CN110857451A

CN110857451A - 一种检测复发性流产的微缺失或/和微重复的引物组合、mlpa探针、基因芯片及试剂盒

Info

Publication number: CN110857451A
Application number: CN201911130559.5A
Authority: CN
Inventors: 王彬彬; 王晶
Original assignee: Institute Of Science And Technology National Health Commission; Capital Medical University
Current assignee: Institute Of Science And Technology National Health Commission; Capital Medical University
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN110857451B

Abstract

本发明提供一种检测复发性流产的微缺失或/和微重复的引物组合、MLPA探针、基因芯片及试剂盒，涉及生物技术领域，所述引物组合具有如SEQ ID NO.1‑21所示的核苷酸序列，可以被制备成MLPA探针、基因芯片及试剂盒或构建体、重组细胞，还可以作为快速筛选易患复发性流产的生物样品系统的主要部件。本发明提供的引物组合及其应用可以同时检测多个位点的复发性流产微缺失或/和微重复，特异性好，反应灵敏，检测时间短，方法简单、从点突变到大染色体缺失/插入都可以进行检测，成本低廉，临床应用价值高。

Description

一种检测复发性流产的微缺失或/和微重复的引物组合、MLPA 探针、基因芯片及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测易患复发性流产的生物样品的引物组合及其制备的MLPA探针、基因芯片、试剂盒、系统及方法。

背景技术

复发性流产(Recurrent Spontaneous Abortion,RSA)为妇科常见病理性妊娠，是指连续发生2次或2次以上的自然流产者。研究表明，导致复发性流产的原因很多，其中，遗传因素与复发性流产发生密切相关，其中染色体微缺失和微重复也是遗传因素的常见类型。染色体微缺失/微重复是指染色体上出现长度为1.5kb-10Mb的缺失或重复。尽管每种微缺失或/和微重复综合征发病率都很低，但由于临床检测技术的限制，大量的由于微缺失或/和微重复导致的复发性流产患者在孕前检查和诊断中无法检出，导致患者身心乃至家庭遭受重创和巨大经济负担。因此，如果在备孕期间或胚胎移植前能够检测染色体的微缺失/微重复，将对复发性流产患者具有很重要的意义。

由于妊娠是一个多环节的复杂过程，因此，目前对复发性流产的研究也较多，中国专利文献CN 107177696A通过检测TNF-α、CTLA4、MTHFR三个遗传易感基因对复发性流产进行预防和治疗；中国专利文献CN 103221421A通过对检查非母系样品、特别是从(预期)生物学父亲获得的样品中的人膜联蛋白A5(ANXA5)启动子，或检查从所述女性获得的绒毛膜活检或羊膜穿刺样品中的人膜联蛋白A5(ANXA5)启动子，或在将体外受精胚胎植入所述女性受试者之前，检查从所述体外受精胚胎的桑椹胚期之前或期间获得的单细胞样品中的人膜联蛋白A5(ANXA5)启动子中的某些核苷酸点突变对复发性流产倾向进行检测；中国专利文献CN108486241A通过检测血清mRNA生物标志物实现复发性流产的诊断；中国专利文献CN106987593A通过检测ESR2基因和AR基因的突变判断生物样本是否易患复发性流产。

鉴于导致复发性流产的原因很多，而目前的检测方法不一定能对所有的复发性流产进行检测。而且，目前微缺失/和微重复诊断技术仍存在检出率低、只能进行靶向性诊断等问题，例如主要进行微缺失/和微重复诊断技术中的高分辨率核型分析方法仅能发现少部分较大片段的微缺失异常，荧光原位杂交方法特异性好，但是只能进行靶向性诊断。

发明内容

为解决现有技术中微缺失/和微重复导致的复发性流产检测率低的问题以及使待测生物样品是否为复发性流产生物样本的检测更完善和准确，本发明提供一种可以快速筛选和检测是否为易患复发性流产的生物样品的MLPA探针组合、试剂盒、基因芯片和系统，本发明提供的试剂盒、MLPA探针、基因芯片和系统对待检测的生物样本要求低，方法简单、成本低廉，临床应用价值高。

为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种检测复发性流产的生物样品的引物组合，其具有如SEQ ID NO.1-21所示的核苷酸序列。

其中，所述引物组合可以同时对生物样本中的AKT1基因、PDZD2基因的中的微缺失/微重复进行检测，从而筛选待测生物样品是否为易患复发性流产的生物样品。

为实现本发明的技术目的，本发明另一方面提供一种检测复发性流产的生物样品的MLPA探针组合，其具有如SEQ ID NO.1-21所示的核苷酸序列，分别为：

其中，所述每个MLPA探针上具有荧光标记和通用引物。

其中，所述通用引物对依次具有如SEQ ID NO.22-23所示的核苷酸序列。

其中，上述探针组合可以同时对生物样本中的AKT1基因、PDZD2基因的中的微缺失/微重复进行检测，从而筛选待测生物样品是否为易患复发性流产的生物样品。

本发明再一方面提供一种检测复发性流产的生物样品的试剂盒，其具有上述的MLPA探针组合。

其中，所述试剂盒中还包括反应液。

其中，所述反应液包括常规的用于MLPA杂交连接反应的缓冲剂、连接酶、聚合酶以及用于PCR反应的缓冲剂、连接酶、聚合酶或其他相关试剂。

具体的，所述杂交反应剂为：

其中，扩增反应剂为：

其中，上述试剂可均以通过市售获得。

为实现本发明的技术目的，本发明还提供一种检测复发性流产的生物样品的基因芯片，包括固相载体及附着在其上的基因探针。

其中，所述基因探针具有如SEQ ID NO.1-21所示的核苷酸序列。

其中，所述固相载体为适用于制作基因芯片的任一一种固相载体。

为实现本发明的技术目的，本发明再提供一种检测复发性流产的生物样品的系统，包括：

全基因组DNA提取单元，用于提取所述生物样品中的全基因组DNA样本；

全基因组DNA样本处理单元，用于使变性后的全基因组DNA样本与所述引物组合制成的MLPA探针组合或所述MLPA探针组合或试剂盒中的MLPA探针组合杂交和扩增，获得分析样本；

样本分析单元，用于判断分析样本是否为易患复发性流产的生物样品，并给出判断结果。

其中，所述生物样品可以是任意一种可以提取出的全基因组DNA的样本，包括但不限于血液、羊水细胞、皮肤组织等。

其中，所述全基因组DNA样本处理单元中包括杂交反应剂和扩增反应剂。

其中，所述杂交反应剂为：

其中，扩增反应剂为：

其中，所述全基因组DNA样本处理单元中使全基因组DNA样本变性的操作条件是将全基因组DNA在98℃处理5分钟。

其中，所述全基因组DNA样本处理单元中使变性后的全基因组DNA样本与所述引物组合或与MLPA探针组合进行杂交的操作条件是将变性后的全基因组DNA样本与引物组合或与MLPA探针组合在95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时。

其中，所述使杂交产物进行扩增的操作条件是：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。

其中，所述样本分析单元采用毛细管电泳装置，通过电泳检测结果判断分析样本是否为易患复发性流产的生物样品。

为实现本发明的技术目的，本发明再提供一种检测复发性流产微缺失或/和微重复的方法，其采用上述引物组合或MLPA探针组合或试剂盒或系统对待测生物样品进行检测，包括：

提取待测生物样品的全基因组DNA溶液后，进行变性处理，得到变性后的基因组DNA；

利用所述引物组合制成的MLPA探针组合或所述MLPA探针组合或试剂盒中的MLPA探针组合与变形后的基因组DNA进行杂交连接反应，获得连接产物；

将得到连接产物进行PCR反应后，对PCR扩增产物进行毛细管电泳，得到毛细管电泳结果；

对毛细管电泳结果进行分析后，判断待测生物样品是否为复发性流产微缺失或/和微重复样品。

其中，所述变性处理是将DNA溶液在98℃处理5分钟。

其中，所述杂交连接反应的反应液为：

其中，所述杂交连接反应的反应条件为在95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时。

其中，所述PCR反应的反应液为：

其中，所述PCR反应的反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。

有益效果

1、本发明方法利用具有SEQ ID NO.1-23所示的核苷酸序列的引物组合或MLPA探针或基因芯片或试剂盒或系统可以在一个管中同时检测生物样品中多个位点的微缺失或/和微重复，从而判断该生物样品是否为微缺失或/和微重复的复发性流产样品，特异性好，反应灵敏，检测时间短，方法简单，从点突变到大染色体缺失/插入都可以进行检测，成本低廉，临床应用价值高。

2、本发明提供的引物组合进一步丰富了复发性流产的致病基因图谱，同时也为复发性流产的早期致病基因筛查研究和干预治疗研究提供科学依据。

附图说明

图1是本发明实施例2进行毛细管电泳的检测结果图；

图2是本发明实施例3提供的快速筛选易患复发性流产的生物样品的系统。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

此外，还需要说明的是，本发明提供的筛选易患复发性流产的生物样品的引物组合、MLPA探针、试剂盒、基因芯片、系统以及方法均是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。

在本文前面筛选易患复发性流产的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患复发性流产的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

实施例1引物、探针及试剂盒

1、引物组合

依据内参基因GAPDH和目的基因AKT1，PDZD2序列信息，设计引物，并将设计得到的引物利进行二级结构评估和Tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下检测出待测生物样品的复发性流产微缺失或/和微重复的本发明的SEQ ID NO.1-21所示的核苷酸序列的引物序列依次如表1所示：

表1本发明提供的引物组合序列

二级结构评估及Tm值评估可以采用本领域常用的任一一种方式进行，例如在本发明的一个实施例中，采用DNA folding form评估其二级结构，具体是(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)；采用MLPA自带软件RaW-Probe评估其Tm值。

需要说明的是，本发明提供的上述的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的，因为它可以用于制备MLPA探针。

需要说明的是，本发明提供的上述引物组合还可以用于构建载体或形成重组细胞，以便能够有效地用作复发性流产相关研究的模型。其中，构建载体可以用于转化受体细胞从而形成重组细胞，所述构建载体的载体可以是为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒中的一种，所述受体细胞可以是大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞等，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

2、MLPA探针

根据MLPA原理，将上述引物进行标记，并与通用引物序列结合，形成MLPA探针，其中，本发明的MLPA探针所使用的通用引物的序列如SEQ ID NO.22-23所示；所述对上述引物标记采用常规技术，例如荧光标记，通用引物序列为：

5'端通用引物：gggttccctaagggttgga

3'端通过引物：tctagattggatcttgctggcac。

3、基因芯片

本申请的基因芯片是采用常规方法将步骤2获得的探针固定在聚合物基片行，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成本申请的MLPA探针。本申请的基因芯片的使用方法与常规方法相同。

4、试剂盒

该试剂盒包括步骤1中的引物组合，或步骤2中的MLPA探针。

优选条件是包括步骤2中的MLPA探针。

当试剂盒中包括步骤2中的MLPA探针时，其中还包括杂交连接反应用的反应液和PCR反应用的反应液。

进一步的，杂交连接反应用的反应液为本领域MLPA反应常规使用的缓冲液、连接酶或其他相关试剂；PCR反应液为本领域常规使用的PCR反应常规使用的Buffer、dNTP、MgCl₂、MLPA-F、MLPA-R、Hot start Taq、ddHB2BO。

进一步的，本发明的试剂盒所使用的条件包括杂交连接反应条件和PCR反应条件，其中，杂交连接反应条件为95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时；PCR反应的条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。

实施例2快速筛选易患复发性流产的生物样品的系统

如图2所示，本发明提供的快速筛选易患复发性流产的生物样品的系统包括：

101：全基因组DNA提取单元，用于提取所述生物样品中的全基因组DNA样本；102：全基因组DNA样本处理单元，用于使全基因组DNA提取单元中的全基因组DNA样本变性，并与所述引物组合制成的MLPA探针组合或所述MLPA探针组合或试剂盒中的MLPA探针组合杂交，最后使杂交产物进行扩增，获得分析样本；103：样本分析单元，用于判断分析样本是否为易患复发性流产的生物样品，并给出判断结果。

具体的，所述102：全基因组DNA样本处理单元包括：1021全基因组DN A变性处理模块；1022全基因组DNA杂交处理模块和1023杂交产物扩增处理模块。

在本文前面筛选易患复发性流产的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易患复发性流产的生物样品的系统，在此不再赘述。

实施例3具有正常DNA的生物样品的筛选和检测

利用实施例1中的试剂盒对具有正常DNA血液生物样品进行检测，为了体现本发明提供MLPA探针组合的高灵敏度和高特异性，本申请还设计了非目标基因TBX6、LHX1、HNF1B、HFE2、GSTT1、CRKT1、CRKL、DUSPP22和WNT3的MLPA探针，上述基因的MLPA探针序列如表1所示，并加入到上述MLPA探针组合中，筛选和检测的具体操作如下：

表2其他基因的MLPA探针

1、样本的获取及处理

采用常规方法采集外周血，该外周血是从人体中取出的离体生物样品，并采用常规的DNA提取试剂盒提取样本中的全基因组DNA，获得全基因组DNA样本，利用ThermoScientific NanoDrop 2000紫外分光光度计测量DNA样本浓度，并稀释至20ng/μl，备用；

抽取其中的5μl基因组DNA(总量为100ng)于200μl PCR反应管中98℃变性5分钟，得到变性后的全基因组DNA。

当然，生物样本还可以使用其他任一一种能够提取全基因组DNA的离体生物样品，例如羊水细胞、皮肤组织、毛发、唾液和肌肉等。

2、反应液的配制

将试剂盒中的每条探针分别稀释至500fmol/ul，配制成Probe Mix；然后配制杂交连接反应液，即

3、杂交连接反应

取步骤2配制的杂交反应液5μl，加入步骤1的PCR反应管中，枪头反复吹吸至完全混匀后，在95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时，得到连接产物。

4、PCR扩增

配制PCR反应液，并以每管24μl分装于200μl PCR薄壁反应管中，取步骤3得到的连接产物1μl作为PCR反应模板进行PCR扩增，得到扩增产物。

其中，PCR反应液为：

PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。

5、数据分析

将得到扩增产物均做3个平行管，并设立有内参基因，进行毛细管电泳实验，得到如图1所示的电泳图，将试验结果采集的荧光数据利用ABI 3730XL测序仪处理后，得到峰型的面积数据。取每个基因的峰型面积(area)数据的平均值(DQ值)，通过相对定量的方式计算是否存在拷贝数变异，即：

当计算结果为0.80<DQ<1.20，则判定样本正常，没有发生微缺失(Normal)；

当计算结果为DQ＝0.00，则判断样本为纯合子缺失(Homozygous deletion)；

当计算结果为0.40<DQ<0.65，则判断样本为杂合子缺失(Heterozygousdeletion)；

当计算结果为1.3<DQ<1.65，则判断样本为杂合子重复(Heterozygousduplication)；

当计算结果为1.75<DQ<2.15，则判断样本杂合子/纯合子三倍重复(Heterozygoustriplication/homozygous)。

根据图1所示的毛细管电泳图可以看出，本发明的包含多个引物的MLPA探针对一个样本进行多基因检测的峰图清晰，无噪音，尤其是本申请提供的MLPA探针组合中即便包括非目标基因的MLPA探针，也可以实现目标基因AKT1、PDZD2的准确高效的识别和检测，可见，本发明提供MLPA探针特异性好、灵敏度高，而且多对MLPA探针可以同时对一个样本进行检测，效率高，成本低廉。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易患复发性流产的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

应用实施例

对相关候选基因在复发性流产病例和对照利用多重连接探针扩增技术(MLPA)进行分析。病例组包括443例复发性流产患者的生物样品，对照为202例正常生育且无流产史女性的生物样品，且上述样品已经利用现有技术确认，病例组中AKT1基因存在1个微缺失，PDZD2基因存在2个微缺失。本发明利用上述实施例提供的MLPA探针或试剂盒或系统再次对上述生物样品进行检测和筛选，检测结果如表3所示：

表3生物样品检测结果

根据表1的检测结果可知，在病例组的确检出1例AKT1基因拷贝数缺失，检出2例PDZD2基因拷贝数变异，而对照组中均未检出，且检测的生物样品与已知检测结果相同。试验还发现本发明方法一次性就可以检测一个样本是否发生了微重复或微缺失，而且可以判断该样本中发生了微重复或微缺失的具体基因及发生类型，仅需8小时，远低于采用常规方法进行需要对样本进行多次的不同基因检测才能判定样本是否发生了微重复或/和微缺失所用的长达2天以上的检测时长。

可见，本发明方法具有与常规方法同样的检测效果，而且检测效率高，准确率好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 国家卫生健康委科学技术研究所

首都医科大学

<120> 一种检测复发性流产的微缺失或/和微重复的引物组合、MLPA探针、基因芯片及试剂盒

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcagtgtt gctcagacgt ttgcattttc aaagatttgt t 41

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgttgtgtg aagtctcctg atttttgaag gctgacaatt tt 42

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taattagtaa gttccctgtt gttcaaactc cttgcttggc aaaa 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaagtgga acattttttt ccgagtgtca gtatgaaaaa tggt 44

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtatacgt ttctgtgcag acgtacacca ccctgtgtga gcacagat 48

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtatttttac acatggctct ggacagctgt ctgactctgt cagca 45

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tatagaagat gattagcttc agttagttca ttggttctca acccttttat tgtcct 56

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacatccctg cctggagaaa gattaaattt aacttctctg taacatgaga aaataa 56

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atactaagga ataagatttt gttgggtagg atcgagcttt ggtaggagga ggagga 56

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccttcagatt ggctgctttc acttagtaac atgcctttaa gtttccttca tgtcttcg 58

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttccttagta gctcatttct tttcagtgtc atgtaatact ccgttgtctg cgtgtgcc 58

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcggtttatc tagtcactta ctcaaggaca tcttggtcat ttccaagttt tggcaat 57

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagtgttcaa ggcatgacta gtatttctaa ttagcctaat aaattcccac actttctgaa 60

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtgaacacta atggtattgt cctactaaaa ctgtcattgt ttcttttttt ttaactggt 59

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagtcattca caataagcta tgagggtaaa taaatatgtg ttataacaag taaaccgta 59

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aggaaatgaa tgggcagcc 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gttaggaaag cctgccggt 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgctcccact cctgatttct g 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaaaagagct aggaaggaca gg 22

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggttcataac tgtctgcttc tctg 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgtaggctc atttgcaggg ggga 24

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gggttcccta agggttgga 19

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tctagattgg atcttgctgg cac 23

Claims

1.一种检测复发性流产的生物样品的引物组合，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1-21所示的核苷酸序列。

2.一种检测复发性流产的生物样品的MLPA探针组合，其特征在于，其具有如SEQ IDNO.1-21所示的核苷酸序列，其中，所述每个MLPA探针上具有荧光标记和通用引物，所述通用引物具有如SEQ ID NO.22-23所示的核苷酸序列。

3.一种检测复发性流产的生物样品的试剂盒，其特征在于，其具有权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的MLPA探针组合。

4.一种检测复发性流产的生物样品的基因芯片，其特征在于，其具有包括固相载体及附着在其上的如权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的MLPA探针组合。

5.一种检测复发性流产的生物样品的构建体，其特征在于，其是具有权利要求1所述的引物组合的载体。

6.一种检测复发性流产的生物样品的重组细胞，其特征在于，其是将具有权利要求1所述的引物组合的载体转化到受体细胞形成。

7.一种检测复发性流产的生物样品的系统，其特征在于，包括：

全基因组DNA样本处理单元，用于使全基因组DNA样本变性，并与所述引物组合制成的MLPA探针组合或所述MLPA探针组合或试剂盒中的MLPA探针组合杂交，最后使杂交产物进行扩增，获得分析样本；

8.一种检测复发性流产微缺失或/和微重复的方法，其特征在于，其具有权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的MLPA探针组合或权利要求3试剂盒或权利要求4所述的系统对待测生物样品进行检测，包括：

提取待测生物样品的全基因组DNA后，进行变性处理，得到变性后的基因组DNA；

9.一种将权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的MLPA探针组合或权利要求3试剂盒或权利要求4所述的系统用于筛选或检测具有AKT1基因或/和PDZD2基因微缺失/微重复的生物样品的应用。

10.一种将权利要求1所述的引物组合用于构建载体或形成重组细胞的用途，以便能够有效地用作复发性流产相关研究的模型。