发明内容
本发明的目的在于提供一种人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒,所述试剂盒含有用于特异性扩增33个基因座的33组引物对,33个基因座分别为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaE、DYS635、DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b、DYS458、DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS438、DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4及DYS390,33个基因座对应的引物对如表1所示:
表1、各个基因座的引物序列及浓度
每个基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。
优选的,33个基因座的引物对使用5种不同的荧光染料标记,根据标记的荧光染料不同分为5组,分别是:
D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaE和DYS635为第一组;
DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、DYS385a/b和DYS458为第二组;
DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043为第三组;
Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS438为第四组;
DYS393、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4及DYS390为第五组。
所述5种不同的荧光染料分别是6-FAM、HEX、TAMRA、ROX和VIG。
试剂盒内还包括反应缓冲液、热启动Taq酶、超纯水、AllelicLadder以及荧光分子量内标,所述反应缓冲液为50mM的Tris-HCl、50mM的KCl、2.0mM的MgCl2、0.2mM的dNTPs和0.8mg/mL的BSA。
优选的,试剂盒内聚合酶链式反应的扩增程序为:95℃2min;94℃30s,61℃40s,72℃1min,重复15个循环;90℃30s,60℃1min,65℃80s,重复15个循环;60℃30min。
本发明的另一个目的在于提供上述人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒在个体识别、亲子鉴定、嫌疑人家系排查或常染色体数据库及Y染色体数据库中的的应用。
本发明的有益效果是:
1.本发明包含了公安部DNA数据库推荐使用的18个A-STR基因座,同时涵盖了14个突变率低、多态性高的Y-STR基因座,以及Amelogenin基因座,实现单管同时扩增检测33个基因座,为业内最多;
2.本发明实现了一次实验同时分析A-STR及Y-STR两种数据,可同时用于案件的快速排查,达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率,14个Y-STR基因座对于案件的排查具有很大的地域、姓氏指向性;
3.本发明实现了同建A-STR及Y-STR两个DNA数据库,大大节约了人力物力财力;
4.本发明可以检测出大量女性DNA样本背景下的微量男性DNA,是如强奸犯罪等混合斑检测的有力武器;
5.本发明在检测父-子亲子鉴定时,由于Y-STR数据已包含而无需单独再做Y-STR实验分析;
6.本发明涉及一种采用六色荧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方法;其中,本发明适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、毛囊、血痕或血液等;
7.本发明试剂盒引物通过精心设计和不断修改,具有较强的扩增特异性及温度耐受性。
综上所述,本发明选择了公安部DNA数据库推荐的18个A-STR基因座和1个性别鉴定基因座,并在此基础上添加了14个突变率低、多态性较高的Y-STR基因座,实现了一次实验同时对常染色体和Y染色体同步扩增和检测。本发明试剂盒可以对以滤纸和FTA卡为载体的血斑和唾液斑进行直接扩增而无需模板提取和纯化过程,也可以适用于不同提取方法提取的DNA样品,属于国内、外独家产品。本发明试剂盒可用于案件的快速排查,提高检测效率及案件排查速度,尤其对强奸案中男性样本微量检测及父-子亲子鉴定检测成效显著,本试剂盒适用范围广,兼容性好,与现有法医DNA检测系统完全兼容。
实施例4
为建立一个同步扩增A-STR和Y-STR两种基因座的复合扩增体系,反复优化引物,不断调整浓度,在不出现非特异扩增基础上保持各基因座结果均衡。由于DYS458、DYS393、DYS389I/II与X染色体同源性较高,本发明通过对基因组数据库的反复比对,找到合适区域设计特异引物,保证了所有Y-STR基因座在100ng的女性样品中仍无扩增。如下分述这三个基因座的优化过程。
采用如表6所示的引物,对采集的女性DNA样品进行扩增,扩增程序同实施例1。扩增后结果如图3所示(该图中所对应的是SEQIDNO.71~72)。从图中可以看出,DYS385a/b基因座对应的位置出现了非特异扩增峰(图3红色箭头),说明对照例中的引物会导致结果的误判。在采用表6中另外四对引物进行扩增时,也同样出现了非特异性扩增峰。这主要是由于DYS458与X染色体同源性较高,对女性样本进行检测时,会出现误扩增的情况。
表6、在DYS458基因座扩增中出现非特异峰的引物表
同理,采用表7中DYS393的引物,也会造成女性样本的非特异扩增峰,扩增程序同实施例1。扩增结果如图4所示(该图中所对应的是SEQIDNO.79~80),DYS393基因座在女性样本中出来了扩增峰,证实是该基因座引物在基因组中的非特异扩增峰。在采用表7中其他四对引物进行扩增时,也同样出现了非特异性扩增峰。用DYS393的序列在NCBI数据库中BLAST发现,其与很多常染色体以及X染色体都有较高的同源性,导致该基因座较难找到合适引物设计位置。通过基因座序列比对,将引物3`末端设计在Y染色体特异的碱基位置并多次重复实验验证,最终确定本发明所选择的特异引物。
表7、在DYS393基因座扩增中出现非特异峰的引物表
同理,采用表8中DYS389I/II的引物,也会造成女性样本的非特异扩增峰,扩增程序同实施例1。扩增结果如图5(DYS390位置)所示(该图中所对应的是SEQIDNO.85~86),DYS389I/II基因座在女性样本中出现扩增峰,证实是该基因座引物在基因组中的非特异扩增峰。在采用表8中另两对引物进行扩增时,也同样出现了非特异性扩增峰。经反复分析DYS389I/II基因座的模板序列,发现该段序列在男女性样本中差异比较小,如果引物设计的位置不对,就会导致非特异扩增问题,从而导致结果的误判。
表8、在DYS389基因座扩增中出现非特异峰的引物表
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
<110>广东华美众源生物科技有限公司
广州市刑事科学技术研究所
<120>一种人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒及其应用
<130>
<160>90
<170>PatentInversion3.5
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