CN102250883B - 一种荧光标记的x-str基因座复合pcr方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种荧光标记的X-STR基因座复合PCR方法及其应用，该系统复合扩增分析12个基因座：GATA172D05、DXS6789、DXS10074、DXS10078、GATA165B12、DXS6797、DXS6803、DXS6804、GATA31E08、DXS7130、DXS9895和DXS6810，这12个基因座引物分别用FAM、HEX、TAMRA、ROX四种荧光标记。本发明可制备一套试剂盒，作为具有中国特色的X-STR基因座复合扩增试剂盒，可用于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传病的基因定位，特别是用于姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲权鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，尤其涉及一种通过复合扩增12个STR基因座来进行的荧光标记X-STR基因座复合PCR方法及其应用。
背景技术
短串联重复序列（short tandem repeat，简称STR）是由2-7个碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类微卫星DNA序列，其片段可采用PCR技术扩增。STR主要由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因座的遗传多态性，其等位基因可用银染、荧光标记和放射自显影等技术分型。人类基因组中，平均每6-10kb就存在有一个STR基因座，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因遗传标记的丰富来源。
X染色体STR（X chromosomal short tandem repeat，X-STR）基因座由于其在不同性别个体存在形式的差异及其X染色体连锁遗传方式的特点，具有一些常染色体遗传标记无法比拟的优点，其中最有价值之处体现在一些疑难的亲权鉴定案，比如：双亲缺乏的同父异母姐妹关系鉴定、祖母-孙女关系鉴定、可疑父之间疑为父子的乱伦关系鉴定、常染色体STR检验出现突变的父女（母子）关系鉴定等。此外，X-STR分型也可作为个体识别中性别鉴定的辅助指标，以及混合样本的判定。X-STR分型还可用于X染色体数目畸形的诊断，也能用于检测X连锁遗传病、X染色体失活的亲源性鉴定等。
与目前多种常染色体STR试剂盒可供选择的情况相比，目前关于X-STR分型的商品化的试剂盒仅见德国Biotype公司和QIAGEN公司的
Argus X-8、ArgusX-UL和
Argus X-12等三种，三种试剂盒总共仅能对十二个X-STR基因座进行分型检测，可被检测的X-STR基因座数目少，不能满足鉴定的需要。此外，越来越多的研究显示不同地区、不同民族STR遗传会显示出遗传异质性，具有独立群体的特征。这三个试剂盒中的某些基因座在中国群体多态性较低，其他实验室以及本发明人实验室的实验数据均已显示这三个试剂盒中的基因座在中国汉族人群中并不存在明显的连锁不平衡，因此该试剂盒的4个单倍型不能用于汉族人群的亲子鉴定和个人识别。同时国外试剂盒价格昂贵，且购买不便（订货后通常需要3至4周方可到货），限制了其广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适合中国人群的，可以快速、方便地针对常染色体STR、Y-STR难以排除或认定亲权关系的特殊检案（突变、全同胞或同父异母半同胞姐妹认亲、祖孙隔代认亲等）进行鉴定的荧光标记的X-STR基因座复合PCR方法。
本发明的另一个目的在于提供上述复合PCR方法在检测X连锁遗传病、X染色体失活的亲源性鉴定中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明公开了一种荧光标记的X-STR基因座复合PCR方法，该复合PCR方法分析12个基因座：GATA172D05、DXS6789、DXS10074、DXS10078、GATA165B12、DXS6797、DXS6803、DXS6804、GATA31E08、DXS7130、DXS9895和DXS6810。
上述12个基因座是在一个复合扩增体系中同时扩增。
上述12个基因座引物分别用FAM、HEX、TAMRA、ROX四种荧光素标记。
FAM标记GATA172D05、DXS6789和DXS10074，HEX标记DXS10078、GATA165B12和DXS6797，TAMRA标记DXS6803、DXS6804和GATA31E08，ROX标记DXS7130、DXS9895和DXS6810。
本发明提供的复合PCR方法对X-STR基因座进行PCR扩增的同步进行电泳检测；检测体系为多重荧光聚合酶链反应结合毛细管阵列电泳。
本发明对上述12个X-STR基因座进行了研究，表明这12个基因座在中国人群中有高度的遗传多态性和稳定性，而且分型明确。
本发明复合PCR方法中12个基因座的选择：
（1）易于扩增：除这12个基因座外，实验初期我们共筛选了35个X-STR基因座。但单基因座扩增结果发现，这些基因座的扩增存在着一些问题，有的扩增产量少，显带过浅，甚至有时很难得到扩增产物，如DXS10076；有的很容易出现非特异带（如影子带），如DXS10011。而本发明选择的GATA172D05、DXS6789、DXS10074、DXS10078、GATA165B12、DXS6797、DXS6803、DXS6804、GATA31E08、DXS7130、DXS9895和DXS6810等12个基因座易于扩增、稳定性好、结果清晰、非特异性带很少。
（2）均为四核苷酸重复STR基因座：STR基因座的核心序列的碱基数目与结巴带（stutter band）的发生频率有关，五核<四核<三核<二核。以往开发的STR基因座中，不乏三核苷酸重复基因座，结巴带明显，影响判读分型。而本发明选择的十二个基因座全部为四核苷酸重复，大大降低了结巴带对分型的影响。
（3）扩增产物片段长度不重叠：复合扩增体系中同一荧光素标记的基因座片段大小之间应有一点差距，才不会发生重叠，干扰分型。如用6-FAM标记的三个基因座中，GATA172D05基因座扩增产物片段长度为103～131bp，DXS6789为145～189bp，DXS10074为199～227bp。DXS6803与DXS981相差14bp，DXS981与DXS6809相差10bp，故这三个基因座引物可用同一荧光素标记。
用FAM（蓝色）分别标记GATA172D05、DXS6789和DXS10074等3个基因座的正向引物5’端；HEX（绿色）标记DXS10078、GATA165B12和DXS6797等3个基因座的正向引物5’端；TAMRA（黄色）标记DXS6803、DXS6804和GATA31E08等3个基因座的正向引物5’端；ROX（红色）标记DXS7130、DXS9895和DXS6810等3个基因座的正向引物5’端；12对引物混合为一管Primer mixture。同种颜色的基因座组内等位基因片段不重叠，不同颜色的基因座组间片段有重叠，PCR产物总体长度<273bp，适于陈旧降解的检材。
内标O-500Internal Lane Standard（O-500ILS）用橙色标记。
本发明的复合PCR方法：
1.复合扩增：
复合PCR体系组成：总体积25μL，内含1μL模板DNA（1-5ng），0.2μL HS-Taq DNA聚合酶（5U/μL），5μL5×PCR Reaction mix，2.5μL Primer mixture，16.3μL ddH2O。
PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，61℃1min，70℃1min共5个循环；92℃30s，61℃1min，70℃1min共5个循环；60℃45min；4℃保存。
同时扩增9947A control DNA样本和空白水作为阳性和阴性对照。采用ABI9700型PCR热循环仪进行扩增。
2.阵列毛细管电泳：在去离子甲酰胺（Hi-Di Formamide）中加入5%分子量内标（O-500ILS），混匀后放4℃备用（最好不要超过一个月）。扩增产物分别与己含内标的Hi-DiFormamide以1：10的比例混合，震荡混匀后简短离心，然后95℃变性3min，迅速置冰中冷却3min。分别运行ABI PRISM310、ABI PRISM3100、ABI PRISM3130或ABIPRISM3500的Data Collection Software，用相应的Run module进行电泳，并接收荧光信号。电泳条件为恒压14.7kv。
3.等位基因分型标准物（Ladder）和特异性分型软件制备：提取血痕样本DNA，进行单基因座扩增，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色。选择各基因座不同片段长度的扩增产物，连接到载体pMD18T vector上成为重组DNA分子。将重组DNA分子导入大肠杆菌E.coli JM109进行繁殖扩增，筛选出含目的片段的重组体后，用重新设计的荧光标记引物扩增重组体，获得各基因座的等位基因片段。将等位基因片段混合制成ladder，在ABI
系列的毛细管电泳仪上电泳。根据电泳结果调整各基因座ladder中等位基因的比例，使ladder的峰高均衡（图1）。
4.基因分型：每批样本均配一个ladder同步电泳，作为等位基因判型的依据。同时在
软件基础上设定分析的Panel和Bin，制成本体系特异性的分型软件，实现基因型的自动判别（图2）。
本发明的荧光标记的X-STR基因座复合PCR方法可以制成试剂盒，为突变、姐妹认亲和隔代认亲的亲权鉴定提供新的检测系统，也可用于检测X连锁遗传病和X染色体失活的亲源性鉴定。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.多态性高：本发明筛选的十二个X-STR基因座在中国群体的的累积DPM为0.999999889，累积DPF为0.999999999，累积MECTrio为0.999999999，累积MECDuo为0.999974643，超过目前国外的试剂盒水平，对于中国群体DNA个体识别和亲权鉴定具有很高的应用价值。
2.简便高效：本发明采用荧光标记技术，同步对十二个X-STR基因座进行PCR扩增和电泳检测，只需一次加入模板、一次扩增反应、一次电泳，自动化程度高，大大提高了工作效率，节约检材和试剂耗材，检验成本降低。
3.检材适用性范围广：对于血液（痕）、唾液（斑）、精液（斑）、带毛囊的毛发、肌肉、骨骼等生物学检材均适用，不同组织之间分型结果具有同一性；目标片段短，适用于陈旧降解的检材；以XX28为模板，结果能成功扩增的模板最低量为0.25ng，灵敏度高，对于微量检材也能奏效。
4.实用价值高：本发明将为X-STR分型更广泛应用于法医个体识别、亲子鉴定、遗传病诊断等提供可能性。可在双亲缺乏的同父异母姐妹关系鉴定、祖母-孙女关系鉴定、常染色体STR检验出现突变的父女（母子）关系鉴定等案件中发挥重要作用。
5.分析结果准确：本发明的荧光标记引物复合扩增技术快速、方便，PCR产物可用ABI PRISM系列的各种遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化、国际化，保证不同实验室数据比较的正确性。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
同一福利院接收的儿童甲（8岁）和乙（6岁），疑为全同胞姐妹，要求作亲权鉴定。
实验过程：
1.采集甲、乙的带毛囊的毛发，剪取3个毛囊采用Chelex-100快速提取DNA，细胞离心后加入100μL5%Chelex-100，56℃孵育30min，98℃孵育10min，10000rpm离心2min，吸取上清进行PCR扩增。
2.PCR扩增：将以下试剂震荡混匀5秒钟后短暂离心，10μL反应体积按以下比例混合：
| 5×PCR Reaction mix | 2μL |
| 10×STR Primer mixture | 1μL |
| Hs Taq DNA聚合酶（5U/μl） | 0.2μL |
| DNA模板 | 1μL |
| 消毒的超纯水 | 5.8μL |
5×PCR反应混合液含dNTP200mmol/L，MgCl21.5mmol/L。
上述引物混合物中，各个基因座的引物序列及其荧光标记如表1所示。
表1基因座及其引物序列和荧光标记
反应混合物短暂离心后放置入ABI9700型PCR热循环仪上，95℃预变性5min；94℃变性30s，61℃复性1min，70℃延伸1min，5个循环；92℃变性30s，61℃复性1min，70℃延伸1min，5个循环；60℃延伸45min；4℃保存。
3.毛细管电泳：PCR产物分别与己含内标的去离子甲酰胺以1：10的比例混合，震荡混匀后简短离心，然后95℃变性3min，迅速置冰中冷却3min。把样本放入ABI PRISM3100遗传分析仪，点击Data Collection Software，编辑sample sheet，用相应的Run module进行电泳，并接收荧光信号。电泳条件为恒压14.7kv。同步电泳ladder。
4.基因分型：打开
软件，在主页面的File菜单选择Add Samples toProject，浏览找到并选中样品文件所在的文件夹，点Add to List。依次点击并选择AnalysisMethod、Panel、Size Standard、Matrix等进行分析，设定保存文件。分析完毕后，选择Export Table for CODIS，输出数据。
5.同步还采用常染色体STR复合扩增体系
试剂盒（简写为PP16）和STRTyper-10试剂盒（简写为STRTyper-10）进行24个常染色体STR的分型。分型方法按照各自的说明书进行。
结果分析：
采用本发明的X-STR基因座分型，根据X-STR基因座的遗传特点，来自同一父亲的姐妹间必有一个相同的等位基因。如果违反此规律，可排除二者来自同一父亲。
常染色体STR分型结果和X-STR分型结果见表3。采用亲子亲缘关系鉴定处理分析系统Version1.0进行常染色体STR基因座全同胞亲权指数（full-sibling index，FSI）计算。检测PP16体系的15个常染色体STR基因座，计算甲和乙之间的累计全同胞关系指数（combinedfull-sibling index，CFSI）为2.5369×10-5；检测STRTyper-10体系的9个常染色体STR基因座，计算得出的CFSI值是4.8180×10-3；检测本发明XSTRTyper-12体系共12个X染色体STR基因座，甲与乙在GATA172D05、DXS6789、DXS10078和DXS6804基因座上未检见相同的等位基因，违反同父的全同胞姐妹遗传规律，可排除甲与乙之间存在全同胞姐妹关系。在这个实施例中，常染色体STR分型结果不能明确给出排除的信息。增加检测常染色体STR基因座的数目，只存在进一步降低CFSI值的可能，还是无法得出明确直观的信息。但是，X-STR可以明确给出排除的信息。甲与乙在GATA172D05、DXS6789、DXS10078和DXS6804等4个X-STR基因座上未检见相同的等位基因，违反来自同父姐妹的遗传规律，因此可以排除甲与乙之间存在全同胞姐妹关系。
表2实施例1可疑半同胞姐妹STR分型和HSI计算结果
aH0：甲与乙是全同胞姐妹；H1：甲与乙是无关个体。
*违反遗传规律。
实施例2
应用X-STR荧光标记复合PCR方法进行父母均已去世的张某、王某两女是否为同父异母的半同胞姐妹的鉴定。
实验过程：
1.采集张某、王某的口腔拭子样本，采用Chelex-100快速提取法提取DNA，细胞离心后加入200μL5%Chele-100，56℃孵育30min，98℃孵育10min，10000rpm离心2min，吸取上清进行PCR扩增。
2.PCR扩增：同实施例1。
3.毛细管电泳：同实施例1。
4.基因分型：同实施例1。
5.同步还采用常染色体STR复合扩增体系
试剂盒（简写为PP16）和STRTyper-10试剂盒（简写为STRTyper-10）进行24个常染色体STR的分型。分型方法按照各自的说明书进行。
结果分析：
采用本发明的X-STR基因座分型，根据X-STR基因座的遗传特点，来自同一父亲的姐妹间必有一个相同的等位基因。如果违反此规律，可排除二者来自同一父亲；如果均符合此遗传规律，则计算二者之间的半同胞关系指数（FHSI）和半同胞关系概率（WHS），评判二者为半同胞姐妹的可能性大小。
常染色体STR分型结果和X-STR分型结果见表4。采用亲子亲缘关系鉴定处理分析系统Version1.0进行常染色体STR基因座半同胞关系指数（half-sibling index，HSI）计算，手工进行甲和乙X染色体STR基因座HSI值计算。检测PP16体系的15个常染色体STR基因座，计算张某和王某之间的累计半同胞关系指数（combined half-sibling index,CHSI）为5.086；检测STRTyper-10体系的9个常染色体STR基因座，计算得出的CHSI值是543.1；检测XSTRTyper-12体系，张某与王某在12个X-STR基因座上均至少有1个相同的等位基因，不违反同父异母半同胞姐妹的遗传规律，计算CHSI值是95.19。三个体系的CHSI值高达262934.45，支持张某与王某之间存在同父异母半同胞姐妹关系。在此实施例中，X-STR可以直观地给出是否符合遗传关系的信息，在均不违反遗传关系的情况下，还可为提高CHIS值做出贡献，得到更高的关系指数值，使结论更加明确可靠。
表3实施例2可疑半同胞姐妹STR分型和HSI计算结果
aH0：张某与王某是同父异母半同胞姐妹；H1：张某与王某是无关个体。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种荧光标记的X-STR基因座复合PCR方法及其应用
<130>
<160> 24
<170> PatentIn version 3.2
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gactacctaa cagaaaacct tttggg 26
Claims (6)
1.一种非诊断用的荧光标记的X-STR基因座复合PCR方法，其特征在于该复合PCR方法分析12个基因座：GATA172D05、DXS6789、DXS10074、DXS10078、GATA165B12、DXS6797、DXS6803、DXS6804、GATA31E08、DXS7130、DXS9895和DXS6810，
其中基因座GATA172D05对应的引物序列为F-SEQ ID No:1和R-SEQ ID No:2；基因座DXS6789对应的引物序列为F-SEQ ID No:3和R-SEQ ID No:4；基因座DXS10074对应的引物序列为F-SEQ ID No:5和R-SEQ ID No:6；基因座DXS10078对应的引物序列为F-SEQ ID No:7和R-SEQ ID No:8；基因座GATA165B12对应的引物序列为F-SEQ ID No:9和R-SEQ ID No:10；基因座DXS6797对应的引物序列为F-SEQ ID No:11和R-SEQ ID No:12；基因座DXS6803对应的引物序列为F-SEQ ID No:13和R-SEQ ID No:14；基因座DXS6804对应的引物序列为F-SEQ ID No:15和R-SEQ ID No:16；基因座GATA31E08对应的引物序列为F-SEQ ID No:17和R-SEQ ID No:18；基因座DXS7130对应的引物序列为F-SEQ ID No:19和R-SEQ ID No:20；基因座DXS9895对应的引物序列为F-SEQ ID No:21和R-SEQ ID No:22；基因座DXS6810对应的引物序列为F-SEQ ID No:23和R-SEQ ID No:24。
2.如权利要求1所述的复合PCR方法，其特征在于所述12个基因座是在一个复合扩增体系中同时扩增。
3.如权利要求1所述的复合PCR方法，其特征在于FAM标记GATA172D05、DXS6789和DXS10074，HEX标记DXS10078、GATA165B12和DXS6797，TAMRA标记DXS6803、DXS6804和GATA31E08，ROX标记DXS7130、DXS9895和DXS6810。
4.如权利要求1所述的复合PCR方法，其特征在于对X-STR基因座进行PCR扩增的同步扩增和电泳检测；所述检测体系为多重荧光聚合酶链反应结合毛细管阵列电泳。
5.如权利要求1～4任一所述的复合PCR方法在认定特殊的亲权关系检案中的应用。
6.应用于权利要求1所述的PCR方法的X染色体STR分型试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的12个基因座的复合扩增引物，所述的复合扩增引物为：基因座GATA172D05对应的引物序列为F-SEQ ID No:1和R-SEQ ID No:2；基因座DXS6789对应的引物序列为F-SEQ ID No:3和R-SEQ ID No:4；基因座DXS10074对应的引物序列为F-SEQ ID No:5和R-SEQ ID No:6；基因座DXS10078对应的引物序列为F-SEQ ID No:7和R-SEQ ID No:8；基因座GATA165B12对应的引物序列为F-SEQ ID No:9和R-SEQ ID No:10；基因座DXS6797对应的引物序列为F-SEQ ID No:11和R-SEQ ID No:12；基因座DXS6803对应的引物序列为F-SEQ ID No:13和R-SEQ ID No:14；基因座DXS6804对应的引物序列为F-SEQ ID No:15和R-SEQ ID No:16；基因座GATA31E08对应的引物序列为F-SEQ ID No:17和R-SEQ ID No:18；基因座DXS7130对应的引物序列为F-SEQ ID No:19和R-SEQ ID No:20；基因座DXS9895对应的引物序列为F-SEQ ID No:21和R-SEQ ID No:22；基因座DXS6810对应的引物序列为F-SEQ ID No:23和R-SEQ ID No:24。
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