CN113278697B - 一种基于外周血内基因甲基化的肺癌诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于外周血内基因甲基化的肺癌诊断试剂盒，属于肿瘤诊断试剂领域。本发明的试剂盒包括检测TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2的甲基化的试剂，可实现肺癌快速诊断，准确性高，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤诊断试剂领域。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。
对肺癌患病风险进行提前预测，以及早期筛查，对肺癌的预后改善具有重大意义。通过肿瘤标志物，可快速、便捷地实现肺癌患病风险预测和早期筛查。经过人们长期研究，已有众多的肺癌标志物，主要有如下几种类型：(1)自身抗体；(2)自身抗体以外的其他蛋白；(3)代谢物；(4)RNA；(5)序列改变的DNA；(6)不同程度甲基化的DNA。每种类型下的标志物数量众多。
由于被检者的个体差异，依赖现有的标志物组合进行预测与筛查仍存在不小比例的假阳性和假阴性，准确度不够高。
TBCEL(tubulin folding cofactor E like，Gene ID：219899)广泛表达于多种器官，其功能与细胞内微管的动态有关，目前已知其参与精细胞个体化调控。
GPI(glucose-6-phosphate isomerase，Gene ID：2821)编码葡萄糖磷酸异构酶蛋白家族的一个成员。这种编码的蛋白质被认为是一种兼职蛋白质，因为它能够执行不同的机械功能。
UBE2S(ubiquitin conjugating enzyme E2 S，Gene ID：27338)编码泛素结合酶家族的一个成员，后者可与泛素形成巯基酯键，广泛表达于身体多种器官。
TOX(thymocyte selection associated high mobility group box，Gene ID：9760)编码一种蛋白，该蛋白带有名为HMG box的DNA结合结构域，其中HMG box与染色质组装、转录和复制相关。
PPL(periplakin，Gene ID：5493)编码一种蛋白质，该蛋白质是桥粒和角质形成细胞表皮角化膜的组成部分。
H2AFX(H2A histone family，member X，Gene ID：100857391)编码组蛋白H2A家族的成员，其与染色质组装相关。
FOXA1(forkhead boxA1，Gene ID：3169)编码一种DNA结合蛋白，是肝细胞内的特异性转录激活因子，与白蛋白和转甲状腺素表达有关。
TTC7B(tetratricopeptide repeat domain 7B，Gene ID：145567)编码一种蛋白，其功能尚不清楚，主要表达于脑部。
ZNF799(zinc finger protein 799，Gene ID：90576)编码一种锌指蛋白，其功能尚不清楚，在多种器官中的均有表达，甲基化均较低。
WNT10B(Wnt family member 10B，Gene ID：7480)编码一种外分泌信号转导蛋白，与肿瘤发生和几种发育过程相关，该基因广泛表达于各种组织，但甲基化均较低。
KCNQ3(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3，Gene ID：3786)编码一种调控神经兴奋的蛋白，主要表达于大脑。
GFI1(growth factor independent 1transcriptional repressor，Gene ID：2672)编码一种转录抑制型的锌指蛋白，参与造血和肿瘤发生，主要表达于骨髓和淋巴结。
CCDC170(coiled-coil domain containing 170，Gene ID：80129)编码一种蛋白，其功能尚不清楚，在甲状腺、肺部等组织表达。
RAET1G(retinoic acid early transcript 1G，Gene ID：353091)编码主要组织相容性复合体(MHC)I类蛋白质家族的一个成员。尽管编码的蛋白质包括C末端跨膜和细胞质结构域，但蛋白水解过程导致这些结构域的去除，并随后通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定与质膜相连。该基因在各种器官内的甲基化均较低。
EFNB2(ephrin B2，Gene ID：1948)编码ephrin(EPH)家族的一个成员。ephrins和EPH相关受体是受体蛋白酪氨酸激酶的最大亚家族，参与调节发育事件，特别是神经系统和红细胞生成。
上述15个基因中，UBE2S、TOX、H2AFX、FOXA1、WNT10B、GFI1、EFNB2等7个基因被报道与肺癌相关，但这15个基因的甲基化情况与肺癌之间的关系尚不明确。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种可区分肺癌和良性肺疾病的基于外周血基因甲基化检测的肺癌诊断试剂盒。
本发明的技术方案如下：
检测外周血内基因的甲基化水平的试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途，所述基因为TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2中的1～15个。
进一步地，所述试剂为甲基化测序试剂；
所述甲基化测序试剂包括重亚硫酸盐试剂、测序建库试剂和PCR扩增试剂。
进一步地，所述PCR扩增试剂包括引物对，引物对序列依次如SEQ ID NO.1～30所示。
进一步地，所述试剂为甲基化特异性PCR试剂、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸试剂、甲基化敏感性单链构象分析试剂或甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳试剂。
一种肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒包括检测外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2中的1～15个的甲基化水平的试剂。
进一步地，所述试剂为甲基化测序试剂；
所述甲基化测序试剂包括重亚硫酸盐试剂、测序建库试剂和PCR扩增试剂。
进一步地，所述PCR扩增试剂包括引物对，引物对序列依次如SEQ ID NO.1～30所示。
进一步地，所述试剂为甲基化特异性PCR试剂、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸试剂、甲基化敏感性单链构象分析试剂或甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳试剂。
一种区分良性肺疾病和肺癌的诊断系统，包括模型训练模块和预测模块；
所述模型训练模块用于对已确诊为良性肺疾病或肺癌患者的外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2甲基化水平进行机器学习训练，得到区分良性肺疾病和肺癌患者的二分类模型；
所述预测模块用于将待检测患者的外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2甲基化水平输入前述二分类模型，得出患者为良性肺疾病或肺癌患者的诊断结果。
进一步地，所述机器学习训练为采用LASSO回归模型进行训练。
本发明的有益效果：
实验发现，肺癌和良性肺疾病患者的外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2甲基化水平存在显著差异，将这15个基因的甲基化水平通过机器学习训练，即可得到可区分肺癌和良性肺疾病的二分类模型，进而实现肺癌和良性肺疾病的准确辨别。更便捷地，则无需二分类模型，直接根据TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2中的1～15个的甲基化水平高低来判断，其中TBCEL、RAET1G、TOX、PPL、GPI、H2AFX、CCDC170、UBE2S、GFI1、WNT10B、TTC7B、KCNQ3、EFNB2甲基化水平越低，恶性程度越高，为肺癌的可能性越高；ZNF799、FOXA1甲基化水平越高，恶性程度越高，为肺癌的可能性越高。
本发明的试剂盒和诊断系统是利用前述发现设计得到，具备准确辨别肺癌和良性肺疾病的能力(AUC为0.797)，具有良好的应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，即不脱离通过检测外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和/或EFNB2甲基化水平来区分肺癌和良性肺疾病的思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，例如将甲基化水平的检测手段做本领域常规替换；这些修改、替换或变更均在本发明的范围内。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：肺癌患者及良性肺疾病患者外周血中的甲基化差异。横轴示不同样本类型，其中蓝色代表良性肺疾病患者外周血样本，红色代表肺癌患者外周血样本；纵轴代表不同位点的甲基化水平；如图所示，各方格代表该样本在相应位点上的甲基化水平与该位点所有样本甲基化平均水平的差值，越接近红色其差值越大，代表该样本在该位点的甲基化水平越高；而越接近蓝色则代表该位点的甲基化水平越低。
图2：预测模型的筛选及构建。采用LASSO模型筛选从候选基因中筛选相关性最强的基因；横轴示λ值的对数，纵轴示该λ值对应的预测模型用于区分外周血良恶性的曲线下面积；如图所示，当λ值为10-2时，预测模型具有最大AUC，诊断效能最高，为最佳预测模型。
图3：15个基因的甲基化水平差异：对比了15个基因在良性肺疾病患者及肺癌患者外周血中的甲基化水平；横轴示外周血样本类型，纵轴示该基因在相应外周血样本中的甲基化水平；如图所示，15个基因在良性肺疾病(B)及肺癌(M)患者外周血样本中的甲基化水平存在显著差异。
图4：预测模型在训练组(左)和验证组(右)中的效能。将最佳预测模型用以区分训练组中的良恶性外周血样本，计算该模型的诊断效能；横轴示假阳性率，纵轴示真阳性率；如图所示，该模型在训练组中的AUC达0.998，可准确区分良性肺疾病与肺癌患者外周血。将最佳预测模型用以区分验证组中的良恶性外周血样本，计算诊断效能；横轴示假阳性率，纵轴示真阳性率；如图所示，该模型在验证组中的AUC为0.797，较之训练组有所下降，但仍可区分良性肺疾病患者与肺癌患者的外周血样本。
具体实施方式
实施例1肺癌诊断的甲基化测序试剂盒
1.试剂盒的组成
试剂盒检测的样本是外周血DNA，试剂包括重亚硫酸盐试剂、测序建库试剂和PCR扩增试剂。
所述重亚硫酸盐试剂为本领域常用的甲基化测序所用重亚硫酸盐试剂，其功能是将未发生甲基化的C碱基转化为U，该试剂市面有售(例如：EpiTech重亚硫酸盐试剂盒(A-59104)，天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215)等)。
所述测序建库试剂是对DNA进行末端修复和添加测序接头的试剂，市面有售，例如Ironman建库试剂盒。
所述PCR扩增试剂包括引物、市售PCR预混液，用于扩增已经被重亚硫酸盐试剂处理过的所关注的15个DNA区段(TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2基因)，通过测序与序列比对，即可得到所关注的DNA区段相对于DNA区段本来序列的区别，统计C突变为T的比例，进而可知晓TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2等15个基因(后文简称“前述15个基因”)的甲基化水平。甲基化水平以基因胞嘧啶位置的C/(C+T)的比值来表示。
本试剂盒的PCR扩增引物序列如表1所示。
表1 PCR扩增引物
2.试剂盒的使用
在正式诊断之前，先用本发明的试剂盒，对部分已临床确诊为肺癌的患者和已确诊为良性肺疾病的患者采集外周血，提DNA，检测前述15个基因的甲基化水平；随机选取70％数据作为训练集，剩余数据作为测试集，采用LASSO回归模型训练区分肺癌和良性肺疾病的二分类模型。
正式诊断时，用本发明的试剂盒对待确诊(肺癌或良性肺疾病)患者的外周血内前述15个基因的甲基化水平进行检测，再将甲基化水平数据代入到前面训练好的二分类模型，实现肺癌和良性肺疾病的区分鉴别。
实施例2前述15个基因甲基化情况与肺癌相关性
一、临床样本
连续纳入拟行手术切除治疗的肺结节患者，纳入标准如下：①胸部CT表现为肺部结节；②于四川大学华西医院胸外科行手术切除并经病理确诊(具备足够样本量)；③既往无肺癌及其他肿瘤病史；④无放、化疗等治疗史；⑤对研究内容知情、自愿参加项目并签署知情同意书。排除标准如下：①合并肺不张、肺炎、肺门增大或胸腔积液等影像学表现；②合并严重的其他疾病(严重的心血管或肺部疾病等)；共纳入146例肺结节患者，具体临床特征见下表：
表2. 146例肺结节患者临床、病理及影像学特征
二、方法
1.生物样本及信息采集
1)临床、病理、影像学信息采集：①通过医院住院病人系统收集受试者临床信息及病理诊断，包括一般信息、人口学特征、吸烟史、肿瘤家族史、临床症状、肿瘤标志物、病理诊断等；②通过医院影像科系统，由两名经验丰富的影像专科医生对肺部结节进行测量及分析，包括结节密度、长径、形状、边界、边缘、周边及空泡征、血管集束征等特殊征象。
2)生物样本收集：于手术前收集患者外周血样本，离心分离上层血浆后，置入-80℃冰箱中长期保存。
2.基于捕获的重亚硫酸盐测序
1)游离DNA提取：采用Bioo scientific公司的NextPrep-Mg cfDNA IsolationKit试剂盒，从血浆中提取cfDNA，详情参考说明书。
2)DNA浓度检测及质检
a)琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度及是否存在RNA及蛋白污染；
b)使用nanodrop检测DNA纯度(OD260/OD280比值)；
c)使用Qubit对DNA浓度进行精确定量，其中OD值在1.8-2.0之间、DNA浓度≥20ng/μl、总量1μg以上的DNA样本用于建库；
3)重亚硫酸盐转化实验：采用Zymo Lightning Kit对DNA样本进行重亚硫酸盐转化，其原理为重亚硫酸盐处理可使DNA样本中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不发生变化，后续通过测序评估甲基化水平。
其具体步骤如下：
a)取DNA样本20μl加入PCR管中，与Lightning转化试剂130μl充分混匀；
b)完成一个热循环，条件为：①98℃ 8min；②54℃ 60min；
c)取M-混合缓冲液600μl加入Zymo-SpinTM吸附柱中，置于收集管内；
d)将步骤b所得溶液加入上述吸附柱内，充分混匀后以＞10000×g离心30s，保留吸附柱；
e)取M-洗脱液100μl加入上述吸附柱中，超速离心30s；
f)取L-脱硫酸缓冲液200μl加入上述吸附柱，室温静置15-20min，超速离心30s后重复步骤e；
g)将上述吸附柱置入1.5ml离心管，加入M-洗涤液10μl，超速离心30s，取上清液保存备用。
4)建库测序
a)采用Ironman建库试剂盒构建文库，进行DNA末端修复，于3’端添加A碱基，连接甲基化测序接头等，构建预文库；
b)取1μl预文库进行Qubit定量，并进行凝胶电泳质检；
c)采用10K甲基化panel(基准公司)的探针对预文库进行杂交；
d)洗脱杂交后的文库DNA，采用PCR进行文库DNA的富集，引物如表1所示；
e)PCR产物纯化后，采用Qubit进行浓度测定；
f)根据文库的有效浓度及数据产出需求进行Illumina Hiseq PE150测序。
3.生物信息学分析
1)质量评估：使用FastQC工具，对测序得到的fastq文件进行质量评估；评估参数包括总位点数、序列平均长度、GC含量、单个碱基测序质量、单个序列质量分布、单个碱基测序内容等。根据上述参数评估测序结果是否达到标准，符合标准则进行后续分析，否则需重新建库或加测；
2)数据修剪：根据质量评估结果，使用cutadapt工具对fastq文件进行修剪，主要包括去除接头及低质量碱基序列；
3)基因组比对：使用BS-seeker2工具，将修剪后的fastq文件与参考基因组(hg19)进行比对；通过对比参考基因组胞嘧啶位置上对应序列C/(C+T)比例，得到单个胞嘧啶的甲基化水平；为了保证甲基化水平评估的准确性，需计算内参DNA重亚硫酸氢盐转化率，保证该转化率在98％以上；
4)甲基化差异化分析：基于单个胞嘧啶的甲基化水平，使用CGmapTools工具对各样本进行比较，分析差异性甲基化区域、高/低度甲基化区域及等位基因特异性甲基化区域等信息；除上述分析外，还采用Rstudio对比不同人群甲基化水平的差异，分析临床病理特征(如年龄、性别、TNM分期等)与甲基化改变的相关性。
三、结果
基于测序结果，采用LASSO回归模型对甲基化差异最明显的基因进行筛选(图1)。通过交叉验证(10-fold cross validation)，选择AUC最大时的λ值，构建最佳预测模型。如图2所示，当λ值约为10-2时，预测模型的错误率低，诊断效能较优，为最佳预测模型。该模型共包含15个基因；如图3所示，其甲基化水平在良性肺疾病患者与肺癌患者外周血样本中存在显著差异。
将所有外周血样本按7∶3比例随机分为训练组(n＝102)和验证组(n＝44)，基于上述15个基因的最佳预测模型在训练组中可准确区分良性肺疾病患者及肺癌患者外周血样本，敏感度为98％，特异度为100％，曲线下面积(Area under the Curve of ROC)达0.998；在验证组中敏感度为81％，特异度为59％，AUC为0.797，可区分肺癌和良性肺疾病患者外周血样本(图4)。
本实施例结果表明，通过对外周血TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2等15个基因的甲基化检测，加以机器学习的二分类模型处理，即可实现肺癌和良性肺疾病的有效区分。
本发明的试剂盒和诊断系统原理和本实施例相同，也能达到同样的技术效果。
综上，本发明的诊断试剂盒和诊断系统基于外周血TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2等15个基因的甲基化水平在良性肺疾病和肺癌患者中的差异，可有效区分良性肺疾病和肺癌。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种基于外周血内基因甲基化的肺癌诊断试剂盒
<130> GYKH1094-2020P0112397CC20JS048
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cacagcgcca tcctcaag 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
ccaccgctga ttgtctgg 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
ccaactgccc gccgtcac 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
acagcagagg ccagagaaag 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
aagggcaaag tttctcctac g 21
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
ggccgggcca ccctactc 18
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
atatggctgg tgcagtccag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
cttaggctcc atccccgaac 20
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
ctgggcttcg cttctgct 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
catcccctcc cgacattg 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
ctgcaccgcg cccagaag 18
Claims (7)
1.检测外周血内基因的甲基化水平的试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途，其特征在于：所述基因为TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测外周血内基因的甲基化水平的试剂为甲基化测序试剂；所述甲基化测序试剂包括重亚硫酸盐试剂、测序建库试剂和PCR扩增试剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括引物对，引物对序列如SEQ ID NO.1～30所示。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测外周血内基因的甲基化水平的试剂为甲基化特异性PCR试剂、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸试剂、甲基化敏感性单链构象分析试剂或甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳试剂。
5.一种肺癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2甲基化水平的试剂；所述试剂包括引物对，引物对序列如SEQ ID NO.1～30所示。
6.一种区分良性肺疾病和肺癌的诊断系统，其特征在于：包括模型训练模块和预测模块；所述模型训练模块用于对已确诊为良性肺疾病或肺癌患者的外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2甲基化水平进行机器学习训练，得到区分良性肺疾病和肺癌患者的二分类模型；
所述预测模块用于将待检测患者的外周血中基因TBCEL、GPI、UBE2S、TOX、PPL、H2AFX、FOXA1、TTC7B、ZNF799、WNT10B、KCNQ3、GFI1、CCDC170、RAET1G和EFNB2甲基化水平输入前述二分类模型，得出患者为良性肺疾病或肺癌患者的诊断结果。
7.如权利要求6所述的诊断系统，其特征在于：所述机器学习训练为采用LASSO回归模型进行训练。
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