CN105950750A - 用于肝癌诊断及预后评估的基因群及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组基于二代测序技术的用于肝癌诊断及预后评估的基因群，以及针对该组基因群设计的用于肝癌诊断及预后评估的基因检测试剂盒。根据已知数据库建立26个中国肝癌患者热点基因突变组合，对肝癌病人循环肿瘤DNA进行到高效靶向富集，可用于指导肝癌病人的预后及疗效的监控。本发明试剂盒具有检测通量高、灵敏度高、特异性高的特性，灵敏度可以达到0.02％，样本的DNA量可以低至10ng。

Description

用于肝癌诊断及预后评估的基因群及试剂盒
(一)技术领域
本发明涉及一组基于二代测序技术的用于肝癌诊断及预后评估的基因群，以及针对该组基因群设计的用于肝癌诊断及预后评估的基因检测试剂盒。
(二)背景技术
原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是恶性程度最高的肿瘤之一，其发病率居全球肿瘤的第6位，病死率居第3位。以手术为主的综合治疗模式对肝癌的治疗取得了显著成效，但由于肝癌病人经常发现时已处于中晚期且伴有不同程度的肝硬化，手术切除率低，复发率高，预后差。目前蛋白质类血清标志物筛查及影像学诊断是检测肝癌患者术后或化疗后残瘤，复发，转移病灶的主要手段，但二者均存在灵敏度及特异性不足等问题。尤其蛋白质类血清标志物的灵敏度和特异性较差，在血中的半衰期较长，其浓度水平与病变程度相关性较差等。
游离循环核酸(Cell Free nucleic acids，cfDNA)是指存在血浆或血清、脑脊液等细胞外游离状态的核酸片段，约160-180bp，是细胞DNA在生理或病理条件下降解的产物。目前研究表明肿瘤病人外周血中存在的cfDNA显著高于健康人群，并且这些cfDNA携带有肿瘤患者的基因信息(包括肿瘤基因的异常突变，甲基化和异常拷贝数等)，称之为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。其主要来源于坏死的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞，凋亡的肿瘤细胞及来自于肿瘤细胞的外分泌小体，在cfDNA中的占比低，约占整个cfDNA的1％，甚至只有0.01％。已有多篇文献证明ctDNA与多种肿瘤的发生和发展有着密切的关系，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，可用于肿瘤早期诊断、发展过程监测、预后判断、以及个性化用药指导等方面。相对于常规的蛋白类诊断标志物及血液中的循环肿瘤细胞，检测ctDNA具有更高的灵敏度和特异性，更适合成为癌症的生物学指标。香港中文大学Peiyong Jiang应用全基因测序研究血浆中ctDNA的大小分布，发现肝癌病人的血浆中存在两种不同长度的DNA分子：短链DNA分子(<150bp)和长链DNA分子(>180bp)；短链DNA分子与ctDNA突变率及拷贝数异常相关，且与ctDNA浓度正相关；长链DNA分子不携带肿瘤相关ctDNA特征，且与ctDNA浓度负相关，显示对肝癌中的ctDNA进行定量和定性分析，对肝癌的诊断具有较高的灵敏性和特异性，可作为肝癌有效的分子诊断工具。Atsushi Ono利用二代测序和PCR技术回顾性地检测46例肝癌患者血清，在其中7例病人血清检出了ctDNA，研究显示ctDNA阳性的肝癌患者的预后显著差于阴性患者；ctDNA的浓度可真实地反映肿瘤的进程，很好地预测病人复发转移。暗示肝癌病人血液中的ctDNA可作为生物标志物用于预后，监测肝癌的发生发展。
(三)发明内容
本发明目的是提供一组基于二代测序技术的用于肝癌诊断及预后评估的基因群，以及针对该组基因群设计的用于肝癌诊断及预后评估的基因检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是：
用于肝癌诊断及预后评估的基因群，由以下26个基因片段组成：
表1：26个基因片段
发明人通过定制了26个癌症基因的肝癌易感位点的测序引物分析了原发性肝细胞癌病人的癌旁组织，肿瘤组织，癌栓或转移瘤，及配对的术前血浆和术后血浆样本中ctDNA，表明肝癌病人血液ctDNA中的这些基因可以真实地反应患者肿瘤组织及转移瘤中的基因信息，及经手术治疗后对肿瘤负荷的反馈，可用于肝癌的预后评估及疗效监测等。
本发明还涉及一种用于肝癌诊断及预后评估的试剂盒，主要包括PCR反应试剂(可直接采用Master Mix成品)和特异性PCR扩增引物，其特征在于特异性PCR扩增引物如下表所示：
表2：26个基因片段对应的引物
本发明根据已知数据库建立包含26个癌症相关基因的热点基因突变组合，对肝癌病人循环肿瘤DNA进行到高效靶向富集，使用二代测序平台对靶向测序文库进行靶向测序，经过分析得到靶向区域的DNA序列。这将大大缩小测序通量，在降低测序成本的同时，有效加深测序深度，发现一些普通测序难以发现但对诊断治疗有重要意义的低频突变。该试剂盒检测通量高、灵敏度高、特异性强，一次检测能够覆盖26个中国肝癌患者热点基因突变。
本发明用于测序和文库构建的步骤为：待测DNA样品采用多重PCR酶进行扩增后构建文库与阴性样品、质控品一起进行大规模平行测序(二代测序)，仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的SNP位点等信息。
待测DNA样品为人类基因组DNA，包括人类细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
本发明引物是针对已知数据库建立26个癌症相关基因的中国肝癌患者热点基因突变的特定序列进行设计。引物偏向性扩增的程度低，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果好。这些引物以混合物形式溶解于一管中，在实验中同时加入。
测序反应过程：DNA模板多重PCR反应、模板文库构建、上机模板准备和富集反应、上机测序反应和测试数据处理分析。
上机模板准备和富集反应过程包括模板油包水扩增和阳性模板富集，所述两个过程中利用标准的建库流程及富集进行测序。上机反应获得的数据结果通过序列筛选、拼接和比对等方法以及生物信息学分析，最终获得测试样本的SNP位点信息。
所述检测结果数据处理、生物信息学分析得出26个癌症相关基因的中国肝癌患者热点基因突变。
测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、质控和突变位点分析等过程，通过数据的处理最终获得检测样本SNP位点的信息。
本发明还涉及利用所述的试剂盒对肝癌病人基因群进行检测的方法，所述方法包括：
(1)在不同阶段(例如术前，术后等阶段)，提取待测病人基因组样品cfDNA及基因组DNA；
(2)基因组DNA打断成长度为180～280bp的片段，打断后的基因组DNA和cfDNA进行末端修复，再作为模板DNA，加入所述特异性PCR扩增引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增；
(3)将不同阶段获得的PCR反应产物进行数据对比，获得肝癌病人在不同阶段的ctDNA水平变化数据。
所述PCR扩增反应参数如下：95℃预变性2～5min；95℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～20s，10～20个循环。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一组基于二代测序技术的用于肝癌诊断及预后评估的基因群，以及针对该组基因群设计的用于肝癌诊断及预后评估的基因检测试剂盒，具有检测通量高、灵敏度高、特异性高的特性，灵敏度可以达到0.02％，样本的DNA量可以低至10ng。
(四)附图说明
图1为实施例1肝癌患者术前、术后、随访血浆中ctDNA含量水平；
图2为实施例2肝癌患者术前、术后、随访血浆中ctDNA含量水平。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
方法步骤：
(1)血浆提取cfDNA
收集原发性肝细胞癌病人术前术后血浆及随访血浆4ml，加入至50ml离心管，后严格按照Circulating Nucleic Acid提取试剂盒操作聚提取cfDNA。收集原发性肝细胞癌病人全血，分离出淋巴细胞，提取基因组DNA。
(2)测序文库的构建和捕获(Library Construction)
首先将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180～280bp的片段，打断后的基因组DNA和cfDNA进行末端修复再利用本发明定制的26个中国肝癌患者热点基因突变组合引物(参见表2)，进行多重PCR反应扩增富集，模板文库构建和上机模板准备，上机测序。
PCR反应体系组成：Master Mix(Thermo，DreamTaqTMGreen PCR Master Mix)11μL、包含所述26对引物的panel 5.5μL、待测DNA样品4.5μL；
PCR扩增反应参数如下：95℃预变性2～5min；95℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～20s，10～20个循环。
(3)测序及生物信息学分析
使用二代测序平台对靶向测序文库进行靶向测序，经过分析得到靶向区域的DNA序列。以病人淋巴细胞为对照，通过一系列生物信息学分析，检测肿瘤分群特异性突变，建立测定病人肿瘤负荷的指标体系，并使用这些基因突变频率在病人不同时期血液样本中的分布情况评估肝癌病人的预后情况，指导进一步治疗。
实施例1：
收集某肝癌患者术前，术后及随访血浆，提取cfDNA及淋巴细胞提取基因组DNA，并利用以上所述的测序方法进行检测。经测序后通过使用病人淋巴细胞的基因组序列作为对照，根据基因突变在循环肿瘤DNA与淋巴细胞中分布的差异情况，依据两者突变频率计算血液样本中该体细胞突变的突变频率差值作为反映病人ctDNA含量的指标。结果显示其术后ctDNA的含量水平显著下调，但在随访血浆中发现ctDNA含量水平显著上升，暗示病人肿瘤复发风险提高，经过影像学诊断证明其复发(参见图1)。
实施例2：
收集某肝癌患者术前，术后及随访血浆，提取cfDNA及淋巴细胞提取基因组DNA，并利用以上所述的测序方法进行检测，经测序后通过使用病人淋巴细胞的基因组序列作为对照，根据基因突变在循环肿瘤DNA与淋巴细胞中分布的差异情况，依据两者突变频率计算血液样本中该体细胞突变的突变频率差值作为反映病人ctDNA含量的指标。其术后ctDNA的水平显著下调，但在随访血浆中发现ctDNA水平与术后无明显变化，提示预后良好，经过影像学诊断证明其未出现复发转移(参见图2)。
本发明的重要癌症相关基因用于对肝癌病人循环肿瘤DNA进行靶向富集：根据已知数据库建立26个中国肝癌患者热点基因突变组合，对肝癌病人循环肿瘤DNA进行到高效靶向富集，可用于指导肝癌病人的预后及疗效的监控。这些基因涵盖了对中国肝癌患者诊断治疗有重要意义的大部分基因。
依据本发明的设计，制备相应的PCR引物，并与DNA样品进多重PCR反应、模板文库构建、上机模板准备和富集反应，富集对中国肝癌患者诊断治疗有重要意义的基因，这些基因只占全部分基因组的很小一部分，有效降低测序成本，并提高测序深度，结果对肝癌患者的诊断及个性化用药有很强的参考意义。

Claims (4)

1.用于肝癌诊断及预后评估的基因群，由以下26个基因片段组成：
2.一种用于肝癌诊断及预后评估的试剂盒，主要包括PCR反应试剂和特异性PCR扩增引物，其特征在于特异性PCR扩增引物如下表所示：
3.利用权利要求2所述的试剂盒对肝癌病人基因群进行检测的方法，所述方法包括：
(1)在不同阶段，提取待测病人基因组样品cfDNA及基因组DNA；
(2)基因组DNA打断成长度为180～280bp的片段，打断后的基因组DNA和cfDNA进行末端修复，再加入所述特异性PCR扩增引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增；
(3)将不同阶段获得的PCR反应产物进行数据对比，获得肝癌病人在不同阶段的ctDNA水平变化数据。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应参数如下：95℃预变性2～5min；95℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～20s，10～20个循环。
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