CN108866191A

CN108866191A - 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep2

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Publication number: CN108866191A
Application number: CN201810830855.5A
Authority: CN
Inventors: 李振艳
Original assignee: Shanghai Yipu Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yipu Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: CN108866191B; US20210292850A1; JP7258139B2; EP3828273A4; WO2020020072A1; EP3828273A1; JP2021531046A

Abstract

本发明提供了一种甲基化肿瘤标志物STAMP‑EP2及其应用，属于分子生物学领域。本发明提供了甲基化肿瘤标志物STAMP‑EP2在制备肿瘤诊断试剂中的应用。本发明所述肿瘤标志物STAMP‑EP2，在所有肿瘤类型中均高甲基化，对应的正常组织中均低甲基化，具有非常高的敏感性与特异性，检测所述STAMP‑EP2的引物可用于制备肿瘤诊断试剂盒。

Description

基于甲基化修饰的肿瘤标记物STAMP-EP2

技术领域

本发明属于疾病诊断标记物领域，更具体地，本发明涉及基于甲基化修饰的肿瘤标记物STAMP(Specific Tumor Aligned Methylation of Pan-cancer)。

背景技术

肿瘤的发生发展是一个复杂的、多层面多因素的、动态的过程，包含了外界环境、遗传学变异以及表观遗传学变异等多种因素错综复杂的相互作用。外界环境因素包括物理化学生物等致癌因素以及不健康的生活习惯等，遗传学变异包括基因突变、拷贝数变化、染色体错位等，表观遗传学变异主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等因素。在肿瘤的发生发展过程中，环境因素、遗传学因素以及表观遗传学因素相辅相成，共同作用，导致一系列抑癌基因的失活以及原癌基因的激活，进而导致肿瘤。在肿瘤的发展过程中，虽然三种因素皆贯穿其中，互相作用。但是在肿瘤的发生及早期，三种因素的作用重点是有先后顺序的，目前来说，肿瘤问题对于人类来讲还面临诸多挑战，尽管近年来新的手术方法以及靶向治疗、免疫治疗等方面取得了一些喜人的进展，但是人们对肿瘤的认识还存在许多误区，肿瘤的转移、复发、异质性、耐药性等等重大问题都急需解决。

人体的肿瘤有很多种，人体的大部分组织都有肿瘤的发生，而不同类型的肿瘤又分为众多的亚型，尤其是近年来获益于肿瘤分子生物学领域的发展，肿瘤的分类更加细化。对于不同类型、不同分期或不同分子亚型的肿瘤，其治疗方案也截然不同。

随着人们对肿瘤认识的加深以及科学技术的进步，许多新型的肿瘤标记物被发现并用于临床诊断。1980年之前，肿瘤标记物主要是一些激素、酶类、蛋白质等细胞分泌物，例如癌胚抗原(CEA)、甲胎抗原(AFP)等可以作为肝癌胃癌等多种肿瘤的标记物，糖类抗原125(CA125)可以作为宫颈癌的标记物，前列腺特异性抗原(PSA)可作为前列腺癌标记物，目前这一类肿瘤标记物虽然临床仍在用，但其敏感性与准确性已难以满足临床需求。

液体活检技术是以血中循环肿瘤细胞或循环肿瘤DNA为检测靶标对肿瘤进行诊断和预测的技术。该技术目前还处于起步阶段，存在诸多不足：首先，敏感性与特异性不够高，肿瘤本身有很大的异质性，包含多种亚型的细胞群，而临床样本尤其是血液样本，肿瘤DNA所占比例非常小，现有的肿瘤标记物难以满足临床要求的敏感性，在临床容易造成误诊；其次，一种标记物只针对一种或少数几种肿瘤有较好效果，而血液中的DNA来源非常复杂，因此现有的肿瘤标记物无法应对复杂的肿瘤来源、转移等问题。由于这些复杂情况的存在，使得很多DNA甲基化肿瘤标记物在应用于临床时难以有统一的使用标准，严重影响标记物的敏感度以及准确性。人体的肿瘤有很多种，不同的肿瘤既有特性又有共性，如果能找到一种不同肿瘤共同的标记物，对于肿瘤的筛查、诊断、治疗以及疗效判定等等方面意义重大。

因此，肿瘤诊断领域亟待开发具有普适性的，易于判断且准确性高的新型肿瘤标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供以DNA甲基化修饰作为肿瘤标记物，利用肿瘤中特异性位点异常高甲基化现象来检测肿瘤的方法。

在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸，包括：(a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸；(c)上述(a)～(b)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的CpG位点(如2～45个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40个)；(d)与上述(a)～(c)的多核苷酸或片段互补的核酸(如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸)。

在一个优选例中，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰。

在本发明的第二方面，提供分离的多核苷酸，其由所述的多核苷酸转变而来，对应于前述第一方面的序列，其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变，非修饰的胞嘧啶转为T或U。

在一个优选例中，其由对应于前述第一方面的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。在另一优选例中，所述的多核苷酸包括：(e)SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；(f)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的多核苷酸；(g)上述(e)～(f)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的CpG位点(如2～45个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40个)。

在本发明的第三方面，提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸的用途，用于制备肿瘤的检测试剂或试剂盒。

在一个优选例中，所述肿瘤包括(但不限于)：血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

在另一优选例中，所述肿瘤的样本包括：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

在本发明的第四方面，提供一种制备肿瘤检测试剂的方法，所述方法包括：提供前述第一方面或第二方面所述的多核苷酸，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少1个(如2～45个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40个)修饰的CpG位点；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：引物，探针。

在本发明的第五方面，提供试剂或组合的试剂，其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面或第二方面任一所述的多核苷酸的全长或片段，其中存在至少1个(如2～45个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40个)修饰的CpG位点。

在一个优选例中，所述的试剂或组合的试剂针对包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而设计)，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括：引物，探针。

在另一优选例中，所述的引物为：SEQ ID NO:5和6所示的引物。

在本发明的第六方面，提供本发明的第五方面所述的试剂或组合的试剂的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒；较佳地，所述的肿瘤包括(但不限于)：消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

在本发明的第七方面，提供一种检测试剂盒，其包括：容器，以及位于容器中的前面所述的试剂或试剂组合；较佳地，每一种试剂位于一个独立的容器中。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，DNA纯化试剂，DNA提取试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书(标明检测操作步骤和结果判定标准)。

在本发明的第八方面，提供一种体外检测样品的甲基化谱式的方法，包括：(i)提供样品，提取核酸；(ii)检测(i)的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面所述的多核苷酸或由其转变而来的前述第二方面所述的多核苷酸。

在一个优选例中，步骤(3)中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合以及SEQ ID NO.1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。并且，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。

在另一优选例中，步骤(ii)包括：(1)对(i)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的CpG位点的修饰情况。

在另一优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该多核苷酸CpG中的C发生高度甲基化。

在另一优选例中，所述的甲基化谱式的方法不以直接获得疾病的诊断结果为目的，或不是诊断性的方法。

在本发明的第九方面，提供一种肿瘤诊断试剂盒，包括利用本发明的第一方面或第二方面所示序列设计的引物对以及包含该序列的基因Panel或基因群组，通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、临床获取20对癌旁-肺癌样本，癌旁样本作为肺癌对照组，肺癌样本作为肺癌实验组，比较对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图2、临床获取10例结直肠癌癌旁样本作为对照组，30例结直肠癌样本作为实验组，比较结直肠癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图3、临床获取10例正常胃(或胃炎)样本作为对照组，10例胃癌手术切沿样本作为实验组1，获取20例胃癌样本作为实验组2，比较三组样本中STAMP-EP2甲基化值。

图4、临床获取10例结直肠癌癌旁样本作为对照组，30例结直肠癌样本作为实验组，比较对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图5、临床获取10例正常胃(或胃炎)样本作为对照组，10例胃癌手术切沿样本作为实验组1，20例胃癌样本作为实验组2，比较对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图6、临床获取20对癌旁-乳腺癌样本，癌旁样本作为乳腺癌对照组，乳腺癌样本作为乳腺癌实验组，比较对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图7、临床获取18对癌旁-胰腺癌样本，癌旁样本作为胰腺癌对照组，胰腺癌样本作为胰腺癌实验组，比较对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图8、临床获取11对癌旁-头颈部癌样本，包括5例喉癌、2例扁桃体癌、2例会厌癌、1例舌根癌、1例下咽癌，癌旁样本作为对照，癌组织作为实验组，比较头颈部癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值。

图9、临床获取10例非癌患者胆汁样本，10例胆囊癌患者胆汁样本，非癌样本作为胆囊癌对照组，胆囊癌样本作为胆囊癌实验组，比较对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图10、临床获取10例非白血病骨髓涂片样本作为对照组，20例白血病骨髓涂片样本作为实验组，比较白血病对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图11、临床获取8例肾癌癌旁对照样本作为对照组，14例肾癌样本作为实验组，比较肾癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值(左图)及检测特异性和敏感性(右图)。

图12、临床获取5例膀胱癌癌旁样本与非癌尿液样本作为对照组，获取7例膀胱癌组织样本与膀胱癌尿液样本作为实验组，比较膀胱癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值。

图13、采集20例正常人血浆作为对照组，以及不同肿瘤类型患者血浆样本包括10例肝癌血浆样本、10例胰腺癌血浆样本、10例肺癌血浆样本、10例结直肠癌血浆样本、10例乳腺癌血浆样本，比较各组的STAMP-EP2甲基化值。

图14、CpG位点在肿瘤细胞系与非肿瘤细胞系的甲基化差异。

具体实施方式

本发明人致力于肿瘤标志物的研究，经过广泛的研究筛选，提供一种通用型的DNA甲基化肿瘤标志物STAMP(Specific Tumor Aligned Methylation of Pan-cancer)，在正常的组织中STAMP处于低甲基化状态，在肿瘤组织中STAMP呈高甲基化状态，可用于临床肿瘤的检测，以及用于作为设计肿瘤诊断试剂的基础。

术语

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“样本”或“样品”包括从任何个体或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。

如本文所用，“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中CpG存在高度甲基化、羟甲基化、醛甲基化或羧甲基化修饰。例如，以甲基化特异PCR(MSP)分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的PCR反应可获得阳性的PCR结果即可认为该受试的DNA(基因)区处于高甲基化状态。例如，以实时定量甲基化特异性PCR而言，高甲基化状态的判定可根据其对照样品的甲基化状态的相对值分析统计学差异。

如本文所用，所述的肿瘤包括但不限于：血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

基因标志物

为了寻找对于诊断肿瘤有用的靶标，本发明人经过了广泛而深入的研究，确定了STAMP-EP2这一靶标。STAMP-EP2基因序列区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，只要检测到其中一个上述基因的启动子区域发生异常的甲基化状态(高度甲基化)，即可判定该受检者为肿瘤高危人员。并且，STAMP-EP2呈现的这种在在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存的显著差异广谱地存在于各种种类的肿瘤中，包括实体瘤以及非实体瘤。

因此，本发明提供了分离的多核苷酸，所述的多核苷酸来自于人基因组，具有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5(为SEQ ID NO:1的反向互补序列)或SEQ ID NO:6(为SEQ ID NO:2的反向互补序列)所示的核苷酸序列，在肿瘤患者的肿瘤细胞内，该多核苷酸序列中，多处5’-CpG-3’的碱基C位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。本发明也包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个(如2～45个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40个)甲基化CpG位点。上述的多核苷酸或片段也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。

在本发明的一些具体实施例中，所述的多核苷酸的片段例如是：包含SEQ ID NO:1中第247～305位碱基的片段(包含SEQ ID NO：1中17～27号CpG位点)；包含SEQ ID NO:2中第249～307位碱基的片段(含有SEQ ID NO：2中18～28号CpG位点)。上述片段的反义链也是可用的。并且，这些片段是本发明的较佳实施方式的举例，根据本发明提供的信息，也可以选择其它的片段。

此外，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示核苷酸序列或序列片段的基因Panel或基因群组也被包含在本发明中。针对所述的基因Panel或基因群组，也可以通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。

上述的多核苷酸可以作为基因组中人们分析甲基化状态的关键区域，通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态。任何可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明中。

上述的多核苷酸在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。

因此，本发明还提供了上述多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸，包括：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。

本发明也包含上述多核苷酸或其反义链经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个甲基化CpG位点。

检测试剂及试剂盒

基于本发明的新发现，还提供了基于所述的多核苷酸序列设计的检测试剂，用于体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式。本领域已知的确定基因组的序列及甲基化状态的检测方法和试剂均可被应用于本发明中。

因此，本发明提供了一种制备肿瘤检测试剂的方法，包括：提供所述的多核苷酸，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少1个甲基化CpG位点。

本发明所述的检测试剂包括但不限于：引物，探针，等等。

所述的试剂例如是引物对，在得知了多核苷酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中TpG互补为针对原为去甲基化的基因区)。应理解，根据本发明的新发现，针对所述靶序列上的不同位置的CpG位点或其组合，本领域技术人员可以设计出多种引物或探针或其它类型的检测试剂，这些均应被包含在本发明的技术方案中。

所述的试剂也可以是试剂组合(引物组合)，包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条多核苷酸。

本发明还提供了体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等所需的各种试剂。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。

检测方法

测定多核苷酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)或实时定量甲基化特异性PCR，Methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。

检测甲基化水平时也可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法。这种方法是基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。

其他可用的技术还有：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、qPCR法、二代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或HPLC法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。应理解，在本发明的新揭示的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中。

作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的PCR扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理多核苷酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的多核苷酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中多核苷酸的甲基化谱式，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。

本发明所述的方法包括：包括：(a)提供样品，提取基因组DNA；(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在甲基化谱式异常。

本发明的方法可用于：(i)对受试者样品进行检测，分析受试者是否患有肿瘤；(ii)区分肿瘤高危人群。所述的方法也可以是不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形。

在本发明的优选实施例中，通过PCR扩增及焦磷酸测序法检测DNA甲基化，本领域人员应理解，实际应用中并不限于该方法，其它DNA甲基化检测方法亦可。在进行PCR扩增中，所应用的引物也不限于是实施例中所提供的。

由于基因组DNA经过重亚硫酸盐处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，在后续的PCR过程中又转换为胸腺嘧啶，会降低基因组的序列复杂度，使得PCR扩增出特异目标片段的难度增大。因此优选地可采用巢式PCR扩增，设计外围与内围两对引物，进行两轮PCR扩增反应，以第一轮的扩增产物作为第二轮扩增的模板，可以有效提高扩增的效率与特异性。然而应理解，本发明中可用的检测方法并不限于此。

经过针对临床样本的研究验证，本发明的方法用于诊断临床肿瘤时，准确性非常高。本发明可应用于肿瘤辅助诊断、疗效判定、预后监测等等领域，具有很高的临床应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、针对STAMP-EP2检测的核酸序列

提供STAMP-EP2肿瘤标记物的序列，如下SEQ ID NO:1(chr5:140797163～140797701(hg19/Human))所示，其中下划线标示碱基为甲基化CpG位点，下划线下面的数字表示该位点的编号。

上述序列经重亚硫酸盐处理后序列(其中Y代表C或U)如下SEQ ID NO:3：

提供STAMP-EP2肿瘤标记物的序列，如下SEQ ID NO:2(chr5:140787504～140788044(hg19/Human))所示，其中下划线标示碱基为甲基化CpG位点，下划线下面的数字表该该位点的编号；

上述序列经重亚硫酸盐处理后序列(其中Y代表C或U)如下SEQ ID NO:4：

上述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的反向互补序列如下SEQ ID NO:5：

CGGTCTATTCGGTCCTTCACAAGTAAGTCCCCGCTCTGCGCGTCTACGCTGAAGTGCAGCTTCTCCGCGCTCACTCGCAGCTCGCGAGCCGACACATCCAGGACACTAAGCCCTAGATCCTTAGCGAGGTTCCCCACCACCGAGCCCTTGGCCAGCTCCTCCGGAATCGAGTAGCGGATCGGCTCACACAGCGTGGGGTAGAACAAAGGCAGCAGCAAAGGAAATAGTACCTGCCGCGGGCCGGCCCGGCGCCTCTGCGCGCAGCTCCCTCCCATCGTTCGCTCGGGTTCTCGCTGGGTCCCCGCTTTTCCAGTTGGAGAAAGTGCACTCTACCGCGCTAAAAGAGCATTCGGCCCAGGACAGGAGGAGTCCCGGGTCTCGGAGCTGGCAATCTGGTGTGCTGGGCAAGGTCTGCGCAGCCGGGAGCCTCTGTGTGGGAGCTGGTTTTCTTTTCTGTTGTTGGCTGCGCAGGGAATCCCAGGCTAGAGGCTGAGGGATCCCCGGCGTCAGCGCTTGCTCTGCACTGGCCGACGGCGGCG

上述SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的反向互补序列如下SEQ ID NO:6：

CGGTCTATTCGGTTCTTCACAAGTAAGTCCCCGCTCTCCGCGTCTACGCTGAAGTGCAGCTTCTCCGCGCTCACTCGCAGCTTGCGAGCCGACACATCCAGGACACTGAGCCCTAGATCCTTAGCGAGGTTCCCCACCACCGAGCCCTTGGCCAGCTCCTCCGGAATCGAGTAGCGGATCGGCTCACTCAGGGTGGGGTAGAACAAAGGCAGCAGCAAAGGAAATAGCACCTGCCGCGGGCCGGCCCGGCGCCTCTGCGCGCAGCTCCCTCCCATCGTTCGCTCGGGTTCTCGCTGGGTCCCCGCTTTTCCAGTTGGAGAAAGTGCACTCTACCGCGCTAAAAGAGCATTCGGCCCAGGACAGGAGGAGTCCCGGGTCTCGGAGCTGGCAATCCGCTGTGCTGGGAAAGGTCTGCGCAGCCGGGAGGCTCTGTGTGGGAGCTGGTTTTCTTCTTTCTGTTGTTGGCTGCGCAGGGAATCCCAGGCCAGAGGCTGACGGATCCCCGGCGTCAGCGCTTGCTCTGCACTGGCCGACAGCGGCG

上述SEQ ID NO:5序列经重亚硫酸盐处理后序列(其中Y代表C或U)如下SEQ IDNO:4(其中Y代表C或U)：

YGGTUTATTYGGTUUTTUAUAAGTAAGTUUUYGUTUTGYGYGTUTAYGUTGAAGTGUAGUTTUTUYGYGUTUAUTYGUAGUTYGYGAGUYGAUAUATUUAGGAUAUTAAGUUUTAGATUUTTAGYGAGGTTUUUUAUUAUYGAGUUUTTGGUUAGUTUUTUYGGAATYGAGTAGYGGATYGGUTUAUAUAGYGTGGGGTAGAAUAAAGGUAGUAGUAAAGGAAATAGTAUUTGUYGYGGGUYGGUUYGGYGUUTUTGYGYGUAGUTUUUTUUUATYGTTYGUTYGGGTTUTYGUTGGGTUUUYGUTTTTUUAGTTGGAGAAAGTGUAUTUTAUYGYGUTAAAAGAGUATTYGGUUUAGGAUAGGAGGAGTUUYGGGTUTYGGAGUTGGUAATUTGGTGTGUTGGGUAAGGTUTGYGUAGUYGGGAGUUTUTGTGTGGGAGUTGGTTTTUTTTTUTGTTGTTGGUTGYGUAGGGAATUUUAGGUTAGAGGUTGAGGGATUUUYGGYGTUAGYGUTTGUTUTGUAUTGGUYGAYGGYGGYG

上述SEQ ID NO:6序列经重亚硫酸盐处理后序列(其中Y代表C或U)如下SEQ IDNO:8(其中Y代表C或U)：

YGGTUTATTYGGTTUTTUAUAAGTAAGTUUUYGUTUTUYGYGTUTAYGUTGAAGTGUAGUTTUTUYGYGUTUAUTYGUAGUTTGYGAGUYGAUAUATUUAGGAUAUTGAGUUUTAGATUUTTAGYGAGGTTUUUUAUUAUYGAGUUUTTGGUUAGUTUUTUYGGAATYGAGTAGYGGATYGGUTUAUTUAGGGTGGGGTAGAAUAAAGGUAGUAGUAAAGGAAATAGUAUUTGUYGYGGGUYGGUUYGGYGUUTUTGYGYGUAGUTUUUTUUUATYGTTYGUTYGGGTTUTYGUTGGGTUUUYGUTTTTUUAGTTGGAGAAAGTGUAUTUTAUYGYGUTAAAAGAGUATTYGGUUUAGGAUAGGAGGAGTUUYGGGTUTYGGAGUTGGUAATUYGUTGTGUTGGGAAAGGTUTGYGUAGUYGGGAGGUTUTGTGTGGGAGUTGGTTTTUTTUTTTUTGTTGTTGGUTGYGUAGGGAATUUUAGGUUAGAGGUTGAYGGATUUUYGGYGTUAGYGUTTGUTUTGUAUTGGUY GAUAGYGGYG

实施例2、STAMP-EP2：肺癌-临床病例样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取20对癌旁-肺癌样本，癌旁样本作为肺癌对照组，肺癌样本20例作为肺癌实验组；

2.DNA提取：分别提取实验组和对照组DNA；本实验用酚氯仿抽提法，但不限于该方法；

3.重亚硫酸盐处理：以重亚硫酸盐处理提取的DNA样本，严格按照步骤操作；本实验中用ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit，货号D5006，但不限于该试剂盒；

4.引物设计：根据STAMP-EP2序列SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2特点，设计PCR扩增引物与焦磷酸测序引物，由于SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2有比较大的相似性，本实验设计引物可同时检测SEQ ID NO：1中17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27号CpG位点与SEQ IDNO：2中18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28号CpG位点甲基化。后续通过焦磷酸测序法检测SEQ ID NO：1中17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27号CpG位点与SEQ ID NO：2中18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28号CpG位点的甲基化值，作为STAMP-EP2甲基化值的代表，PCR引物扩增序列、焦磷酸测序引物序列、焦磷酸测序上机检测序列以及检测位点如表1所示；

表1

5.PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳：以重亚硫酸盐处理后的样本作为PCR的产物，进行PCR扩增，扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的特异性，扩增片段大小应为143bp；

6.焦磷酸测序：通过QIAGEN公司的Pyro Mark Q96 ID焦磷酸测序仪进行检测，严格按照说明书步骤进行操作；

7.STAMP-EP2甲基化值计算：焦磷酸测序可以检测出目标区域SEQ ID NO：1中17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27号CpG位点与SEQ ID NO：2中18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28号CpG位点的甲基化情况，计算平均值作为STAMP-EP2在该样本中的甲基化值；

8.结果分析：比较肺癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图1，结果显示，在肺癌临床样本中，STAMP-EP2在肺癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性95％，特异性100％。

实施例2、STAMP-EP2：结直肠癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取10例结直肠癌癌旁样本作为对照组，获取30例结直肠癌样本作为实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较结直肠癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图2，结果显示在结直肠癌临床样本中，STAMP-EP2在结直肠癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001,检测敏感性93.33％，特异性100％。

实施例3、STAMP-EP2：胃癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取10例正常胃(或胃炎)样本作为对照组，获取10例胃癌手术切沿样本作为实验组1，获取20例胃癌样本作为实验组2；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较正常胃(或胃炎)对照组与手术切沿实验组1以及胃癌实验组2三组样本中STAMP-EP2甲基化值，如图3，结果显示在胃癌临床样本中，STAMP-EP2在胃癌实验组2中甲基化值显著增高，P<0.0001。同时，手术切沿组实验组1的甲基化情况介于正常胃(或胃炎)对照组与胃癌实验组2之间，说明STAMP-EP2甲基化在手术切沿位置已开始有变化，STAMP-EP2作为胃癌标记物，一方面可用于胃癌检测，另一方面可以用于胃癌手术切沿判定。

实施例4、STAMP-EP2：宫颈癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取12例宫颈癌癌旁样本作为对照组，获取16例宫颈癌样本作为实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较宫颈癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图4，结果显示在宫颈癌临床样本中，STAMP-EP2在宫颈癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性93.33％，特异性100％。

实施例5、STAMP-EP2：肝癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取22对癌旁-肝癌样本，癌旁样本作为肝癌对照组，肝癌样本作为肝癌实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较肝癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图5，结果显示在肝癌临床样本中，STAMP-EP2在肝癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性100％，特异性100％。

实施例6、STAMP-EP2：乳腺癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取20对癌旁-乳腺癌样本，癌旁样本作为乳腺癌对照组，乳腺癌样本作为乳腺癌实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较乳腺癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图6，结果显示在乳腺癌临床样本中，STAMP-EP2在乳腺癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性100％，特异性100％。

实施例7、STAMP-EP2：胰腺癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取18对癌旁-胰腺癌样本，癌旁样本作为胰腺癌对照组，胰腺癌样本作为胰腺癌实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较胰腺癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图7，结果显示在胰腺癌临床样本中，STAMP-EP2在胰腺癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性88.9％，特异性100％。

实施例8、STAMP-EP2：头颈部癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取11对癌旁-头颈部癌样本，包括5例喉癌、2例扁桃体癌、2例会厌癌、1例舌根癌、1例下咽癌，癌旁样本作为对照，癌组织作为实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较头颈部癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图8，结果显示在头颈部癌临床样本中，STAMP-EP2在头颈部癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性100％，特异性100％。

实施例9、STAMP-EP2：胆囊癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取10例非癌患者胆汁样本，10例胆囊癌患者胆汁样本，非癌样本作为胆囊癌对照组，胆囊癌样本作为胆囊癌实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较胆囊癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图9，结果显示在胆囊癌临床样本中，STAMP-EP2在胆囊癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性90％，特异性100％。

实施例10、STAMP-EP2：白血病-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取10例非白血病骨髓涂片样本作为对照组，获取20例白血病骨髓涂片样本作为实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较白血病对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图10，结果显示在白血病临床样本中，STAMP-EP2在白血病实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性100％，特异性100％。

实施例11、STAMP-EP2：肾癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取8例肾癌癌旁对照样本作为对照组，获取14例肾癌样本作为实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较肾癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图11，结果显示在肾癌临床样本中，STAMP-EP2在肾癌实验组中甲基化值显著增高，P<0.0001，检测敏感性92.86％，特异性100％。

实施例12、STAMP-EP2：膀胱癌-临床样本验证-焦磷酸测序法

1.获取临床样本：从临床获取5例膀胱癌癌旁样本与非癌尿液样本作为对照组，获取7例膀胱癌组织样本与膀胱癌尿液样本作为实验组；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：比较膀胱癌对照组与实验组STAMP-EP2甲基化值，如图12，结果显示在膀胱癌临床样本中，STAMP-EP2在膀胱癌实验组中甲基化值显著增高。

实施例13、STAMP-EP2，血浆样本-临床样本验证

1.为了证明SATMP-C肿瘤标记物同样可通过液体活检的方式进行检测，本发明人采集20例正常人血浆作为对照组，以及不同肿瘤类型患者血浆样本包括10例肝癌血浆样本、10例胰腺癌血浆样本、10例肺癌血浆样本、10例结直肠癌血浆样本、10例乳腺癌血浆样本；

2.步骤2.3.4.5.6.7同实施例2中步骤；

8.结果分析：如图13所示，与正常人血浆对照相比，在肝癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌以及乳腺癌组中，STAMP-EP2甲基化值均显著增高。

实施例14、STAMP-EP2：CpG位点在肿瘤细胞系与非肿瘤细胞系的甲基化差异

1.提取肺癌细胞系HepG2与正常肺细胞系基因组DNA；

2.分别用重亚硫酸盐处理提取的HepG2与正常肺细胞系基因组DNA，作为后续PCR扩增的模板；

3.根据SEQ ID NO:1和2的序列设计扩增引物，针对不同序列区域，常规方法设计引物进行扩增。

4.PCR扩增之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段特异性，切胶回收目的片段，连接插入T载体，转化感受态大肠杆菌，涂菌板，第二天挑克隆测序，每个片段挑取10个克隆进行Sanger测序；

结果如图14，显示SEQ ID N O:1区域在肝正常细胞系中平均甲基化值为3.0％，在肝癌细胞系HepG2中平均甲基化值为78.3％，肝癌细胞系甲基化水平显著高于肝正常细胞系。SEQ ID NO:2区域在肝正常细胞系中平均甲基化值为1.8％，在肝癌细胞系HepG2中平均甲基化值为78.7％，肝癌细胞系甲基化水平显著高于肝正常细胞系。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海奕谱生物科技有限公司

<120> 基于甲基化修饰的肿瘤标记物STAMP-EP2

<130> 185626

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 539

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

cgccgccgtc ggccagtgca gagcaagcgc tgacgccggg gatccctcag cctctagcct 60

gggattccct gcgcagccaa caacagaaaa gaaaaccagc tcccacacag aggctcccgg 120

ctgcgcagac cttgcccagc acaccagatt gccagctccg agacccggga ctcctcctgt 180

cctgggccga atgctctttt agcgcggtag agtgcacttt ctccaactgg aaaagcgggg 240

acccagcgag aacccgagcg aacgatggga gggagctgcg cgcagaggcg ccgggccggc 300

ccgcggcagg tactatttcc tttgctgctg cctttgttct accccacgct gtgtgagccg 360

atccgctact cgattccgga ggagctggcc aagggctcgg tggtggggaa cctcgctaag 420

gatctagggc ttagtgtcct ggatgtgtcg gctcgcgagc tgcgagtgag cgcggagaag 480

ctgcacttca gcgtagacgc gcagagcggg gacttacttg tgaaggaccg aatagaccg 539

<210> 2

<211> 541

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

cgccgctgtc ggccagtgca gagcaagcgc tgacgccggg gatccgtcag cctctggcct 60

gggattccct gcgcagccaa caacagaaag aagaaaacca gctcccacac agagcctccc 120

ggctgcgcag acctttccca gcacagcgga ttgccagctc cgagacccgg gactcctcct 180

gtcctgggcc gaatgctctt ttagcgcggt agagtgcact ttctccaact ggaaaagcgg 240

ggacccagcg agaacccgag cgaacgatgg gagggagctg cgcgcagagg cgccgggccg 300

gcccgcggca ggtgctattt cctttgctgc tgcctttgtt ctaccccacc ctgagtgagc 360

cgatccgcta ctcgattccg gaggagctgg ccaagggctc ggtggtgggg aacctcgcta 420

aggatctagg gctcagtgtc ctggatgtgt cggctcgcaa gctgcgagtg agcgcggaga 480

agctgcactt cagcgtagac gcggagagcg gggacttact tgtgaagaac cgaatagacc 540

g 541

<210> 3

<211> 539

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(539)

<223> seq id no:1重亚硫酸盐处理后序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(539)

<223> y is C or U

<400> 3

yguyguygty gguuagtgua gaguaagygu tgayguyggg gatuuutuag uututaguut 60

gggattuuut gyguaguuaa uaauagaaaa gaaaauuagu tuuuauauag aggutuuygg 120

utgyguagau uttguuuagu auauuagatt guuagutuyg agauuyggga utuutuutgt 180

uutggguyga atgututttt agygyggtag agtguauttt utuuaautgg aaaagygggg 240

auuuagygag aauuygagyg aaygatggga gggagutgyg yguagaggyg uyggguyggu 300

uygygguagg tautatttuu tttgutgutg uutttgttut auuuuaygut gtgtgaguyg 360

atuygutaut ygattuygga ggagutgguu aagggutygg tggtggggaa uutygutaag 420

gatutagggu ttagtgtuut ggatgtgtyg gutygygagu tgygagtgag ygyggagaag 480

utguauttua gygtagaygy guagagyggg gauttauttg tgaaggauyg aatagauyg 539

<210> 4

<211> 541

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(541)

<223> seq id no:2重亚硫酸盐处理后序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(541)

<223> y is c or u

<400> 4

yguygutgty gguuagtgua gaguaagygu tgayguyggg gatuygtuag uututgguut 60

gggattuuut gyguaguuaa uaauagaaag aagaaaauua gutuuuauau agaguutuuy 120

ggutgyguag auutttuuua guauagygga ttguuagutu ygagauuygg gautuutuut 180

gtuutggguy gaatgututt ttagygyggt agagtguaut ttutuuaaut ggaaaagygg 240

ggauuuagyg agaauuygag ygaaygatgg gagggagutg ygyguagagg yguyggguyg 300

guuygyggua ggtgutattt uutttgutgu tguutttgtt utauuuuauu utgagtgagu 360

ygatuyguta utygattuyg gaggagutgg uuaaggguty ggtggtgggg aauutyguta 420

aggatutagg gutuagtgtu utggatgtgt yggutyguaa gutgygagtg agygyggaga 480

agutguautt uagygtagay gyggagagyg gggauttaut tgtgaagaau ygaatagauy 540

g 541

<210> 5

<211> 539

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

cggtctattc ggtccttcac aagtaagtcc ccgctctgcg cgtctacgct gaagtgcagc 60

ttctccgcgc tcactcgcag ctcgcgagcc gacacatcca ggacactaag ccctagatcc 120

ttagcgaggt tccccaccac cgagcccttg gccagctcct ccggaatcga gtagcggatc 180

ggctcacaca gcgtggggta gaacaaaggc agcagcaaag gaaatagtac ctgccgcggg 240

ccggcccggc gcctctgcgc gcagctccct cccatcgttc gctcgggttc tcgctgggtc 300

cccgcttttc cagttggaga aagtgcactc taccgcgcta aaagagcatt cggcccagga 360

caggaggagt cccgggtctc ggagctggca atctggtgtg ctgggcaagg tctgcgcagc 420

cgggagcctc tgtgtgggag ctggttttct tttctgttgt tggctgcgca gggaatccca 480

ggctagaggc tgagggatcc ccggcgtcag cgcttgctct gcactggccg acggcggcg 539

<210> 6

<211> 541

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

cggtctattc ggttcttcac aagtaagtcc ccgctctccg cgtctacgct gaagtgcagc 60

ttctccgcgc tcactcgcag cttgcgagcc gacacatcca ggacactgag ccctagatcc 120

ttagcgaggt tccccaccac cgagcccttg gccagctcct ccggaatcga gtagcggatc 180

ggctcactca gggtggggta gaacaaaggc agcagcaaag gaaatagcac ctgccgcggg 240

ccggcccggc gcctctgcgc gcagctccct cccatcgttc gctcgggttc tcgctgggtc 300

cccgcttttc cagttggaga aagtgcactc taccgcgcta aaagagcatt cggcccagga 360

caggaggagt cccgggtctc ggagctggca atccgctgtg ctgggaaagg tctgcgcagc 420

cgggaggctc tgtgtgggag ctggttttct tctttctgtt gttggctgcg cagggaatcc 480

caggccagag gctgacggat ccccggcgtc agcgcttgct ctgcactggc cgacagcggc 540

g 541

<210> 7

<211> 539

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (1)..(539)

<223> seq id no:5重亚硫酸盐处理后序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(539)

<223> y is c or u

<400> 7

yggtutatty ggtuuttuau aagtaagtuu uygututgyg ygtutaygut gaagtguagu 60

ttutuygygu tuautyguag utygygaguy gauauatuua ggauautaag uuutagatuu 120

ttagygaggt tuuuuauuau ygaguuuttg guuagutuut uyggaatyga gtagyggaty 180

ggutuauaua gygtggggta gaauaaaggu aguaguaaag gaaatagtau utguygyggg 240

uygguuyggy guututgygy guagutuuut uuuatygtty gutygggttu tygutgggtu 300

uuyguttttu uagttggaga aagtguautu tauygyguta aaagaguatt ygguuuagga 360

uaggaggagt uuygggtuty ggagutggua atutggtgtg utggguaagg tutgyguagu 420

ygggaguutu tgtgtgggag utggttttut tttutgttgt tggutgygua gggaatuuua 480

ggutagaggu tgagggatuu uyggygtuag yguttgutut guautgguyg ayggyggyg 539

<210> 8

<211> 541

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(541)

<223> seq id no:6重亚硫酸盐处理后序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(541)

<223> y is c or u

<400> 8

yggtutatty ggttuttuau aagtaagtuu uygututuyg ygtutaygut gaagtguagu 60

ttutuygygu tuautyguag uttgygaguy gauauatuua ggauautgag uuutagatuu 120

ttagygaggt tuuuuauuau ygaguuuttg guuagutuut uyggaatyga gtagyggaty 180

ggutuautua gggtggggta gaauaaaggu aguaguaaag gaaataguau utguygyggg 240

uygguuyggy guututgygy guagutuuut uuuatygtty gutygggttu tygutgggtu 300

uuyguttttu uagttggaga aagtguautu tauygyguta aaagaguatt ygguuuagga 360

uaggaggagt uuygggtuty ggagutggua atuygutgtg utgggaaagg tutgyguagu 420

ygggaggutu tgtgtgggag utggttttut tutttutgtt gttggutgyg uagggaatuu 480

uagguuagag gutgayggat uuuyggygtu agyguttgut utguautggu ygauagyggy 540

g 541

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

gaatgttttt ttagygyggt agagtgta 28

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

caacaacaaa aaaaataata cctacc 26

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ttaattggaa aagyggggat tta 23

<210> 12

<211> 62

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

gygagaatty gagygaayga tgggagggag ttgygygtag aggygtyggg tyggttygyg 60

gt 62

Claims

1.分离的多核苷酸，其特征在于，包括：

(a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸；

(b)SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸；

(c)上述(a)～(b)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的CpG位点；

(d)与上述(a)～(c)的多核苷酸或片段互补的核酸。

2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰。

3.分离的多核苷酸，其特征在于，其由权利要求1或2所述的多核苷酸转变而来，对应于权利要求1的序列，其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变，非修饰的胞嘧啶转为T或U。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，包括：

(e)SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；

(f)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的多核苷酸；

(g)上述(e)～(f)的多核苷酸的片段，且其中存在至少1个修饰的CpG位点。

5.权利要求1～4任一所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备肿瘤的检测试剂或试剂盒。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括：血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤的样本包括：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

8.一种制备肿瘤检测试剂的方法，其特征在于，所述方法包括：提供权利要求1～4任一所述的多核苷酸，以所述多核苷酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中存在至少1个修饰的CpG位点。

9.试剂或组合的试剂，其特征在于，其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求1～4任一所述的多核苷酸的全长或片段，其中存在至少1个修饰的CpG位点。

10.如权利要求9所述的试剂或组合的试剂，其特征在于，所述的试剂或组合的试剂针对包含所述靶序列的基因序列，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。

11.如权利要求9所述的试剂或组合的试剂，其特征在于，所述的试剂或组合的试剂包括：引物或探针；较佳地，所述的引物为：SEQ ID NO:5和6所示的引物。

12.权利要求9～11任一所述的试剂或组合的试剂的用途，用于制备检测肿瘤的试剂盒；较佳地，所述的肿瘤包括：消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

13.一种检测试剂盒，其特征在于，其包括：

容器，以及位于容器中的权利要求9～11任一所述的试剂或试剂组合。

14.一种体外检测样品甲基化谱式的方法，其特征在于，包括：

(i)提供样品，提取核酸；

(ii)检测(i)的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求1或2所述的多核苷酸或由其转变而来的权利要求3或4所述的多核苷酸。。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合以及SEQ ID NO.1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(ii)包括：

(1)对(i)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；

(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。