CN110157812A - 一种同时检测常染色体和y染色体str基因座的复合扩增试剂盒 - Google Patents

一种同时检测常染色体和y染色体str基因座的复合扩增试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试剂盒，其含有对应38个基因座的36组特异性扩增引物对，包括序列SEQ ID NO.1～74。本申请可同时分析A‑STR及Y‑STR两种数据用于案件的快速排查，达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。

Description

一种同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试 剂盒
技术领域
本发明属于分析遗传学领域，涉及人类染色体STR基因座的复合扩增检验系统，尤其涉及一种同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试剂盒。
背景技术
短串联重复序列(STR)是目前普遍应用的分子遗传标记，它片段小易扩增，适宜于检验微量和降解生物检材，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增和自动化检测，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点，非常适用于建立DNA数据库，因此DNA-STR分型技术已成为法医物证检验的主要手段之一。
目前，用于法医检测的STR分型包括常染色体STR分型和Y染色体分型检测，且常染色体STR分型检测与Y染色体STR分型检测一般都是分开的。最多在常染色体检测中加入了DYS391。因为DYS391多态性差，主要用于辅助性别判定。例如，当一个重大刑事案件发生时，往往会对现场提取的物证先进行常染色体STR检测，当确认为男性犯罪嫌疑人遗留的物证时，再加做Y染色体STR检测，由此增加侦查线索。同时STR分型技术因受到检材状态、扩增位点个数、扩增体系等因素的影响，仅PCR过程的时间长达3个小时左右，由此往往因为增加了检测时间而延误抓获犯罪嫌疑人的最佳机会，同时也会因为犯罪嫌疑人遗留在现场的物证量少导致检测失败，最终失去侦查线索。
总而言之，随着刑事案件的增多，现有检测试剂盒已无法很好的满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求，如何实现常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座同时检测，并且具有达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率成为有待解决的问题。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试剂盒。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
一种同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，至少包括36组特异性扩增引物对，其序列分别依次为：SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.19～20、SEQ ID NO.21～22、SEQ IDNO.23～24、SEQ ID NO.25～27、SEQ ID NO.28～29、SEQ ID NO.30～31、SEQ ID NO.32～33、SEQ ID NO.34～35、SEQ ID NO.36～37、SEQ ID NO.38～39、SEQ ID NO.40～41、SEQ IDNO.42～43、SEQ ID NO.44～45、SEQ ID NO.46～47、SEQ ID NO.48～49、SEQ ID NO.50～51、SEQ ID NO.52～53、SEQ ID NO.54～55、SEQ ID NO.56～57、SEQ ID NO.58～60、SEQ IDNO.61～62、SEQ ID NO.63～64、SEQ ID NO.65～66、SEQ ID NO.67～68、SEQ ID NO.69～70、SEQ ID NO.71～72、SEQ ID NO.73～74。
在一些实施例中，所述特异性扩增引物对应38个STR基因座，所述38个STR基因座位于至少一个常染色体和至少一个Y染色体上，所述基因座依次为：DYS391、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS635、DYS458、DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS438、DYS448、DYS437、D19S433、vWA、DYS19、D18S51、DYS576、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、DYS533、DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4、DYS390及DYS481。
在一些实施例中，所述特异性扩增引物的终浓度为0.025μM～0.51μM。
在一些实施例中，将所述38个STR基因座分组。
在一些实施例中，将所述38个STR基因座至少分为5组：DYS391、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS635和DYS458为第一组；DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS438和DYS448为第二组；DYS437、D19S433、vWA、DYS19、D18S51、DYS576为第三组；Amelogenin、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、DYS533为第四组；DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4、DYS390及DYS481为第五组。
在一些实施例中，将所述特异性扩增引物中的至少一条引物的5’端进行标记。
在一些实施例中，所述各组基因座对应的特异性扩增引物的5’端采用荧光染料标记。
在一些实施例中，所述荧光染料包括6-FAM、HEX、SUM、LYN、和/或PUR。
在一些实施例中，所述试剂盒包括反应混合液、特异性复合扩增引物、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH2O、Allelic Ladder、荧光分子量内标，其中反应混合液的组成为：Tris-HCl 50mM、MgCl2 2.0mM、KCl 50mM、dNTPs 0.2mM、BSA 0.8mg/ml。
在一些实施例中，所述试剂盒的扩增体系为反应混合液：10.0μL；热启动Taq酶：1.0μL；引物混合物：5.0μL；基因组DNA：0.125ng～5.0ng；sdH2O补足至25.0μL。
一种根据上述的复合扩增试剂盒的使用方法，当所述特异性扩增引物用于扩增时，扩增程序为：预变性，95℃2min；15个循环，94℃30s，60℃40s，72℃1min；15个循环，94℃30s，58℃1min，65℃1min20s；终延伸，60℃20min；4℃保温维持。
在一些实施例中，将所述特异性扩增引物采用所述扩增程序扩增，其扩增产物的片段长度为600bp。
一种上述的复合扩增试剂盒在法医个体识别、嫌疑人家系排查、恶性事件中微量男性样本检测、常染色体数据库、Y染色体数据库、和/或亲权鉴定中的应用。
在一些实施例中，所述复合扩增试剂盒适用于多种类型的检材，所述检材包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA、和/或通过滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
与现有技术相比，本发明提供的一种同时检测38个染色体基因座的复合扩增试剂盒，达到的技术效果是：1)本申请即能用Y染色体基因座信息于嫌疑人的快速排查，又能根据常染色体基因座信息确定嫌疑人；2)本发明包含了公安部DNA数据库推荐使用的15个A-STR基因座，同时涵盖了22个高多态性的Y-STR基因座，实现单管同时扩增检测38个基因座；3)本申请采用AGCUMarker SIZ-600分析，将STR试剂盒检测片段提升至600bp，实现了一次实验同时分析A-STR及Y-STR两种数据，可同时用于案件的快速排查，达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率；4)本申请因为同时检测了常染色体和Y染色体STR基因座，与两种试剂盒分开检测相比，可以节省扩增模板用量，从而在一定程度上解决案件中微量检材问题；获取常染色体STR分型的同时，22个Y-STR基因座对于案件的排查具有很大的地域、姓氏指向性，可最大限度的排除无关家系；5)本发明可以检测出大量女性DNA样本背景下的微量男性DNA，是检测如强奸犯罪等混合斑检材的有力武器；6)本发明在检测父-子亲权鉴定时，由于Y-STR数据已包含而无需单独再做Y-STR实验分析；7)本发明涉及一种采用六色新型荧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方法；其中，本发明适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、毛囊、血痕或血液等；8)本发明试剂盒引物具有较强的扩增特异性，种属特异性及温度耐受性；9)本申请可以满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求提供有效的技术保障。
附图说明
图1是根据本申请一些实施例所示的试剂盒标准DNA9948的分型图；
图2是根据本申请一些实施例所示的等位基因Allelic Ladder分型图；
图3a是根据本申请一些实施例所示的中国专利申请号201510477236.9一个亲子鉴定(被检父亲)排除的分型图；
图3b是根据本申请一些实施例所示的中国专利申请号201510477236.9一个亲子鉴定(被检男孩)排除的分型图；
图4a是根据本申请一些实施例所示本申请用于一个亲子鉴定(被检父亲)排除的分型图；
图4b是根据本申请一些实施例所示本申请用于一个亲子鉴定(被检被检)排除的分型图；
图5是根据本申请一些实施例所示的实际案件中某血卡扩增图谱结果。
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。
本发明提供一种同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试剂盒。短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)是存在于人基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心序列一般由2～6个碱基构成，因该核心序列在不同个体间呈不同数目的串联重复而呈现出长度多态性。人基因组DNA中平均每6-10kb就有一个STR基因座，这些广泛分布于人基因组中高度多态重复序列成为个体识别和亲权鉴定的有效遗传标记。在一些实施例中，可以用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)和电泳分离的方法检测STR分型。
本发明中的常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座是通过筛序获得的38个基因座。关于筛选步骤可以参考实施例1所述，在此不再赘述。在一些实施例中，所述38个基因座可以包括DYS391、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS635、DYS458、DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS438、DYS448、DYS437、D19S433、vWA、DYS19、D18S51、DYS576、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、DYS533、DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4、DYS390及DYS481。在一些实施例中，所述STR基因座位于至少一个常染色体和至少一个Y染色体上。在一些实施例中，将所述38个STR基因座分组。例如，可以将所述38个STR基因座分为2组、3组、4组、5组、或至少5组等。优选地，可以将所述38个STR基因座分为5组。更优选地，可以将所述38个STR基因座分为如下5组：DYS391、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS635和DYS458为第一组；DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS438和DYS448为第二组；DYS437、D19S433、vWA、DYS19、D18S51、DYS576为第三组；Amelogenin、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、DYS533为第四组；DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4、DYS390及DYS481为第五组。
在一些实施例中，所述复合扩增试剂盒是用于同时扩增常染色体STR基因座和Y染色体基因座对应的特异性引物。所述试剂盒包括反应混合液、特异性复合扩增引物、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH2O、Allelic Ladder、荧光分子量内标，扩增体系为反应混合液：10.0μL；热启动Taq酶：1.0μL；引物混合物：5.0μL；基因组DNA：0.125ng～5.0ng；sdH2O补足至25.0μL。在一些实施例中，本发明的特异性扩增引物采用所述扩增程序扩增，其扩增产物的片段长度为600bp。在一些实施例中，片段长度为600bp的扩增产物可以根据AGCU MarkerSIZ-600得到。
所述特异性扩增引物可以指含有SEQ ID NO：1～74(如表1所示)的引物，所述SEQID NO：1～74的引物的浓度可以0.02μM～0.51μM。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：1～74的引物的浓度可以为如表1所示的浓度。在一些实施例中，所述特异性扩增引物对应于本发明的38个基因座，例如，其对应关系可以参考表1所示。在一些实施例中，可以对特异性扩增引物中的至少一条引物的5’端进行标记。例如，可以对表1所示的特异性扩增引物中的至少一条引物的5’端进行标记。在对所述特异性扩增引物进行标记时可以选用包括但不限于荧光染料标记法等。其中，荧光染料可以包括但不限于6-FAM、HEX、SUM、LYN、PUR等。在一些实施例中，对特异性扩增引物中至少两条以上的引物的5’端进行标记时，其选用的荧光染料标记物可以是相同的、部分相同或者不同的。优选地，可以将特异性扩增引物对应的基因座分若干组(例如，2组、3组、4组、5组)，然后按照对各组基因座进行标记。更优选地，可以将特异性扩增引物对应的基因座分5组，各组基因座标记选用的荧光染料标记物也完全不同。特别优选地，可以将特异性扩增引物对应的基因座分为如实施例2所示的5组基因座，以及与其相对应的标记物。关于更多的基因座排布可以参考实施例2所示。
反应混合液可以包括但不限于Tris-HCl、MgCl2、KCl、dNTPs等。优选地，反应混合液可以包括Tris-HCl 50mM、MgCl2 2.0mM、KCl 50mM和dNTPs0.2mM、0.8mg/mL BSA。
热启动Taq酶是一种具有热稳定性的DNA聚合酶，该DNA聚合酶的含量为5U/μL，优选地，热启动Taq酶的体积为1.0μL。
sdH2O为超纯水。
在一些实施例中，所述试剂盒可以应用于法医个体识别、嫌疑人家系排查、亲权鉴定中的一种或其任意组合。当所述试剂盒应用于法医个体识别、嫌疑人家系排查、亲权鉴定中的一种或其任意组合，其分型结果正确。具体的，可以以实施例6-8为例进一步说明。其中，实施例6-8仅作为示例的目的说明，其并不限制本申请的保护范围。在一些实施例中，所述复合扩增试剂盒可以适用于多种类型的检材，所述检材包括但不限于利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA、和/或通过滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
下面进一步以具体实施例的方式对本发明详细说明，下述说明并不对本申请的范围构成限制。
实施例1常染色体和Y染色体STR基因座的筛选
本发明基因座的筛选是基于中国专利申请号NO.201010282414.X公开的基因座的基础上，将D6S1043基因座改为D19S433基因座，其余常色体基因座对6000多名个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，其中，通过上述数据表明在16个STR基因座中，除TH01、TPOX基因座外，其余各基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值大都在0.5以上，这表明除TH01、TPOX基因座外的其他基因座在法医学上有较好的应用价值。基于此，本发明保持原有的常染色体STR基因座，通过对亲缘关系的鉴定，家系排查，估计可能的人群来源有巨大的作用，增加了部分Y-STR基因座。
本发明在上述15个常染体STR位点的基础上，加入22个Y-STR基因座(包含Y-filer试剂盒中17个Y-STR，同时包含DYS576，DYS533，DYS481，DYS527a/b)，22个Y-STR基因座完全符合公安部Y-STR数据库建设方案推荐的核心基因座要求，每个基因座信息如表1：
表1、各基因座信息
实施例2特异性引物设计及引物验证
随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试及摸索复合扩增系统中引物之间特异的浓度比例，最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的情况下复合更多的人常染色体和Y染色体STR基因座。
具体的，包括如下步骤：
(1)特异性引物设计
设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计；除此之外，人类基因组序列中除含有短串联重复序列的多态性外，还存在广泛单核苷酸多态性(SNP)。有报道在人类编码区平均220-350bp出现1个SNP，而在人类全基因组中平均1000bp则出现一个SNP。SNP也具有良好的多态性和稳定的遗传性，因此继限制性片段多态性(RFLP)和短串联重复(STR)作为遗传标记后，SNP已发展成为新一代的遗传标记手段。多个STR基因座复合扩增身份鉴定试剂盒，是基于PCR扩增技术设计制备。因此，引物序列的选择不可避免会遇到SNP位点。有些SNP位点发生率比较稀少且发生比率未知，但在人类身份鉴定DNA数据库的建设过程中，样品数量很大，因此出现的可能性也增加。因此SNP需要在STR身份鉴定试剂盒的设计开发中不可忽视。引物序列设计的原则是尽量避开SNP位点，或者是尽量避免SNP位点出现在靠近引物的3’末端。因为3’末端的碱基不匹配会严重降低PCR的扩增成功率，造成位点片段信号降低甚至缺失，从而引起分型错误。通过UCSC的SNP数据库的查询发现在中国专利申请号NO.201510477236.9公开的引物序列中SNP位点(表2)。因此，本发明按照上述原则进行引物设计，尽量避免在SNP位点靠近引物序列的3’末端。具体的，对于引物序列中不可避免的SNP位点采用设计兼并引物的方法，防止引物遇到SNP序列时碱基不匹配引起的扩增失败。应当理解的是，本领域技术人员在引物设计时，需保证引物的长度适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值和GC含量相近、引物之间不能形成二聚体；同时由于有些Y-STR基因座与X染色体上有较高的同源性，所以在引物设计时需要考虑到引物扩增的特异性，既要保证女性样本无扩增，同时还要考虑到在复合扩增中引物对不同检材的适用性，保证不同检材扩增均衡性要求。具体包括如下：
a.引物Tm值：由于算法不一样，不同软件设计的引物Tm值不尽相同，但需要尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。
b.引物间二聚体：尽可能避免两条引物3’末端之间有连续超过3个碱基互补配对。
c.引物与模板序列非特异结合：设计过程中尽量避免引物序列与模板序列非特异区域结合。
d.引物比对：引物序列需要利用NCBI进行blast比对，除了特异性引物结合区外，匹配区域越少越好。
表2中国专利申请号NO.201510477236.9公开的引物序列中含有的SNP位点
基因座名称 引物序列 SNP位点
CSF1PO CCTATTGGGAGGTCATTGTAA CCTATTGGGAGGTCATTGT(A/G)A
DYS393 TTCCTAATGTGGTCTTCTACT TTCCTAATGTGGTCTTCTAC(T/C)
(2)引物验证
首先，进行引物的单扩实验，排除有非特异、扩增效率低的引物；其次，进行单色小复扩实验，即将每一组引物分别单独混合测试，和单扩一样，需要排除产生非特异及扩增效率低的引物；最后，进行大复扩实验，即四组引物全部混合测试，在初步确定了各基因座复合扩增引物后，进行引物的初步组配，利用标准DNA以及其他实际DNA样本为模板，考察每个基因座引物的浓度及检测效率，考察非特异扩增产物，若存在，即通过调整引物序列的方式，对引物序列加以改进。优选地，引物序列及浓度见表3。
表3引物序列及对应浓度
实施例3PCR扩增体系的确定
除了上述基因座的特异性扩增引物，本试剂盒反应体系还包括反应混合液、热启动Taq酶和sdH2O，所述反应混合液包含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTP、BSA，各组分的浓度可以根据需要进行调整。
具体的，可以在PCR扩增体系中，对Mg2+浓度、dNTPs浓度两个因素设计正交实验进行优化，制备成PCR反应混合液，加入到PCR体系中。最终PCR体系各组成见表4。
表4 PCR反应扩增体系
其中，反应混合液中各组分反应终浓度为50mM Tris-HCl、50mM KCl、2.0mMMgCl2、0.2mM dNTPs、0.8mg/mL BSA；38个基因座对应的引物及其引物浓度如表3所示。再者，38个基因座是按如下分组并进行荧光标记的：DYS391、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS635和DYS458为第一组，荧光染料标记为6-FAM；DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS438和DYS448为第二组，荧光染料标记为HEX；DYS437、D19S433、vWA、DYS19、D18S51、DYS576为第三组，荧光染料标记为SUM；Amelogenin、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、DYS533为第四组，荧光染料标记为LYN；DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4、DYS390及DYS481为第五组，荧光染料标记为PUR。
实施例4本申请的试剂盒的使用方法
本申请的试剂盒的使用方法可以包括PCR扩增反应步骤，其中PCR扩增反应可以包括扩增反应程序。在一些实施例中，扩增反应程序的不同，其扩增产物也不同。具体的，早本发明38对引物在单管PCR体系里扩增时，可能因为扩增片段大小不等、扩增标记引物不同，容易导致扩增效率差异比较大，进而在检测时，扩增峰高差异比较显著，因此为改善扩增峰高之间的差异、提高不同基因座之间扩增均衡性问题、满足不同检材的适应性、不同退火温度的耐受性，需要测试不同的扩增程序，以保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。
下面仅便于说明的目的，并不限制本申请的所要保护的范围。首先，循环数测试：分别测试了28个循环，29个循环，30个循环，31个循环，实验证明最佳循环为30个；其次退火温度测试：分别测试了57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，实验证明最佳温度为60℃和58℃；再次，需要测试循环内延伸时间及延伸温度，已达到大小片段扩增效率差异较大问题，更好的提高试剂盒的扩增性能，最终扩增程序如下表5：
表5扩增程序
基于上述得到的优选地扩增程序，本申请试剂盒的扩增步骤如下：
1)将含有PCR扩增体系的PCR扩增管置于热循环仪上；
2)选择如表5所述的程序进行扩增；
3)扩增后的产物应避光保存；
4)电泳结束后，将PCR扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL离心后的PCR扩增产物或试剂盒等位基因分型标准物与0.5μL荧光分子量内标AGCUMarker SIZ-600(AGCU MarkerSIZ-600可以参考中国专利申请号201610839513.0)和12μL去离子甲酰胺混合，避免产生气泡，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，遗传分析仪电泳检测，用片段分析软件GeneMapper分析电泳数据。其中，DNA标准对照品9948和等位基因分型标准物的分型结果如图1、图2所示。
实施例5
采用实施例1中的22个Y-STR基因座进行案件排查。
1、收集案件排查中的不同检材：本实验中4451份来自不同个体的样品均由某市公安局提供：包括3500份血样，100份精斑、700份唾液斑、151份组织。基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2014法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
2、扩增检测
按照实施例5所述的方法进行PCR扩增、电泳检测和结果分析。所有样品包括Y-filer试剂盒、中国专利申请号201410208458.6公开的试剂盒、中国专利申请号201510477236.9公开的试剂盒、本发明公开的试剂盒。
3、结论
结果如表6所示，本发明的分辨效能优势明显。不同来源的2000份样品测试结果表明，中国专利申请号201410208458.6公开新加入的10个Y-STR基因座可以把该2000份样品分出1283种单倍型，中国专利申请号201510477236.9公开加入的18个Y-STR基因座可以分成1800种单倍型，分别较Y-filer试剂盒分辨能力可以达到64％和105％(1283种单倍型/1710种单倍型、1800种单倍型/1710种单倍型)，而本发明(22Y)的分辨能力较中国专利申请201510477236.9公开的分辨能力有很大的提升，2000份无关样本分辨能力提升10％((22Y分辨出的2000种单倍型-18Y分辨出的1800种单倍型)/2000份样本)；3000份样本分辨能力提升15％，4000份样本和4451份样本分辨能力分别提升20％和24.98％，检测样本数目越多，分辨能力优势越明显，在实际案件排查过程中，可以尽可能多的排查无关家系，增加了案件排查效率，节省了人力物力和财力，满足公安法医案件Y排查的需要。
表6、4451份模板10Y、18Y、22Y分型结果中的单倍型数量的统计
实施例6单亲亲子鉴定能力比较
分别应用中国专利申请号201510477236.9公开的基因座复合扩增试剂盒及本发明提供的试剂盒进行单亲亲子鉴定。
1、收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由某一司法鉴定中心提供300个父子对样本，共计600个样。DNA提取采用Chelex-100法分别提取600个血卡样本的基因组DNA：基因组DNA的提取参考《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。也可以直接以血卡样本直扩检测，通过1.2mm孔径血滤纸片或FTA卡血样片实行。
2、扩增检测
按照实施例1、6进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。
3、结论
分别应用中国专利申请号201510477236.9公开的及本申请复合扩增检验系统对300对父子对进行单亲亲子鉴定，其中有5对父子对中国专利申请号201510477236.9复合扩增系统中有1个Y基因座分型不符合遗传规律，该5对父子对样本EX16+22Y复合扩增系统中有4个Y基因座分型不复合遗传规律。其中1对父子对检测图谱见图3～4，中国专利申请号201510477236.9和本申请结果显示(见表7)，中国专利申请号201510477236.9被检父与某男孩在检测的15个常染色体基因座中，均符合遗传规律，18个Y染色体基因座中1个不符合遗传规律。男孩与被检父在DYS385b一个Y基因座上不符合遗传规律，根据司法鉴定技术规范(SF/Z JD0105001-2010)有3个以上的基因座不符合遗传规律，可以排除亲权关系的存在，故中国专利申请号201510477236.9公开的试剂盒不能认定或排除父子关系。本申请结果显示(见表7)被检父与某男孩在检测的15个常染色体基因座均符合遗传规律。男孩与被检父在DYS576、DYS385b、DYS533、DYS481四个Y基因座上不符合遗传规律，根据司法鉴定技术规范(SF/Z JD0105001-2010)有3个以上的基因座不符合遗传规律，可以排除亲权关系的存在。本申请较中国专利申请号201510477236.9，常染色体基因座数目已经够用，较多的Y染色体基因座大大提高了分辨率和排除率，在单亲亲子鉴定中体现出巨大的优越性。
单亲父子关系鉴定，要求检测常染色体基因座及Y染色体基因座，目前的做法是检测一个常染色体基因座检测试剂盒和一个Y染色体基因座检测试剂盒。本实施例中，根据15个常染色体基因座检测结果，无法认定或排除父子关系；而增加的Y基因座最终排除了两者的父子关系。通过本发明方案，将从前需要两个试剂盒，常染色体基因座检测试剂盒和Y染色体基因座检测试剂盒，整合成一个试剂盒，只需一次PCR扩增、电泳检测就能得到更多的信息。亲子检测试剂盒的检测结果如表7所示。
表7单亲亲子鉴定检测结果
实施例7本发明在法医个体识别中的应用
1、收集案件中的血斑：样品由某市公安局提供。
2、样品DNA提取：基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2014法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、PCR扩增及毛细管电泳分析。结果如图1、图2、图5。
综上所述，本试剂盒实现了A-STR基因座和Y-STR基因座同步检测分析，原本需要两次的检验程序缩减到一次完成，减少了检测时间，提高了检测效率，从而增加了抓获犯罪嫌疑人的机会；另外一次检验减少了样品所需的绝对量，从而增加了犯罪嫌疑人遗留在案件现场的有效物证量，最终更多的物证信息增加了侦查线索。总而言之，随着刑事案件的增多，现有检测试剂盒已不能很好的满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求，而A-STR和Y-STR两种基因座一起检测，可以达到缩短检测时间的同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 苏州市公安局刑事科学技术研究所
无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 一种同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试剂盒
<141> 2019-05-29
<160> 74
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (14)

1.一种同时检测常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，至少包括36组特异性扩增引物对，其序列分别依次为：SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.19～20、SEQ ID NO.21～22、SEQ IDNO.23～24、SEQ ID NO.25～27、SEQ ID NO.28～29、SEQ ID NO.30～31、SEQ ID NO.32～33、SEQ ID NO.34～35、SEQ ID NO.36～37、SEQ ID NO.38～39、SEQ ID NO.40～41、SEQ IDNO.42～43、SEQ ID NO.44～45、SEQ ID NO.46～47、SEQ ID NO.48～49、SEQ ID NO.50～51、SEQ ID NO.52～53、SEQ ID NO.54～55、SEQ ID NO.56～57、SEQ ID NO.58～60、SEQ IDNO.61～62、SEQ ID NO.63～64、SEQ ID NO.65～66、SEQ ID NO.67～68、SEQ ID NO.69～70、SEQ ID NO.71～72、SEQ ID NO.73～74。
2.根据权利要求1所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物对应38个STR基因座，所述38个STR基因座位于至少一个常染色体和至少一个Y染色体上，所述基因座依次为：DYS391、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS635、DYS458、DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS438、DYS448、DYS437、D19S433、vWA、DYS19、D18S51、DYS576、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、DYS533、DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4、DYS390及DYS481。
3.根据权利要求1所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的终浓度为0.025μM～0.51μM。
4.根据权利要求2所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，将所述38个STR基因座分组。
5.根据权利要求4所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，将所述38个STR基因座至少分为5组：DYS391、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS635和DYS458为第一组；DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS438和DYS448为第二组；DYS437、D19S433、vWA、DYS19、D18S51、DYS576为第三组；Amelogenin、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、DYS533为第四组；DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4、DYS390及DYS481为第五组。
6.根据权利要求1所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，将所述特异性扩增引物中的至少一条引物的5’端进行标记。
7.根据权利要求6所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，所述各组基因座对应的特异性扩增引物的5’端采用荧光染料标记。
8.根据权利要求7所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料包括6-FAM、HEX、SUM、LYN、和/或PUR。
9.根据权利要求4所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应混合液、特异性复合扩增引物、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH2O、Allelic Ladder、荧光分子量内标，其中反应混合液的组成为：Tris-HCl 50mM、MgCl2 2.0mM、KCl 50mM、dNTPs 0.2mM、BSA0.8mg/ml。
10.根据权利要求9所述的一种复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增体系为反应混合液：10.0μL；热启动Taq酶：1.0μL；引物混合物：5.0μL；基因组DNA：0.125ng～5.0ng；sdH2O补足至25.0μL。
11.一种根据权利要求1～10中任意一项所述的复合扩增试剂盒的使用方法，其特征在于，当所述特异性扩增引物用于扩增时，扩增程序为：预变性，95℃2min；15个循环，94℃30s，60℃40s，72℃1min；15个循环，94℃30s，58℃1min，65℃1min20s；终延伸，60℃20min；4℃保温维持。
12.根据权利要求11所述的复合扩增试剂盒的使用方法，其特征在于，将所述特异性扩增引物采用所述扩增程序扩增，其扩增产物的片段长度为600bp。
13.一种在权利要求1～10中任意一项所述的复合扩增试剂盒在法医个体识别、嫌疑人家系排查、恶性事件中微量男性样本检测、常染色体数据库、Y染色体数据库、和/或亲权鉴定中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述复合扩增试剂盒适用于多种类型的检材，所述检材包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA、和/或通过滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
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