CN107630093A - 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途。所述用于诊断肝癌的试剂包含针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对。本发明联合分析4个基因上的6个包含甲基化胞嘧啶区域作为判断肝癌发病和复发风险的生物标记物准确度远远大于单一生物标记物的检测，降低假阳性的发生。并且，本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好等优点，能及时、精准的检测出肝癌的发病及复发风险，对早期肝癌的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在早期肝癌患者上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。

Description

用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及用于DNA技术领域，特别是指一种使用NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的胞嘧啶甲基化程度联合诊断肝癌、肝癌发病风险、肝癌复发风险的试剂、试剂盒及检测方法与其用途。

背景技术

肝癌是一种严重威胁我国人民群众身体健康和生命安全的肿瘤。在我国，肝癌发病率位居恶性肿瘤的第二位。肝癌恶性程度很高，因为发病之初往往没有症状或症状不明显，加之肿瘤进展迅速，在确诊的时候，约70-80％的患者已经无法接受手术治疗，治疗效果很差，生存期非常短。因此，提高肝癌的治愈率，关键在于早期诊断、早期治疗。目前，国内外专家都认为，对于高危人群的监测和筛查是早期诊断肝癌的最主要的办法。我国肝癌的病因主要包括以下几个方面：(1)肝炎病毒感染；(2)长期酗酒；(3)环境因素：如食物黄曲霉毒素污染、农村饮水蓝绿藻类毒素污染；(4)其他肝脏疾病：如肝脏代谢性疾病、自身免疫性疾病、隐原性肝硬化等等。一般认为，我国的肝癌患者约90％以上均合并有乙型肝炎或丙型肝炎的感染。所以，慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎患者及长期酗酒者均是肝癌的高危人群，还有有肝癌家族史的人，都需要密切的进行监测。

一般而言，监测包含两方面：一方面是抽血化验，主要监测血清甲胎蛋白，甲胎蛋白是肝癌比较特异的肿瘤标志物，其持续升高往往意味着肝癌的发生；另一方面是影像学检查，包括肝脏超声检查、增强CT、增强核磁等检查。我们建议，对于肝癌的高危人群，最好应该每隔半年进行一次检查，首选血清甲胎蛋白检测及腹部超声检查。对于腹部超声发现的大于1厘米的肝脏结节，应该进行增强CT或增强核磁的检查来明确结节的性质，特别要指出的是，最近投入临床使用的一种叫做普美显的核磁增强剂，对于肝脏病变的诊断敏感度有很大的提高，目前在包括日本的一些国家，已经推荐普美显作为筛查肝癌的首选核磁增强剂。通过目前的免疫分析和回声测定检测出早期肝癌(直径小于3cm、直径小于5cm和单一的或高度分化的肿瘤)，并经过适当治疗，则预后相对较好。然而，用于免疫分析的现有的肿瘤标记AFP和PIVKA-II的灵敏度和特异性不够。尤其是对于早期肝癌，这两种标记的灵敏度明显很低。因此，很难检测早期肝癌，当检测到时大部分病例已经发展为晚期癌症，与其它癌症比较，肝癌患者的5年内存活率很低同时，当前在回声测定中仪器的改进使我们能够检测早期肝癌，但因为如下若干问题使其不适合筛选高风险肝癌患者：一次测定耗时30分钟左右、需要专门技能、依赖仪器性能和对普通医院的普及率较低。另外，由于很难检查整个肝，尤其是被其它器官遮住的部分和肝的内部，因此存在漏检肝癌风险。因此，仍没有足够令人满意的现有的用于检测肝癌尤其是早期肝癌的方法。

近年来，随着分子生物学的飞速发展及高通量测序技术的出现，对于表观遗传学的认知和研究也越来越多。多项研究结果表明，癌症细胞或突变的体细胞中特定基因存在高度甲基化的现象。在高等真核细胞中，基因组DNA仅在CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基上被甲基化，富含CpG的区域称为“CpG岛”，已知其在完整的人类基因组的大约一半上存在。通常CpG岛存在于启动子区，在这种情况下甲基化与基因表达调控密切相关。简言之，在未甲基化情况下，基因可正常表达，但在甲基化情况下，通过某些调控系统的过程基因表达相反受到抑制。已知这种通过甲基化的基因表达调控对组织、发育、分化、疾病、性别或年龄具有特异性。特别地，由于在癌细胞或转化细胞中经常观察到受CpG岛上的异常的高度甲基化阻抑的基因表达，因此认为其与癌症发生有关。

肿瘤细胞的生长离不开血液循环的营养输送，同时，肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环系统，游离地存在于血液当中，这就是ctDNA。虽然这些DNA是断裂的，不完整的，但它来自于肿瘤细胞，如果肿瘤细胞携带某种基因突变和甲基化修饰，这些突变和甲基化的修饰程度也能在ctDNA中反映出来。通过检测ctDNA的基因突变和甲基化修饰程度，就可以揭秘体内肿瘤组织的突变信息，从而为肿瘤的精准靶向治疗和药效检测提供依据。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种用于诊断肝癌的试剂及其试剂盒，以克服现有技术中的不足。

本发明的第二目的还在于提供一种利用该试剂诊断肝癌、肝癌复发风险的检测方法及用途。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对在制备用于检测肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的产品中的用途。

在一些较为具体的实施方案中，所述用途包括：针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对在制备用于检测NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法中的试剂盒中的用途。

本发明实施例还提供了一种用于诊断肝癌的试剂，其包含针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对，其中，针对NEBL基因的引物对包括LM1-F1和LM1-R1，针对FAM55C基因的引物对包括LM2-R1和LM2-F2，针对GALNT3基因的引物对包括LM3-F2和LM3-R2-1，针对DSE基因的引物对包括F3和R3。

本发明实施例还提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，其包括前述的用于诊断肝癌的试剂。

本发明实施例还提供了前述的用于诊断肝癌的试剂或试剂盒在制备检测肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法的产品中的用途，所述的方法包括：

(1)提供来源于受试者的DNA样品的基因组DNA；

(2)使用于化学处理或酶处理的试剂接触所述基因组DNA，以区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶；

(3)用PCR方法扩增所述基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域；

(4)测定来源于受试者的基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量，以获得测定值；

将所述的测定值与参考值比较，从而判断受试者以下情况的指征：罹患肝癌；肝癌风险增加；具有肝癌复发风险。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

1)本发明使用NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的胞嘧啶甲基化程度和定量联合诊断肝癌、肝癌发病风险、肝癌复发风险，从而判断临床样本的肝癌发病风险。本发明选取的4个基因的6个包含甲基化胞嘧啶的区域均来自于第二代高深度测序的结果并结合临床信息综合分析评分所得，联合分析4个基因上的6个包含甲基化胞嘧啶区域作为判断肝癌发病风险和复发风险的生物标记物准确度远远大于单一生物标记物的检测，降低假阳性的发生。

2)本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点，能及时、精准的检测出肝癌的发病风险及复发风险，对早期肝癌的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在早期肝癌患者上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。

附图说明

图1是本发明一实施例中检出率验证时使用PeakScanner分析软件对Sanger测序产生的文件进行分析获得的峰图。

图2是本发明一实施例中临床样本检测时使用PeakScanner分析软件对Sanger测序产生的文件进行分析获得的峰图。

图3是本发明一实施例中50例样品风险检测结果统计图。

具体实施方式

下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明实施例的一个方面提供了针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对在制备用于检测肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的产品中的用途。

在一些较为具体的实施方案中，所述用途包括：针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对在制备用于检测NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法中的试剂盒中的用途。

在一些较为具体的实施方案中，PCR引物对中一对引物的核苷酸序列不包含与基因组DNA中所述核苷酸序列再包含可发生甲基化修饰的胞嘧啶残疾区域互补，并且当所述胞嘧啶发生甲基化修饰时包含在引物对所产生的扩增产物的内部。

进一步的，PCR引物对与不含可发生甲基化修饰的胞嘧啶基因组DNA核苷酸序列至少在其3′-端处特异性杂交，并通过一代测序序列分析来对甲基化胞嘧啶的存在量进行测定。

本发明实施例的另一个方面提供了一种用于诊断肝癌的试剂，其包含针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对，其中，针对NEBL基因的引物对包括LM1-F1和LM1-R1，针对FAM55C基因的引物对包括LM2-R1和LM2-F2，针对GALNT3基因的引物对包括LM3-F2和LM3-R2-1，针对DSE基因的引物对包括F3和R3。

在一些较为具体的实施方案中，针对NEBL基因的引物对LM1-F1和LM1-R1的序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，针对FAM55C基因的引物对LM2-R1和LM2-F2的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，针对GALNT3基因的引物对LM3-F2和LM3-R2-1的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，针对DSE基因的引物对F3和R3的序列分别如SEQID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，其包括前述的用于诊断肝癌的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液和超纯水。

本发明实施例还提供了前述的用于诊断肝癌的试剂或试剂盒在制备检测肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法的产品中的用途，所述的方法包括：

(1)提供来源于受试者的DNA样品的基因组DNA；

(2)使用于化学处理或酶处理的试剂接触所述基因组DNA，以区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶；

(3)用PCR方法扩增所述基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域；

(4)测定来源于受试者的基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量，以获得测定值；

将所述的测定值与参考值比较，从而判断受试者以下情况的指征：罹患肝癌；肝癌风险增加；具有肝癌复发风险。

作为本发明的一更为优选的实施案例，所述方法包括以下步骤：

(1)从临床样本中提取并纯化基因组DNA；

(2)使用化学处理或者酶处理所述基因组DNA，以区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶；

(3)通过PCR扩增所述基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因内含有甲基化胞嘧啶的区域；

(4)测定来自所述基因组DNA中的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中含CpG序列的区域中肝癌特异性甲基化胞嘧啶的含量。

其中所述临床样本中的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中肝癌特异性甲基化胞嘧啶的含量是所述临床样本的以下判断指征：罹患肝癌；肝癌风险增加；存在肝癌复发风险。

在一些较为具体的实施方案中，步骤(2)中使用化学处理或者酶处理基因组DNA，以区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶，所使用的化学处理或者酶处理需使99％以上的非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶。

更优选的，使用化学处理或者酶处理基因组DNA，以区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶，所使用的化学处理方法指的是所有含有亚硫酸氢盐的转化试剂盒都适用。

进一步的，所述DNA样品包括来源于人类的血清、血浆、全血、组织(包含石蜡包埋组织)、血液细胞、排泄物、内分泌物、外分泌物中的任意一种。

进一步优选的样本是组织包含石蜡包埋和全血。

更适宜的是，所述肝癌是指早期肝癌或I-III期肝癌。

更适宜的是，测定来源于受试者的基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量所采用的测定方法是指一代测序法。

藉由上述技术方案，本发明使用NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的胞嘧啶甲基化程度和定量联合诊断肝癌、肝癌发病风险、肝癌复发风险，从而判断临床样本的肝癌发病风险。本发明选取的4个基因的6个包含甲基化胞嘧啶的区域均来自于第二代高深度测序的结果并结合临床信息综合分析评分所得，联合分析4个基因上的6个包含甲基化胞嘧啶区域作为判断肝癌发病和复发风险的生物标记物准确度远远大于单一生物标记物的检测，降低假阳性的发生。并且，本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好等优点，能及时、精准的检测出肝癌的发病及复发风险，对早期肝癌的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在早期肝癌患者上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。

本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不祈祷限制性作用。

在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：

采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。

在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。

以下结合若干实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。

实施例1

1.NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的肝癌特异性胞嘧啶甲基化区域筛选

筛选方法如下：

(a)下载TCGA肝细胞癌的甲基化芯片数据，包括375个肝癌组织和50个癌旁的甲基化谱。下载TCGA肝细胞癌的RNA测序数据，包括369个肝癌组织和50个癌旁的基因表达谱。从GEO下载甲基化芯片数据GSE69270，包括184个非肿瘤病人的血的甲基化谱。从TCGA下载其它类型肿瘤(BLAC,BRCA,COAD,GBM,HNSC,KIRC,LUAD,LUSC,READ and UCEC)的甲基化芯片数据。

(b)分析50对癌-癌旁配对的甲基化谱，用配对检验比较每个位点在癌和癌旁中的甲基化水平，用多重检验的方法把P值换算成FDR值。满足癌和癌旁的甲基化差异大于阈值的位点，被认为是差异甲基化位点。

(c)分析41对癌-癌旁配对的基因表达谱，计算每个基因的P值，然后多重检验的方法把P值换算成FDR值。满足癌和癌旁的甲基化差异大于阈值的位点，被认为是差异甲基化位点。

(d)根据(b)和(c)的结果，选择在肿瘤中显著低表达且其启动子甲基化显著增高的基因，得到候选基因和甲基化位点(集合1)。

(e)进一步筛选(d)中得到的候选甲基化位点(集合1)。比较375个肝癌和50个癌旁，保留在375个肿瘤中高甲基化的位点。利用GSE69270中血的甲基化数据，保留在血中低甲基化的位点。通过以上筛选得到甲基化位点(集合2)。

(f)分析(e)得到的甲基化位点(集合2)在其它10种肿瘤中的甲基化水平，仅保留在10种肿瘤中都低甲基化的位点。这样得到4个基因(NEBL、FAM55C、GALNT3、DSE)上的6个位点，作为肝癌特异性胞嘧啶甲基化位点。

2.NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的肝癌特异性胞嘧啶甲基化区域作为肝癌标志物的特异性验证

特异性验证方法如下：

在TCGA的肝细胞癌(LIHC)和其它10种癌症中，6个位点的甲基化水平如下表。甲基化水平是由beta值定义，其中M是甲基化等位基因信号值，U是非甲基化等位基因信号值。

表1 6个甲基化位点在各种不同类型的癌症样本中的甲基化平均值

表2 6个甲基化位点在各种不同类型的癌旁样本中的甲基化平均值

从表1和表2中可以看到，6个甲基化位点在肝癌LIHC样本中存在高甲基化状态，而在癌旁样本中处于低甲基化状态，在其他癌症样本中均处于低甲基化状态。

3.NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的肝癌特异性胞嘧啶甲基化区域作为肝癌标志物的检出率预测

检出率预测方法如下：

(a)从GEO数据库下载甲基化芯片数据GSE54503和GSE89852。GSE54503包括66对肝癌癌和癌旁配对的甲基化数据；GSE89852包括37对肝癌癌和癌旁配对的甲基化数据。

(b)使用6个肝癌特异性甲基化位点的TCGA数据，建立模型LM。将此模型用于2套独立的肝癌数据集GSE54503和GSE89852上，根据LM模型的值判断样本是肝癌还是正常。

(c)根据(b)的结果，总结模型预测肝癌的能力。灵敏性表示真实的肝癌样本被预测为肝癌的比例。特异性表示真实的正常(肝癌癌旁)样本被预测为正常的比例。AUC是ROC曲线下的面积，AUC的取值范围一般在0.5和1之间，AUC值越大表示模型的分类效果越好。

表36个甲基化位点构建的logist回归模型在独立数据集上对肝癌的检出率

	灵敏性	特异性	AUC
				GSE54503	0.909	0.970	0.972
GSE89852	0.919	0.973	0.945

4.NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的肝癌特异性胞嘧啶甲基化区域作为肝癌标志物的检出率验证

检出率验证方法如下：

(1)本验证实验通过伦理委员会认可，样本使用志愿者肝癌病人样本分别采集5个病人的共5对冰冻癌症组织样本和癌旁组织样本，冰冻组织可长期保存在液氮中；

(2)按照Qiagen DNA Mini Kit试剂盒的操作说明，提取组织中的DNA，并使用Qubit和Nanodrop并对其进行浓度和纯度的测定；

(3)取上述提取所得DNA 500ng，使用Zymo GoldDNA MethylationKit对DNA进行重亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的C碱基转化为U碱基。

(4)取转化后的DNA 5ng，进行第一轮PCR扩增，扩增反应配置如下：

(5)设置PCR程序如下：

(6)将PCR产物使用羧基磁珠进行纯化，纯化后，进行第二轮PCR扩增，扩增反应配置如下：

(7)设置PCR程序如下：

(8)将PCR产物混合6×电泳上样缓冲液，并进行3％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压90V，电泳时间1.5小时。

(9)使用QiaQuickMinElute Gel ExactionKit对扩增产物进行切胶回收。

(10)取200ng回收产物置于ABI3700上进行Sanger测序。

(11)对Sanger测序产生的后缀名为“ab”的文件进行分析，分析软件使用PeakScanner，峰图示例见图1。

(12)使用PeakScanner分别读取6个甲基化位点的C碱基峰值记为HCx(X根据甲基化位点1-6进行命名)，T碱基峰值记为HTx(X根据甲基化位点1-6进行命名)。

(13)计算每个位点的甲基化效率Sx(X根据甲基化位点1-6进行命名)，

Sx＝HCx/(HCx+HTx)

(14)将6个Sx的值导入自开发软件《预测肝癌发病、复发、术后辅助诊断软件v1.0》，计算肝癌的风险值P，按照下表给出诊断意见。

表4：

PValue	诊断意见
		P<0.3	无风险
0.3≤P≤0.5	存在风险，需随时观察
		P>0.5	高风险

(15)5对样本的检测结果进行统计，结果见下表。

备注：Sample ID中数字编号表述样本编号，字母T代表癌症(Tumor)字母N代表癌旁(Normal)。

由上表可以开到，5个临床诊断为癌症样本(Tumor)均诊断为高风险样本或存在风险样本，5个临床诊断为正常样本(Normal)均诊断为无风险样本。

阳性检出率接近100％，若按照存在风险50％得分来计算，阳性检出率80％。

假阳性率为0％，阴性检出率100％。

5.NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的肝癌特异性胞嘧啶甲基化区域作为肝癌标志物用于临床样本检测

检测方法如下：

(1)本验证实验通过伦理委员会认可，样本来源为志愿者50人，其中10人经临床诊断为肝癌患者，检测方式采用盲检，样本采集使用EDTA抗凝管采集血液10mL，4℃冰箱保存，48小时内通过离心分离血浆～5mL，若不立即使用，可长期保存在液氮中；

(2)按照Qiagen Circulation DNA Extraction Kit试剂盒的操作说明，提取血浆中的DNA，并使用Qubit和Nanodrop并对其进行浓度和纯度的测定；

(3)取上述提取所得DNA 20ng，使用Zymo Gold DNA Methylation Kit对DNA进行重亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的C碱基转化为U碱基。

(4)取转化后的DNA 5ng，进行第一轮PCR扩增，扩增反应配置如下：

(5)设置PCR程序如下：

(6)将PCR产物使用羧基磁珠进行纯化，纯化后，进行第二轮PCR扩增，扩增反应配置如下：

(7)设置PCR程序如下：

(8)将PCR产物混合6×电泳上样缓冲液，并进行3％琼脂糖凝胶电泳，电泳电压90V，电泳时间1.5小时。

(9)使用QiaQuickMinElute Gel ExactionKit对扩增产物进行切胶回收。

(10)取200ng回收产物置于ABI3700上进行Sanger测序。

(11)对Sanger测序产生的后缀名为“ab”的文件进行分析，分析软件使用PeakScanner，峰图示例见图2。

(12)使用PeakScanner分别读取6个甲基化位点的C碱基峰值记为HCx(X根据甲基化位点1-6进行命名)，T碱基峰值记为HTx(X根据甲基化位点1-6进行命名)。

(13)计算每个位点的甲基化效率Sx(X根据甲基化位点1-6进行命名)，

Sx＝HCx/(HCx+HTx)

(14)将6个Sx的值导入自开发软件《预测肝癌发病、复发、术后辅助诊断软件v1.0》，计算肝癌的风险值P，按照下表给出诊断意见。

表5：

(15)诊断结果统计参见图3。

从以上实施例和附图可以明显看到，本发明提供的一种使用NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的胞嘧啶甲基化程度联合诊断肝癌、肝癌复发风险的检测方法可以有效、准确的将对肝癌患者或受试人群进行肝癌风险的预测及复发风险的预测，在步骤1中本发明通过大数据信息分析及统计方法找寻了6个肝癌特异的甲基化位点，并通过适用TCGA先用数据和BSP法验证了6个肝癌特异甲基化位点的特异性和检出能力；在此基础上本发明采用了甲基化PCR扩增结合一代测序的方法对6个肝癌特异甲基化位点的阳性检出率、假阳性率及阴性检测率进行了复检，在检测了5对临床样本中，阳性检出率高达100％，若按照检出风险计算50％得分来看，检出率也达到80％以上，同时假阳性率和阴性检出率分别达到了0％和100％；最后本案发明人实际盲检50例志愿者静脉血样本，检出37例样本无肝癌发病风险，5例存在风险样本，8例高风险样本，与临床诊断结果完全吻合。本发明通过检测样本中的甲基化位点变化，并通过机器学习分析计算风险值的方法对受试人群的多种来源样本进行肝癌风险检测，较现有的影像学、临床指征用于肝癌的早期诊断有着高灵敏、快速、操作简单、稳定性好等优势，较现有使用的探针池捕获DNA片段结合二代测序法进行肝癌风险预测有着检出率高、成本低廉的优势。

综上所述，藉由上述技术方案，本发明联合分析4个基因上的6个包含甲基化胞嘧啶区域作为判断肝癌发病和复发风险的生物标记物准确度远远大于单一生物标记物的检测，降低假阳性的发生。并且，本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好等优点，能及时、精准的检测出肝癌的发病及复发风险，对早期肝癌的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在早期肝癌患者上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州贝斯派生物科技有限公司

<120> 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ggtggggaga gtgtttaaat t 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

taaaaaactt ttcccaaatc tttac 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

cccaaaactc caattctacc tatac 25

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ataggaaaga ttgttttatt agagttaatt 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

ttatttggag ttttttaggt gagttttag 29

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

caaaattcct ccaatataaa taaacc 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

gggtattttt attttaggtt gattga 26

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

tcaccaaaac caaaaaaaac 20

Claims (10)

1.针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对在制备用于检测肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于包括：针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对在制备用于检测NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法中的试剂盒中的用途。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：PCR引物对中一对引物的核苷酸序列不包含与基因组DNA中所述核苷酸序列再包含可发生甲基化修饰的胞嘧啶残疾区域互补，并且当所述胞嘧啶发生甲基化修饰时包含在引物对所产生的扩增产物的内部。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：PCR引物对与不含可发生甲基化修饰的胞嘧啶基因组DNA核苷酸序列至少在其3′-端处特异性杂交，并通过一代测序序列分析来对甲基化胞嘧啶的存在量进行测定。

5.一种用于诊断肝癌的试剂，其特征在于包含针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对，其中，针对NEBL基因的引物对包括LM1-F1和LM1-R1，针对FAM55C基因的引物对包括LM2-R1和LM2-F2，针对GALNT3基因的引物对包括LM3-F2和LM3-R2-1，针对DSE基因的引物对包括F3和R3。

6.根据权利要求5所述的用于诊断肝癌的试剂，其特征在于：针对NEBL基因的引物对LM1-F1和LM1-R1的序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，针对FAM55C基因的引物对LM2-R1和LM2-F2的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，针对GALNT3基因的引物对LM3-F2和LM3-R2-1的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，针对DSE基因的引物对F3和R3的序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

7.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于包括权利要求5-6中任一项所述的用于诊断肝癌的试剂；优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液和超纯水。

8.权利要求5-6中任一项所述的用于诊断肝癌的试剂或权利要求7所述的用于诊断肝癌的试剂盒在制备检测肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量的方法的产品中的用途，所述的方法包括：

(1)提供来源于受试者的DNA样品的基因组DNA；

(2)使用于化学处理或酶处理的试剂接触所述基因组DNA，以区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶；

(3)用PCR方法扩增所述基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域；

(4)测定来源于受试者的基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量，以获得测定值；

将所述的测定值与参考值比较，从而判断受试者以下情况的指征：罹患肝癌；肝癌风险增加；具有肝癌复发风险。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：步骤(2)中所述用于化学处理或酶处理的试剂能够使99％以上的非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶；优选的，所述用于化学处理或酶处理的试剂包括含有亚硫酸氢盐的转化试剂盒。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述DNA样品包括来源于人类的血清、血浆、全血、组织、血液细胞、排泄物、内分泌物、外分泌物中的任意一种；优选的，所述DNA样品为石蜡包埋和全血的组织；

和/或，所述肝癌为早期肝癌或I-III期肝癌；

和/或，测定来源于受试者的基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因和DSE基因中至少两个基因中含CpG序列的区域中的肝癌特异性甲基化胞嘧啶的存在情况和/或量所采用的方法为一代测序法。