CN111549131A - 一种基于循环肿瘤dna和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种准确可靠的基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的可用于多肿瘤早期筛查的系统。它包括：(1)含有亚洲人肿瘤基因突变频繁且致病的位点的数据库；(2)提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒；(3)分析循环肿瘤DNA生物信息学的设备；(4)检测肿瘤标记物含量的试剂盒；(5)挖掘循环肿瘤DNA和肿瘤标记物与肿瘤的存在和种类关系的计算设备。本发明提供了一种针对亚洲人的多肿瘤早筛系统，该系统组成设备易得、技术人员容易操作、结果准确率高。

Description

一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛 系统
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种肿瘤的早期筛查系统。
背景技术
随着人口的老龄化和快速增长，全球的癌症发病数和死亡数也正在快速增长。癌症预计将成为21世纪死亡的首要原因，并且将是世界各国提高预期寿命的主要障碍。
2018年9月12日，世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(IARC) 在《CA:ACancer Journal for Clinicians》杂志发布了2018年全球癌症负担状况最新估计报告。数据显示，全球癌症负担持续增长，全球1/5的男性和1/6的女性将在其一生中患上癌症，更有1/8的男性和1/10的女性将死于癌症。全球范围内，癌症诊断5年内存活人数(5年患病率)预计为4380万。估计2018年全球将有 1810万新病例(1730万除非黑色素瘤皮肤癌)和960万癌症死亡(不包括非黑色素瘤皮肤癌的950万)。肺癌是发病率最高的癌症(占总病例的11.6％)，也是癌症死亡的主要原因(占总癌症死亡人数的18.4％，180万人)，紧随其后的是女性乳腺癌(11.6％)，两者估计2018年新发病例可达210万人；紧接着是结直肠癌(10.2％，180万)和前列腺癌(7.1％，130万)的发病率，死亡率是：结直肠癌(9.2％，8.8万)，胃癌(8.2％，7.8万)和肝癌(8.2％，7.8万)。
肿瘤的生存率和肿瘤的分期是密切相关的。根据台湾地区中山医学大学2015年的统计，非小细胞肺癌I、II、III、IV期的5年生存率分别为66.4％、79.7％、 22.7％和7.7％，小细胞肺癌L、E期的1年生存率分别为62.5％和30％，乳腺癌 0、I、II、III、IV期的5年生存率分别为100％、95.2％、96.9％、76.4％、26.9％，胃癌I、II、III、IV期的5年生存率分别为95.2％、71.4％、49.0％、9.6％。从生存率可以看出，越早检查出癌症，生存率就越高，尤其是那些进展很快的癌症。
循环肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)是指人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征(包括突变、缺少、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等)来自肿瘤基因组的DNA片段。ctDNA的主要来源包括：1、坏死的肿瘤细胞；2、凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、肿瘤细胞分泌的外排体。传统的组织活检必须要知道肿块的位置，增加了对肿瘤早期预防的难度。当肿瘤的碎片进入到血液里面去，可以从血液当中检测出来，从而在影像可见的阶段之前，提早预测到肿瘤发生转移，进而能更早的预防和治疗肿瘤。非侵入性液体活检可以提前发现癌症的高危群体，提早对肿瘤的发展进行干预。理论上讲，一个细胞含有约6-7pg的DNA，1mL血能提取10ng游离DNA，相当于来自约2000-3000 个凋亡细胞的DNA量。虽然一般情况下ctDNA只占整个循环DNA的1％，甚至只有0.01％，所以ctDNA检测需要一个超高灵敏度的检测技术。
肿瘤多基因突变的检测，目前使用最多的是测序，得益于二代测序的发展，目前测序的成本非常低，性价比很高。扩增和测序过程都会有一定概率的突变，在使用高保真酶的情况下，扩增的突变概率大约在百万分之一，测序的突变概率大约在万分之一到百分之一，正常情况下，这些突变可以忽略，但ctDNA的频率很低，只有0.01％到1％，这时就很难区分扩增突变、测序突变和真实的突变，很容易产生假阳性。
分子标签技术的原理就是给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样，根据不同的标签序列我们就可以区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正的携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。
肿瘤标志物是指存在于肿瘤细胞内或肿瘤细胞表达及脱落的物质，或是宿主对于体内肿瘤反应而产生的物质。通过化学、免疫学及基因组学等方法测定其存在或含量，证实肿瘤的存在、分析病程、监测疗效和复发以及判断预后，以达到辅助临床改善对于患者进一步处理的目的。虽然应用广泛，对于肿瘤的检测、预后判断和疗效判断有一定的帮助，但是敏感性和特异性都不够，容易产生漏诊和误诊。ctDNA和肿瘤标记物都可以进行肿瘤的筛查、疗效评估和复发筛查，可以进行互补，提高这三个方面的特异性和敏感性，而且还可以准确的区分肿瘤的类别。
亚洲人肿瘤中的基因突变频率和位点与欧美人的突变不同，比如非小细胞肺癌的基因突变中，亚洲人EGFR、KRAS、ALK、BRAF的突变率分别为40-55％、 8-10％、3-5％和0.5-1％，而欧美人EGFR、KRAS、ALK、BRAF的突变率分别为5-15％、20-30％、3-6％、2-3％。我们现在检测的基因片段很多都是根据欧美人的突变数据库设计的，和亚洲人的是有差别的。所以设计一套适合中国人的基因检测位点对于中国人的疾病筛查是很有意义的。
发明内容
本发明旨在提供一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，为了达到目标，解决背景技术里的难题，采用了以下的解决方案：
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，包括
(1)含有亚洲人肿瘤基因突变频繁且致病的位点的数据库，
(2)提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒，
(3)分析循环肿瘤DNA生物信息学的设备，
(4)检测肿瘤标记物含量的试剂盒，
(5)挖掘循环肿瘤DNA和肿瘤标记物与肿瘤的存在和种类关系的计算设备。
优选地，所述数据库由选自TCGA、COSMIC和ICGC数据库中亚洲人肿瘤基因突变频繁区域的数据与选自ClinVar、My Cancer Genome、ACMG和ClinGen数据库中突变致病性位点的数据交集构成。
优选地，所述数据库的构建过程是，首先在TCGA、COSMIC和ICGC数据库下载所有亚洲人的突变信息，然后提取出目标肿瘤类型的病人ID和突变位点，接着使用软件比对提取的文件和COSMIC、clinvar注释文件，取出所有病人的致病突变，随后利用滑窗计算区域突变致病风险总和，选取高风险的区域。
优选地，所述提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒用于提取外周血中的循环肿瘤DNA，末端修复、加A、接头连接及纯化、靶向富集及纯化，最后扩增及测序，其中接头上含有分子标签，可保证突变检测的准确性。
优选地，所述提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒中提取循环肿瘤DNA的方法为磁珠法或硅胶柱法。
优选地，所述分子标签包含8-14bp的随机碱基。
优选地，所述分析循环肿瘤DNA生物信息学包括根据样品ID拆分样品、根据分子标签拆分DNA、根据分子标签去除不符合的DNA突变、分析突变和注释突变。
优选地，所述不符合的DNA突变是指该突变不满足在拥有相同分子标签的序列集合中所占比例超过95％且在COSMIC数据库或clinvar数据库中被注释为致病的双重条件。
优选地，所述肿瘤标记物包括CA-125、CEA、CA19-9、Prolactin、HGF、OPN、Myeloperoxidase、TIMP-1。
利用该数据库进行亚洲人多肿瘤早筛，包括以下步骤：
(1)在公共数据库中寻找亚洲人肿瘤基因突变频繁且致病的区域，这些区域能尽可能覆盖目标癌症。首先在TCGA、COSMIC和ICGC等公共数据库下载所有亚洲人的突变信息，然后提取出目标肿瘤类型的病人ID和突变位点，接着使用软件比对提取的文件和COSMIC、clinvar注释文件，取出所有病人的致病突变，随后利用滑窗计算区域突变致病风险总和，选取高风险的区域设计接头。
(2)设计接头。本方法使用的是扩增子法，即利用引物将目标区域扩增后建库、测序。本方法同时利用了分子标签技术，在引物上添加了分子标签和建库引物，R端接头的结构为5’-建库引物-分子标签-扩增引物-3’，F端接头的结构为5’-建库引物-扩增引物-3’。分子标签为随机碱基，大小在8-14bp之间，建库引物根据测序平台的不同而更换。本方法验证实验的接头由Qiagen公司合成。
(3)提取ctDNA。方法不限，由于ctDNA的含量极低，应注意提取效率。
(4)末端修复及加A。这一步的目的是促进接头连接。
(5)接头连接及纯化。这一步的目的是将接头及分子标签连接到模板DNA 上。
(6)靶向富集及纯化。这一步的目的是扩增目的区域。
(7)扩增后纯化并测序。利用PCR反应将目标片段扩增，以增加片段的数目，增加测序上样量。
(8)测序完成后，根据样品标签拆分样品。在后续的分析中，只有满足以下条件，一条突变才能被留下：1、在拥有相同分子标签的序列集合中，拥有该突变的序列所占比例超过95％；2、在COSMIC数据库或clinvar数据库中被注释为致病。
(9)检测肿瘤标记物的浓度。我们选择的是CA-125、CEA、CA19-9、Prolactin、HGF、OPN、Myeloperoxidase、TIMP-1这8种肿瘤标记物。检测肿瘤标记物的方法不受限制。
(10)利用机器学习算法中的随机森林算法建模。将每个突变和肿瘤标记物中的每个项目都当成一个指标，突变的值为突变频率，肿瘤标记物的值为各自的浓度，空缺值设置为0。训练算法，然后利用训练好的算法建立模型，并根据模型预测肿瘤类别和分期。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤的早筛系统，更加适合中国人的基因检测位点，该系统组成试剂及设备易得、成本便宜、技术人员容易操作、结果准确率高。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：利用本发明系统的实验流程；
图2：利用本发明系统的数据处理流程(其中：箭头旁为软件名称，方框内为文本格式或处理目的)。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中试剂使用方法请参照试剂说明书，本专利说明部分不再赘述。
一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤的早筛系统，包括
(1)含有亚洲人肿瘤基因突变频繁且致病的位点的数据库，
(2)提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒，
(3)分析循环肿瘤DNA生物信息学的设备，
(4)检测肿瘤标记物含量的试剂盒，
(5)挖掘循环肿瘤DNA和肿瘤标记物与肿瘤的存在和种类关系的计算设备。
如图1所示，利用该数据库进行亚洲人多肿瘤早筛，包括以下步骤：
(1)在TCGA、COSMIC和ICGC数据库中寻找亚洲人肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌基因突变频繁的区域。然后根据 ClinVar、My Cancer Genome、ACMG和ClinGen数据库注释突变的致病性，选取致病性强的区域。我们共选择了94个区域，具体区域见表1。
表1：扩增区域及引物
Figure BDA0002479435810000061
Figure BDA0002479435810000071
Figure BDA0002479435810000081
注：基因组版本为hg19。
(2)设计接头。根据区域设计接头，接头来自于凯杰公司，定制试剂盒名称为Qiaseq Targeted DNA Custom Panel(96)。
(3)提取ctDNA。使用凯杰(Qiagen)货号为55114的试剂盒。洗脱体积为20μL。
(4)末端修复及加A。使用Qiaseq Targeted DNA Custom Panel试剂盒进行这一步。首先混和试剂，分别取Fragmentation Buffer(10X)2.5μL、FERA Solution 0.75μL和Fragmentation Enzyme 5μL，混匀，然后取16.75μL模板DNA加入到试剂混合物中。最后放入PCR仪中，程序如下表2：
表2：第一轮PCR程序
Figure BDA0002479435810000091
(5)接头连接。首先混合试剂，取Ligation Buffer 5X 10μL、Ligation solution7.2μL、Nuclease-Free Water 2.3μL和DNA Ligase 5μL，混匀并瞬时离心。然后将试剂混合物加到上一步的产物中去，接着加入接头，混匀并瞬时离心。最后放入PCR仪中，20℃孵育15分钟。
(6)纯化。
1、在上一步产物中加30μL Nuclease-Free Water定容到80μL，并转移到1.5ml的EP管中；
2、加入112μL QIAseq Beads,震荡混匀，静置5min；
3、瞬时离心，放置到磁力架上10min；
4、去除上清，并加入80％乙醇200μL，转动管子180°，待磁珠不在移动，再转动管子180°；
5、去除酒精，再次加入80％乙醇200μL，转动并吸去上清；
6、从磁力架上将EP管取下，瞬时离心，再放到磁力架上，静置2分钟，用10μL小枪吸去底部残余液体后静置10分钟，室温干燥10分钟；
7、加入52μL Nuclease-Free Water洗脱，震荡混匀，静置2分钟；
8、瞬时离心，放置到磁力架上静置5min，取50μL上清加到含70μL QIAseq Beads的1.5mL EP管中，震荡混匀，室温静置5min；
9、瞬时离心，放到磁力架上，静置5分钟；
10、同4、5、6步，用80％乙醇200μL清洗；
11、加入10μL Nuclease-Free Water洗脱，震荡混匀，静置2分钟；
12、瞬时离心，放置到磁力架上静置5min，取9.4μL上清到干净的PCR 管中。
(7)靶向富集。首先混合试剂，取TEPCR buffer 5X 4μL、Qiaseq Targeted DNAPanel 5μL、IL-Forward primer 0.8μL和HotStarTaq DNA Polymerase 0.8μ L，混匀并瞬时离心。然后将试剂混合物加到上一步9.4μL的纯化产物中去。最后放入PCR仪中。
PCR程序如下表3：
表3：靶向富集PCR程序
Figure BDA0002479435810000101
(8)富集后纯化。
1、在上一步产物中加70μL Nuclease-Free Water定容到90μL，并转移到 1.5mL的EP管中；
2、加入108μL QIAseq Beads,震荡混匀，静置5min；
3、瞬时离心，放置到磁力架上10min；
4、去除上清，加入80％乙醇200μL，转动管子180°，待磁珠不再移动，再转动管子180°；
5、去除酒精，再次加入80％乙醇200μL，转动并吸去上清；
6、从磁力架上将EP管取下，瞬时离心，再放到磁力架上，静置2分钟，用10μL小枪吸去底部残余液体后静置10分钟，室温干燥10分钟；
7、加入14μL Nuclease-Free Water洗脱，震荡混匀，静置2分钟；
8、瞬时离心，放置到磁力架上静置5min，取13.4μL上清到干净的PCR 管中。
(9)扩增。首先混合试剂，取UPCR buffer 5X 4μL、IL-Universal Primer 0.8 μL、IL-5502Index Primer 0.8μL、和HotStarTaq DNA Polymerase 1μL，混匀并瞬时离心，加入到上一步纯化的13.4μL产物中，混匀并瞬时离心。最后放入 PCR仪中。PCR程序如下表4：
表4：扩增PCR程序
Figure BDA0002479435810000111
(10)扩增后纯化。操作同第(8)步，最后加入31ul Nuclease-Free Water，并吸取30ul到干净的EP管中。
(11)测序。我们的样品送到诺禾致源进行测序。
(12)测序完成后，根据样品标签拆分数据。后续的分析过程见附图2。只有满足以下条件，突变才能被最终留下：1、在拥有相同分子标签的序列集合中，拥有该突变的序列所占比例超过95％；2、在COSMIC数据库或clinvar数据库中被注释为致病。
(13)检测肿瘤标记物的浓度。我们选择的是CA-125、CEA、CA19-9、 Prolactin、HGF、OPN、Myeloperoxidase、TIMP-1这8种肿瘤标记物。检测的方法是ELISA法。
(14)将每个突变和肿瘤标记物项目都当成一个指标，代入模型中，突变的值为突变频率，肿瘤标记物的值为各自的浓度，空缺值设置为0，根据结果肿瘤类别和分期。模型是利用随机森林算法构建的。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点看，均应将实施例看作是示范性的，而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方案。

Claims (9)

1.一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：包括
(1)含有亚洲人肿瘤基因突变频繁且致病的位点的数据库，
(2)提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒，
(3)分析循环肿瘤DNA生物信息学的设备，
(4)检测肿瘤标记物含量的试剂盒，
(5)挖掘循环肿瘤DNA和肿瘤标记物与肿瘤的存在和种类关系的计算设备。
2.根据权利要求1所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述数据库由选自TCGA、COSMIC和ICGC数据库中亚洲人肿瘤基因突变频繁区域的数据与选自ClinVar、My Cancer Genome、ACMG和ClinGen数据库中突变致病性位点的数据交集构成。
3.根据权利要求2所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述数据库的构建过程是，首先在TCGA、COSMIC和ICGC数据库下载所有亚洲人的突变信息，然后提取出目标肿瘤类型的病人ID和突变位点，接着使用软件比对提取的文件和COSMIC、clinvar注释文件，取出所有病人的致病突变，随后利用滑窗计算区域突变致病风险总和，选取高风险的区域。
4.根据权利要求1所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒用于提取外周血中的循环肿瘤DNA，末端修复、加A、接头连接及纯化、靶向富集及纯化，最后扩增及测序，其中接头上含有分子标签。
5.根据权利要求4所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述提取、建库、扩增、测序循环肿瘤DNA的试剂盒中提取循环肿瘤DNA的方法为磁珠法或硅胶柱法。
6.根据权利要求4所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述分子标签包含8-14bp的随机碱基。
7.根据权利要求1所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述分析循环肿瘤DNA生物信息学包括根据样品ID拆分样品、根据分子标签拆分DNA、根据分子标签去除不符合的DNA突变、分析突变和注释突变。
8.根据权利要求7所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述不符合的DNA突变是指该突变不满足在拥有相同分子标签的序列集合中所占比例超过95％且在COSMIC数据库或clinvar数据库中被注释为致病的双重条件。
9.根据权利要求1所述的一种基于循环肿瘤DNA和肿瘤标记物的亚洲人多肿瘤早筛系统，其特征在于：所述肿瘤标记物包括CA-125、CEA、CA19-9、Prolactin、HGF、OPN、Myeloperoxidase、TIMP-1。
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