CN105039581B

CN105039581B - 一种女性ptc发病风险相关的snp标记及其应用

Info

Publication number: CN105039581B
Application number: CN201510574162.0A
Authority: CN
Inventors: 宁丽峰; 俞琼; 刘雅文; 寇长贵; 史杰萍; 吴燕华; 艾力哲; 王崇; 杨光; 于雅琴
Original assignee: Science Technology Research Institute Of National Health And Family Planning Commission Of People's Republick Of China; Jilin University
Current assignee: Science Technology Research Institute Of National Health And Family Planning Commission Of People's Republick Of China; Jilin University
Priority date: 2015-09-10
Filing date: 2015-09-10
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2035-09-10
Also published as: CN105039581A

Abstract

本发明涉及SNP标记及其应用，具体地，本发明涉及一种女性PTC发病风险相关的SNP标记及其应用。所述SNP标记rs1621位点基因型为杂合AG时，被测女性个体含有PTC易感因子。本发明提供了一种PTC相关的SNP标记，用于检测女性甲状腺乳头状癌发病风险，具有很高的临床应用价值。

Description

一种女性PTC发病风险相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及SNP标记及其应用，具体地，本发明涉及与女性甲状腺乳头状癌(PTC)发病风险相关的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记在制备甲状腺乳头状癌诊断试剂中的应用。

背景技术

甲状腺癌即甲状腺组织的癌变，是一种较为常见的恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的1％，是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,男女发病率比约为1：2.5-3，与一般恶性肿瘤易发于机体机能较差的老年人不同，甲状腺癌的发病更年轻化，多发于青壮年，平均发病年龄约为40岁左右。根据肿瘤组织分化程度，甲状腺癌可以分为甲状腺分化癌(differentiatedthyroid carcinoma DTC)和甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)；分化癌(DTC)根据病理分型，又可分为乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)、滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)及髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)，其中乳头状癌(PTC)和滤泡状癌(FTC)较为常见。目前甲状腺癌的诊断以术中活检为主，配合术前实验室检查、影像学检查及细胞穿刺检查加以确定，主要包括：实验室检查，例如甲状腺功能检查、甲状腺素结合球蛋白(TBG)检查、甲状旁腺素(PTH)检查、降钙素(CT)检查；颈部影像学检查，例如超声检查、CT检查、MRI检查、核素显像；细针穿刺细胞学检查等。虽然甲状腺癌的发病机制尚未明确，随着分子生物学技术的发展，已发现了许多甲状腺癌相关分子标志物，包括甲状腺癌相关癌基因如BRAF、Ret、Ras、Trk、MET基因等。并且大量的分子生物学方面研究得出，甲状腺癌的发生发展是多基因参与的过程，将基础与临床相结合，发现不同基因、蛋白和小RNA的异常变化及调控作用，从分子水平揭示甲状腺癌发生发展机制，可为今后肿瘤的诊断、治疗和预后提供一定的临床应用价值。

SNP多见于二等位多态性，少数情况也可能是3个或4个等位多态性，这种单核苷酸变异可能是转换(如：C/T，和G/A)，也可能是颠换(如：C/A，G/T，C/G和A/T)。C/T转换的发生率总是明显高于其它几种变异，约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。SNP是决定药物个体反应差异性和人类疾病易感性的重要因素。转换的几率之所以高于颠换，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化修饰，可自发地脱去氨基而转换为胸腺嘧啶。单核苷酸多态性在不同人群、不同甲状腺癌病理类型中的分布及作用效果存在很大差异。近年来，在亚洲人群中研究SNPs与甲状腺乳头状癌(PTC)发病风险间关系的报道较多，有研究发现位于BRAF基因上的rs17161747可以增加有癌症家族史人群的PTC的发病风险；rs1042179可以增加吸烟人群的PTC的发病风险；rs3748093则可以增加不喝酒及低于45岁人群的PTC的发病风险。在欧洲人群，同样也有许多关于甲状腺癌SNPs的报道，其中既有SNPs可以增加DTC发病风险的研究，又有降低DTC发病风险的研究。

本发明通过对收集了2373例样本，其中PTC患者881例，甲状腺结节患者577例，正常对照组915例。对与甲状腺癌相关的MET、ALK基因的4个SNP位点进行了分析，结果显示，MET基因rs1621位点在女性中的genotype数据显著，女性中MET基因rs1621位点在“PTC组”与“正常对照组”有显著差别，“PTC组”AG频率显著较高。本发明提供了一种PTC相关的SNP标记，用于检测女性甲状腺乳头状癌发病风险，具有很高的临床应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过检测与女性甲状腺乳头状癌相关的SNP位点，检测和分析受检人是有患病风险，将其从人群筛选出来，提前告知采取相应的预防措施，达到预防为主，防治结合的目的。

发明人通过对2373例样本(其中PTC患者881例，甲状腺结节患者577例，正常对照组915例)的深入研究，发现了MET的SNP位点rs1621和女性PTC发病危险度密切相关，并据此开发了能够判断PTC发病危险度的试剂盒。

本发明的目的在于提供一个和女性PTC发病危险度密切相关的SNP位点rs1621，所述SNP位点基因型为杂合子AG的女性个体PTC发病危险度要远远高于基因型为纯合子AA或GG的女性个体。

本发明的目的还在于提供了用于检测SNP位点基因型的检测试剂，所述检测试剂可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中rs1621位点的基因型即可。

进一步，本领域技术人员已知，检测单核苷酸多态性的方法很多，可分为杂交法、熔解法、电泳法、测序法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法。以杂交法检测SNP的有位点特异寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide，简称ASO)、荧光共振能量转换(fluorescence resonance energy transfer，简称FRET)、金纳米颗粒探针等；以溶解法检测SNP的有动力学位点特异性杂交(dynamic allele-specific hybridization，简称DASH)、DNA熔解分析、变性高效液相色谱法等；以电泳法检测SNP的有SSCP单链构象多态性(single strand conformation polymorphism)、DGGE/TGGE变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis)、杂合双链分析等；以酶学法检测SNP的有ARM扩增不应突变系统(amplification refractory mutation system)、SNuPE单核苷酸引物延伸(single nucleotide primer extension)、SNaPshot法、TaqMan ASO(5’nucleaseassays)、OLA寡核苷酸连接分析(oligonucleotide ligation assay)、CFLP裂解片段长度多态性(cleavase fragment length polymorphism)、EMC错配的酶裂解(enzyme mismatchcleavage)、RNA:DNA错配分析、BESS碱基切除的序列扫描(base excision sequencescanning)、NIRCA非同位素RNA酶裂解分析(nonisotopic rnase-cleavage assay)、寡核苷酸探针的侵略性裂解(invasive cleavage of oligonucleotide probes)、扣锁探针、分子反转探针(molecular inversion probe，简称MIP)、GBA遗传单位分析(genetic bitanalysis)、CAPS裂解扩增多态性序列分析(cleaved amplified polymorphic sequenceanalysis)、PTT蛋白质残缺检测(protein truncation test)、READIT反向酶活性DNA查询(reversed enzyme activity DNA interrogation test)、DNA测序等；用化学法检测SNP的有错配的化学裂解(chemical cleavage of mismatch)、铑嵌入法、高锰酸钾法、离子敏场效应晶体管等；用物理法检测SNP的有基质辅助的激光吸附/离子化飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)、GOOD ASSAY等。其中，SNaPshot技术由美国应用生物公司(ABI)开发，它的原理：先经过多重PCR，将模版体外扩增。然后用虾碱酶消化掉剩余的dNTP。在一个含有测序酶、4种荧光标记的ddNTP(不含dNTP)，以及紧挨多态位点5'端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止。4种双脱氧核苷酸——ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP分别加上荧光标记dR6G、dROX^TM、dTAMRA^TM和dR110，经ABI荧光测序仪检测并由Peak scaner等软件分析后，分别呈现出绿、红、黑、蓝等4种颜色。因此，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型；根据峰的位置和延伸引物设计方案，可以确定该峰所对应的SNP位点。

本发明的目的还在于提供的用于检测SNP位点基因型的检测试剂，所述检测试剂检测rs1621位点是否是AG基因型。进一步的，检测试剂包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物、能够检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。

本发明的目的在于提供一种检测PTC发病危险度的引物，所述引物可以扩增rs1621位点在内的核苷酸序列，引物序列如下：正向引物SEQ ID NO 7：ACGTTGGATGACCCTGAGCAGAACTTTGTG；反向引物SEQ ID NO 8：ACGTTGGATGGTAACCTACACCACATGCAC；所述单碱基延伸引物序列为：；SEQ ID NO 9：(ctaccCCACATGCACTATACAGTAG)。

本发明的目的还在于提供了用于检测SNP位点基因型的试剂盒，该试剂盒包括采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中rs1621位点的基因型。优选的，所述的试剂盒包括检测rs1621位点是否是AG基因型的检测试剂。

进一步，所述的用于检测SNP位点基因型的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物、能够检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。用于扩增rs1621位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物SEQ ID NO 7；反向引物SEQ ID NO 8；所述单碱基延伸引物序列为：SEQ ID NO 9。

本发明提供了用于判断女性个体PTC发病危险度的检测试剂盒，该试剂盒的判断原理是利用试剂盒中的试剂检测rs1621位点的基因型，根据所测女性个体的上述SNP位点的基因型判断其PTC发病危险度。当rs1621位点基因型为杂合AG时，被测女性个体属于PTC发病危险度高的人群。

本发明还提供了rs1621位点在制备一种判断女性PTC发病危险度的检测试剂中的应用。所述试剂可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP基因型所需的试剂，只要其能够检测样本中rs1621位点的基因型即可。优选采用正向引物SEQ ID NO 7；反向引物SEQ IDNO 8；所述单碱基延伸引物序列为：SEQ ID NO 9检测样本中rs1621位点的基因型。

本发明还提供了rs1621位点在制备检测SNP位点基因型的试剂盒中的应用。所述试剂盒中包括能够检测SNP位点基因型的试剂。在一个具体的实施方案中，所述试剂包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。用于扩增rs1621位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物为SEQ ID NO 7；反向引物为SEQ ID NO 8。所述单碱基延伸引物序列为SEQ ID NO 9。

本发明还提供了rs1621位点在制备判断女性PTC发病危险度的检测试剂盒中的应用。所述试剂盒的判断原理是利用试剂盒中的试剂检测rs1621位点的基因型，根据所测患者的上述SNP位点的基因型判断个体PTC发病危险度。当rs1621位点基因型为杂合AG时，被测女性个体属于PTC发病危险度高的人群。

本发明还提供了用于检测rs1621位点基因型的试剂在制备用于检测rs1621位点基因型的试剂盒中的应用。

本发明还提供了用于检测rs1621位点基因型的试剂在制备用于判断女性PTC发病危险度的检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的的PTC保护因子的检测方法，所述的检测方法包括：

1)提取离体外周血的基因组DNA；

2)检测rs1621位点是否是AG基因型。

优选的，基因组DNA用全血DNA提取试剂盒。

进一步可通过本领域技术人员熟知的检测单核苷酸多态性的方法检测rs1621位点是否是AG基因型，包括杂交法、熔解法、电泳法、测序法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法。

所述离体外周血中rs1621位点基因型为杂合AG时，被测女性样本含有PTC易感因子。

本发明优点和有益效果：检测流程相对简便、设备要求低、成本低廉，有利于临床推广。

若某一基因型频率不随世代变化而处于平衡状态的现象，称为Hardy-Weinberg平衡。假设某一基因座上有一对等位基因为N(野生型)和A(突变型)，在群体中等位基因频率分别为P和q(p+q＝1)。如果个体所携带的等位基因是独立遗传的，那么等位基因频率分布应符合二项分布，即等位基因N和A所组成的三种基因型NN，NA，AA的概率分别p²、2pq、q²。在一个理想的群体中(基因型频率无性别差异、群体容量无限大、随机婚配、无突变和回复突变、无自然选择等)，其基因型频率分布应符合H-W平衡。通过H-W平衡检验可以该研究所选的研究对象是否具有代表性。应用软件进行拟合优度的χ²检验来判别病例组和对照组的基因型分布是否符合H-W平衡。若P>0.05，说明研究样本符合H-W平衡。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1

1.研究对象

本研究收集了2373例血液标本，其中PTC患者881例，甲状腺结节患者577例，正常对照组915例。本研究还采用自行设计的甲状腺疾病患者调查表进行了其他调查，其内容包括：性别、年龄、民族、、血型、职业、文化水平、婚姻状况、既往史和家族史等。

2.结果

(1)统计结果：人口统计学特征描述(患者年龄、性别等)

性别：做卡方检验后，p＝0.9906远大于0.05，因此三组的性别构成并无显著不同。

表1

年龄：平均年龄44.9±9.53岁，中位年龄45岁，范围在[12岁，75岁]。分组做方差分析后，p<0.001，三组的年龄显著不同。用LSD(Least significant difference)法做两两检验，甲状腺结节患者的平均年龄显著大于其他两组(p<0.001)，PTC组和正常对照组无明显差别(p＝0.947)。

表2

实施例2

SNPs位点的选择

基于前期的实验工作基础，我们选取MET和ALK基因为候选基因，进一步的，选取MET基因的rs1621和rs6566位点，选取ALK基因的rs1881420和rs1881421位点。

引物设计：

根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成，所设计的引物序列见表3。

表3

实施例3

2.1人全血基因组DNA提取

采用液体纯化提取DNA试剂盒(Promega美国)，提取外周血白细胞中的基因组DNA。具体操作步骤如下：

①取900μL细胞裂解液加入1.5mL Eppendorf管中；

②加入200μL充分解冻的全血，颠倒混合4～5次，充分混匀，室温下作用20min；

③13,000rpm离心3min，弃上清，然后充分振荡，将沉淀再悬浮；

④加入300μL核裂解液，轻轻振荡充分混匀，37℃水浴作用30min；

⑤加入1.5μL RNA降解酶，充分混匀，37℃水浴作用15min；

⑥加入100μL蛋白沉淀液，振荡混匀，室温作用20min；

⑦13,000rpm离心3min，将上清液移入已加入300μL异丙醇的Eppendorf离心管中，轻轻颠倒混匀，作用20min；

⑧13,000rpm离心3min，弃上清，加入300μL 70％乙醇，轻轻摇匀；

⑨13,000rpm离心3min，弃上清，将Eppendorf管室温凉干；

⑩加入100μL DNA溶解液，混匀，放置65℃水浴作用1h(或4℃过夜)。2.2DNA含量及纯度的检测

用紫外分光光度计，分别取波长为260nm和280nm两个波段，测得DNA溶液在此波长的OD260值及OD280值，利用以下公式计算DNA含量和DNA纯度：

DNA含量＝50μg/mL×OD260×稀释倍数；

DNA纯度＝OD260/OD280。

需控制DNA浓度大于15ng/uL，DNA的纯度在1.6～1.9之间，便于下一步的实验。

2.3 Sequenom MassArray系统基因分型步骤

SNP的基因型检测应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)，SNPs Sequenom质谱分析方法的原理是：

首先通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,然后加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用MALDI-TOF-MS检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。SNPs的质谱分析方法特点是应用MALDI-TOF质谱进行SNPs分析是基于根据不同的分子量可以将等位基因排序。如产物中存在两个单核苷酸多态性位点，每一个位点有一个等位基因，那么该等位基因是纯合子。如果两个单核苷酸多态性都是杂合子，那么质谱仪将会捕捉到四个不同的波谱峰。不同的波谱峰形状代表电荷标记的不同质量。在多重分析中如果两个不同的SNP位点的任意两个等位基因质量相同时，电荷标记还可以用来移动某一个特异性的SNP位点。

其主要的实验步骤包括：

﹙1﹚PCR扩增反应

1)按照384板配置相关试剂；

2)DNA样本浓度标化至10～20ng/μL，1,000g离心3分钟备用。

3)将各PCR组份溶解后置于冰上备用(注意酶一定要保存在冰上，防止高温

中失活。

4)扩增PCR反应体系

表4

5)将上述配好的试剂小心混匀后分在12孔的连排管中，每孔加入混匀试剂148uL。

6)12道移液器吸取混合试剂4μL加入到384孔板中，其中H11、H12、P11、P12孔留作对照，其孔中不加入引物，只含其他组份。

7)每板按照标记好的样本板加入相应的模板，加入体积为1μL。

8)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。

9)扩增PCR反应程序：

94℃15min预反应，接45个循环反应(94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃再延伸3min，4℃保持。

10)配置1％琼脂糖凝胶，每排留有25个孔，其中一个作为标记孔，其他加入PCR反应后的产物。

11)进行电泳，吸取2μL上样缓冲液，1μL PCR产物，电压110V，电流75mA，40分钟后观察结果，如结果良好可继续SAP反应。

2.4 SAP反应

1)按照384板配置相关试剂(表5)。

表5

2)将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μL/板。

3)使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μL到384板的每个孔中。

4)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。

5)SAP反应程序：

37℃40min，85℃5min，4℃保持。

2.5延伸反应

1)按照384板配置相关试剂(表6)

表6

3)使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μL到384孔板的每个孔中。

5)延伸反应程序：

表7

94℃	30sec
			94℃	5sec
52℃	5sec	40cycles
			80℃	5sec	5cycles
72℃	3min
			4℃	∞

2.6完成去盐，导入Assay中，样本表格输入，建板，点样，Mass ARRAY分析，质量控制及输出报告等实验工作。

去盐

1)在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。

2)使用Liquid Handler机器臂在384样本板的每个孔中加16μL水。

3)将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。

4)将384样本板放置离心机中室温旋转混匀60分钟。

导入Assay中

1)打开Typer4.0。

2)选择Assay Editor。

3)右键单击添加一个新的项目。

4)右键新建项目名称或现有项目的名称并选择进口检测组。

5)取消SNP Group选项，将自动取消设计文件和浏览阵列组(.xls文件)。

6)可以键入一个新的阵列组ID或默认文件名。

7)单击导入，然后关闭。

8)关闭阵列编辑器。

样本表格输入

1)根据384加样顺序创建样本清单。

2)打开Typer4.0，选择Plate Editor。

3)单击Sample Tab，右键新建样本文件夹。

4)右键新建样本清单。

5)打开并浏览创建的样本清单，输入样本组名称，导入完成。

建板

1)打开Typer4.0。

2)选择Plate Editor。

3)右键单击添加新用户。

4)右键单击添加新项目。

5)右键单击添加板。

6)板型ID和选择板式。

7)找到Assay Tab。

8)选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加Assay。

9)找到Sample Tab，选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加Sample。

10)保存板文件。

点样

1)离心：去盐后的产物4,000转/分离心4分钟，使树脂沉淀。

2)核查体积。

a)在主菜单中选择Transfer。

b)加载一个Method。

c)设定Dispense Speed参数。

d)选定Volume Check。

e)选Run并且观察体积。

f)依据体积调整Dispense Speed参数获得合适的体积。

3)在芯片上点样，方法同体积核查步骤。

4)在芯片上点Calibrant，注意在Method里选中Calibrant。49

Mass ARRAY分析

1)在RT计算机上打开RT程序。

2)按下COMPACT上的Probe Scout Plate Out按钮，然后把芯片放到Scout板上并放回COMPACT中，然后按Probe In按钮。

3)打开Chip Linker并连接CHIP和Plate。

a)双击Chip Linker。

b)找到在Plate Editor里建立的板。

c)选择iPLEX模式。

d)选择Genotype或者Genotype+Area模式。

e)选择Dispenser类型。

f)输入实验名称。

g)输入芯片条形码。

h)选择添加、创建。

4)把条形码名称输入Acquire中，点击Barcode Report，结果正确后点击AUTO RUNSETUP tab。

5)CHIP扫描。

质量控制

1)打开Typer4.0，点击Type Analyzer。

2)打开扫描结果。

3)检查质控点。

4)查看Assay的得率和分型图。

输出报告

1)分型图。

2)分别导出原始的基因分型数据和结合分型图后的基因分型数据。

3)检查数据文件的完整性和正确性。

4)将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。

实施例4

4.1分析方法：

统计分析，使用包为dgcGenetics和genetics。其中涉及卡方检验、logistic回归等分析。所有检验为双侧检验，检验水准为α＝0.05。具体地：

(1)单个SNP分析：对每一个变量(SNP信息)，针对“正常对照组”和“甲状腺结节组”、“PTC组”进行卡方检验：例如考察rs1621中AA与AG、GG的比例在不同组别中是否有差异。

(2)SNP与性别分析：针对每一个SNP，分性别进行检验，并采用加性模型计算风险大小。

4.2分析结果：

单个SNP比较分析：

用卡方检验查看各个基因型的频数差异，本实验中测的4个SNP位点并没有p-value<0.05且符合Hardy-Weinberg平衡的。

表8

p-value(genotype)是不同组AA、AG和GG频数做卡方检验的p-value，p-value(allele)是不同组的A和G频数做卡方检验的p-value。pHWE(control)是对照组符合Hardy-Weinberg平衡的概率，pHWE(all)是所有样本符合Hardy-Weinberg平衡的概率。一般要求pHWE(control)大于0.05结果才可信，不然样本中存在种群结构使得结果有误差。本次分析中ALK基因的两个SNP位点pHWE(control)小于0.05，不符合Hardy-Weinberg平衡。

性别与SNP的交互作用：

用性别分层后做检验，看每个性别中不同分组各基因型的频数差异。四个位点中只有MET基因的rs1621位点在女性中的genotype数据显著(P小于0.05)。

表9

进一步的，对女性中MET基因rs1621位点在PTC组、甲状腺结节组和正常对照组两两比较结果如下表10。

表10

	恶性肿瘤	良性肿瘤	对照
				恶性肿瘤	-	0.078	0.011
良性肿瘤	-	-	0.908
				对照	-	-	-

“PTC组”与“正常对照组”有显著差别，“PTC组”AG频率显著较高，而“AA”、“GG”频率较低。(采用Bonferroni correction校正后检验水准α’＝0.017)。OR值：以major allele的风险作为1(base)，采用加性模型(additive model)，通过logistic回归来计算基因型的风险大小(odds ratio，OR)。以下表11结果是分别计算“PTC组”/“甲状腺结节组”对“正常对照组”的相对风险。

表11

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一套引物在制备判断女性甲状腺乳头状癌发病危险度的检测试剂中的应用，其特征在于，该套引物中，正向引物为SEQ ID NO 7；反向引物为SEQ ID NO 8；单碱基延伸引物序列为SEQ ID NO 9。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测试剂检测SNP位点是rs1621位点。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测试剂检测rs1621位点是否是AG基因型。