CN104046699A - F9基因拷贝数变异检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，包括2×PCR缓冲液；竞争性DNA；PCR引物混合液；Taq DNA聚合酶。AccuCopy技术的精确度高，变异系数小于5%，并且结果的准确性也高。因此，本项发明采用了AccuCopy技术开发F9基因拷贝数变异检测试剂盒，并检测发现了约15例有大缺失突变的血友病B患者，临床应用效果良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒。
背景技术
血友病B（HB）是临床常见的一种遗传性出血疾病，主要由F9基因突变导致凝血因子IX（FIX）质或量的缺陷而引起体内凝血功能的异常，在男性中的发病率约为1/30,000。根据血浆中FIX活性，HB可分为轻型（>5%）、中型（1-5%）和重型（<1%）三种类型。重型患者表现为自发性关节出血，肌肉出血和内脏器官出血等，轻型患者表现为外伤后出血难止。因此，该病具有高致残率和致死率。替代治疗是目前唯一有效的治疗方法，制剂主要包括凝血酶原复合物（PCC）和重组凝血因子IX（rFIX)。由于缺乏根治措施，通过携带者诊断和产前诊断避免血友病胎儿的出生，对提高人口素质，减轻社会负担具有重要的意义。然而，前提是需要先对家系中血友病B患者进行准确有效的基因诊断。
F9基因位于X染色体长臂27.1-27.2，全长32.7kb，包括8个外显子和7个内含子及其侧翼调控区域。遗传方式为X连锁隐性遗传病，先证者同胞患病风险决定于母亲是否为致病基因携带者，携带者女性的男性后代患病风险为50%，女性后代携带致病基因的风险也为50%。男性患者的女性后代100%为携带者，而男性后代100%为正常。目前已报道的F9基因突变类型广泛，包括有点突变、缺失、插入、重复等。随着基因体外扩增技术的出现和发展，通过患者外周血有核细胞DNA进行F9基因分析已经成为当前进行F9基因诊断的主要手段。简单来说，针对F9的8个外显子及其侧翼序列区域分别设计PCR引物进行体外扩增，然后将PCR扩增产物进行直接测序，通过将测序结果与参考序列比对，查找可能的致病突变。这种直接测序的方法可以检测错义突变、剪接位点突变、无义突变及小缺失和小插入等突变。当家系中先证者的突变位点明确后，对于女性家系成员进行的携带者检测只需扩增相应突变位点所在的外显子，测序比对是否存在相同的突变。如果该女性为携带者，那么相应位点为杂合突变。女性携带者怀孕后，为了避免患儿的出生，怀孕16-22周时需要抽取胎儿羊水进行DNA抽提，直接扩增胎儿羊水DNA的相应突变位点所在外显子，测序比对后查找胎儿是否存在相同的突变。除了直接测序法查找致病突变外，我们还会对家系成员进行基因连锁分析，以对携带者检测和产前诊断结果进行核实。基因连锁分析并不是直接检测致病基因的异常，而是利用与致病基因紧密连锁和共同传递的一系列基因组遗传多态性标记，通过检测家系先证者，明确与致病基因相关的这些遗传标记的特点，进而对家系中其他成员的遗传标记进行检测协助诊断。经过前期工作的筛选后，我们选择了F9 基因外的6个STR位点（DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102）用于F9基因的遗传连锁分析。然而由于遗传连锁分析属于间诊断方法，且容易受到染色体同源重组等因素的影响，不能得到完全可靠的结果，所以需要与常规测序方法的结果相互验证以取得更加可信的诊断结论。
利用常规直接测序方法可使绝大部分的血友病B家系能得到明确诊断。但据血友病B突变数据库统计，大缺失或重复突变占总F9基因突变类型的5%左右，直接测序的方法不能给与明确诊断，甚至漏诊。首先，当先证者存在大片段缺失时，由于缺失而使得PCR扩增失败。而对于女性家系成员来说，由于存在另外一条正常的染色体模板，PCR扩增是能够成功的，测序结果也是正常的，但不能排除携带者的可能性。其次，当先证者为大片段重复时，PCR能够成功扩增所有外显子区域，但是测序比对不能发现重复突变。此时，对相应外显子的拷贝数进行定量能够明确。基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异（CNVs）。随着微阵列CNV芯片技术以及二代测序技术的发展及应用，发现拷贝数变异（CNVs）广泛地存在于人类染色体基因组中。CNVs主要由基因组发生重组而导致，一般指长度为几kb-几Mb基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的重复，缺失和插入等。通过拷贝数检测方法对先证者F9各外显子的拷贝数进行检测，如果相应外显子缺失，则拷贝数结果为0；如果相应外显子重复，则拷贝数结果大于1。而对于携带者来说，如果缺失拷贝数结果为1，而重复的话拷贝数结果将大于2。但是目前针对CNVs的检测方法非常多，选择合适的技术用于F9基因检测极为重要。
目前CNVs的检测方法主要有：多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-depengent probe amplification，MLPA)、微阵列比较基因杂交(array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型芯片、affymetrix CNV芯片技术及二代测序技术等。此外，实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)等则主要用于CNVs的验证。其中array-CGH、SNP分型芯片、Affymetrix微阵列技术、二代测序技术等主要用于全基因组范围内未知CNVs的检测，这些全基因组CNVs检测技术先进，准确而高效，但相对比较昂贵，尤其是在检测某些特定基因或者特定区域时并不是最佳选择。RT-qPCR方法虽然经典，但是效率太低，一个反应体系中不能同时对多个片段进行检测。MLPA主要是针对特定基因或特定区域进行拷贝数检测的技术，2002年由Schouten等首次报道，是目前应用最为广泛的单一基因拷贝数检测技术，可在同一反应管中对50个不同片段的拷贝数进行检测，所需设施简单，PCR仪和毛细管电泳仪。荷兰MRC-Holland公司研发了数百种MLPA检测试剂盒，用于人类疾病，细胞遗传学及肿瘤研究，其中包括各种遗传性出血与血栓性疾病的相关基因的CNVs的检测。尽管MLPA在诊断特定基因外显子CNVs方面技术已经非常成熟，但是MLPA也存在一些比较突出的问题。首先，它对所检测标本的DNA质量要求相对较高，普通的DNA抽提方法无法满足实验要求，需要购买质量较好的商品化试剂盒进行抽提，增加了实验成本，而且检测标本和参比标本必须使用同种DNA抽提方法。其次，MLPA方法不易建立，我们也曾试图进行该方法的建立，但是通过多次尝试后，并未得到理想而又准确的结果。我们也曾经购买商品化的试剂盒，每次检测结果不稳定，不能保证结果的可靠性。因此，我们针对自己的需求开发了以多重荧光竞争PCR技术为基础的AccuCopy拷贝数检测技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，基于多重基因拷贝数检测方法技术，检测F9基因拷贝数变异的试剂盒及检测体系，主要用于检测F9基因缺失或重复突变而导致的凝血因子IX（FIX）质或量的缺陷，以获取F9基因各目标位点的正确拷贝数的检测试剂盒。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，包括：
1）2×PCR缓冲液；
2）竞争性DNA；
3）PCR引物混合液；
4）Taq DNA聚合酶；
其中，所述PCR引物混合液包括：
a）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8共七对目标位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:1-14；
b）参照位点A、参照位点B、参照位点C共三对参照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15-20；
c）一对性别位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:21-22；
所述竞争性DNA包括：
i）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8共七个人标准序列的内对照DNA：SEQ ID NO:23-29;
ii）参照基因A、参照基因B、参照基因C共三个参照基因的内对照DNA：SEQ ID NO:30-32。
进一步的，所述的每对引物中有一个5’端荧光素标记。
优选的，所述荧光素可选用FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、ROX、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄。但不仅限于此23种荧光素，如果上述所标记引物的扩增产物利用片断大小可以区分鉴别，可利用同种荧光标记；如果无法以扩增产物片段大小区别则可利用不同种荧光标记区分。
F9基因拷贝数变异检测方法，主要包括以下步骤：
（1）针对待测F9基因，设计七对目标位点的多重PCR引物，每对引物中的一条具有荧光标记；设计了三对参照基因的多重PCR引物；每对引物中的一条具有荧光标记；设计了一对性别位点的多重PCR引物；该对引物中的一条具有荧光标记；上述同种荧光标记的多重PCR引物对应扩增产物的长度有差异；
（2）设计针对不同待测的F9基因目标位点和参照基因的内对照DNA片段，所述内对照DNA片段与(1)中对应的多重PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插入少数1-50个碱基的序列；
（3）对所有内对照DNA片段严格定量；
（4）将每种内对照DNA片段等量混合，与所述多重PCR引物对待测样品进行多重荧光PCR扩增；
（5）扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的片段分开，得到每个条带的位置信息以及荧光强度。
优选的，步骤（5）之后还包括以下步骤：计算每个F9基因目标位点的样本条带/内对照DNA条带的荧光峰高或面积比，然后将目标位点的该比值除以参照基因的该比值再乘以参照基因的拷贝数即得目标位点的相对拷贝数。
如果存在目标位点拷贝数已知的参照样本，可以将待测样本目标位点的相对拷贝数除以参照样本对应目标位点的相对拷贝数再乘以参照样本该目标位点拷贝数即得待测样本该目标位点的精确拷贝数。
本发明的有益效果是:
1、AccuCopy技术与MLPA一样，可在同一反应管中针对多个外显子进行拷贝数检测。而且在诊断特定基因或者特定区域CNVs方面AccuCopy具有更大的优势和应用前景。AccuCopy技术操作相对简单，只需要常规的PCR仪及ABI3130XL测序仪，而且对模板DNA的质量要求没有MLPA高，各种方法抽提的DNA均能满足试验要求，且仅需10-20 ng的模板DNA。同时，应用AccuCopy技术，完成整个试验过程只需要4个小时，而MLPA需要24个小时，效率明显提高。更为重要的是AccuCopy技术的精确度高，变异系数小于5%，并且结果的准确性也高。因此，本项发明采用了AccuCopy技术开发F9基因拷贝数变异检测试剂盒，并检测发现了约15例有大缺失突变的血友病B患者，临床应用效果良好。
2、快速检测：在获得内对照DNA后，只要将样本DNA与内对照DNA混匀后进行多重PCR，然后将PCR产物直接上毛细管荧光电泳仪（如ABI测序仪）即可，整个实验过程仅需要一步PCR循环和一步毛细管电泳，耗时不到4个小时。
3、高精确性：由于目标基因片段与其内对照DNA之间仅有少数几个碱基差别，这两个模板的扩增效率将体现高度一致性，因此最后的扩增产物真实的反应了扩增前两个模板浓度比例，根据我们预测试结果，一个竞争性PCR反应重复3次的标准方差在5%之内，而且如果将目标基因片段与内对照DNA按不同稀释梯度混合进行竞争性PCR，我们发现样本峰与内对照峰面积之比与两个模板的原始浓度比的相关性达到99.9%以上。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明所述检测方法的原理示意图；
图2为本发明实施例中样品1检测结果示意图；
图3为本发明实施例中样品2检测结果示意图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
F9基因目标位点序列，参照基因及内对照DNA序列信息：
1、F9基因位点1（目标位点）
人标准序列，164bp
tccaaagacccattgagggagatggacattatttcccagaagtaaatacagctcagcttgtactttggtacaactaatcgaccttaccactttcacaatctgc TAGC aaaggttatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccat
F9_1内对照DNA序列，162bp
tccaaagacccattgagggagatggacattatttcccagaagtaaatacagctcagcttgtactttggtacaactaatcgaccttaccactttcacaatctgc TC aaaggttatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccat
2、F9基因位点2+3（目标位点）
人标准序列，188bp
tggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagactttcttaagagatgtaaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtttttcttgatcatgaaaacgccaac AAAA ttctgaatcggccaaagaggtataa
F9_2+3内对照DNA序列，186bp
tggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagactttcttaagagatgtaaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtttttcttgatcatgaaaacgccaac AA ttctgaatcggccaaagaggtataa
3、F9基因位点4（目标位点）
人标准序列，154bp
ggaccgggcattctaagcagtttacgtgccaattcaatttcttaacctatctcaaagatggagatcagtgtgagtcca ATCC atgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaagg
F9_4内对照DNA序列，152bp
ggaccgggcattctaagcagtttacgtgccaattcaatttcttaacctatctcaaagatggagatcagtgtgagtcca AC atgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaagg
4、F9基因位点5（目标位点）
人标准序列，96bp
aatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctc CTGT actgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcc
F9_5内对照DNA序列，94bp
aatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctc CT actgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcc
5、F9基因位点6（目标位点）
人标准序列，212bp
aagtgacaaggatgggcctcaatctcaatttttgtaatacatgttccatttgccaatgagaaatatcaggttactaatttttcttctatttttctagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcaca AACT tctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgga
F9_6内对照DNA序列，210bp
aagtgacaaggatgggcctcaatctcaatttttgtaatacatgttccatttgccaatgagaaatatcaggttactaatttttcttctatttttctagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcaca AT tctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgga
6、F9基因位点7（目标位点）
人标准序列，174bp
Tgttttcacaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttga AACT ggtgttaaaattacagttgtcgcaggtaaatacacagaaagaataataatctgcagcaccactagctctttaa
F9_7内对照DNA序列，172bp
tgttttcacaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttga AT ggtgttaaaattacagttgtcgcaggtaaatacacagaaagaataataatctgcagcaccactagctctttaa
7、F9基因位点8（目标位点）
人标准序列，109bp
tggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactga AGTG gaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaa
F9_8内对照DNA序列，107bp
tggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactga AG gaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaa
8、参照基因A
人标准序列，75bp
TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG CTGT ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA
参照基因A内对照DNA序列，73bp
TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG CT ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA
9、参照基因B
人标准序列，145bp
CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GCTG CAGCGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT
参照基因B内对照DNA序列，143bp
CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GG CAGCGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT
10、参照基因C
人标准序列，222bp
AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGCCCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAGGAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCA GCAG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC
参照基因C内对照DNA序列 220bp
AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGCCCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAGGAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCA GG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC
11、性别位点
人标准序列，X染色体，116bp
CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGTGTTGATTCTTTATCCCAGATGTTTCTCAAGTGGTCCTGATTTTACAGTTCCTACCACCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGGCCTC
人标准序列，Y染色体，122bp
CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGGGTGGATTCTTCATCCCAAATAAAGTGGTTTCTCAAGTGGTCCCAATTTTACAGTTCCTACCATCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGGCCTC
下表为用于复合扩增体系的引物序列以及所述引物序列的混合物。
实施例
参照图1所示，利用本发明所述的F9基因拷贝数变异检测试剂盒对一个血友病B患者和一个疑似携带者进行F9基因的拷贝数检测。
一、检测样本：样本A为临床诊断患有血友病B的男性，样本B为临床分析疑似为血友病B携带的女性。
二、检测方法
主要包括以下步骤：
将分别为男性和女性待测样本及一个已知目标位点拷贝数的男性参照样本的DNA用Biophotomerterplus(Eppendor)（核酸蛋白测定仪）进行精确定量，然后稀释至20ng/μl作为待测DNA样本待用。
F9基因拷贝数变异检测试剂盒提供以下试剂：2×PCR缓冲液，竞争性DNA，PCR引物混合液，TaqDNA聚合酶。
多重PCR体系（20μl）配置：
PCR反应条件设置如下：95℃10分钟；7个循环的Touchdown程序（94℃ 20秒，64℃-1℃/循环40秒和72℃ 2min）,28个循环扩增（94℃ 20秒，60℃ 30秒和72℃ 2min），在72℃延伸2分钟，在60℃延伸60分钟，4℃保存；
取1μlPCR产物用ddH2O稀释10倍，然后取1μl加入到8.8μl的Hi-Di(ABI)和0.2μll的LIZ500分子内标（ABI）中，95℃5min变性后，置于3130XL测序仪上进行毛细管电泳。
结果使用GeneMapper4.0软件进行数据分析，读取峰高等数据，参照图2、图3所示。
数据分析表
1.表1、表2为2个检测样本及1个对照样本的10个位点扩增体系数据。
表1
表2
2.样本DNA峰高值S除以竞争DNA峰高值C
计算每个位点的样本DNA峰（S峰）与内对照DNA峰（C峰）的峰高比（S/C），得到结果如表3、表4所示。
表3
表4
3.样本的拷贝数
将每个目标位点的S/C比值分别除以参照位点的S/C比值然后乘以参照基因的拷贝数即可获得目标基因的相对拷贝数，使用参照样本对应目标位点的拷贝数为2对检测结果进行进一步的校正，获取目标位点的精确拷贝数，得到结果如表5所示。
表5
三、结论
样本A为F9基因第1-3外显子区域缺失的男性，与临床检测结果一致。
样本B为F9基因第1-3外显子区域一个拷贝的女性，与临床检测结果一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
天昊生物医药科技（苏州）有限公司
<120> F9基因拷贝数变异检测试剂盒
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> Artificial
<400> 18
aatgcacacc tccagggaaa ac 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 19
agggtgctgg gatcagagag ag 22
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 20
gtttcttgct actggagggt ggcaaaatg 29
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 21
ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24
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<213> Artificial
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gtttcttgag gccaaccatc agagctta 28
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<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 23
tccaaagacc cattgaggga gatggacatt atttcccaga agtaaataca gctcagcttg 60
tactttggta caactaatcg accttaccac tttcacaatc tgctcaaagg ttatgcagcg 120
cgtgaacatg atcatggcag aatcaccagg cctcatcacc at 162
<210> 24
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 24
tggctccatg ccctaaagag aaattggctt tcagattatt tggattaaaa acaaagactt 60
tcttaagaga tgtaaaattt tcatgatgtt ttcttttttg ctaaaactaa agaattattc 120
ttttacattt cagtttttct tgatcatgaa aacgccaaca attctgaatc ggccaaagag 180
gtataa 186
<210> 25
<211> 152
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 25
ggaccgggca ttctaagcag tttacgtgcc aattcaattt cttaacctat ctcaaagatg 60
gagatcagtg tgagtccaac atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc 120
tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa gg 152
<210> 26
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<212> DNA
<213> Artificial
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aatggcagat gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctac 60
tgagggatat cgacttgcag aaaaccagaa gtcc 94
<210> 27
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<212> DNA
<213> Artificial
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aagtgacaag gatgggcctc aatctcaatt tttgtaatac atgttccatt tgccaatgag 60
aaatatcagg ttactaattt ttcttctatt tttctagtgc catttccatg tggaagagtt 120
tctgtttcac aattctaagc tcacccgtgc tgagactgtt tttcctgatg tggactatgt 180
aaattctact gaagctgaaa ccattttgga 210
<210> 28
<211> 172
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 28
tgttttcaca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta 60
atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaatg gtgttaaaat tacagttgtc 120
gcaggtaaat acacagaaag aataataatc tgcagcacca ctagctcttt aa 172
<210> 29
<211> 107
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 29
tggcttccat gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac 60
tgaaggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaa 107
<210> 30
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 30
tgagccaaaa attcagaata caaggagctt tcaaggaaaa aggctatgct gcgtttgcct 60
gccttccaag caa 73
<210> 31
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 31
cactgagccc cagagacctg acaagcctgt ttgagccgtg cctgaaaaat gtggctcatc 60
ctcagggcag cggggaaaat ggaagagttt aattggttct gacttcagga ttcagatcat 120
agttttccct ggaggtgtgc att 143
<210> 32
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 32
agggtgctgg gatcagagag aggctttttc agggagacca tcagtgggtg ggagaagatg 60
tctcatctcc gcccgagtct ccattgtgag ctttctgagc atttcaccat ggagactcgg 120
cacagacgtg ttccttggct ttcctgtagg aatccagggc ccaccagagc ttcccttagc 180
accaggtggc agctggttca ttttgccacc ctccagtagc 220
Claims (3)
1.一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括：
1）2×PCR缓冲液；
2）竞争性DNA；
3）PCR引物混合液；
4）Taq DNA聚合酶；
其中，所述PCR引物混合液包括：
a）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8共七对目标位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:1-14；
b）参照位点A、参照位点B、参照位点C共三对参照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15-20；
c）一对性别位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:21-22；
所述竞争性DNA包括：
i）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8共七个人标准序列的内对照DNA：SEQ ID NO:23-29;
ii）参照基因A、参照基因B、参照基因C共三个参照基因的内对照DNA：SEQ ID NO:30-32。
2.根据权利要求1所述的F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于：所述的每对引物中有一个5’端荧光素标记。
3.根据权利要求2所述的F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于：所述荧光素可选用FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、ROX、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄。
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2014
- 2014-07-08 CN CN201410322475.2A patent/CN104046699B/zh active Active
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