JP2022532859A - メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーstamp-ep8及びその応用 - Google Patents
メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーstamp-ep8及びその応用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本明細書で使用される場合、「単離」とは、物質をその元の環境から単離することを指す(天然物質である場合、元の環境は自然環境である)。例えば、生細胞において、自然状態にあるポリヌクレオチドとポリペプチドは、単離・精製されないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然状態で共存する他の物質から単離される場合、それは単離・精製されるものである。
腫瘍を診断するために有用な標的を見つけるために、本発明者らは、広範囲で詳細な研究を行い、STAMP-EP8という標的を確定した。STAMP-EP8遺伝子配列領域のメチル化状態が、腫瘍組織と非腫瘍組織では有意差があるので、STAMP-EP8遺伝子配列領域には異常な高メチル化状態の存在を検出すると、当該受検者が、がんのハイリスクグループであることを判定できる。さらに、STAMP-EP8によって提示される腫瘍組織と非腫瘍組織の間の有意差が、固形腫瘍と非固形腫瘍を含むさまざまな種類の腫瘍に広範に存在する。
本発明の新たな発見に基づき、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するための、ポリヌクレオチド配列に基づいてデザインされた検出試薬も提供する。本分野に既知された確定なゲノムの配列、その変異とメチル化状態の検出方法と試薬は、いずれも本発明に適用できる。
ポリヌクレオチドのメチル化プロファイルは、既存の技術(例えばメチル化特異的PCR(MSP)またはリアルタイム定量的メチル化特異的PCR、Methylight)、または開発中と開発予定の他の技術によって測定することができる。
本発明者らは、研究とスクリーニングを繰り返した後に、腫瘍マーカーSTAMP-EP8を得、その配列は、SEQ ID NO: 1(chr8:23562476-23565175,Human/hg19)に示された;ただし、下線が引かれた塩基はメチル化されたCpGサイトであり、下線が引かれた数字はそのサイトの番号を示す。
当該バイサルファイトシーケンシングPCRのステップは、以下に示された:
1. 肺がん細胞株A549および正常な肺細胞株MRC5からゲノムDNAを抽出した;
2. 肺がん細胞株A549及び正常な肺細胞株MRC5から抽出されたゲノムDNAをそれぞれバイサルファイトで処理し、その後のPCR増幅のテンプレートとした;
3. SEQ ID NO: 1の配列に従って増幅プライマー(SEQ ID NO:5~14)を表1に示されるようにデザインし、増幅を行った。
4. PCR増幅後、2%アガロースゲル電気泳動でPCRフラグメントの特異性を検出し、ゲルを切断して標的フラグメントを回収し、Tベクターをライゲートして挿入し、コンピテント大腸菌を形質転換し、プレートに塗り広げ、2日目に、シーケンスのためにクローンを選択し、サンガーシーケンスのために各フラグメントから10個を超えるクローンを選択した。
当該パイロシーケンス法のステップは、以下に示された:
1. 臨床サンプルの入手:臨床から腫瘍随伴/非癌性-癌組織サンプルを得、腫瘍随伴/非癌性サンプルをコントロールグループとし、癌組織サンプルを腫瘍検出実験グループとした;
2. DNAの抽出:それぞれに実験グループとコントロールグループのDNAを抽出した;この実験では、フェノール-クロロホルム抽出法を使用したが、この方法に限定されない;
3. バイサルファイトの処理:抽出されたDNAサンプルをバイサルファイトで処理し、手順に厳密に従った;この実験では、ZYMO Research社のEZDNA Methylation-Gold Kit、アイテム番号D5006を使用したが、このキットに限定されない;
4. プライマーのデザイン:STAMP-EP8配列とするSEQ ID NO:1の特徴に基づき、PCR増幅プライマーとパイロシーケンスプライマーをデザインした;021-024号CpGサイトのメチル化値を検出し、STAMP-EP8メチル化値の代表として、PCRプライマー増幅配列、パイロシーケンスプライマー配列、パイロシーケンスマシン検出配列及び検出サイトは、SEQ ID NO 15~18に示された(表2);
5. PCR増幅とアガロースゲル電気泳動:バイサルファイトで処理されたサンプルをPCRのテンプレートとして使用し、PCR増幅を行い、増幅産物は、PCR増幅の特異性を特定するためにアガロースゲル電気泳動によって特定された;
6. パイロシーケンシング:QIAGEN会社のPyroMark Q96 IDパイロシーケンサーで検出し、ユーザーマニュアルのステップに従って厳密に操作した;
7. STAMP-EP8のメチル化値の計算:パイロシーケンシングは、標的領域の各CpGサイトのメチル化値を独立に検出することができる;サンプル中のSTAMP-EP8のメチル化値として、すべてのCpGサイトの平均メチル化値を計算した;
8. 結果の分析:腫瘍随伴/非癌性コントロールグループと、腫瘍実験グループとのSTAMP-EP8メチル化値を比較した。
臨床から得られた8例の非白血病骨髄スミアサンプルをコントロールグループとし、8例の白血病骨髄スミアサンプルを実験グループとし、上記実施例3のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのSTAMP-EP8メチル化レベルを比較した。
臨床から得られた5例の乳がん腫瘍随伴サンプルをコントロールグループとし、5例の乳がん組織サンプルを実験グループとし、上記実施例3のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのSTAMP-EP8メチル化レベルを比較した。
臨床から得られた8例の結腸直腸がん腫瘍随伴サンプルをコントロールグループとし、8例の結腸直腸がんサンプルを実験グループとし、実施例3のパイロシーケンスステップによって、STAMP-EP8のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた10例の食道がん腫瘍随伴サンプルをコントロールグループとし、10例の食道がんサンプルを実験グループとし、実施例3のパイロシーケンスステップによって、STAMP-EP8のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた8例の肝臓がん腫瘍随伴サンプルをコントロールグループとし、8例の肝臓がんサンプルを実験グループとし、実施例3のパイロシーケンスステップによって、STAMP-EP8のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた4例の肺がん腫瘍随伴サンプルをコントロールグループとし、4例の肺がんサンプルを実験グループとし、実施例3のパイロシーケンスステップによって、STAMP-EP8のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた4例の膵臓がん腫瘍随伴サンプルをコントロールグループとし、4例の膵臓がんサンプルを実験グループとし、実施例3のパイロシーケンスステップによって、STAMP-EP8のメチル化レベルを分析した。
Claims (18)
- (a) SEQ ID NO:1に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(b) (a)のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在するもの;及び/又は
(c) 上記(a)又は(b)のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸;
を含むことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。 - 上記の修飾は、5-メチル化修飾、5-ヒドロキシメチル化修飾、5-ホルミル化修飾又は5-カルボキシル化修飾を含むことを特徴とする請求項1に記載された単離されたポリヌクレオチド。
- (b)には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントに、
SEQ ID NO: 1又は2の204~223位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の1~478位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の513~1040位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の1082~1602位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の1621~2117位塩基;又は
SEQ ID NO: 1又は2の2160~2700位塩基;
が存在することを特徴とする請求項1に記載された単離されたポリヌクレオチド。 - 請求項1、2又は3に記載されたポリヌクレオチドから転換され、請求項1又は3の配列と対応し、修飾されたCpGサイトのシトシンCが変化しなく、未修飾のシトシンがT又はUに転換することを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
- (d) SEQ ID NO:2又はSEQ ID NO: 4に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド;
(e) 上記の(d)のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在するもの;
を含むことを特徴とする請求項4に記載されたポリヌクレオチド。 - (e)には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントに、
SEQ ID NO: 1又は2の204~223位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の1~478位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の513~1040位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の1082~1602位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の1621~2117位塩基;
SEQ ID NO: 1又は2の2160~2700位塩基;
SEQ ID NO: 4又は3の2478~2497位塩基;
SEQ ID NO: 4又は3の2223~2700位塩基;
SEQ ID NO: 4又は3の1661~2188位塩基;
SEQ ID NO: 4又は3の1099~1619位塩基;
SEQ ID NO: 4又は3の584~1080位塩基;又は
SEQ ID NO: 4又は3の1~541位塩基;
が存在することを特徴とする請求項5に記載されたポリヌクレオチド。 - 腫瘍検出用の試薬又はキットを調製するために用いられることを特徴とする請求項1~6のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドの使用。
- 上記の腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍;乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍;食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍;肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍;神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍;口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん;腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍、皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含むことを特徴とする請求項7に記載された使用。
- 上記の腫瘍のサンプルが、組織サンプル、パラフィン包埋サンプル、血液サンプル、胸水サンプル、肺胞洗浄液サンプル、腹水および洗浄液サンプル、胆汁サンプル、便サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、喀痰サンプル、脳脊髄液サンプル、細胞塗抹サンプル、子宮頸部塗抹サンプルまたはブラシサンプル、組織および細胞生検サンプルを含むことを特徴とする請求項7又は8に記載された使用。
- 請求項1~6のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列を特異性的に検出する検出試薬をデザインすることを含む腫瘍検出試薬を調製する方法;ただし、上記の標的配列には、少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在する;好ましくに、上記の検出試薬が、プライマー、プローブを含む、方法。
- 標的配列のCpGサイトの修飾状況を特異的に検出し、上記の標的配列とは、請求項1~6のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドの全長又はフラグメントであり、ただし、少なくとも1個の修飾されたCpGサイトが存在することを特徴とする試薬又は組み合わせた試薬。
- 上記の試薬又は組み合わせた試薬が、上記の標的配列を含む遺伝子配列を標的とし、上記の遺伝子配列が、遺伝子パネル又は遺伝子グループを含むことを特徴とする請求項11に記載された試薬又は組み合わせた試薬。
- 上記の試薬又は組み合わせた試薬が、プライマー、プローブを含むことを特徴とする請求項11に記載された試薬又は組み合わせた試薬;好ましくに、上記のプライマーは、
SEQ ID NO:5と6に示されたプライマー;
SEQ ID NO:7と8に示されたプライマー;
SEQ ID NO:9と10に示されたプライマー;
SEQ ID NO:11と12に示されたプライマー;
SEQ ID NO:13と14に示されたプライマー;又は
SEQ ID NO:15と16に示されたプライマーである、試薬又は組み合わせた試薬。 - 腫瘍検出用のキットを調製するための、請求項11~13のいずれか一つに記載された試薬又は組み合わせた試薬の使用;好ましくに、上記の腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍;乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍;食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍;肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍;神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍;口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん;腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍、皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含む、使用。
- 容器、及び容器に位置する請求項11~13のいずれか一つに記載された試薬又は組み合わせた試薬
を含むことを特徴とする検出キット。 - (i)試料を提供し、核酸を抽出すること;
(ii)(i)の核酸における標的配列のCpGサイトの修飾状況を検出し、上記の標的配列は、請求項1~3のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチド又はこれから転換されてなる請求項3~6のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドであること;
を含むことを特徴とする生体外でサンプルのメチル化プロファイルを検出する方法。 - ステップ(3)には、分析する方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、メチル化チップ法、qPCR法、デジタルPCR法、次世代シーケンス法、3世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、DNA濃縮検出法、Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)技術、HPLC法、MassArray、メチル化特異的PCR、又はそれらの組み合わせ及びSEQ ID NO:1に示された配列における一部又は全部のメチル化サイトの組み合わせた遺伝子グループの生体外での検出方法及び生体内トレーサー検出方法を含むことを特徴とする請求項16に記載された方法。
- ステップ(ii)が、
(1)その中の未修飾のシトシンがウラシルに転化するように(i)の産物を処理する;好ましくに、上記の修飾が、5-メチル化修飾、5-ヒドロキシメチル化修飾、5-ホルミル化修飾又は5-カルボキシル化修飾を含む;好ましくに、バイサルファイトでステップ(i)に記載された核酸を処理すること;
(2)(1)で処理された核酸における上記の標的配列の修飾状況を分析すること;
を含むことを特徴とする請求項16に記載された方法。
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