CN105018623B - 同时扩增人常染色体和y染色体str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时扩增人常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用,该试剂盒可在单管反应中最多同时复合扩增34个基因座,其中常染色体STR基因座15个,Y染色体STR基因座18个及Amelogenin。本发明采用了六色荧光技术,并配合独特的基因座排布方式,将34个基因座分为5组,每组STR基因座分别标记不同的荧光标记,此外,本试剂盒具有很强的检材适应性。本试剂盒同时检测了常染色体和Y染色体STR基因座,可以节省扩增模板用量,缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域,涉及人类常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩增检验系统,具体涉及一种同时扩增人常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,可应用于法医个体识别、嫌疑人家系排查及亲权鉴定等方面。
背景技术
短串联重复序列(Short Tandem Repeat,STR)是存在于人基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列,其核心序列一般由2~6个碱基构成,因该核心序列在不同个体间呈不同数目的串联重复而呈现出长度多态性。人基因组DNA中平均每6~10kb就有一个STR基因座,这些广泛分布于人基因组中高度多态重复序列成为个体识别和亲权鉴定的有效遗传标记,可用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和电泳分离的方法进行检测。
DNA-STR分型技术由于具有特异性好,灵敏度高,分型简便快速,易于标准化等优点,自20世纪90年代以来已成为法医物证检验的主要手段之一。目前常用的STR检测试剂盒包括常染色体STR检测试剂盒和Y染色体STR检测试剂盒,可以分别进行个体识别检测和父系检测。当一个重大刑事案件发生时,往往会对现场提取的物证先进行常染色体STR检测,当确认为男性犯罪嫌疑人遗留的物证时,再加做Y染色体STR检测,由此增加侦查线索。目前国内使用最多的ABI公司生产的Y染色体STR试剂盒(Yfiler)和常染色体STR试剂盒(Identifiler)因受到检材状态、扩增位点个数、扩增体系等因素的影响,仅两次PCR过程就耗时5-6个小时,这样两次的检验程序往往因为增加了检测时间而延误抓获犯罪嫌疑人的最佳机会,同时也会因为犯罪嫌疑人遗留在现场的物证量少导致检测失败,最终失去侦查线索。总而言之,随着刑事案件的增多,现有检测试剂盒已无法很好的满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求,如何实现常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座一起检测,达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率成为有待解决的问题。
本发明利用高效的热启动Taq DNA聚合酶及多色荧光技术,可以单管同时扩增34个基因座,最终研发常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座同时检测的综合试剂盒,为满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求提供有效的技术保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时扩增人常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用,达到缩短检测时间,提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
本发明为实现上述目的,采用如下技术方案实现:
通过对DYS549、DYS522、DYS389I、DYS439、DYS447、DYS389II、DYS392、DYS576、DYS19、DYS388、DYS391、DYS635、DYS460、DYS456、DYS533、DYS520、DYS438、DYS527a/b、DYS449、DYS709、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、Y_GATA_H4、DYS458、DYS607、DYS393、DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444、DYS643、Amelogenin、vWA、D10S1248、D2S441、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D22S1045、D1S1656、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、PentaE、TH01和TPOX共62个基因座的研究,确保所选基因座与市场主流试剂盒(ABI公司的Identifiler和Yfiler)的基因座具有一定兼容性,即可以与已有DNA数据进行共享与交流,最后筛选出18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座,筛选出的基因座如下:
D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、D19S433、vWA、D5S818、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、Amelogenin、DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYS456、DYS458、DYS635、Y_GATA_H4、DYS448、DYS527a/b。
同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,试剂盒包含上述34个基因座中的至少1个常染色体STR基因座和1个Y-STR基因座的特异性扩增引物。
将上述34个基因座进行分组,各组分别采用荧光染料中的一种标记,并且不同组别标记物不同,所述荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX或者VIG。
根据以上34个基因座,优选采用如下的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法:D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS448为第一组,荧光染料标记物为6-FAM;DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS458为第二组,荧光染料标记物为HEX;DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、DYS390为第三组,荧光染料标记物为TAMRA;Amelogenin、D8S1179、D5S818、DYS19、FGA、DYS438为第四组,荧光染料标记物为ROX。DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、Y_GATA_H4、DYS635为第五组,荧光染料标记物为VIG。
随着复合扩增系统中引物数量的增加,不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重,反应体系的动力学变得越来越复杂,因此需要设计大量特异性的引物序列进行复杂的测试及摸索复扩系统中引物之间特异的浓度比例,最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的情况下复合更多的STR基因座。本发明通过复杂的测试摸索出引物序列及对应的浓度,如表1所示。
表1:
除了上述基因座的特异性扩增引物,本试剂盒反应体系还包括反应混合液、热启动Taq酶和sdH2O,所述反应混合液包含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTPs,各组分的浓度可以根据需要进行调整。本试剂盒各组分及其在反应体系中体积见表2。
表2:
本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性,所以需要测试不同的扩增程序,保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。最终扩增程序如表3。
表3:
本试剂盒检测扩增产物的方法为毛细管电泳。
本试剂盒具有很强的检材适应性包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
本试剂盒应用广泛,可用于法医个体识别、亲权鉴定(被拐卖儿童、灾难中遇害者遗体认定)及DNA家谱构建。
有益效果:与同类试剂盒相比较,本试剂盒具有如下优势:
1、本试剂盒可以同时检测18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座,实现常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座一起检测,达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
2、本试剂盒可以同时检测18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座,基因座数量是同类试剂盒中最多。
3、本试剂盒因为同时检测了常染色体和Y染色体STR基因座,与两种试剂盒分开检测相比,可以节省扩增模板用量,从而在一定程度上解决案件中微量检材问题。
4、本试剂盒具有很强的检材适应性,即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本,不同检材的样本包括:利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
附图说明
图1.基因座分组及染色示意图;
图2.EX16+18Y案件中血样分型图;
图3.EX16+18Y Ladder分型图;
具体实施方式
实施例1STR基因座的筛选
通过对DYS549、DYS522、DYS389I、DYS439、DYS447、DYS389II、DYS392、DYS576、DYS19、DYS388、DYS391、DYS635、DYS460、DYS456、DYS533、DYS520、DYS438、DYS527a/b、DYS449、DYS709、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、Y_GATA_H4、DYS458、DYS607、DYS393、DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444、DYS643、Amelogenin、vWA、D10S1248、D2S441、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D22S1045、D1S1656、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、PentaE、TH01和TPOX共62个基因座的基因多态性的研究,确保基因座与市场主流试剂盒(ABI公司的Identifiler和Yfiler)的基因座具有一定兼容性,即可以与已有DNA数据进行共享与交流的前提下,最后筛选出18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座。每个基因座相应信息如表4所示。
表4:
实施例2试剂盒STR基因座排布
D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS448为第一组,荧光染料标记物为6-FAM;DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS458为第二组,荧光染料标记物为HEX;DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、DYS390为第三组,荧光染料标记物为TAMRA;Amelogenin、D8S1179、D5S818、DYS19、FGA、DYS438为第四组,荧光染料标记物为ROX。DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、Y_GATA_H4、DYS635为第五组,荧光染料标记物为VIG,分组图见图1所示。
实施例3试剂盒特异性引物设计及不同引物浓度调试
随着复合扩增系统中引物数量的增加,不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重,反应体系的动力学变得越来越复杂,因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试及摸索复扩系统中引物之间特异的浓度比例,最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的情况下复合更多的STR基因座。
⑴特异性引物设计
设计引物之前,必须分析待测靶序列的性质,选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
a.引物Tm值:由于算法不一样,不同软件设计的引物Tm值不尽相同,但需要尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2℃。
b.引物间二聚体:尽可能避免两条引物3’末端之间有连续超过3个碱基互补配对。
c.引物与模板序列非特异结合:设计过程中尽量避免引物序列与模板序列非特异区域结合。
d.引物比对:引物序列需要利用NCBI进行blast比对,除了特异性引物结合区外,匹配区域越少越好。
⑵引物验证
首先,进行引物的单扩实验,排除有非特异、扩增效率低的引物;其次,进行单色小复扩实验,即将每一组引物分别单独混合测试,和单扩一样,需要排除产生非特异及扩增效率低的引物;最后,进行大复扩实验,即四组引物全部混合测试,在初步确定了各基因座复合扩增引物后,进行引物的初步组配,利用标准DNA以及其他实际DNA样本为模板,考察每个基因座引物的浓度及检测效率,考察非特异扩增产物,若存在,即通过调整引物序列的方式,对引物序列加以改进。最终引物序列及浓度见表5。
表5:
实施例3调整PCR反应混合液
PCR扩增体系中,对Mg2+浓度、dNTPs浓度两个因素设计正交实验进行优化。其中,Mg2+浓度分别测试1.5mM 2.0mM、2.5mM、3.0mM 4个水平,dNTPs浓度分别测试0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.30mM 4个水平,Tris-HCl浓度定为50mM,KCl浓度定为50mM,其他扩增组分按照表2进行配置,扩增程序按照表3程序进行扩增。最终将Mg2+浓度定为2.0mM,dNTPs浓度定为0.2mM,Tris-HCl浓度定50mM,KCl浓度定为50mM,利用以上材料制备成PCR反应混合液,加入到PCR体系中。最终PCR体系各组成见表6:
表6:
实施例4调整PCR反应程序及PCR扩增
本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性,所以需要测试不同的扩增程序,保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。首先,循环数测试:分别测试了28个循环,29个循环,30个循环,31个循环,最佳循环为29。其次,退火温度测试:分别测试了56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,62℃,最佳温度为60度。最终扩增程序见表7。
表7:
将实施例3中配置好的PCR反应体系放置于热循环仪上按照PCR反应程序进行扩增。
实施例5毛细管电泳检测
将实施例4中的扩增产物3000rpm离心5分钟,取1μL产物或Allelic Ladder与0.5μL AGCU Marker SIZ-500和12μL去离子甲酰胺混合,95℃变性3分钟后冰浴,通过毛细管电泳检测。
实施例6本试剂盒在法医个体识别中的应用
⑴收集案件中的血斑。
⑵样本DNA提取:采用法庭科学DNA实验室检验规范[GA-T383-2002]中硅珠法提取方法。
⑶EX16+18Y试剂盒PCR扩增及毛细管电泳检测。
首先,按照实施例2-5进行荧光标记引物和PCR体系配制、PCR扩增和毛细管电泳检测并最终获得分型结果,整个PCR扩增过程耗时2个小时左右。检测结果见图2,AllelicLadder见图3。
⑷使用ABI公司生产的Y染色体STR试剂盒(Yfiler)和常染色体STR试剂盒(Identifiler)分别进行样本检测。整个PCR扩增过程耗时5个小时左右。
⑸对EX16+18Y试剂盒与ABI公司生产的Y染色体STR试剂盒(Yfiler)和常染色体STR试剂盒(Identifiler)进行分型比对,结果见表8。
表8:
本试剂盒实现了常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座一起检测,原本需要两次的检验程序减少到一次完成,减少了繁琐的操作步骤,从而减少了检测时间,增加了抓获犯罪嫌疑人的机会。总而言之,随着刑事案件的增多,现有检测试剂盒已无法很好的满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求,常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座一起检测,达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
上海市刑事科学技术研究院
<120> 同时扩增人常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应
用
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<170> PatentIn version 3.3
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<400> 35
gaaatggcgg catttaaa 18
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
acaagaaaag aaatgaaatt caga 24
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
aagaatgtca tagatagatg at 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
atacctactt ctgtatccaa ctc 23
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagaatgtca tagatagatg at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atacctactt ctgtatccaa ctc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtatccgcca tggtagcata ata 23
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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tacattcaca catatatttt acaca 25
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tctcttgtgt atctattcat tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ggtaggcagg cagataggca g 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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atcaaagtgg aaagtagtct gg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cttgcaacat ctccatccat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttcctaatgt ggtcttctac t 21
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<213> 人工序列
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atgaggtatg tctcatagaa aag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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catcacagta ataactgatg caag 24
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gagaccagcc tcaccaac 18
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<211> 24
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gttatggttt taggtctaac attt 24
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attgttggga ttacaggcat aatcc 25
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<211> 19
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<213> 人工序列
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<211> 24
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cccaaaactt cttaaactga tgta 24
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catgccattc tcctgcttc 19
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attgctgctg aatgggagca 20
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gaagtaatgg aattagaaat aaata 25
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agagtgggtt ctgaagagct a 21
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<213> 人工序列
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aagtcttcaa gagttcaag 19
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<211> 25
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<213> 人工序列
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atttatctct atctttacct ctcta 25
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<211> 20
<212> DNA
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aattcagaag gtggaaattg 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
gttaaaatat tctaggaaga tta 23
Claims (9)
1.一种同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,其特征在于,试剂盒包含如下34个基因座的特异性扩增引物,所述基因座如下:D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、D19S433、vWA、D5S818、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、Amelogenin、DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYS456、DYS458、DYS635、Y_GATA_H4、DYS448、DYS527a/b;
所述34个基因座的特异性扩增引物为:D3S1358 SEQ ID NO:1~2、D13S317 SEQ ID NO:3~4、D7S820 SEQ ID NO:5~6、D16S539 SEQ ID NO:7~8、TPOX SEQ ID NO:9~10、TH01 SEQID NO:11~12、D2S1338 SEQ ID NO:13~14、CSF1PO SEQ ID NO:15~16、D19S433 SEQ ID NO:17~18、vWA SEQ ID NO:19~20、D5S818 SEQ ID NO:21~22、FGA SEQ ID NO:23~24、D8S1179SEQ ID NO:25~26、D21S11 SEQ ID NO:27~28、D18S51 SEQ ID NO:29~30、Amelogenin SEQID NO:31~32、DYS19 SEQ ID NO:33~34、DYS385a/b SEQ ID NO:35~36、DYS389ⅠSEQ ID NO:37~38、DYS389Ⅱ SEQ ID NO:39~40、DYS390 SEQ ID NO:41~42、DYS391 SEQ ID NO:43~44、DYS392 SEQ ID NO:45~46、DYS393 SEQ ID NO:47~48、DYS438 SEQ ID NO:49~50、DYS439SEQ ID NO:51~52、DYS456 SEQ ID NO:53~54、DYS458 SEQ ID NO:55~56、DYS635 SEQ IDNO:57~58、Y_GATA_H4 SEQ ID NO:57~58、DYS448 SEQ ID NO:61~62、DYS527a/b SEQ IDNO:63~64。
2.根据权利要求1所述同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,其特征在于,所述引物的浓度为:SEQ ID NO:1~2 0.1μM、D13S317 SEQ ID NO:3~4 0.1μM、D7S820 SEQ ID NO:5~6 0.1μM、D16S539 SEQ ID NO:7~8 0.1μM、TPOX SEQ IDNO:9~10 0.1μM、TH01 SEQ ID NO:11~12 0.1μM、D2S1338 SEQ ID NO:13~14 0.1μM、CSF1POSEQ ID NO:15~16 0.1μM、D19S433 SEQ ID NO:17~18 0.15μM、vWA SEQ ID NO:19~20 0.15μM、D5S818 SEQ ID NO:21~22 0.1μM、FGA SEQ ID NO:23~24 0.2μM、D8S1179 EQ ID NO:25~26 0.1μM、D21S11 SEQ ID NO:27~28 0.15μM、D18S51 SEQ ID NO:29~30 0.15μM、Amelogenin SEQ ID NO:31~32 0.1μM、DYS19 SEQ ID NO:33~34 0.2μM、DYS385a/b SEQ IDNO:35~36 0.1μM、DYS389ⅠSEQ ID NO:37~38 0.15μM、DYS389Ⅱ SEQ ID NO:39~40 0.15μM、DYS390 SEQ ID NO:41~42 0.2μM、DYS391 SEQ ID NO:43~44 0.15μM、DYS392 SEQ ID NO:45~46 0.2μM、DYS393 SEQ ID NO:47~48 0.15μM、DYS438 SEQ ID NO:49~50 0.2μM、DYS439SEQ ID NO:51~52 0.15μM、DYS456 SEQ ID NO:53~54 0.1μM、DYS458 SEQ ID NO:55~560.15μM、DYS635 SEQ ID NO:57~58 0.2μM、Y_GATA_H4 SEQ ID NO:59~60 0.2μM、DYS448SEQ ID NO:61~62 0.1μM、DYS527a/b SEQ ID NO:63~64 0.1μM。
3.根据权利要求1所述同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,其特征在于,将基因座进行分组并且至少1个特异性扩增引物的5’端通过化学荧光染料进行标记。
4.根据权利要求3所述同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,其特征在于,基因座分组方式为:D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS448为第一组;DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS458为第二组;DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、DYS390为第三组;Amelogenin、D8S1179、D5S818、DYS19、FGA、DYS438为第四组;DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、Y_GATA_H4、DYS635为第五组。
5.根据权利要求4所述同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,其特征在于,各组分别采用荧光染料中的一种标记,并且不同组别标记物不同,所述荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX或者VIG。
6.根据权利要求4所述同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,其特征在于,还包括反应混合液、热启动Taq、sdH2O、Allelic Ladder以及荧光分子量内标,所述反应混合液为Tris-HCl 50mM、MgCl2 2.0mM、KCl 50mM和dNTPs 0.2mM。
7.根据权利要求6所述同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒,其特征在于,试剂盒的扩增程序为:
变性 95℃ 2min,
循环94℃ 30s,60℃ 1min,72℃ 1min 29个循环,
终止延伸 60℃ 10min
4℃保温维持。
8.权利要求1~6中任意一项所述同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒在法医个体识别、嫌疑人家系排查及亲权鉴定中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:法医个体识别、嫌疑人家系排查及亲权鉴定中所用的检材包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA或滤纸、FTA卡、棉签、纱布任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
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