CN107881230A - 一种检测肺癌血浆游离目标dna多位点低频突变的方法和试剂盒 - Google Patents

一种检测肺癌血浆游离目标dna多位点低频突变的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域及核酸检测领域，涉及检测肺癌血浆游离目标DNA多位点低频突变的方法及其试剂盒。本发明提供了高灵敏度和高通量的用于一次性检测肺癌血浆游离DNA多位点突变的方法及试剂盒。该检测方法结合ddPCR及二代测序技术对肺癌ctDNA突变进行检测，包括步骤：1)数字PCR混合液制备，包括待测样品DNA模板、引物及PCR预混液；2)制作数字PCR微反应液滴，进行PCR扩增反应；3)PCR产物的回收与纯化；4)二轮PCR混合液制备及扩增；5)PCR产物纯化及文库质控，6.上机测序及数据分析；可一次性检测肺癌EGFR/BRAF/KRAS/PIK3A/MET2/ERBB2/AKT1/NRAS/TP53/PTEN共10个基因的热点突变信息，能显著节约样本，实现高灵敏、高通量的检测肺癌ctDNA突变信息。

Description

一种检测肺癌血浆游离目标DNA多位点低频突变的方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域及核酸检测领域，具体涉及检测肺癌血浆游离目标DNA多位点低频突变的方法及其试剂盒。
背景技术
据报道，肺癌是全球发病率增长最快的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80％左右。最新研究估算，2015年我国约有73.3万例肺癌新发病例(占癌症整体新发病例的17.1％)，死亡病例61万例(占癌症整体死亡病例的21.1％)，严重威胁着我国人群的生命健康。约75％的患者发现时已处于中晚期，手术切除及化疗仍是主要的治疗方式，但其病发症多，患者5年生存率很低。随着基因测序技术的不断发展和肿瘤信号通路研究的深入，多种肺癌相关基因突变被发现，包括EGFR、KRAS、BRAF、HER2、PIK3CA等，这些基因突变激活相关通路蛋白从而导致肿瘤的发生。目前，多个针对这些突变的癌症靶向药物已上市或进入临床研究，显著提高了肺癌患者的生存质量。因此，肺癌相关突变的早期筛查及准确检测意义重大。
近年来，人外周血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)成为一种新的肿瘤早期诊断及预后检测的标志物。ctDNA来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞，携带有区别于正常血浆游离DNA的突变信息(包括点突变，缺失，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等)，因此通过检测血液中ctDNA的突变，可以方便的对患者进行早期筛查、诊断并监测癌症发展、变化，相较于传统组织活检，具有无创、操作简单、可动态监测等优势。然而，ctDNA只占血浆总游离DNA的1％以下，特别是在癌症早期患者中含量更低，约为0.01％，因此，从如此高的背景游离DNA中准确检测到肿瘤相关低频突变信息并非易事。已有ctDNA检测技术如微滴式数字PCR技术(ddPCR)、基于数字PCR及流式的乳液扩磁技术(BEAMing)，在准确性上有很大提升，但是一次检测位点量少，不能满足逐个筛查的需求；基于癌症靶向捕获及深度测序的技术(CAPP-seq)，需要用到杂交捕获，步骤相对繁琐，耗时长，成本高，限制了其在临床上的广泛应用。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种高灵敏度和高通量的用于一次性检测肺癌血浆游离DNA多位点突变的方法及试剂盒。该检测方法结合ddPCR及二代测序技术对肺癌ctDNA突变进行检测，可一次性检测肺癌EGFR/BRAF/KRAS/PIK3A/MET2/ERBB2/AKT1/NRAS/TP53/PTEN共10个基因的热点突变信息，能显著节约样本，提高了癌ctDNA检测的灵敏度和准确率，为肺癌的早期筛查，术后监控及指导用药提供了依据。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，供提供一种检测肺癌血浆游离目标DNA多位点低频突变的方法及试剂盒，尤其是高灵敏度和高通量的用于一次性检测肺癌血浆游离DNA多位点突变的方法及试剂盒。该检测方法结合ddPCR及二代测序技术对肺癌ctDNA突变进行检测，可一次性检测肺癌EGFR/BRAF/KRAS/PIK3A/MET2/ERBB2/AKT1/NRAS/TP53/PTEN共10个基因的热点突变信息，能显著节约样本，实现高灵敏、高通量的检测肺癌ctDNA突变信息。
具体的，本发明提供的检测肺癌血浆游离DNA多位点低频突变的方法，其包括步骤：
1)数字PCR混合液制备，包括待测样品DNA模板、引物及PCR预混液；
2)制作数字PCR微反应液滴，进行PCR扩增反应；
3)PCR产物的回收与纯化；
4)二轮PCR混合液制备及扩增；
5)PCR产物纯化及文库质控。
6.上机测序及数据分析。
本发明中，所述步骤1)的PCR混合液制备中，各成分特征如下：
所述模板为人类血浆游离DNA，其含量10ng～150ng；
PCR引物包括正向与反向引物，
正向引物序列：
5’-CGCTCTTCCGATCTCTG-上游特异性引物-3’
反向引物序列：
5’-TGCTCTTCCGATCTGAC-下游特异性引物-3’
其中所述上游特异性引物及下游特异性引物是指特异性扩增目标区域的引物序列，长度一般为18-30bp，PCR产物大小150bp～200bp，引物终浓度0.2-0.4uM。
本发明中，所述步骤2)中PCR微反应液滴的制备方法为将数字PCR反应混合液加入微滴生成器，生成20000个微反应液滴；
步骤2中所述PCR扩增反应条件为：
94℃预变性5min；94℃变性30s；54℃～58℃退火30s；68℃延伸1min；68℃总延伸10min；共进行50～55个循环，10℃终止反应。温度变化速率设置为1℃/s。
本发明中，步骤3)中所述PCR产物的回收与纯化包括以下步骤：
(1)步骤2中所述PCR微滴的破除。将PCR产物置于干冰速冻，13000rpm离心5min，重复3次后取上清至新的EP管，其中包含了PCR产物及引物、dNTPs；
(2)纯化回收到的PCR产物。利用1.2X磁珠对PCR产物进行纯化；
本发明中，步骤4)所述二轮PCR混合液的制备，包括模板、引物及PCR预混液，各成分特征如下：
所述模板为前述纯化后的PCR产物；
所述引物为通用引物，包括正向引物与反向引物，
正向引物序列：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′
反向引物序列：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
其中XXXXXX为index标签。
步骤4中所述PCR扩增反应条件为：
98℃预变性30s；98℃变性10s；65℃退火/延伸75s；65℃总延伸5min；共进行5～10个循环，10℃终止反应。温度变化速率设置为1℃/s。
本发明中，步骤5中所述PCR产物纯化是指利用0.9X磁珠对PCR产物进行纯化。文库指步骤4所获得纯化的PCR产物，文库质控指用Bioanalyzer 2100检测插入片段大小，合格文库插入片段150bp～200bp，无杂峰。
本发明中，步骤6上机测序指步骤5中检测合格的文库利用illumina平台Hiseq/Miseq测序仪进行测序。
本发明提供了一种检测血浆游离DNA多位点低频突变的试剂盒，其含有特异性扩增肺癌血浆游离DNA多位点突变的引物及二次扩增所需通用引物，可一次性检测肺癌EGFR/BRAF/KRAS/PIK3A/MET2/ERBB2/AKT1/NRAS/TP53/PTEN共10个基因的热点突变信息；
其中，特异性扩增ctDNA突变的引物设计原则为：基于肺癌相关热点突变区设计特异性引物，特异性引物长度18-30bp，扩增子大小在150-200bp；
特异性引物信息如下：
通用引物序列包括正向引物与反向引物，
正向引物序列：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′
反向引物序列：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
其中XXXXXX为index标签。
引物浓度为5uM。
本发明的肺癌血浆游离目标DNA多位点低频突变的方法相比现有技术有明显改善，主要表现在：
(1)可一次性检测肺癌多重基因，包括EEGFR/BRAF/KRAS/PIK3A/MET2/ERBB2/AKT1/NRAS/TP53/PTEN共10个基因的热点突变信息，覆盖95％以上的已知突变及耐药位点，且ctDNA用量低至10ng，极大的提高了检测通量，可为肺癌早期筛查及靶向药物治疗提供依据；
(2)结合数字PCR及高通量测序技术的检测方法在检测灵敏度上有极大提升，灵敏度达1/10000，可在非常高的背景DNA中检测到极微量的突变型DNA。
附图说明
图1为实施例1中各突变位点部分检测值，
图1-1为EGFR基因突变c.2573T＞G，p.L858R，
图1-2为EGFR基因突变c.2369C＞T，T790M，
图1-3为KRAS基因突变p.G12C。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。需理解，这些实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限制。
实施例1
本实施例以以下基因突变为例对本发明进行验证：EGFR基因突变c.2573T＞G，p.L858R、c.2369C＞T，T790M、del E746-A750；KRAS基因突变p.G12C；具体步骤如下：
(1)样本制备：EGFR基因突变c.2573T＞G，p.L858R、c.2369C＞T，T790M来源于细胞系H1975，突变del E746-A750来源于细胞系H1650，KRAS基因突变p.G12C来源于细胞系A549，所有突变位点均经sanger测序鉴定。将上述突变型DNA分别用野生型DNA稀释成40％的比例，然后四种稀释好的DNA按1∶1∶1∶1的比例混合，使得每一种突变型DNA的比例均为10％，接着用野生型DNA倍比稀释使得最终突变型与野生型的比例为1∶100，1∶1000，1∶10000，混合好的三种比例的DNA经covaris S220打断至200～500bp；
(2)制备数字PCR混合液：在PCR 8连管中加入2x genotyping master mix、肺癌特异性引物(终浓度0.2-0.4uM)、不同比例的10ng上述打断后DNA混合样品，补水至20ul反应体系。每个梯度三个重复；
(3)配置好的数字PCR混合液放入液滴生成器中进行液滴制备。制备步骤参照数字PCR仪液滴制备说明。制备好的液滴放入PCR仪中进行第一轮PCR反应。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共55个cycle，68℃总延伸10min，10度Hold；
(4)将PCR产物置于干冰速冻，13000rpm离心5min，重复3次后取上清至新的EP管，用AmpureXP进行纯化，上清中加入1.2X Ampure XP磁珠，混合均匀后室温静置5min，磁力架静置2min至上清澄清，去上清，加入85％乙醇清洗2次，室温晾干磁珠，加入20ul 10mMTris-HCl，重悬磁珠，静置2min，取上清至新管；
(5)制备二轮PCR反应混合液：管中加入2X PCR master mix，正反向通用引物(终浓度0.5uM)，注意不同样品使用不同的index引物，混合后分装至上步中的PCR纯化产物中；
(6)二轮PCR反应：将反应混合液放入PCR仪进行二轮PCR反应，反应条件为，98℃预变性30s；98℃变性10s，65℃退火/延伸75s，65℃总延伸5min，共10个cycle，10度Hold；
(7)PCR产物的纯化：PCR产物中加入0.9x Ampure XP磁珠，混合均匀后室温静置5min，磁力架静置2min至上清澄清，去上清，加入85％乙醇清洗2次，室温晾干磁珠，加入20ul 10mMTris-HCl，重悬磁珠，静置2min，取上清17ul至新管；
(8)文库质控：制备好的样品取1ul进行2100检测，文库大小在280-320bp之间为合格文库；
(9)上机测序：质控合格的文库采用illumina Hiseq/Mieq PE101程序进行上机测序，具体实验操作按照制造商提供的操作说明书进行；
(10)测序结果解读。
实施例2
收集临床肺癌组织样本及对应血液样本进行一次性多重肺癌基因突变检测
检测样本DNA提取：组织样本DNA提取利用Qiagen公司DNeasy Blood&Tissue Kit，按照提取试剂盒的说明进行操作。血液游离DNA提取利用Qiagen公司QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit，按照试剂盒说明书进行操作。提取得到的组织DNA用Nanodrop检测OD260/OD280应介于1.8～2.1，血液游离DNA用2100检测，片段在150～200bp，组织DNA和血液游离DNA均用Qubit 2.0定量；
(1)制备数字PCR混合液：在PCR 8连管中加入2x genotyping master mix、肺癌特异性引物(终浓度0.2-0.4uM)、10ng上述DNA，补水至20ul反应体系；
(2)配置好的数字PCR混合液放入液滴生成器中进行液滴制备。制备好的液滴放入PCR仪中进行第一轮PCR反应。PCR扩增条件为：
94℃预变性5分钟；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共55个cycle，68℃总延伸10min，10度Hold；
(3)将PCR产物置于干冰速冻，13000rpm离心5min，重复3次后取上清至新的EP管，用AmpureXP进行纯化，上清中加入1.2X Ampure XP磁珠，混合均匀后室温静置5min，磁力架静置2min至上清澄清，去上清，加入85％乙醇清洗2次，室温晾干磁珠，加入20ul 10mMTris-HCl，重悬磁珠，静置2min，取上清至新管；
(4)制备二轮PCR反应混合液：管中加入PCR master mix，正反向通用引物(终浓度0.5uM)，注意不同样品使用不同的index引物，混合后分装至上步中的PCR纯化产物中；
(5)二轮PCR反应：将反应混合液放入PCR仪进行二轮PCR反应，反应条件为，98℃预变性30s；98℃变性10s，65℃退火/延伸75s，65℃总延伸5min，共10个cycle，10度Hold；
(6)PCR产物的纯化：PCR产物中加入0.9x Ampure XP磁珠，混合均匀后室温静置5min，磁力架静置2min至上清澄清，去上清，加入85％乙醇清洗2次，室温晾干磁珠，加入20ul 10mMTris-HCl，重悬磁珠，静置2min，取上清17ul至新管；
(7)文库质控：制备好的样品取1ul进行2100检测，文库大小在280-320bp之间为合格文库；
(8)上机测序：质控合格的文库采用illumina Hiseq/Mieq PE101程序进行上机测序，具体实验操作按照制造商提供的操作说明书进行；
(9)测序结果解读。

Claims (10)

1.一种检测肺癌血浆游离目标DNA多位点低频突变的方法，包括以下步骤：
(1)数字PCR混合液制备，包括模板、引物及PCR预混液；
(2)制作PCR微反应液滴，进行PCR扩增反应；
(3)PCR产物的回收与纯化；
(4)二轮PCR混合液制备，包括模板、引物及PCR预混液，PCR扩增；
(5)PCR产物纯化及文库质控。
(6)上机测序及数据分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的模板取自于人类外周血游离DNA，模板浓度10ng～150ng。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的引物特异性扩增肺癌相关热点突变及耐药位点，其引物特征如下：
正向引物序列：
5’-CGCTCTTCCGATCTCTG-上游特异性引物-3’
反向引物序列：
5’-TGCTCTTCCGATCTGAC-下游特异性引物-3’
引物终浓度为0.2～0.4uM，其中上下游特异性引物序列如下：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增反应条件如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的PCR产物回收与纯化是指将PCR产物置于干冰速冻，13000rpm离心5～10min，重复3次后取上清至新的EP管，1.2XAmpure XP磁珠纯化。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述二轮PCR的模板来自于步骤(3)中纯化后的PCR产物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述二轮PCR引物序列为：
正向引物序列：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′
反向引物序列：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
其中XXXXXX为index标签，引物终浓度为0.5uM。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述PCR扩增反应条件为：
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述产物质控是指用2100检测纯化后的PCR主峰270～320bp，无杂峰。
10.一种检测肺癌血浆游离DNA低频突变的试剂盒，其特征在于，包含以下引物：
(1)特异性扩增肺癌相关热点突变的56对引物，其引物特征如下：
正向引物序列：
5’-CGCTCTTCCGATCTCTG-上游特异性引物-3’
反向引物序列：
5’-TGCTCTTCCGATCTGAC-下游特异性引物-3’
其中特异性引物序列如下：
(2)二次PCR通用引物序列：
正向引物序列：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′
反向引物序列：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′
其中XXXXXX为index标签。
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