CN105506065A

CN105506065A - 肝癌基因检测方法、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105506065A
Application number: CN201410499216.7A
Authority: CN
Inventors: 韩泽广; 胡涛涛
Original assignee: Shanghai Human Genome Research Center
Current assignee: Chinese National Human Genome Center at Shanghai; Shanghai Human Genome Research Center
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明公开了一种肝癌基因检测试剂盒，包括与94个肝癌关联基因的外显子区域和TERT基因的3个启动子区域相匹配的97个靶向探针。本发明还公开了该试剂盒在肝癌诊断中的应用，以及使用该试剂盒检测肝癌关联基因的方法。本发明的肝癌基因检测试剂盒，可用于肝癌的临床诊断和分型，使肝癌诊断更加准确、快速，为肝癌的个性化治疗提供新的途径。

Description

肝癌基因检测方法、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及肝癌相关基因的检测试剂盒，该试剂盒在肝癌诊断中的应用，以及使用该试剂盒进行肝癌相关基因检测的方法。

背景技术

肝癌严重威胁着我国人民的生命健康。肝癌的诊断，尤其早期诊断是临床诊疗和预后的关键。肝癌的治疗在过去20年来已取得很大的进展，外科手术切除及肝脏移植属于“根治性”治疗，仍是肝癌治疗的首要选择。随着肝癌早期诊断水平的提高及肿瘤治疗生物学概念的改变，肿瘤局部非手术治疗在肝癌治疗中的地位日益提高。经导管动脉内化疗栓塞(TACE)已成为不能切除肝癌治疗的首选方法，是中晚期肝癌治疗的重要手段。但目前肝癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物，针对性差，疗效不佳，而死亡的原因主要与其高度转移特性有关，常常侵犯肝内血管而后全身转移而导致患者死亡。但导致肝癌转移的分子机制不清楚，尤其决定肿瘤细胞转移的内在变异基因尚没有确定。而确定关键突变基因将为患者的诊断、分型和靶向治疗奠定坚实基础。

经数十年的肿瘤研究表明，肿瘤是遗传性疾病，是基因疾病，是基因组不稳定性疾病。尤其基因组的结构异常，比如体细胞基因的蛋白编码区突变(包括单碱基突变、插入和缺失、易位等)是肿瘤形成的重要机制之一。这些体细胞的基因突变既能引起癌基因的活性增强，比如MYC和RAS基因等；也能够使抑癌基因的活性丧失，比如TP53和APC等。一般认为，肿瘤的发生是一个包含多种遗传学损伤的多步骤过程。这种损伤可以导致细胞逃避正常的生长控制，也可以激活某种生存机制的通路。研究发现，肿瘤形成至少需要4-5步的遗传学突变，突变基因涉及约12类信号通路的失调。众多的证据表明，不同的基因突变与患者临床特征、预后、治疗反应甚至治疗方法密切相关，比如EGFR和B-RAF发生突变，可以选择相应的抑制剂进行靶向治疗，获得成功。目前，技术的飞速发展给我们深入研究肿瘤带来了新的机遇，这些技术可以让我们从全基因组的水平全面理解肿瘤的发生发展的分子机制，可以更准确地发现更多的肿瘤致病基因，尤其突变基因，将为肿瘤诊断指标、分子分型以及药物靶标的发现等奠定了很好的基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种肝癌基因检测试剂盒，它可以准确、快速地捕获肝癌关联基因。

为解决上述技术问题，本发明的肝癌基因检测试剂盒，包括与94个肝癌关联基因的外显子区域和TERT基因的3个启动子区域相匹配的97个靶向探针。

所述的肝癌关联基因为突变频率在4％以上、相同基因在3个以上不同群体出现且小于等于10kb的基因。包括：ADAMTSL3、ADCY2、AMPH、APC、AR、ARID1A、ARID1B、ARID2、ATAD3B、ATM、AXIN1、AXIN2、BAZ2B、BRAF、BRCA2、BRD8、BRD9、BRE、C18ORF34、CACNA1C、CACNA2D4、CCNE1、CDH8、CDKN2A、CLIP1、COL11A1、COL5A3、CPA2、CSMD3、CTNNB1、DCAF4L2、DISC1、DOCK7、DSE、ELM01、EPS15、ERRFI1、FAM5C、GJA1、GNAS、GPR126、GXYLT1、HDAC9、HIST1H4B、IGF1R、IGSF10、IGSF3、IRF2、ITPR2、JAK1、KEAP1、KRAS、LIPI、LRP1B、MLL3、MLL4、MXRA5、NFE2L2、OTOP1、PAM、PCDH15、PCDHA13、PCDHA7、PCMTD1、PDZRN4、PEG3、PIK3CA、PREX2、PROKR2、PTEN、RADIL、RNF43、ROBO2、ROCK1、RPS6KA3、SAMD9L、SCN3A、SCN8A、SENP5、SLC10A1、SMAD4、SOS1、SPAG17、SYNJ2、TERT、TMEM170A、TMEM51、TP53、TTLL2、UBR3、USP25、WWP1、ZIC3、ZNF226。

所述的TERT基因的启动子区域为chr5：1253287-1253843，1295104-1295162，1295162-1300162。

本发明要解决的技术问题之二是提供上述试剂盒在肝癌诊断中的应用。

本发明要解决的技术问题之三是提供使用上述试剂盒检测肝癌基因的方法，其步骤包括：

1)采集患者的肝脏组织样本，进行样本DNA抽提、纯化、质检；

2)对样本DNA进行酶切、杂交、捕获、连接、洗脱、扩增，构建测序样本文库；捕获采用权利要求1至4任一项所述的试剂盒；

3)检测样本文库的浓度、大小和纯度；

4)测序，数据分析，确定发生突变的基因及突变频率。

步骤4)中的数据分析包括：测序结果mapping、单样本SNV分析、单样本SmallInDel分析、样本间SNV差异分析、样本间SmallInDel差异分析。

较佳的，在步骤4)的数据分析之后，还可以对数据分析结果进行二次抽取分析，对该肝癌病人的肝癌组织和癌旁组织存在的亚克隆群体进行分类及病理分级。分类及病理分级的方法是：将每个样本参加测序的基因组总量与100个细胞的预测基因组量A比较，推测100个细胞应有的测序数据量a；从总的测序数据中随机抽取10次a，将该10次抽调出来的数据a做相关性分析，再将最终得到的突变基因突变频率做聚类分析，得出组织中可能存在的克隆群体及其所占比例。

本发明针对肝癌相关基因开发用于靶向捕获基因测序的试剂盒，并将其应用在肝癌的诊断上，使肝癌的临床诊断更加准确、快速，从而有助于临床医生更好地选择肝癌的个性化治疗方案。

附图说明

图1是本发明的肝癌基因检测试剂盒的设计及应用流程图。

图2～图5是本发明实施例1的测序样本文库的浓度及片段大小的质控结果。

图6是本发明实施例1的样本富集统计图，覆盖深度都在5000倍以上。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，即Agilent公司和Illumina公司指定的操作流程和条件。

实施例1两例肝癌病人的靶向捕获测序

测序方法包括以下步骤：

1.采集两例肝癌手术病人的癌旁组织和癌组织共4个组织样本T1、P1、T2、P2(T代表癌组织，P代表癌旁正常组织，-80℃冰箱保存，样本来源于南京市江苏省人民医院肝胆外科)，进行组织DNA抽提。本实验采用DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen，69506)试剂盒，并且根据生产厂商提供的标准操作流程，进行样本的DNA抽提及纯化。DNA经ND-1000分光光度计和0.8％琼脂糖凝胶电泳质检合格后备用，DNA质检结果见表1。

表1两对样本(T1/P1、T2/P2)中抽提DNA后的质量评价结果

样本名称	浓度(ng/μL)	A260/A280	A260/A230	体积(μL)	总量(μg)	结果
							T1	131.00	/	/	90	11.79	合格
P1	174.00	/	/	90	15.66	合格
							T2	171.40	1.91	0.72	90	15.43	合格
P2	136.20	1.85	0.56	90	12.26	合格

2.按照Agilent公司HaloPlexTargetEnrichmentSystemforIlluminaPaired-EndSequencingLibrary对基因组DNA进行酶切、杂交、捕获、连接、洗脱、扩增等步骤，完成测序样本文库构建。

肝癌关联候选基因的筛选方法如下：

第一步，整合现有针对肝细胞癌病例样本测序的文献和报道，对每篇文献中提及的体细胞突变基因进行整合；

第二步，归总，将各个文献中整合出的优先筛选基因整合到一起，分别将基因的突变频数和样本数叠加后统计突变频率，再删除重复基因，将这批基因作为优先候选基因；

第三步，将对各个文献中单独整合的其他基因序列进行再次整合。首先对这些基因的突变频数进行重新统计，方法同第二步，额外添加两个筛选条件：1、同一基因出现在三个以上样本群体中，即有三个以上不同研究小组都检测到该突变基因；2、在第1个筛选条件的基础上，选取突变频率大于或等于4％的基因作为候选基因。

第四步，将第二步和第三步的基因整合到一起，除去重复基因，再将基因大小超过10kb的基因剔除，留下的94个基因作为最终的候选基因。

对候选基因的特定区域进行靶向捕获的设计方案请参见表2所示。其中，阅读序列为100bp，97个靶向探针与2066个目标区域(区域大小为420.396kbp)完全相匹配；全部的探针总数为19982个，区间总长为416.32kbp，总设计序列大小为1.08Mbp，平均覆盖率99.03％，每个样本最低测序得出的总序列大小为216.24Mbp；探针数据库采用RefSeq、Ensembl、CCDS、Gencode、VEGA、SNP，设计区域包括了基因的编码外显子区域、非编码区、5'非编码区和3'非编码区，3'端和5'端各延伸了10bp，不允许同义覆盖。

所建文库使用2.0Fluorometer仪器检测浓度，Agilent2100系统检测文库的大小和纯度，检测结果如图2～5所示，结果显示文库可以进行上机测序。

表2基于HaloPlex平台对候选基因的指定区域进行靶向捕获的设计方案

目标ID	区域	覆盖度	高覆盖度(≥90％)	低覆盖度(<90％)
					ADAMTSL3	29	100.00％	29	0
ADCY2	27	100.00％	27	0
					AMPH	25	99.68％	25	0
APC	19	99.63％	19	0
					AR	11	99.74％	11	0
ARID1A	21	98.66％	20	1
					ARID1B	23	99.55％	23	0
ARID2	24	99.93％	24	0
					ATAD3B	17	91.90％	14	3
ATM	62	98.62％	59	3
					AXIN1	10	100.00％	10	0
AXIN2	11	99.47％	11	0
					BAZ2B	36	98.52％	35	1
BRAF	21	99.39％	20	1
					BRCA2	28	98.02％	27	1
BRD8	33	100.00％	33	0
					BRD9	19	95.41％	18	1
BRE	15	99.62％	15	0
					C18ORF34	25	100.00％	25	0
CACNA1C	54	99.95％	54	0

CACNA2D4	39	99.23％	38	1
					CCNE1	11	100.00％	11	0
CDH8	13	100.00％	13	0
					CDKN2A	5	99.57％	5	0
chr5:1253287-1253843	1	100.00％	1	0
					chr5:1295104-1295162	1	100.00％	1	0
chr5:1295162-1300162	1	99.34％	1	0
					CLIP1	26	99.98％	26	0
COL11A1	69	98.33％	67	2
					COL5A3	67	99.68％	66	1
CPA2	12	100.00％	12	0
					CSMD3	72	99.52％	70	2
CTNNB1	14	99.50％	14	0
					DCAF4L2	1	100.00％	1	0
DISC1	20	98.89％	19	1
					DOCK7	53	99.82％	53	0
DSE	8	100.00％	8	0
					ELMO1	25	100.00％	25	0
EPS15	27	99.47％	27	0
					ERRFI1	3	100.00％	3	0
FAM5C	7	100.00％	7	0
					GJA1	1	77.67％	0	1
GNAS	17	99.28％	16	1
					GPR126	27	98.95％	26	1
GXYLT1	8	95.28％	6	2
					HDAC9	29	99.51％	28	1
HIST1H4B	1	100.00％	1	0
					IGF1R	21	99.87％	21	0
IGSF10	8	99.96％	8	0
					IGSF3	11	98.84％	10	1
IRF2	10	100.00％	10	0
					ITPR2	59	99.95％	59	0
JAK1	24	99.75％	24	0
					KEAP1	5	100.00％	5	0
KRAS	6	100.00％	6	0
					LIPI	11	97.20％	10	1
LRP1B	93	99.67％	92	1

MLL3	62	96.87％	55	7
					MLL4	37	99.90％	37	0
MXRA5	6	98.84％	6	0
					NFE2L2	6	98.54％	5	1
Otop1	6	98.83％	6	0
					PAM	27	100.00％	27	0
PCDH15	45	98.01％	44	1
					PCDHA13	5	98.95％	5	0
PCDHA7	4	88.31％	3	1
					PCMTD1	8	100.00％	8	0
PDZRN4	13	100.00％	13	0
					PEG3	7	99.94％	7	0
PIK3CA	20	98.25％	18	2
					PREX2	49	99.43％	48	1
PROKR2	2	100.00％	2	0
					PTEN	9	98.92％	9	0
RADIL	14	98.83％	14	0
					RNF43	9	99.79％	9	0
ROBO2	32	100.00％	32	0
					ROCK1	33	90.84％	28	5
RPS6KA3	23	100.00％	23	0
					SAMD9L	1	99.50％	1	0
SCN3A	27	98.37％	27	0
					SCN8A	28	99.99％	28	0
SENP5	10	99.76％	10	0
					SLC10A1	5	100.00％	5	0
SMAD4	13	100.00％	13	0
					SOS1	24	99.65％	23	1
SPAG17	48	99.79％	47	1
					SYNJ2	30	99.81％	29	1
TERT	16	100.00％	16	0
					TMEM170A	4	100.00％	4	0
TMEM51	2	100.00％	2	0
					TP53	14	97.53％	13	1
TTLL2	4	100.00％	4	0
					UBR3	43	100.00％	43	0
USP25	26	99.49％	26	0

WWP1	25	99.35％	24	1
					ZIC3	4	100.00％	4	0
ZNF226	9	99.58％	9	0

3.按照cBotUserGuide(Part#15006165，Rev.F，Illumina)所示相应流程，在IllumminaHiSeq2000测序仪配套的cBot系统上完成Cluster(簇)生成和第一向测序引物杂交。按照HiSeq2000UserGuide(Part#15011190_H，Illumina)准备测序试剂，将携有cluster的flowcell(流式细胞)上机(仪器型号：HiSeq2000，Illumina)。选用paired-end程序，进行pairedend2×100ntmultiplex测序。测序过程由Illumina提供的datacollectionsoftware进行控制，并进行实时数据分析。测序质量评估结果请参见表3，每个样品提供测序后平均覆盖度5000倍(见图6)；每向碱基质量大于20(Q20)的比例不小于85％，符合预期值。

表3样本经深度测序后测序质量评估

采用Agilent公司的推出的SureCall软件对测序所得数据进行分析。使用Agilen提供的比对软件(GenAligners_v1.1.0)进行序列比对(mapping)。SNV的结果由SureCall软件处理得到，结果经过了annovar软件注释，分析内容包括：测序结果mapping、单样本SNV分析、单样本SmallInDel分析、样本间SNV差异分析(组)、样本间SmallInDel差异分析(组)。序列比对和捕获富集分析结果见表4。SNV数据分析结果见表5、6。

表4序列比对和捕获富集分析结果

表5第1例肝癌患者癌组织(T1)SNV数据分析结果

表6第2例肝癌患者癌组织(T2)SNV数据分析结果

分析结果显示，在第1例肝癌患者的癌组织T1中检测到有6个基因发生突变，突变频率分别为39.06％(CLIP1)、49.17％(TP53)、18.18％(MLL4)、41.56％(ARID1B)、37.56％(PCMTD1)、60.54％(MXRA5)；在第2例肝癌患者的癌组织T2中检测到有8个基因发生突变，突变频率分别为25.62％(IGSF3)、16.53％(FAM5C)、27.66％(ATM)、61.03％(CLIP1)、35.22％(CACNA2D4)、51.84％(CACNA1C)、CCDC178(95.35％)、83.20％(RADIL)。两患者的癌旁组织(P1、P2)均未检测到基因突变。不同患者之间突变信息的不同可能与患者的病理分级相关联，同一组织的癌组织中检出的亚克隆群体越多，表明患者所处的病理级别越高，反之则越低；含有多个基因突变的克隆群体所占比例越大，表明患者所处病理级别越高，反之越低。

Claims

1.肝癌基因检测试剂盒，其特征在于，包括与94个肝癌关联基因的外显子区域和TERT基因的3个启动子区域相匹配的97个靶向探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌关联基因为突变频率在4％以上、相同基因在3个以上不同群体出现且大小在10kb以下的基因。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌关联基因包括：ADAMTSL3、ADCY2、AMPH、APC、AR、ARID1A、ARID1B、ARID2、ATAD3B、ATM、AXIN1、AXIN2、BAZ2B、BRAF、BRCA2、BRD8、BRD9、BRE、C18ORF34、CACNA1C、CACNA2D4、CCNE1、CDH8、CDKN2A、CLIP1、COL11A1、COL5A3、CPA2、CSMD3、CTNNB1、DCAF4L2、DISC1、DOCK7、DSE、ELM01、EPS15、ERRFI1、FAM5C、GJA1、GNAS、GPR126、GXYLT1、HDAC9、HIST1H4B、IGF1R、IGSF10、IGSF3、IRF2、ITPR2、JAK1、KEAP1、KRAS、LIPI、LRP1B、MLL3、MLL4、MXRA5、NFE2L2、OTOP1、PAM、PCDH15、PCDHA13、PCDHA7、PCMTD1、PDZRN4、PEG3、PIK3CA、PREX2、PROKR2、PTEN、RADIL、RNF43、ROBO2、ROCK1、RPS6KA3、SAMD9L、SCN3A、SCN8A、SENP5、SLC10A1、SMAD4、SOS1、SPAG17、SYNJ2、TERT、TMEM170A、TMEM51、TP53、TTLL2、UBR3、USP25、WWP1、ZIC3、ZNF226。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TERT基因的启动子区域为chr5：1253287-1253843，1295104-1295162，1295162-1300162。

5.权利要求1至4任一项所述试剂盒在肝癌诊断中的应用。

6.肝癌基因检测方法，其特征在于，步骤包括：

3)检测样本文库的浓度、大小和纯度；

4)测序，数据分析，确定发生突变的基因及突变频率。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在与，数据分析包括：测序结果mapping、单样本SNV分析、单样本SmallInDel分析、样本间SNV差异分析、样本间SmallInDel差异分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括步骤5)：对数据分析结果进行二次抽取分析，对该患者的肝癌组织和癌旁组织存在的亚克隆群体进行分类及病理分级。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，分类及病理分级的步骤包括：将每个样本参加测序的基因组总量与100个细胞的预测基因组量A比较，推测100个细胞应有的测序数据量a；从总的测序数据中随机抽取10次a，将该10次抽调出来的数据a做相关性分析，再将最终得到的突变基因突变频率做聚类分析，得出组织中可能存在的克隆群体及其所占比例。