CN104120190B - F11基因拷贝数变异检测试剂盒 - Google Patents

F11基因拷贝数变异检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种F11基因拷贝数变异检测试剂盒，包括：2×PCR缓冲液；竞争性DNA；PCR引物混合液和Taq？DNA聚合酶。由于目标基因片段与其内对照DNA之间仅有少数几个碱基差别，这两个模板的扩增效率将体现高度一致性，因此最后的扩增产物真实的反应了扩增前两个模板浓度比例。根据我们预测试结果，一个竞争性PCR反应重复3次的标准方差在5％之内，而且如果将目标基因片段与内对照DNA按不同稀释梯度混合进行竞争性PCR，我们发现样本峰与内对照峰面积之比与两个模板的原始浓度比的相关性达到99.9％以上。因此，基于此原理技术开发的F11基因拷贝数变异检测试剂盒具有快速和高准确性等优点，具有良好的临床价值。

Description

F11基因拷贝数变异检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种F11基因拷贝数变异检测试剂盒。
背景技术
遗传性凝血因子XI(FXI)缺陷症，又称为血友病C，是较为少见的一组遗传性出血性疾病。该病为常染色体隐性遗传性疾病，男女均可受累。本病在人群中的发病率约为10万分之一，随着检测水平的提高，该病在人群中的发病率有所提高，尤其在犹太人中有较高的发病率，杂合突变携带者可高达10％。
遗传性FXI缺陷临床表现多样，患者具有出血倾向，但多数患者无自发性出血，主要表现为创伤或手术后出血增多。大多数临床患者是在术前检查或健康查体时查凝血因子XI活性(FXI：C)低而确诊。与其他出血性疾病不同，FXI:C水平与患者临床出血症严重无明显相关性。
FXI缺陷症患者出血多发生于黏膜，如鼻出血，血尿，月经过多等。这些部位的纤溶活性较高，而研究认为，FXI有抑制纤溶的作用，FXI缺乏可导致凝血酶和凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)活性降低，导致纤溶亢进，从而引起出血增多。这可能是FXI缺陷症导致临床出血的主要机制。
据FXI缺陷症的突变数据库(http://www.factorxi.com)统计，迄今为止，共发现220种与FXI的缺陷有关的基因突变，大多数突变表现为FXI活性和抗原水平的共同降低，为交叉反应物质阴性(CRM-)。突变类型主要包括错义突变、碱基缺失或插入、无义突变和剪切位点突变等，其中错义突变最为常见，占57％，碱基缺失为6％。突变分布于整个FXI基因(F11)，编码包括信号肽、连接区、球形结构区1-4(AP1-AP4)、丝氨酸蛋白酶区(SP)，其中SP区的突变最多，约占占30％。
FXI缺陷症的基因诊断主要是通过F11基因直接测序的方法分析诊断。该方法可有效地诊断点突变及小的缺失和插入突变，但对大缺失突变不能明确诊断，而对打的插入突变则检测不到。
异常的DNA拷贝数变化(CNV)是许多人类遗传性疾病的一种重要分子致病机制。作为疾病的一项生物学标志，染色体水平的缺失、扩增等变化已成为许多疾病研究的热点，然而传统的方法(比如G显带，FISH，CGH等)存在操作繁琐，分辨率低等问题，难以快速提供变异区段的具体信息。近年来，随着芯片技术和分子诊断技术的发展，比较基因组杂交芯片(array-basedComparativeGenomicHybridization，aCGH)及多重连接探针技术(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)被广泛应用于CNV检测。同传统方法相比，该类技术具有极高的分辨率。
aCGH技术通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品(病例样品和对照样品)进行共杂交来检测样本基因组相对于对照基因组的DNA拷贝数变化，该检测无需细胞培养，是对全基因组的拷贝数变化的检测，分辨率远远高于核型分析。所需时间约5天左右。因此，成本相对较高。使用该技术检测患者F11缺失虽然可以保证极高的分辨率，但是由于芯片的成本短期内难以下降，使检测费用高，浪费了大量其他信息。开发针对目的基因片段或目的基因的CNV检测具有重要的临床应用价值。而MLPA利用简单的杂合、连接、PCR扩增反应，可以对待测核酸靶序列或靶基因进行精确的定性和定量分析，现已广泛运用于各种遗传性疾病的基因诊断中。另一种目前广泛应用于CNV检测领域的技术为多重连接探针技术(MLPA)。MLPA最大的特色在于它针对靶序列设计了一对探针，一条化学合成的短探针及一条由M13噬菌体制备的长探针，扩增仅针对完成连接的探针而非样本靶序列。其反应可分为3步：1.两条特异性探针分别与靶序列结合2.两条探针相互连接形成一条单链3.单链结合PCR引物开始循环扩增。只有当特异性探针与靶序列完全互补时，两条探针才能被连接酶连接进而形成单链扩增，而每一对探针的扩增产物的长度都是不同的，借助毛细电泳可以对扩增产物进行分离鉴别，确保了该方法极高的特异性。MLPA可在同一反应管中对50个不同片段的拷贝数进行检测，所需设施简单，PCR仪和毛细管电泳仪。荷兰MRC-Holland公司研发了数百种MLPA检测试剂盒，用于人类疾病，细胞遗传学及肿瘤研究，其中包括各种遗传性出血与血栓性疾病的相关基因的CNVs的检测。尽管MLPA在诊断特定基因外显子CNVs方面技术已经非常成熟，但是MLPA也存在一些比较突出的问题。首先，它对所检测标本的DNA质量要求相对较高，普通的DNA抽提方法无法满足实验要求，需要购买质量较好的商品化试剂盒进行抽提，增加了实验成本，而且检测标本和参比标本必须使用同种DNA抽提方法。
AccuCopy是一种基于竞争性荧光PCR技术的新型检测方法。其扩增模板除待测靶序列之外还包括额外加入的合成片段，即竞争DNA片段，该片段与相应的待测序列极其相似，仅有极微小的差别，通常为数个碱基长度上的差异。这一方法的基本原理为：将一定量的竞争DNA片段与合适量的样本DNA混合，作为随后多重荧光竞争性PCR扩增的模板，同时选择数种已知二倍体模板及其类似合成片段作为参考物(管家基因，分布在不同的染色体上)；扩增后的多重PCR产物经毛细管电泳后对不同基因位点扩增产物以及同一位点的不同模板(样本DNA与竞争DNA)扩增产物根据其长度差异进行分离；通过对荧光峰面积进行分析，将样本DNA荧光峰(S)与竞争DNA荧光峰(C)相比较，获得S/C值后同标准二倍体参考物的S/C值进行校正后获取目标基因的准确拷贝数。
而AccuCopy作为一种检测CNV的新方法，虽然目前使用范围较小，但该方法具有操作简单，对DNA质量要求不高且每次分析所需DNA样本量极少，仅需10ng左右，而MLPA需要高质量的DNA100ng，完成整个反应少于4小时，远远低于MLPA24小时的检测时间。此外该方法的精密度和准确性高，每个反应可以对20个不同的目的片段进行检测。我们利用该技术已经对F8基因的CNV进行了检测，取得了良好的效果，证明AccuCopy技术具有设计灵活，可以根据具体需求随时进行相应的改善与补充。本发明利用AccuCopy技术，设计F11基因CNV检测试剂盒，具有良好的临床价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种F11基因拷贝数变异检测试剂盒，基于多重基因拷贝数检测方法技术，检测F11基因拷贝数变异的试剂盒及检测体系，主要用于检测F11基因缺失或重复突变而导致的凝血因子XI(FXI)质或量的缺陷，以获取F11基因各目标位点的正确拷贝数的检测试剂盒。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种F11基因拷贝数变异检测试剂盒，包括：
1)2×PCR缓冲液；
2)竞争性DNA；
3)PCR引物混合液；
4)TaqDNA聚合酶；
其中，所述PCR引物混合液包括：
a)F11_1，F11_2，F11_3，F11_4，F11_5，F11_6，F11_7，F11_8，F11_10，F11_11，F11_12，F11_13，F11_14，F11_15共14对目标位点的多重PCR引物：SEQIDNO:1-28；
b)参照位点A、参照位点B、参照位点C、参照位点D共4对参照基因的多重PCR引物：SEQIDNO:29-36；
所述竞争性DNA包括：
i)F11_1，F11_2，F11_3，F11_4，F11_5，F11_6，F11_7，F11_8，F11_10，F11_11，F11_12，F11_13，F11_14，F11_15共14个标准序列的内对照DNASEQIDNO:37-50；
ii)参照基因A、参照基因B、参照基因C、参照位点D共4个参照基因的内对照DNASEQIDNO:51-54。
进一步的，所述的每对引物中有一个5’端荧光素标记。
优选的，所述荧光素可选用FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、ROX、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、TAMRA、JOE、BODIPYTMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄。但不仅限于此23种荧光素，如果上述所标记引物的扩增产物利用片断大小可以区分鉴别，可利用同种荧光标记；如果无法以扩增产物片段大小区别则可利用不同种荧光标记区分。
一种F11基因拷贝数变异检测方法，主要包括以下步骤：
1)针对待测F11基因，设计14对目标位点的多重PCR引物，每对引物中的一条具有荧光标记；设计了4对参照基因的多重PCR引物；每对引物中的一条具有荧光标记；上述同种荧光标记的多重PCR引物对应扩增产物的长度有差异；
2)设计针对不同待测的F11基因目标位点和参照基因的内对照DNA片段，所述内对照DNA片段与步骤1中对应的多重PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插入少数1-50个碱基的序列；
3)对所有内对照DNA片段严格定量；
4)将每种内对照DNA片段等量混合，与所述多重PCR引物对待测样品进行多重荧光PCR扩增；
5)扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的片段分开，得到每个条带的位置信息以及荧光强度。
优选的，步骤5之后还包括以下步骤：计算每个F11基因目标位点的样本条带/内对照DNA条带的荧光峰高或面积比，然后将目标位点的该比值除以参照基因的该比值再乘以参照基因的拷贝数即得目标位点的相对拷贝数。
本发明的有益效果是:
1、AccuCopy技术与MLPA一样，可在同一反应管中针对多个外显子进行拷贝数检测。而且在诊断特定基因或者特定区域CNVs方面AccuCopy具有更大的优势和应用前景。AccuCopy技术操作相对简单，只需要常规的PCR仪及ABI3130XL测序仪，而且对模板DNA的质量要求没有MLPA高，各种方法抽提的DNA均能满足试验要求，且仅需10-20ng的模板DNA。同时，应用AccuCopy技术，完成整个试验过程只需要4个小时，而MLPA需要24个小时，效率明显提高。更为重要的是AccuCopy技术的精确度高，变异系数小于5％，并且结果的准确性也高。因此，本项发明采用了AccuCopy技术开发F11基因拷贝数变异检测试剂盒，并检测发现了约9例有大缺失突变的血友病C患者，临床应用效果良好。
2、快速检测：在获得内对照DNA后，只要将样本DNA与内对照DNA混匀后进行多重PCR，然后将PCR产物直接上毛细管荧光电泳仪(如ABI测序仪)即可，整个实验过程仅需要一步PCR循环和一步毛细管电泳，耗时不到4个小时。
3、高精确性：由于目标基因片段与其内对照DNA之间仅有少数几个碱基差别，这两个模板的扩增效率将体现高度一致性，因此最后的扩增产物真实的反应了扩增前两个模板浓度比例，根据我们预测试结果，一个竞争性PCR反应重复3次的标准方差在5％之内，而且如果将目标基因片段与内对照DNA按不同稀释梯度混合进行竞争性PCR，我们发现样本峰与内对照峰面积之比与两个模板的原始浓度比的相关性达到99.9％以上。
附图说明
图1为本发明所述检测方法的原理示意图；
图2为本发明实施例中样品1检测结果示意图；
图3为本发明实施例中样品2检测结果示意图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
F11基因目标位点序列，参照基因及内对照DNA序列信息：
1、F11基因位点1(目标位点)
人标准序列，274bp
AGCTTTGGCTAGCAGGCACACAGGCAAAATCAAGTTCTACATCTGTCCCTGTGTATGTCACTTGTTTGAATACGaaataaaattaaaaaaataaattCAGTGTATTGAGAAAGCAAGCAATTCTCTCAAGGTATATTTCTGACATACTAAGATTTTAACGACTTTCACAAATATGCTGTACTGAGAGAGAATGTTACATAACATTGAGAACTAGTACAAGTAAATATTAAAGTGAAGTGACCATTTCCTACACAAGCTCATTCAGAGGAGGATG
F11_1内对照DNA序列，272bp
AGCTTTGGCTAGCAGGCACACAGGCAAAATCAAGTTCTACATCTGTCCCTGTGTATGTCACTTGTTTGAATACGaaataaaattaaaaaaataaattCAGTGTATTGAGAAAGCAAGCAATTCTCTCAAGGTATATTTCTGACATACTAAGATTTTAACGACTTTCACAAATATGCTGTACTGAGAGAGAATGTTACATAACATTGAGAACTAGTACAAGTAAATATTAAAGTGAAGTGACTTTCCTACACAAGCTCATTCAGAGGAGGATG
2、F11基因位点2(目标位点)
人标准序列，213bp
CATGCACCTTTTTCTCATTGTAGGATGATTTTCTTATATCAAGTGGTACATTTCATTTTATTTACTTCAGTTTCTGGTGGTAAGTAGAGTGTTATCTTAACTATGGGCTGGGAGAGGGAAATCACACTGCAATCTCCACACATGTGGGAGAATCCCACACCATTTATGCCGGGAAGGAAATAAAATGTTTTTATTAACTTCCTGCCTGAGGCT
F11_2内对照DNA序列，211bp
CATGCACCTTTTTCTCATTGTAGGATGATTTTTATATCAAGTGGTACATTTCATTTTATTTACTTCAGTTTCTGGTGGTAAGTAGAGTGTTATCTTAACTATGGGCTGGGAGAGGGAAATCACACTGCAATCTCCACACATGTGGGAGAATCCCACACCATTTATGCCGGGAAGGAAATAAAATGTTTTTATTAACTTCCTGCCTGAGGCT
3、F11基因位点3(目标位点)
人标准序列，171bp
CCAACATAACGCATGCCATGTACTACATCACAGAATGTGTGACTCAGTTGTTGAAGGACACCTGCTTTGAAGGAGGGGACATTACTACGGTCTTCACACCAAGCGCCAAGTACTGCCAGGTAGTCTGCACTTACCACCCAAGATGTTTACTCTTCACTTTCACGGCGGAAT
F11_3内对照DNA序列，169bp
CCAACATAACGCATGCCATGTACTACAACAGAATGTGTGACTCAGTTGTTGAAGGACACCTGCTTTGAAGGAGGGGACATTACTACGGTCTTCACACCAAGCGCCAAGTACTGCCAGGTAGTCTGCACTTACCACCCAAGATGTTTACTCTTCACTTTCACGGCGGAAT
4、F11基因位点4(目标位点)
人标准序列，136bp
AATGCTCACACCAAATAAGCGGTAAGATATGTTCTCAGAATCAACAAATACCAGCTGTGATGTACACATATCGCCACATCGGATGTGGTTTTAAGGCTATGAAATGAAACACTGCTATGTGGAAATAAACCCCCTT
F11_4内对照DNA序列，134bp
AATGCTCACACCAAATAAGCGGTAAGATATTCTCAGAATCAACAAATACCAGCTGTGATGTACACATATCGCCACATCGGATGTGGTTTTAAGGCTATGAAATGAAACACTGCTATGTGGAAATAAACCCCCTT
5、F11基因位点5(目标位点)
人标准序列，128bp
GCTCAGTTGCCAAGAGTGCTCAAGAATGCCAAGAAAGATGCACGGATGACGTCCACTGCCACTTTTTCACGTACGCCACAAGGCAGTTTCCCAGCCTGGAGCATCGGTGAGTGAGTCCCAGGACATTC
F11_5内对照DNA序列，126bp
GCTCAGTTGCCAAGAGTGCTCAAGAACCAAGAAAGATGCACGGATGACGTCCACTGCCACTTTTTCACGTACGCCACAAGGCAGTTTCCCAGCCTGGAGCATCGGTGAGTGAGTCCCAGGACATTC
6、F11基因位点6(目标位点)
人标准序列，185bp
TTCCTCCTTGCAGTTGGAAGAATAAGACACTTTTCCTTTTTCTTTTTATTCAGTAACATTTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGACACCAACCAGAATAACGAAGCTCGATAAAGTGGTGTCTGGATTTTCACTGAAATCCTGTGCACTTTCTAATCTGGGTAATTATCGACTTCTTGATGA
F11_6内对照DNA序列，183bp
TTCCTCCTTGCAGTTGGAAGAATAAGACACTTTTCCTTTTTCTTTTTATTCAGTAACATTTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGACACCAACCAGAATAACGAAGCTCGATAAAGTGGTGTCTGGATTTTCACTGAAATCCTGTGCATTCTAATCTGGGTAATTATCGACTTCTTGATGA
7、F11基因位点7(目标位点)
人标准序列，117bp
CGCGCAGCTTGTATTAGGGACATTTTCCCTAATACGGTGTTTGCAGACAGCAACATCGACAGTGTCATGGCTCCCGATGCTTTTGTCTGTGGCCGAATCTGCACTCATCATCCCGGT
F11_7内对照DNA序列，115bp
CGCGCAGCTTGTATTAGGGACATTTTCCAATACGGTGTTTGCAGACAGCAACATCGACAGTGTCATGGCTCCCGATGCTTTTGTCTGTGGCCGAATCTGCACTCATCATCCCGGT
8、F11基因位点8(目标位点)
人标准序列，232bp
ACCTAAGGGCCATGGAGTGTGACTCCATGGTTTATGGGTGTAACTCCGTGGTTTATGAAGAGTACTTTCAAAATAGGAAAATCTTCACAACTAAGTGCTAGCATGAGCTGACTTTACTTTCTCTAGGTGCTGTAAAAATGTTTTTATGTGTTTGATATGATATATTTCTACTTCCCTTTTGTTTTTGTTAGAAATCTTTGTCTCCTTAAAACATCTGAGAGTGGATTGCCCA
F11_8内对照DNA序列，230bp
ACCTAAGGGCCATGGAGTGTGACTCCATGGTTTATGGGTGTAACTCCGTGGTTTATGAAGAGTACTTTCAAAATAGGAAAATCTTCACAACTAAGTGCTAGCATGAGCTGACTTTACTTTCTCTAGGTGCTGTAAAAATGTTTTTATGTGTTTGATATGATATATTTCTACTTCCCTTTTGTTTTTGTTAGAAATCTTTGTCCTTAAAACATCTGAGAGTGGATTGCCCA
9、F11基因位点10(目标位点)
人标准序列，262bp
CGTCTGCCTGTGAGGTGCATTATGTTTATACCGTTTTGTTTCCAACTGCAGGGGCAAGTGTTACTTAAAGCTTTCTTCAAACGGATCTCCAACTAAAATACTTCACGGGAGAGGAGGCATCTCTGGATACACATTAAGGTTGTGTAAAATGGATAATGGTGAGTATAATGTCACTTGAAAAAATATAGCTGAAGGAATTATTCCATGCTTCATACATCACAATCAAGACTGTCAGTTATAGCCACAGAAGGGAGAACATTCA
F11_10内对照DNA序列，260bp
CGTCTGCCTGTGAGGTGCATTATGTTTATCGTTTTGTTTCCAACTGCAGGGGCAAGTGTTACTTAAAGCTTTCTTCAAACGGATCTCCAACTAAAATACTTCACGGGAGAGGAGGCATCTCTGGATACACATTAAGGTTGTGTAAAATGGATAATGGTGAGTATAATGTCACTTGAAAAAATATAGCTGAAGGAATTATTCCATGCTTCATACATCACAATCAAGACTGTCAGTTATAGCCACAGAAGGGAGAACATTCA
10、F11基因位点11(目标位点)
人标准序列，93bp
CCACCAAAATCAAGCCCAGGATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTCGTGGTGAGTGGCCGTGGCAGGTGACCCTGCACACAACCTCACCCACTC
F11_11内对照DNA序列，91bp
CCACCAAAATCAAGCCCAGGATCGTTGGGAACTGCGTCTGTTCGTGGTGAGTGGCCGTGGCAGGTGACCCTGCACACAACCTCACCCACTC
11、F11基因位点12(目标位点)
人标准序列，107bp
AATGGCAGAAAGCGGGTATGATATTGCCTTGTTGAAACTGGAAACCACAGTGAATTACACAGGTACGGAGAATTTTATCCGGAAAGTTGTCTCCAATGGTGAACTGG
F11_12内对照DNA序列，105bp
AATGGCAGAAAGCGGGTATGATATTGCTGTTGAAACTGGAAACCACAGTGAATTACACAGGTACGGAGAATTTTATCCGGAAAGTTGTCTCCAATGGTGAACTGG
12、F11基因位点13(目标位点)
人标准序列，244bp
TGTGCGATATCGTGCTGAACCTGAGGGAGGAAAATACACGACAACAAGGCAAAAAATGAATATAGTAAACAAAGAAAACACAGATAATGTACAGTGGAAGAAGAGTCTCTTCTGGAAAAGAGGATATATTTTGCGTCTCATATTTAAACCACGATTTTTTAAATTTAGATTCTCAACGACCCATATGCCTGCCTTCCAAAGGAGATAGAAATGTAATATACACTGATTGCTGGGTGACTGGATG
F11_13内对照DNA序列，242bp
TGTGCGATATCGTGCTGAACCTGAGGGAGAAATACACGACAACAAGGCAAAAAATGAATATAGTAAACAAAGAAAACACAGATAATGTACAGTGGAAGAAGAGTCTCTTCTGGAAAAGAGGATATATTTTGCGTCTCATATTTAAACCACGATTTTTTAAATTTAGATTCTCAACGACCCATATGCCTGCCTTCCAAAGGAGATAGAAATGTAATATACACTGATTGCTGGGTGACTGGATG
13、F11基因位点14(目标位点)
人标准序列，87bp
TGACCAACGAAGAGTGCCAGAAGAGATACAGAGGACATAAAATAACCCATAAGATGATCTGTGCCGGCTACAGGGAAGGAGGGAAGG
F11_14内对照DNA序列，85bp
TGACCAACGAAGAGTGCCAGAAGAGATAGAGGACATAAAATAACCCATAAGATGATCTGTGCCGGCTACAGGGAAGGAGGGAAGG
14、F11基因位点15(目标位点)
人标准序列，287bp
CCCCTCGTTCTAGGGAGATTCGGGAGGCCCTCTGTCCTGCAAACACAATGAGGTCTGGCATCTGGTAGGCATCACGAGCTGGGGCGAAGGCTGTGCTCAAAGGGAGCGGCCAGGTGTTTACACCAACGTGGTCGAGTACGTGGACTGGATTCTGGAGAAAACTCAAGCAGTGTGAATGGGTTCCCAGGGGCCATTGGAGTCCCTGAAGGACCCAGGATTTGCTGGGAGAGGGTGTTGAGTTCACTGTGCCAGCATGCTTCCTCCACAGTAACACGCTGAAGGGGCTT
F11_15内对照DNA序列，285bp
CCCCTCGTTCTAGGGAGATTCGGGAGGCCCTCTGTCCTGCAAACACAATGAGGTCTGGCATCTGGTAGGCATCACGAGCTGGGGCGAAGGCTGTGCTCAAAGGGAGCGGCCAGGTGTTTACACCAACGTGGTCGAGTACGTGGACTGGATTCTGGAGAAAACTCAAGCAGTGTGAATGGGTTCCCAGGGGCCATTGGAGTCCCTGAAGGACCCAGGATTTGCTGGGAGAGGGTGTTGAGTTCACTGTGCCAGCATGTCCTCCACAGTAACACGCTGAAGGGGCTT
15、参照基因A
人标准序列，75bp
TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGGCTGTATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA
参照基因A内对照DNA序列，73bp
TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGGCTATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA
16、参照基因B
人标准序列，145bp
CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAGGCTGCAGCGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT
参照基因B内对照DNA序列，143bp
CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAGGGCAGCGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT
17、参照基因C
人标准序列，222bp
AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGCCCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAGGAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCAGCAGTGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC
参照基因C内对照DNA序列220bp
AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGCCCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAGGAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCAGGTGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC
18、参照基因D
人标准序列，298bp
TCCTCCACCAAGCTGATGTGTTCCTTAGCACTGATGGCAATTCTCTTCAGTCTGGGGACAGGTATCATCTCCTTTGGTTTATCAGTGGACGGAGCACGGGCTGCAGGGTTCAACAAAGCATCCATGTCCTCAAAGAAGGCGCAGGGTTCTAGCATGTGGCCATTTCTCACCTTTCGATAGCTTTTCTGGAGACTTTTGAACTTGGTTCGACACTGTTCTGGGGTTCTAAGGAAGCCACATTCTCGCAACCATTCAGCCACAGCACCATACACTTGGCTATTTCGGGGACAGGCCTGAA
参照基因D内对照DNA序列，296bp
TCCTCCACCAAGCTGATGTGTTCCTTAGCACTGATGGCAATTCTCTTCAGTCTGGGGACAGGTATCATCTCCTTTGGTTTATCAGTGGACGGAGCACGGGCTGCAGGGTTCAACAACATCCATGTCCTCAAAGAAGGCGCAGGGTTCTAGCATGTGGCCATTTCTCACCTTTCGATAGCTTTTCTGGAGACTTTTGAACTTGGTTCGACACTGTTCTGGGGTTCTAAGGAAGCCACATTCTCGCAACCATTCAGCCACAGCACCATACACTTGGCTATTTCGGGGACAGGCCTGAA
表1为用于复合扩增体系的引物序列以及所述引物序列的混合物。
表1
实施例
参照图1所示，利用本发明所述的F11基因拷贝数变异检测试剂盒对一个血友病C患者和一个疑似携带者进行F11基因的拷贝数检测。
一、检测样本：样本A为临床诊断患有血友病C的男性，样本B为临床分析疑似为血友病C携带的女性。
二、检测方法
主要包括以下步骤：
将分别为男性和女性待测样本及一个已知目标位点拷贝数的男性参照样本的DNA用Biophotomerterplus(Eppendor)(核酸蛋白测定仪)进行精确定量，然后稀释至20ng/μl作为待测DNA样本待用。
F9基因拷贝数变异检测试剂盒提供以下试剂：2×PCR缓冲液，竞争性DNA，PCR引物混合液，TaqDNA聚合酶。
多重PCR体系(20μl)配置：
PCR反应条件设置如下：95℃10分钟；7个循环的Touchdown程序(94℃20秒，64℃-1℃/循环40秒和72℃2min),28个循环扩增(94℃20秒，60℃30秒和72℃2min)，在72℃延伸2分钟，在60℃延伸60分钟，4℃保存；
取1μlPCR产物用ddH2O稀释10倍，然后取1μl加入到8.8μl的Hi-Di(ABI)和0.2μll的LIZ500分子内标(ABI)中，95℃5min变性后，置于3130XL测序仪上进行毛细管电泳。
结果使用GeneMapper4.0软件进行数据分析，读取峰高等数据，参照图2、图3所示。
数据分析表
1.表2、表3为2个检测样本及1个对照样本的14个位点扩增体系数据。
表2
表3
2.样本DNA峰高值S除以竞争DNA峰高值C
计算每个位点的样本DNA峰(S峰)与内对照DNA峰(C峰)的峰高比(S/C)，得到结果如表4、表5所示。
表4
表5
3.样本的拷贝数
将每个目标位点的S/C比值分别除以参照位点的S/C比值然后乘以参照基因的拷贝数即可获得目标基因的相对拷贝数，使用参照样本对应目标位点的拷贝数为2对检测结果进行进一步的校正，获取目标位点的精确拷贝数，得到结果如表6所示。
表6
三、结论
样本A为F11基因第4-7外显子区域缺失的男性，与临床检测结果一致。
样本B为F11基因第11-15外显子区域一个拷贝的女性，与临床检测结果一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种F11基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括：
1）2×PCR缓冲液；
2）竞争性DNA；
3）PCR引物混合液；
4）TaqDNA聚合酶；
其中，所述PCR引物混合液包括：
a）F11_1，F11_2，F11_3，F11_4，F11_5，F11_6，F11_7，F11_8，F11_10，F11_11，F11_12，F11_13，F11_14，F11_15共14对目标位点的多重PCR引物：SEQIDNO:1-28；
b）参照位点A、参照位点B、参照位点C、参照位点D共4对参照基因的多重PCR引物：SEQIDNO:29-36；
所述竞争性DNA包括：
i）F11_1，F11_2，F11_3，F11_4，F11_5，F11_6，F11_7，F11_8，F11_10，F11_11，F11_12，F11_13，F11_14，F11_15共14个标准序列的内对照DNASEQIDNO:37-50；
ii）参照基因A、参照基因B、参照基因C、参照位点D共4个参照基因的内对照DNASEQIDNO:51-54。
2.根据权利要求1所述的F11基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于：所述的每对引物中有一个5’端荧光素标记。
3.根据权利要求2所述的F11基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于：所述荧光素选用FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、ROX、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、TET、JOE、BODIPYTMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马黄中的一种或多种。
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