CN110904231B - 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 - Google Patents
一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110904231B CN110904231B CN201911236218.6A CN201911236218A CN110904231B CN 110904231 B CN110904231 B CN 110904231B CN 201911236218 A CN201911236218 A CN 201911236218A CN 110904231 B CN110904231 B CN 110904231B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- liver cancer
- methylation
- kit
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 62
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 66
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 66
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 10
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 101000632056 Homo sapiens Septin-9 Proteins 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000013145 classification model Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 102100031685 Cyclin-dependent kinase-like 2 Human genes 0.000 description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150098680 CDKL2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150038024 EFNB2 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100023721 Ephrin-B2 Human genes 0.000 description 4
- 101000777764 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase-like 2 Proteins 0.000 description 4
- 101100444583 Homo sapiens EFNB2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101001049392 Homo sapiens Ephrin-B2 Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102100028024 Septin-9 Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 2
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 108700001666 APC Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 101150071146 COX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 101710178928 Cyclin-dependent kinase-like 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIWNNMMDOVYUOT-BYKQGDNKSA-N [Na].Nc1ncn([C@H]2C[C@H](OP(O)(=O)OC[C@H]3O[C@H](C[C@@H]3O)n3cnc4c3[nH]c(N)nc4=O)[C@@H](CO)O2)c(=O)n1 Chemical compound [Na].Nc1ncn([C@H]2C[C@H](OP(O)(=O)OC[C@H]3O[C@H](C[C@@H]3O)n3cnc4c3[nH]c(N)nc4=O)[C@@H](CO)O2)c(=O)n1 GIWNNMMDOVYUOT-BYKQGDNKSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 101150008740 cpg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学检测领域,具体地,属于肝癌检测领域。提供了所述试剂用于制备辅助诊断肝癌的试剂盒的用途;与此同时,还提供了一种试剂,其能够辅助诊断肝癌,包含所述试剂的试剂盒。使用本发明的试剂能够至少以82.35%的灵敏度和100%的特异性诊断肝癌,其曲线下面积至少为0.8720。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域,具体地,属于肝癌检测领域,更具体地,涉及肝癌基因标志物的甲基化位点的检测。
背景技术
肝癌是世界上最常见的和最致命的疾病之一,也是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤。根据Globocan数据统计,2012年全球新增癌症患者人数约为1400万人,其中肝癌患者排在常见癌种的第六位,全球约有78.2万人罹患肝癌,占所有癌症新增病人的5.6%。肝癌起病隐匿,早期无特异性症状,大多数肝癌患者在就诊时已是中晚期,手术治愈率低,生存期短。血清甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、以及组织活检和超声检查是当前临床上诊断肝癌常用而又重要的方法,然而其灵敏度和特异度并不理想,并且活检还具有创伤性。
肿瘤标志物检测是近年发展起来的用于检测疾病的方法,而寻找准确、稳定、有效的肝癌分子标志物对肝癌进行早期诊断、早期治疗具有重要意义。而随着科学界对肿瘤的认识逐渐深入,越来越多的研究证实细胞表观遗传水平的改变是肿瘤发生与发展的关键事件。DNA甲基化、组蛋白修饰及miRNA表达异常均属于表观遗传学改变,而肿瘤发生的核心环节主要与DNA异常甲基化相关。DNA甲基化检测稳定性好,有组织特异性,易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关。可以作为疾病的诊断、预后提供了新的潜在标记物。
专利CN106929567A公开了通过APC基因、COX2基因、RASSF1A基因以及微小RNA-203基因的甲基化位点的甲基化水平而预测肝癌,但其组合能获得的最高灵敏度和特异性为84.2%和83.0%。
因此,存在对特异性好、灵敏度高的涉及DNA甲基化位点的新的肿瘤基因标志物,特别是肝癌基因标志物的需求。
发明内容
本发明通过在TCGA和GEO数据库搜集和构建肝癌相关的甲基化大数据集,采用生物信息学方法筛选出有应用开发潜力的肝癌DNA甲基化标记物,通过大量研究,申请人发现LOC375196基因的甲基化位点的甲基化水平与肝癌有着密切的联系,而在此之前,本领域通常仅认为LOC375196是一种具有氧化还原酶活性和锌离子结合功能的基因,尚无文献报导其与肝癌存在关联。有鉴于此,
第一方面,本发明提供了一种检测LOC375196中甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备辅助诊断肝癌的试剂盒中的用途,其中,所述甲基化位点为cg12206199。
第二方面,本发明提供了一种检测LOC375196中甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备辅助诊断肝癌的试剂盒中的用途,其中,所述甲基化位点为cg22158769。
进一步地,本发明提供了检测LOC375196中甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备辅助诊断肝癌的试剂盒中的用途,其中,所述甲基化位点为cg12206199和cg22158769。
在一些具体的实施方案中,所述试剂进一步包括用于检测选自CDKL2基因、EFNB2基因以及SEPT9基因的一个或更多个甲基化位点的甲基化水平的试剂。
在一些具体的实施方案中,所述试剂进一步包括用于检测CDKL2基因甲基化位点cg02466113、cg03757145,EFNB2基因甲基化位点cg1877135以及SEPT9基因甲基化位点cg17300544中的一个或多个的甲基化水平的试剂。
进一步地,所述甲基化水平是通过扩增-测序、芯片、PCR的方式测量。
所述扩增-测序测量甲基化,需要包括但不限于核酸引物、测序Tag序列、亚硫酸氢盐等试剂。
所述芯片测量甲基化,需要包括但不限于例如安捷伦的Human CpG IslandMicroarrays和Human DNA Methylation Microarrays、Illumina的InfiniumHumanMethylation27 BeadChip、Infinium HumanMethylation450 BeadChip和GoldenGateMethylation Assay以及Roche NimbleGen的Human DNA Methylation 2.1M DeluxePromoter Array、Human DNA Methylation Array等能够直接用于检测甲基化位点的甲基化水平的甲基化芯片。
所述PCR包括但不限于甲基化特异性PCR、实时甲基化特异性PCR、荧光定量PCR。
所述PCR测量甲基化,需要包括但不限于核酸引物以及核酸探针等试剂。
第三方面,本发明提供了一种用于辅助诊断肝癌的试剂,所述试剂包括用于检测LOC375196的甲基化位点cg12206199和/或cg22158769的甲基化水平的试剂。
使用本发明的检测LOC375196的甲基化位点的试剂,cg12206199能够以82.35%的灵敏度以及100%的特异性诊断肝癌,其曲线下面积(AUC)为0.8720,cg22158769能够以85.29%的灵敏度以及100%的特异性诊断肝癌,其曲线下面积(AUC)为0.9018,表明其具有良好的分类性能,能够诊断肝癌。
Ye Zhou等(“Clinical significance of aberrant cyclin-dependent kinase-like 2 methylation in hepatocellular carcinoma”.Gene,2019)已经报道,CDKL2甲基化是肝细胞癌的一个有价值的生物标志物;Yuting Kuang等(“Guadecitabine(SGI-110)priming sensitizes hepatocellular carcinoma cells to oxaliplatin”.MolecularOncology,2015)已经报道,EFNB2在肝细胞癌的病人当中也发现其启动子区域的高甲基化以及中国专利CN201610621113公开了一种用于诊断肝癌的组合物,所述组合物包括用于检测SEPT9基因及其片段的至少一个区域内甲基化状态的核酸。因此,在一些具体的实施方案中,所述试剂进一步包括用于检测选自CDKL2基因、EFNB2基因以及SEPT9基因的一个或更多个甲基化位点的甲基化水平的试剂。
在一些具体的实施方案中,所述试剂进一步包括用于检测CDKL2基因甲基化位点cg02466113、cg03757145,EFNB2基因甲基化位点cg1877135以及SEPT9基因甲基化位点cg17300544中的一个或多个的甲基化水平的试剂。
使用上述的试剂,进一步提高了诊断肝癌的灵敏度为85.29%,特异性为100%,曲线下面积为0.9265,使得诊断肝癌的效果更佳。
在一些具体的实施方案中,所述核酸引物包括(1)-(4)中的一对或多对:
(1)CDKL2-F:5’-ATGATTGGTTTAGGGTTAATTAT-3’;
CDKL2-R:5’-RTAAACATCACAATCRCCTC-3’;
(2)EFNB2-F:5’-GTGTYGGTTAGTTTAGATTGTGG-3’;
EFNB2-R:5’-CCCAAACRCTAAAAACTACTATC-3’;
(3)LOC375196-F:5’-TGTAGTYGTTGTTTAAGAGYGT-3’;
LOC375196-R:5’-AAACRACTCAACRACTTAACCT-3’;
(4)SEPT9-F:5’-TAATTTTTGTAGGYGTAGAG-3’;
SEPT9-R:5’-AATATAAAAACCRAACCATAAC-3’;
使用上述的引物,能够获得最佳的扩增效率,使得后续的检测过程更佳准确,更能够保证灵敏度和特异性。
第四方面,本发明提供了一种用于辅助诊断肝癌的试剂盒,所述试剂盒包括上述的试剂。
进一步地,所述试剂盒还包括提取核酸的试剂、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
进一步地,各组分的终浓度的范围如下所示:Mg2+2~6mM、dNTP100~400mM、DNA聚合酶0.01~30U、引物10~400nM。
附图说明
图1为靶向PCR扩增示意图;
图2为引物扩增凝胶电泳结果图;
图3为添加测序Tag序列和带样本条形码的测序Tag序列示意图;
图4为6个CpG位点甲基化水平鉴别癌组织和非癌组织的ROC图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
实施例1、基因甲基化位点的筛选
从UCSC Xena网站的TCGA数据集(https://tcga.xenahubs.net)下载到379例癌组织和50例癌旁组织甲基化数据和临床信息。从从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库中下载到355例癌组织、66例癌旁组织、10例正常样本和9例肝硬化组织甲基化数据和临床信息。另外收集了原发性肝癌患者的34对肝癌组织及其癌旁正常组织的样本,用于检测分析DNA甲基化标记物在样本中的甲基化水平。我们将该数据集标记为LiverNGS,见表1。
表1
对两个数据集GSE以及LIHC分别进行差异分析,挑选共有的差异甲基化位点,构建区分肝癌样本与非肝癌样本的分类器。以GSE数据集作为训练集,采用Logistics回归模型对训练集数据进行了分析,得到一个基于6个CpG位点的分类模型,分别为CDKL2(cg02466113、cg03757145)、EFNB2(cg1877135)、LOC375196(cg12206199、cg22158769)和SEPT9(cg17300544)。LIHC数据为测试集,对模型进行性能测试。该6个CpG位点将它们筛选出来作为肝癌特异的DNA甲基化标记物,其对应的基因是CDKL2、EFNB2、LOC375196和SEPT9。
实施例2、临床样本的分析方法
收集的原发性肝癌患者的34对肝癌组织及其癌旁正常组织的样本,用于检测分析DNA甲基化标记物在样本中的甲基化水平。本发明中相关肝癌及癌旁正常组织均取自医院,通过了医学研究伦理委员会认可,所有受试者均签署了知情同意书。肝癌组织及癌旁正常组织的诊断均以最终的医院病理诊断为依据。样本存放于-80℃冰箱保存待用。实验过程如下所述:
1、样本制备
本发明的样本制备是通过TIANamp Genomic DNA Kit提取50mg的新鲜肝癌组织和新鲜的癌旁组织,100μL洗脱液洗脱。提取的基因组DNA需满足以下三个质控条件:提取的核酸总量大于1μg;核酸的OD260/280在1.8-2.0之间;核酸的OD260/230大于2.0。
2、文库制备
本发明将200ng质控合格的基因组DNA按照厂家操作规程采用EZ DNAMethylation-LightningTM Kit(Zymo Research,Irvine,CA,USA)进行重亚硫酸盐处理。随后,重亚硫酸盐处理后的样本DNA采用双引物靶向PCR扩增,具体参见图1。
扩增程序为:95℃预变性10分钟;95℃变性15秒,58℃退火30秒,72℃延伸1分钟,扩增15个循环;最后72℃延伸4分钟。
其中,样本预混液包括1倍不含MgCl2的FastStart高保真反应缓冲液、4.5mMMgCl2、200mM dNTP、0.05U/μL FastStart高保真酶混合液(Roche,Indianapolis,Indiana,USA);亚硫酸盐测序甲基化引物混合液包括0.01-0.4mM的前向靶向扩增引物和反向靶向扩增引物序列,其中,针对4个基因设计了多对引物(具体序列未示出),最终挑选如表2所示的引物,因为其扩增效率最佳,引物扩增胶图如图2所示,图2中泳道引物标记具体代表如下,C2:CDKL2,E2:EFNB2,L6:LOC375196,S9:SEPT9,下划线后字母代表该基因设计的不同引物对,箭头表示最终使用的引物,即表2中所列引物。针对每一个反应,加入10ng-50ng重亚硫酸盐处理后的样本DNA。PCR反应完成后,采用Agencourt AMPure XP system(Beckman CoμLter,CA,USA)进行纯化处理以去除多余的引物和非特异性扩增产物。
表2
添加测序Tag序列和带样本条形码的测序Tag序列:PCR扩增完之后,得到每个样本的扩增产物(参见图3)。接下来通过普通的PCR扩增给每个样本的扩增产物添加上测序Tag序列和带样本条形码的测序Tag序列。添加样本条形码的PCR在25μL的反应体系内进行。25μL反应体系的组成包括:1倍Pfx缓冲液、4mM MgCl2、200mM dNTP、0.05U/μL Platinum PfxDNA聚合酶(Thermo Scientific,DE,USA)。扩增体系中包含0.4mM测序Tag序列和0.4mM带样本条形码的测序Tag序列,其中测序Tag引物序列为:5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACGACATGGTTCTACA-3,带样本条形码的测序Tag引物序列为:5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[BC]-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3',这里BC表示Barcode,即样本条形码序列。
针对每一个反应,加入靶向扩增纯化后的全部样本。采用普通的PCR反应进行扩增,其热循环条件为:94℃预变性2分钟;94℃变性15秒、58℃退火30秒、72℃延伸60秒共进行15个循环的PCR扩增,最后在72℃下进行4分钟的延伸反应。PCR反应完成后,采用Agencourt AMPure XP system(Beckman CoμLter,CA,USA)进行纯化处理以去除多余的引物和非特异性扩增产物。同时,扩增产物的片段大小分布和引物二聚体比例采用Lab chipGX(Perkin Elmer,CA,USA)进行检测。纯化处理后的文库采用dsDNA HS AssayKit(Life Technologies,CA,USA)进行精确定量并质检。
3、测序
将文库总量、扩增产物的片段大小分布和引物二聚体比例质检均合格的待测文库,按照1:1的物质的量进行混合,使用dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies,CA,USA)对混合文库进行精确定量,将文库变性稀释后使用NextSeq500台式测序仪采用SE150进行上机测序。
4、肝癌分类模型的建立和评价
对于测序得到的原始fastq数据,使用BiQ Analyzer 3.0软件的默认分析参数,将测序reads比对到参考序列,并分析提取出6个CpG位点在各个样本中的甲基化水平,结果如表3所示。
表3
根据所选择用于检测的甲基化位点的甲基化程度计算出预测分数Score,以及根据预测分数Score评估检测样本患肝癌风险程度,
预测分数Score计算公式,对于n个CpG位点构成的模型,其Score计算公式为:常规的通用公式为:Score=e(a+x1*CpG1+...+xi*CpGi+...+xn*CpGn),公式中各CpG位点,代表其相应的甲基化水平值(甲基化水平值介于0到1)。
肝癌风险判断阈值:若预测分数Score>=0.5判断为肝癌阳性样本,预测分数Score<0.5,判断为肝癌阴性样本
可以根据已收集的数据库来源和已检测的肝癌样本与对照样本的甲基化谱图来确定公式中每个CpG位点的系数,并可随着所检测的肝癌样本与对照样本的甲基化谱图的不断增加而更新模型中的系数。
例如,可使用下述公式来计算实施例3和4中的所使用到的CpG组合的预测分数:
cg22158769:Score=e(20.99*cg22158769-2.91)
cg12206199:Score=e(22.67*cg12206199-2.95)
cg17300544+cg12206199:Score=e(10.73*cg17300544+20.05*cg12206199-3.63)
cg18771357+cg22158769:Score=e(21.26*cg18771357+15.19*cg22158769-4.92)
cg03757145+cg22158769:Score=e(28.97*cg03757145+12.57*cg22158769-5.21)
cg17300544+cg18771357+cg22158769:
Score=e(7.88*cg17300544+19.70*cg18771357+13.14*cg22158769-5.25)
cg17300544+cg03757145+cg22158769:
Score=e(9.65*cg17300544+24.14*cg03757145+13.14*cg22158769-5.51)
cg17300544+cg22158769+cg02466113:
Score=e(10.71*cg17300544+15.54*cg22158769+7.99*cg02466113-4.57)
cg18771357+cg03757145+cg22158769:
Score=e(17.47*cg18771357+15.99*cg03757145+13.14*cg22158769-5.71)
cg03757145+cg22158769+cg02466113:
Score=e(52.62*cg03757145+17.51*cg22158769-15.68*cg02466113-5.70)
全部6个点的组合:
Score=e(a+x1*cg02466113+x2*cg03757145+x3*cg1877135+x4*cg12206199+x5*cg22158769+x6*cg17300544),
上述公式中系数:a为-6.197599,x1为-49.597064,x2为69.590585,x3为29.773446,x4为40.284933,x5为-24.235368,x6为7.279583。
实施例3、单个甲基化位点用于预测肝癌
分别使用LOC375196的甲基化位点cg22158769以及cg12206199位点而预测肝癌,基于这两个CpG位点Logistics回归分析的分类模型,在临床肝癌组织及其癌旁正常组织样本LiverNGS测序数据为验证集中,显示该分类模型有较好的分类判别能力,其结果如表4所示,从表中可以看出,单个LOC375196的甲基化位点也具有较好的分类性能。
表4
实施例4、甲基化位点的组合用于预测肝癌
使用LOC375196基因的甲基化位点的组合,以及其与其余三个基因中的任意一个或两个的甲基化位点组合而预测肝癌,其结果如表5所示,LOC375196与其余基因进行组合具有更好的分类性能。
表5
最终,使用所有6个CpG位点而预测肝癌,其构建的分类模型敏感性为88.24%,特异性为100%,曲线下面积为0.927,参见表6以及图4。上述结果进一步验证了所筛选出的6个高甲基化CpG位点构建的模型是很好的肝癌甲基化标记物,具备肝癌辅助诊断、甚至早期筛查的潜力。
表6
Claims (4)
1.一种用于辅助诊断肝癌的试剂,其中,所述试剂由检测任一以下甲基化位点组合的甲基化水平的试剂组成:
cg18771357+cg22158769;
cg17300544+cg18771357+cg22158769;
cg18771357+cg03757145+cg22158769;
或者
cg17300544+cg18771357+cg22158769+cg03757145+cg02466113+cg12206199。
2.权利要求1所述的试剂在制备辅助诊断肝癌的试剂盒中的用途。
3.一种用于辅助诊断肝癌的试剂盒,所述试剂盒包括如权利要求1所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括提取核酸的试剂、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911236218.6A CN110904231B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 |
CN202311671268.3A CN117467769A (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911236218.6A CN110904231B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311671268.3A Division CN117467769A (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110904231A CN110904231A (zh) | 2020-03-24 |
CN110904231B true CN110904231B (zh) | 2024-01-05 |
Family
ID=69822581
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311671268.3A Pending CN117467769A (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 |
CN201911236218.6A Active CN110904231B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311671268.3A Pending CN117467769A (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN117467769A (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111676292B (zh) * | 2020-08-11 | 2020-10-30 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 一种用于检测肝癌的组合物,试剂盒及其用途 |
CN112280865B (zh) * | 2020-11-17 | 2022-05-27 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 一种用于检测肝癌的试剂组合,试剂盒及其用途 |
CN112501293B (zh) * | 2020-11-17 | 2022-06-14 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 一种用于检测肝癌的试剂组合,试剂盒及其用途 |
WO2022193097A1 (zh) * | 2021-03-15 | 2022-09-22 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 用于肝癌早筛的核酸及蛋白检测靶标组合及其联合检测方法 |
WO2023066972A1 (en) * | 2021-10-19 | 2023-04-27 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Dna methylation signature for diagnosing hepatocellular carcinoma |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20130103110A (ko) * | 2012-03-09 | 2013-09-23 | (주)지노믹트리 | 간암 특이적 과메틸화 CpG 서열을 이용한 간암의 검출방법 |
WO2014046198A1 (ja) * | 2012-09-19 | 2014-03-27 | シスメックス株式会社 | 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット |
CN105745333A (zh) * | 2012-11-09 | 2016-07-06 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于预测年龄和鉴别诱发或者抑制早衰试剂的方法 |
CN107630093A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-01-26 | 苏州贝斯派生物科技有限公司 | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017210341A1 (en) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | The Regents Of The University Of California | Methods for evaluating, monitoring, and modulating aging process |
EP3494210A4 (en) * | 2016-08-05 | 2020-03-11 | The Regents Of The University Of California | MORTALITY PRONOSTICER BASED ON DNA METHYLATION |
-
2019
- 2019-12-05 CN CN202311671268.3A patent/CN117467769A/zh active Pending
- 2019-12-05 CN CN201911236218.6A patent/CN110904231B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20130103110A (ko) * | 2012-03-09 | 2013-09-23 | (주)지노믹트리 | 간암 특이적 과메틸화 CpG 서열을 이용한 간암의 검출방법 |
WO2014046198A1 (ja) * | 2012-09-19 | 2014-03-27 | シスメックス株式会社 | 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット |
CN105745333A (zh) * | 2012-11-09 | 2016-07-06 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于预测年龄和鉴别诱发或者抑制早衰试剂的方法 |
CN107630093A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-01-26 | 苏州贝斯派生物科技有限公司 | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Augusto Villanueva等.DNA Methylation-based prognosis and epidrivers in hepatocellular carcinoma.Hepatology.2015,第61卷(第6期),第1945-56页. * |
Vardhman等.Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains.Genome Res.2010,第20卷(第4期),第434–439页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110904231A (zh) | 2020-03-24 |
CN117467769A (zh) | 2024-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110904231B (zh) | 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途 | |
CN112322736B (zh) | 一种用于检测肝癌的试剂组合,试剂盒及其用途 | |
CN112501293B (zh) | 一种用于检测肝癌的试剂组合,试剂盒及其用途 | |
CN112280865B (zh) | 一种用于检测肝癌的试剂组合,试剂盒及其用途 | |
CN110484621B (zh) | 一种肝癌早期预警的方法 | |
WO2017112738A1 (en) | Methods for measuring microsatellite instability | |
CN107630093B (zh) | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 | |
CN116254344A (zh) | 一种用于检测膀胱癌的组合物,试剂盒及其用途 | |
TW201905207A (zh) | 用於檢測肝癌的基因標誌物及其用途 | |
CN113201590B (zh) | 用于评估肝细胞癌早期复发风险的lncRNA、评估方法及装置 | |
CN112280867A (zh) | 肝癌早期的预警方法、及预警用检测试剂盒、检测方法 | |
CN109439741B (zh) | 检测特发性癫痫病基因探针组合物、试剂盒及应用 | |
CN114592066B (zh) | 一种新型多靶点肝癌早期检测的组合标志物及其应用 | |
CN114480636B (zh) | 胆汁细菌作为肝门部胆管癌诊断及预后标志物的用途 | |
EP3728630A1 (en) | Compositions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles | |
US11542559B2 (en) | Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis | |
EP3625370A1 (en) | Composite epigenetic biomarkers for accurate screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
EP2203570A1 (en) | 3.4 kb mitochondrial dna deletion for use in the detection of cancer | |
CN113278697B (zh) | 一种基于外周血内基因甲基化的肺癌诊断试剂盒 | |
CN111088358B (zh) | 结直肠癌分子标志物组合、其用途及引物组和检测试剂盒 | |
WO2024066941A1 (zh) | 一种用于检测膀胱癌的组合物,试剂盒及其用途 | |
CN112813168B (zh) | 一种与口腔鳞癌相关的生物标志物 | |
US20230102121A1 (en) | Reagent combination and kit for detecting liver cancers, and use thereof | |
TWI676688B (zh) | 辨識細胞種類型之方法及系統 | |
KR20100090702A (ko) | 암의 검출에 사용하기 위한 약 12317-16254 잔기의 미토콘드리아 dna 결손 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |