外的样本在其他外显子区域的变异人群密度，将其中变异人群密度最大的外显子区间列为第二个筛选到的捕获区间，同时将筛选到的第二个区间的变异样本加入样本数据库，以同样的方法筛选第三个区间，直到样本数据库包括了95％以上的样本，并统计筛选到的外显子区集，作为芯片的人类基因组捕获区间。

所述肝癌早筛芯片上基因panel覆盖区域详情见下表

基因	基因
		ARID1A	CDKN2A
NFE2L2	PTEN
		SF3B1	ARID2
IDH1	RB1
		CTNNB1	AXIN1
PIK3CA	TP53
		FBXW7	KEAP1
SMAD4	GNAS
		TERT及其启动子

2)本实施例的实验流程和数据分析与实施例1相同。

3)结果判断：

对检测到的HBV整合位点以及人类基因组变异进行分析，若满足以下条件之一，则提示可能发生肝癌：

(1)检测出任意HBV病毒整合位点。

(2)检测出原癌基因变异，且该变异在COSMIC数据库中被记录10-20次以上。

(3)检测出抑癌基因变异，且该变异改变蛋白质的氨基酸序列。

检测结果见表3、表4和图3。本发明方法对小于5厘米和大于5厘米的肝癌患者检出率分别为70％和90％,显著高于AFP的35％和50％。本发明方法对于HBV阳性肝癌患者的检出率为89％，显著高于AFP的48％。

表3肝癌患者检测结果

表4乙肝非肝癌患者检测结果

注：-表示否/无

实施例3：

本发明实施例3是对检测方法的检测限进行测试，采用3例模拟样品(1:100、1:500、1:1000)进行低频变异检测，以确认本发明方法对低频变异检测的灵敏度及准确性。模拟样品可以用于模拟早期肝癌患者血浆中低频变异，其相关实验过程与真实临床血浆样品检测相同。

按照以下步骤进行：

(1)肝癌血浆模拟样品准备：

采用来自肝癌组织的DNA(命名为S0)进行稀释，并与一定比例(1:100、1:500、1:1000)的正常人血液游离DNA混合，分别命名为：S1、S2、S3。

(2)文库构建：

S0、S1、S2、S3分别按照实施例1中杂交捕获方法进行捕获，后续步骤按照实施例1中步骤进行文库构建。

(3)质控及上机测序：

按照实施例1中方法对文库进行质控和上机测序。

实验结果：

测序数据分析结果：

表5模拟样品检测结果比对表

HBV与基因组变异在3组模拟样本中均有检出，说明本发明所述方法可以检测突变频率为0.1％以上的样本，方法灵敏度高。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.对核酸样品进行测序的试剂在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于通过包括以下步骤的方法来鉴定受试者是否患有肝癌或处于患有肝癌的风险中：

a.对来自受试者的核酸样品进行测序，和

b.将测序数据与受试者参考基因组和HBV参考基因组数据库中的序列进行比对，以鉴定所述核酸样品是否存在肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异或HBV整合位点，

其中如果所述核酸样品存在所述原癌基因变异、抑癌基因变异和HBV整合位点中的一种或多种，则提示所述受试者患有肝癌或处于患有肝癌的风险中，

优选地，所述核酸样品是包含来自基因组的核酸的样品，

优选地，所述核酸样品是包含经片段化的来自基因组的核酸的样品，

优选地，所述核酸样品是包含细胞外游离核酸的样品，

优选地，包含细胞外游离核酸的样品获自受试者的体液，例如血液、尿液、泪液、唾液、汗液、耳液、淋巴液、精液或阴道液，

优选地，所述肝癌相关的原癌基因选自SF3B1、IDH1、CTNNB1、PIK3CA、TERT、NRAS、HRAS、FLT4、IGF1R、GNAS和KRAS中的一种或多种，

优选地，所述肝癌相关的抑癌基因选自ARID1A、CDKN2A、PTEN、ARID2、RB1、AXIN1、TP53、FBXW7、KEAP1、NFE2L2、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、SMAD4、ATM和CREBBP中的一种或多种。

2.包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的核酸序列的探针在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于通过包括以下步骤的方法分析核酸样品：

a.提供来自受试者的包含核酸分子的核酸样品，

f.对释放的包含目标核酸序列的核酸分子进行测序，

3.权利要求2的用途，

优选地，所述核酸样品是包含来自基因组的核酸的样品，

优选地，所述核酸样品是包含细胞外游离核酸的样品，

优选地，所述探针包含多种不同的探针，

优选地，所述肝癌相关的原癌基因选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：SF3B1、IDH1、CTNNB1、PIK3CA、TERT、NRAS、HRAS、FLT4、IGF1R、GNAS和KRAS，

优选地，所述肝癌相关的抑癌基因选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、PTEN、ARID2、RB1、AXIN1、TP53、FBXW7、KEAP1、NFE2L2、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、SMAD4、ATM和CREBBP，

优选地，所述目标核酸序列选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、SMAD4、GNAS、TERT及其启动子序列，和/或HBV基因组的序列或其特异性区段，

任选地，在包含目标核酸序列的核酸分子的一端或两端连接接头分子，

任选地，在测序之前，对释放的包含目标核酸序列的核酸分子进行扩增，

优选地，所述测序选自电泳测序、合成法测序、连接法测序、联合探针锚定聚合测序、杂交测序、单分子测序和实时测序方法，

优选地，权利要求2的用途可用于对受试者进行肝癌诊断，优选早期诊断，特别是用于对乙肝携带者、乙肝患者及肝硬化患者等肝癌高危人群进行肝癌诊断，优选早期诊断，

优选地，权利要求2的用途还可包括基于所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点的鉴定结果，对肝癌患者进行肿瘤分级或用药指导，

优选地，权利要求2的用途还可用于肝癌预防疫苗适用人群的判断，其中如果所述包含目标核酸序列的核酸分子不存在所述原癌基因变异、抑癌基因变异和HBV整合位点中的任一种，则提示所述受试者适用于肝癌预防疫苗，

优选地，权利要求2的用途还可用于肝癌治疗疫苗有效性的判断，这包括根据所述分析核酸样品的步骤(包括步骤a-g)鉴定来自同一受试者在接受肝癌治疗疫苗之前和之后的核酸样品或来自接受和未接受肝癌治疗疫苗的不同受试者的核酸样品中的所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异或HBV整合位点，其中如果所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点在接受肝癌治疗疫苗之后或在接受肝癌治疗疫苗的受试者中减少或不存在，则判断肝癌治疗疫苗是有效的，

优选地，权利要求2的用途还可用于肝癌患者在药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗或肝癌切除术后的动态监控和预后判断，这包括对来自经受药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗或肝癌切除术的肝癌患者的核酸样品执行所述分析核酸样品的步骤(包括步骤a-g)，以鉴定核酸样品中是否存在肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点，

优选地，权利要求2的用途还可用于体液(例如血液或尿液)中肿瘤细胞核酸分子的定量，这包括对来自体液的核酸样品执行所述分析核酸样品的步骤(包括步骤a-g)，并基于所述肝癌相关的原癌基因变异、肝癌相关的抑癌基因变异和/或HBV整合位点的鉴定结果定量体液中的肿瘤细胞核酸分子。

4.权利要求2或3的用途，其中鉴定所述包含目标核酸序列的核酸分子是否存在原癌基因和/或抑癌基因变异包括以下分析步骤：

将比对位置完全一致的序列识别为一个序列簇，

筛选该序列簇以选择至少包含一条正链序列和一条负链序列并且最小比对质量不小于20的序列簇，

根据筛选后的序列簇生成简并序列，

将简并序列与受试者参考基因组进行比较，以识别序列变异，

根据癌症基因数据库，将序列变异对应的变异基因鉴定为原癌基因和/或抑癌基因，

优选地，癌症基因数据库是选自dbSNP、COSMIC、千人基因组数据库和TCGA数据库中的至少一个的数据库；

优选地，鉴定出的原癌基因变异在COSMIC数据库中被记录10-20次以上，

优选地，鉴定出的抑癌基因变异改变蛋白质的氨基酸序列。

5.权利要求2-4中任一项的用途，其中鉴定所述包含目标核酸序列的核酸分子是否存在HBV整合位点包括以下分析步骤：

从筛选出的序列中筛选出能够至少在30个碱基上比对到受试者参考基因组的序列，

从筛选出的序列中进一步筛选具有如下特征的序列：整个序列中能够比对到HBV基因组或者受试者基因组的部分相加至少占序列长度的80％，

6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述受试者是人。

7.一种用于分析核酸样品的试剂或试剂组合，其包含与目标核酸序列互补或可与目标核酸序列杂交的探针，所述目标核酸序列选自肝癌相关的原癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段、肝癌相关的抑癌基因的序列或其邻近序列或其特异性区段和/或HBV基因组的序列或其特异性区段，

优选地，肝癌相关的原癌基因选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：SF3B1、IDH1、CTNNB1、PIK3CA、TERT、NRAS、HRAS、FLT4、IGF1R、GNAS和KRAS，

优选地，肝癌相关的抑癌基因选自以下一种或多种核酸序列或其邻近序列或其特异性区段：ARID1A、CDKN2A、PTEN、ARID2、RB1、AXIN1、TP53、FBXW7、KEAP1、NFE2L2、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、SMAD4、ATM和CREBBP，

优选地，所述试剂或试剂组合用于分析核酸样品，特别是用于肝癌诊断，优选早期诊断，特别是用于对乙肝携带者、乙肝患者及肝硬化患者等肝癌高危人群进行肝癌诊断，优选早期诊断，用于肝癌患者的肿瘤分级、用药指导，用于肝癌预防疫苗适用人群的判断，用于肝癌治疗疫苗有效性的判断，用于肝癌患者药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗和肝癌切除术后的动态监控和预后判断，用于血液或尿液中肿瘤细胞核酸分子的定量。

8.一组肝癌生物标志物，其包含以下的一种或多种或全部基因或由其组成：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、TERT、TSC1、TSC2、MLL2、MLL4、CDKN2B、BAP1、MLL3、NCOR1、ATM、CREBBP、NRAS、HRAS、SMAD4、GNAS、FLT4、IGF1R和KRAS，

优选地，所述生物标志物包含以下的一种或多种或全部基因序列或由其组成：ARID1A、CDKN2A、NFE2L2、PTEN、SF3B1、ARID2、IDH1、RB1、CTNNB1、AXIN1、PIK3CA、TP53、FBXW7、KEAP1、SMAD4、GNAS和TERT及其启动子序列。

9.权利要求7的试剂或试剂组合或权利要求8的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于权利要求2-6中任一项的用途。

10.权利要求7的试剂或试剂组合或权利要求8的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于分析核酸样品，特别是用于肝癌诊断，优选早期诊断，特别是用于对乙肝携带者、乙肝患者及肝硬化患者等肝癌高危人群进行肝癌诊断，优选早期诊断，用于肝癌患者的肿瘤分级、用药指导，用于肝癌预防疫苗适用人群的判断，用于肝癌治疗疫苗有效性的判断，用于肝癌患者药物治疗、肝移植、肝癌微创治疗和肝癌切除术后的动态监控和预后判断，用于血液或尿液中肿瘤细胞核酸分子的定量。