CN116083595B - 一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及方法，试剂盒采用六组双荧光染料方法标记制备33个STR基因座复合扩增引物组，同时扩增33个STR位点。本发明因采用六组荧光染料标记，具有33个STR位点信息，根据中国人口数据扩展等位基因分型，选择适合中国人群遗传的高多态性位点，个体识别能力较强；包含D8S1132、D6S477、D19S253、D3S3045、D15S659、D10S1435等打拐基因座，同时包含SE33、Penta D、Penta E、FGA、D6S1043等高多态性的基因座；且适用于多种检材，高效提供位点信息，适用性性强；提高了检测的灵敏度、扩增效率；具有良好的种属特异性和适用性。

Description

一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂 盒及方法
技术领域
本发明涉及一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及方法，属于分子遗传技术领域。
背景技术
短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因座数量大，分布广泛，约占整个基因组的3％(International Human Genome SequencingConsortium，2001)，且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。
常染色体个体识别DNA荧光检测试剂盒开发主要采用目前应用最为广泛的多重PCR复合扩增和多色荧光标记检测技术，用于生物学检材的DNA基因分型。根据国内外已有的和我们自己在STR基因座方面的研究成果，并依据这些基因座在人群中等位基因频率分布的特异性，我们选择在人群中具有较高的多态性和杂合度的基因座，在这些基因座附近设计引物并分别标记荧光素，通过多重PCR扩增体系，对多态性STR基因座进行特异性扩增，然后与已知长度并标有荧光素的分子量标准品混合，在遗传分析仪或测序仪上电泳并收集电泳信息，继而对STR基因座的PCR产物分别进行长度和基因型分析，获取所需数据，达到个体识别的目的。
随着STR-PCR技术的发展，越来越多的复合扩增体系被研究开发，常染色体STR检验由于能达到同一认定，因此在个体识别、亲缘关系鉴定中发挥了重要作用。在案件侦破中，常染色体STR检验在证据链中有着举足轻重的作用，因此常染色体STR检验被广泛应用于案件侦破中。目前，在我国dna数据库样本检验中，常染色体STR检验仍然是重点，我国的dna数据库总量已经达到8000万，为案件的比对及串并提供了有力支持。目前国内外有多家公司如ab、promega、中德美联、阅微、海尔施都有常染色体STRs试剂盒，但这些商品化试剂盒无法单独满足中国打拐DNA数据库常染色体基因座的要求，需要配合其他补充试剂盒以达到DNA数据信息位点要求。如：AGCU 21+1FS试剂盒，工作量偏大。
同时，现在国内市场上关于常染色体STR的荧光检测试剂盒中对于引物的标记通常采用四组如6-FAM、VIC、NED和PET，五组如6-FAM、VIC、NED、TAZ和SID单荧光染料进行标记。其中VIC、NED、PET等荧光染料的激发波长均大于540nm，因为波长越长能量越低，所以使用VIC、NED、PET等单荧光标记的引物扩增的产物在进行电泳时其所发射出来的荧光相对较弱，不利于遗传分析仪中的激光检测器进行信号收集，很容易造成STR位点信息的丢失。
发明内容
本发明提供一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，采用6组荧光染料标记方法，建立了33个STR复合扩增检测体系，可同时扩增33个STR位点，同时提供33个STR位点信息，具有灵敏度高，扩增速度快，信息量大的特点，可高效进行个体信息识别；同时符合录入“打拐DNA数据库”的DNA数据要求。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，采用六组荧光染料方法标记制备33个STR基因座复合扩增引物组，同时扩增33个STR位点，包括30个常染色体STR基因座：D3S3045、vWA、D12S391、CSF1P0、PentaE、D6S477、D3S3045、D2S441、D16S539、D7S820、D13S317、D2S1338、PentaD、D8S1132、D22S1045、D19S433、D18S51、D6S1043、D15S659、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、D10S1435、D10S1248、TH01、D1S1656、TPOX、SE33、D19S253；1个Y染色体STR基因座：DYS391；1个性别位点Amel和1个Y染色体Indelrs199815934。
上述包含D8S1132、D6S477、D19S253、D3S3045、D15S659、D10S1435等打拐基因座，同时包含SE33、Penta D、Penta E、FGA、D6S1043等高多态性的基因座，且适用于多种检材，高效提供位点信息，适用性性强。
上述复合扩增试剂盒中的扩增引物的序列如PM NO.01-PM NO.67所示；其中，30对常染色体STR基因座的扩增引物的序列如下：D3S3045，PM NO.01-02；vWA，PM NO.03-04；D12S391，PM NO.05-07；CSF1P0，PM NO.08-09；PentaE，PM NO.10-11；D6S477，PM NO.12-13；D3S3045，PM NO.14-15；D2S441，PM NO.16-17；D16S539，PM NO.18-19；D7S820，PM NO.20-21；D13S317，PM NO.22-23；D2S1338，PM NO.24-25；PentaD，PM NO.26-27；D8S1132，PMNO.28-29；D22S1045，PM NO.30-31；D19S433，PM NO.32-33；D18S51，PM NO.34-35；D6S1043，PM NO.36-37；D15S659，PM NO.38-39；D8S1179，PM NO.40-41；D5S818，PM NO.42-43；D21S11，PM NO.44-45；FGA，PM NO.46-47；D10S1435，PM NO.48-49；D10S1248，PM NO.50-51；TH01，PM NO.52-53；D1S1656，PM NO.54-55；TPOX，PM NO.56-57；SE33，PM NO.58-59；D19S253，PM NO.60-61。1对Y染色体STR基因座的扩增引物的序列如下：DYS391，PM NO.62-63；1对性别位点Amel的扩增引物的序列如下：Amel，PM NO.64-65和1对Y染色体Indel的扩增引物的序列如下：Y-Indel，PM NO.66-67。
上述复合扩增试剂盒中的引物在扩增时的工作浓度如下：所述30对常染色体STR基因座的扩增引物的工作浓度：D3S3045 0.25uM、vWA 0.28uM、D12S391 0.38uM、CSF1P0.4uM、PentaE 0.6uM、D6S477 0.88uM、D3S3045 1.66uM、D2S441 0.25uM、D16S539 0.2uM、D7S820 0.3uM、D13S317 0.35uM、D2S1338 0.45uM、PentaD 0.62uM、D8S1132 0.93uM、D22S1045 0.3uM、D19S433 0.42uM、D18S51 0.77uM、D6S1043 0.46uM、D15S659 0.66uM、D8S1179 0.61uM、D5S818 0.48uM、D21S11 0.75uM、FGA 1.05uM、D10S1435 0.66uM、D10S1248 0.36uM、TH01 0.31uM、D1S1656 0.34uM、TPOX 0.35uM、SE33 0.28uM、D19S2530.83；所述1对Y染色体STR基因座的扩增引物的工作浓度：DYS391 1.41uM；所述1对性别位点Amel的扩增引物的工作浓度：Amel 0.23uM；所述Y染色体Indell的扩增引物的工作浓度：Y-Indel 0.34uM。
引物序列及其终浓度具体如下表所示：
表1各基因座的引物序列及其终浓度
同时，本发明使用荧光共振能量转移系统(以下简称FRET，FluorescenceResonance Energy Transfer)，FRET由两个荧光基团组成，一个荧光供体和另外一个为荧光受体，两者在一定的距离范围内可进行能量转移。当荧光供体和荧光受体距离小于10nm，电子激发荧光供体基团后通过分子内部的相互作用将能量非辐射的转移到荧光受体的基团。能量转移使荧光供体的荧光强度淬灭，并降低其激发态寿命，同时增加了荧光受体基团的荧光发射强度。
荧光共振能量转移系统的使用改善了在长波范围内荧光信号减弱的问题，使波长较长的荧光染料ATTO 550、RHO12、ATTO 590依然具有高效的荧光信号，提高了检测的灵敏度、扩增效率，对于不同品牌的PCR扩增仪具有良好的扩增反应，适用性强。同时，为了在多重PCR过程中实现重复、灵敏、高效的扩增，在进行基因座的引物设计和选择时要具有高度特异性，需排除由于同源性所带来的分析误差，本发明整套引物按照统一的参数进行设计，使引物的退火温度尽量一致；引物结合区避开SNP位点，扩增子避开缺失位点，并对每一个基因座位点的上游引物使用双荧光染料进行标记，各引物标记类型见表1。
需要说明的是，基因座的数量并非是可以任意增加的，实践中，一个基因座的错误选择，会导致整个试剂盒的扩增失败，进而导致无法完成检测，基因座或其引物都可能会因为与其它基因座或引物等的相互影响，进而导致反应无法进行。在进行引物设计时，同一个基因座的引物存在多种选择，复合基因座混合在一起时，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，所有引物在同一反应体系中反应，引物间存在复杂的相互影响，引物的选取不当，将会导致反应无法进行；本发明每个基因座的引物，都是经过选择和优化的，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。
综上，本发明同时采用FRET系统和六组荧光标记的常染色体STR引物混合体系，不仅提高了在长波长范围内的检测灵敏度，且六组双荧光的采用大大增加了常染色体STR位点的个数，可同时扩增33个STR位点，这些位点不但涵盖了美国FBI于2017年1月1日推荐的新的CODIS基因座，同时包含了中国公安部国家DNA数据库常见的18个常染色体STR。
上述复合扩增试剂盒包括同时扩增33个STR位点的67条特异性引物的复合引物组、反应混合液和热启动Taq聚合酶；67条特异性引物包含34条不同荧光染料标记的上游引物和33条非荧光标记的下游引物，序列编号从PM NO.01到PM NO.67。
67条特异性引物共分为五组，第一组、第二组在引物的5’端第一个碱基依次用FAM、HEX进行标记；第三组、第四组、第五组在引物的5’端第一个碱基依次用ATTO 550、RHO12、ATTO 590进行标记，再使用FAM标记引物5’-末端和3’-末端中间序列的一个碱基。第一组：D3S3045，vWA，D12S391，CSF1P0，PentaE，D6S477，D3S3045；第二组：D2S441，D16S539，D7S820，D13S317，D2S1338，PentaD，D8S1132；第三组：rs199815934，Amel，D22S1045，D19S433，D18S51，D6S1043，DYS391，D15S659；第四组：D8S1179，D5S818，D21S11，FGA，D10S1435；第五组：D10S1248，TH01，D1S1656，TPOX，SE33，D19S253。各上游引物标记类型如表1所述。
上述复合扩增试剂盒其25μl的扩增反应体系如下：2.5×TFS PCR Mix 8-10μl，A33引物混合物5μl，Taq DNA聚合酶1μl，模板DNA 2μl，去离子水补足25μl；其中，引物混合物为33个STR基因座的扩增引物混合物，2.5×TFS PCR Mix成分为：pH8.3-8.5的Tris-HCl70mM～125mM，MgCl2 8mM-12mM，KCl 80mM-150mM，BSA 1mg/ml-5mg/ml，dNTPs 5.0mM～7.5mM，PCR增强剂；PCR增强剂为1M-5M的甜菜碱、1％-4％的Tween20、10mM-20mM的硫酸铵与1％-5％的PEG100。前述百分比为质量百分比。
上述复合扩增试剂盒还包括含有镁离子和dNTP的2.5×TFS PCR Mix，33个STR基因座的等位基因ladder，DNA标准品、荧光分子量内标O-640与J6-Matrix。并在固定位置添加阳性内参(IPC)，其扩增效率不随模板浓度的改变而变化，可快速对样品质量进行评估。
扩增与检测方法，包括如下步骤：①样品处理：提取样品的基因组DNA作为扩增模板或直接采用免提取的样品作为扩增模板；②利用序列如PM NO.01-67所示的扩增引物对步骤①获得的样本基因组DNA进行PCR扩增；③使用遗传分析仪对扩增产物进行荧光信号检测；④收集荧光信号数据，使用基因分析软件分析得到的33个基因座的DNA分型结果。
上述模板DNA包括提取样本与直扩样本，其中提取样品主要包括人源的精斑、血液、体液、毛发、组织、血痕等，DNA基因组的主要提取方法为磁珠提取法或Chelex100法；直扩样品包括滤纸、血卡、棉签、FTA卡中的一种或多种载体收集的人类血液或口腔细胞。样品的DNA模板量优选为0.5ng～4ng。
上述复合扩增试剂适应不同检材的扩增，具有较大的退火温度范围，扩增体系在各种反应热循环仪上采用以下的程序可以扩增程序为：95℃3min，95℃5s，62℃90s，28-30个循环；60℃终延伸12min；4℃保持；使用遗传分析仪对扩增产物进行荧光信号检测；收集荧光信号数据，使用基因分析软件分析得到的33个基因座的DNA分型结果。
上述复合扩增试剂盒还包括33个基因座的等位基因ladder，DNA标准品、荧光分子量内标O-640与J6-Matrix。
上述复合扩增试剂盒可应用于中国人群个体识别、亲子鉴定、常染色体DNA数据库建设、群体遗传学研究等方面。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明的有益效果是：
1、因采用六组荧光染料标记，具有33个STR位点信息，不但涵盖了美国FBI于2017年1月1日推荐的新的CODIS基因座，同时包含了中国公安部国家DNA数据库常见的18个常染色体STR，同时符合录入“打拐DNA数据库”的DNA数据要求，且适用于多种检材，高效提供位点信息，适用性性强。
2、在固定位置添加阳性内参(IPC)，其扩增效率不随模板浓度的改变而变化，可快速对样品质量进行评估。
3、采用FRET双荧光标记技术，使波长较长的荧光染料ATTO 550、RHO12、ATTO590依然具有高效的荧光信号，提高了检测的灵敏度、扩增效率；通过对扩增体系的优化，使整体扩增时间控制在60min左右，扩增速度快，均衡性较好。
4、高性能PCR扩增体系的优化，具有更高的灵敏度与更强的抗抑制能力，最低检出限可达20pg，极大提高含抑制剂检材的检出率，从而能够从具有挑战性的案件检材(包括触摸、降解和含抑制剂等样本)中尽可能得到更多的遗传信息，更适用于现场生物物证和降解检材的遗传分析。
5、本试剂盒引物具有良好的种属特异性，对生活中人类经常接触的动物如鸡、鸭、狗、猫、猪等的基因组没有扩增反应；在引物设计时保持了引物的Tm值尽量保持一致，对于不同品牌的PCR扩增仪具有良好的扩增反应，适用性强。
附图说明
图1为本申请所述的33个STR基因座的排布示意图；
图2为本发明实施例中试剂盒等位基因分型标准图；
图3为本发明实施例中扩增阳性标准品9948的33个基因座的分型图谱；
图4为本发明实施例中试剂盒在数据库建设中样本1(男性)的33个基因座的分型图谱；
图5为本发明实施例中试剂盒在数据库建设中样本2(女性)的33个基因座的分型图谱；
图6为本发明实施例中扩增DNA阳性标准品9948 0.125ng、0.25ng、0.5ng和1ng浓度下阳性内参的扩增结果；
图7为本发明实施例中试剂盒扩增DNA阳性标准品9948 0.5ng、0.25ng和0.125ng三个浓度梯度扩增结果；
图8为本发明实施例中试剂盒扩增DNA阳性标准品9948 20pg的33个基因座的分型图谱；
图9为本发明实施例中试剂盒扩增其他种属样本猪、鸡、狗、牛、羊、与鱼的分型图谱；
图10为在中国汉族人群中各位点等位基因频率；
图11为在中国汉族人群中各位点的个体识别率。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，包括：同时扩增33个常染色STR位点的67条特异性引物的复合引物组、反应混合液和热启动Taq聚合酶；采用六组双荧光染料方法标记制备33个常染色STR基因座复合扩增引物组，同时扩增33个常染色STR位点。
通过专业引物设计软件Oligo7，在33个STR基因座位点核心重复区的两翼进行引物设计，使每条引物Tm值接近60℃，扩增产物在75-600bp之间，并对每条引物进行测试优化，直到扩增效率高，不出现错配，无非特异性扩增峰产生。再进行复合扩增测试，在57℃-63℃之间没有非特异产生。引物序列、引物在扩增时的工作浓度等见表1。
33个常染色STR基因座位点，包括：D3S3045、vWA、D12S391、CSF1P0、PentaE、D6S477、D3S3045、D2S441、D16S539、D7S820、D13S317、D2S1338、PentaD、D8S1132、rs199815934、Amel、D22S1045、D19S433、D18S51、D6S1043、DYS391、D15S659、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、D10S1435、D10S1248、TH01、D1S1656、TPOX、SE33、D19S253。
67条特异性引物的复合引物组序列编号：PM NO.01到PM NO.67；67条引物共分为五组，第一组、第二组在引物的5’端第一个碱基依次用FAM、HEX进行标记；第三组、第四组、第五组在引物的5’端第一个碱基依次用ATTO 550、RHO12、ATTO 590进行标记，再使用FAM标记引物5’-末端和3’-末端中间序列的一个碱基。
第一组：D3S3045，vWA，D12S391，CSF1P0，PentaE，D6S477，D3S3045；第二组：D2S441，D16S539，D7S820，D13S317，D2S1338，PentaD，D8S1132；第三组：rs199815934，Amel，D22S1045，D19S433，D18S51，D6S1043，DYS391，D15S659；引物编号：PM NO.30-PM NO.45；第四组：D8S1179，D5S818，D21S11，FGA，D10S1435；第五组：D10S1248，TH01，D1S1656，TPOX，SE33，D19S253。
为使扩增的基因座峰高的均衡性符合要求，对引物浓度以及扩增组分进行系列测试，终确定了引物加量及扩增缓冲液的组分。引物终浓度如表1所示。
试剂盒由两个部分组成，包括反应前扩增试剂盒和反应后电泳试剂盒。各试剂盒组份见表2。
表2各试剂盒组份
其中，反应混合液2.5×TFS PCR Mix成分为：pH8.5的Tris-HCl 100mM，MgCl29mM，KCl 120mM，BSA 1.5mg/ml，dNTPs 6.5mM，PCR增强剂。PCR增强剂为1.5M的甜菜碱，2.5％的Tween20，11mM的硫酸铵与1.8％的PEG100。
本发明提供的用于分析的等位基因分型标准物，是由各个STRs基因座引物扩增对应的等位基因质粒的产物组。DNA阳性标准品9948购买苏州新海生物科技股份有限公司，热启动Taq DNA聚合酶购于宝生物公司。图2为Allelic Ladder电泳图谱。
经验证，本发明的试剂盒在57℃-63℃退火温度范围内有良好的扩增效率，在不同品牌的PCR仪(ABI9700，ABI veriti，E1000等)上均具有较好的扩增效率。
在扩增9948阳性标准品的情况下，按照表4配置反应混合液。
表3 PCR体系配制各组分加入量
组分 25μL体系
2.5×TFS PCR Mix 8.0μL
A33 Plex primers 5.0μL
Taq DNA聚合酶 1.0μL
9948阳性DNA 2.5μL
PCR Grade Water 加至总体积25μL
反应总体积 25μL
扩增体系在各种PCR扩增仪上(ABI9700，ABI veriti，E1000等)，采用以下程序均能得到较好结果：95℃3min，95℃5s，62℃90s，28个循环；60℃终延伸12min；4℃保持，进行PCR扩增；将得到的PCR扩增产物取1ul+0.15ul分子量内标+9ul去离子甲酰胺混匀后，在ABI3130XL遗传分析仪上进行毛细管电泳。电泳参数：进样时间10s，进样电压：3.0Kv；其他参数为机器默认。使用收集软件收集电泳数据，使用GeneMapper软件进行数据分析，图3为9948扩增检测图谱，与理论分型完全一致。
在扩增FTA血卡的情况下，按照表4配置反应混合液。
表4 PCR体系配制各组分加入量
组分 25μL体系
2.5×TFS PCR Mix 8.0μL
A33 Plex primers 5.0μL
Taq DNA聚合酶 1.0μL
FTA卡或滤纸 1.0或1.2mm孔径1-2片
PCR Grade Water 加至总体积25μL
反应总体积 25μL
使用GE生产的E1000 PCR扩增仪进行扩增按照扩增程序：95℃3min，95℃5s，60℃90s，28个循环；60℃终延伸10min；4℃保持，进行PCR扩增；将得到的PCR扩增产物取1ul+0.15ul分子量内标+9ul去离子甲酰胺混匀后，在ABI3130XL遗传分析仪上进行毛细管电泳。电泳参数：进样时间10s，进样电压：3.0Kv；其他参数为机器默认。使用收集软件收集电泳数据，使用GeneMapper软件进行数据分析，图4、图5为FTA血卡直接扩增图谱。
本发明在固定位置添加阳性内参(IPC)，其扩增效率不随模板浓度的改变而变化，若样本降解，可快速对样品质量进行评估，图6为本发明实施例中扩增DNA阳性标准品99480.125ng、0.25ng、0.5ng和1ng浓度下阳性内参的扩增结果。
本发明还对试剂盒的检测灵敏度进行了测试，通过扩增不同浓度的9948阳性DNA，找到可以检测出全部STR基因座分型的最低DNA浓度。配置扩增体系参照表3，9948投入量分别为0.5ng、0.25ng、0.125ng，阳性标准品投入量最大不得超过5ng，否则会造成电泳失败。扩增程序为95℃3min，95℃10s，60℃90s，28个循环；60℃终延伸12min；4℃保持，进行PCR扩增；扩增产物使用3130XL遗传分析仪进行电泳和数据分析。图7为试剂盒扩增DNA阳性标准品9948 0.5ng、0.25ng和0.125ng三个浓度梯度扩增结果，图8为试剂盒扩增DNA阳性标准品9948 20pg的33个基因座的分型图谱。对生活中人类经常接触的动物如鸡、鸭、狗、猫、猪等的基因组没有扩增反应，图9为试剂盒扩增其他种属样本猪、鸡、狗、牛、羊、与鱼的分型图谱。经实验，个体识别能力在0.97以上，在中国汉族人群中各位点等位基因频率如图10所示，个体识别率如图11所示。当DNA浓度为20pg仍可准确分型，33个基因座分型如图8所示。
综上，本发明通过采用六组荧光染料进行双染料标记，不仅极大提高了常染色体基因座的排布数量，还避免了在长波长范围内荧光染料信号强度低，容易淬灭的问题，同时增强了个体识别的能力，提高了试剂盒的灵敏度和均衡性。

Claims (8)

1.一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，其特性在于，其包括用于复合扩增33个STR基因座的33对特异性引物的复合引物组，同时扩增33个STR位点，包括30个常染色体STR基因座：D3S1358、vWA、D12S391、CSF1P0、PentaE、D6S477、D3S3045、D2S441、D16S539、D7S820、D13S317、D2S1338、PentaD、D8S1132、D22S1045、D19S433、D18S51、D6S1043、D15S659、D8S1179、D5S818、D21S11、FGA、D10S1435、D10S1248、TH01、D1S1656、TPOX、SE33和D19S253；1个Y染色体STR基因座：DYS391；1个性别位点Amel和1个Y染色体Indel rs199815934；
33个STR基因座的扩增引物的序列为：
扩增引物使用荧光染料标记进行标记，将33个STR基因座的扩增引物分为如下五组，分别用五种不同颜色的荧光染料标记五组的扩增引物，第一组、第二组在引物的5’端第一个碱基依次用FAM、HEX进行标记；第三组、第四组、第五组在引物的5’端第一个碱基依次用ATTO 550、RHO12、ATTO 590进行标记，再使用FAM标记引物5’-末端和3’-末端中间序列的一个碱基；第一组：D3S1358、vWA、D12S391、CSF1P0、PentaE、D6S477和D3S3045；第二组：D2S441、D16S539、D7S820、D13S317、D2S1338、PentaD和D8S1132；第三组：rs199815934、Amel、D22S1045、D19S433、D18S51、D6S1043、DYS391和D15S659；第四组：D8S1179、D5S818、D21S11、FGA和D10S1435；第五组：D10S1248、TH01、D1S1656、TPOX、SE33和D19S253。
2.据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，复合扩增试剂盒中的引物在扩增时的工作浓度如下：30对常染色体STR基因座的扩增引物的工作浓度：D3S1358 0.25μM、vWA0.28μM、D12S391 0.38μM、CSF1P 0.4μM、PentaE 0.6μM、D6S477 0.88μM、D3S3045 1.66μM、D2S441 0.25μM、D16S539 0.2μM、D7S820 0.3μM、D13S3170.35μM、D2S1338 0.45μM、PentaD0.62μM、D8S1132 0.93μM、D22S1045 0.3μM、D19S433 0.42μM、D18S51 0.77μM、D6S10430.46μM、D15S659 0.66μM、D8S1179 0.61μM、D5S818 0.48μM、D21S11 0.75μM、FGA 1.05μM、D10S1435 0.66μM、D10S12480.36μM、TH01 0.31μM、D1S1656 0.34μM、TPOX 0.35μM、SE330.28μM、D19S2530.83μM；1对Y染色体STR基因座的扩增引物的工作浓度：DYS391 1.41μM；1对性别位点Amel的扩增引物的工作浓度：Amel 0.23μM；Y染色体Indel的扩增引物的工作浓度：Y-Indel 0.34μM。
3.根据权利要求1或2所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，扩增反应程序如下：95℃3min，95℃5s，62℃90s，28-30个循环；60℃终延伸12min；4℃保持。
4.根据权利要求1或2所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，扩增反应体系如下：2.5×TFS PCR Mix 8-10μl，A33引物混合物5μl，Taq DNA 聚合酶1μl，模板DNA 2μl，去离子水补足25μl；其中，引物混合物为33个STR基因座的扩增引物混合物，2.5×TFS PCR Mix成分为：pH8.3-8.5的Tris-HCl 70mM～125mM，MgCl2 8mM-12mM，KCl 80mM-150mM，BSA 1mg/ml-5mg/ml，dNTPs 5.0mM～7.5mM，PCR增强剂；PCR增强剂为1M-5M的甜菜碱、1％-4％的Tween20、10mM-20mM的硫酸铵与1％-5％的PEG100。
5.根据权利要求4所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，还包括含有镁离子和dNTP的2.5×TFS PCR Mix，33个STR基因座的等位基因ladder，DNA标准品、荧光分子量内标O-640与J6-Matrix。
6.根据权利要求1或2所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，在固定位置添加阳性内参，其扩增效率不随模板浓度的改变而变化，可快速对样品质量进行评估。
7.一种利用权利要求1-6任意一项所述的含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒进行复合扩增检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：①样品处理：提取样品的基因组DNA作为扩增模板或直接采用免提取的样品作为扩增模板；②利用序列如SEQID NO:1-67所示的扩增引物对步骤①获得的样本基因组DNA进行PCR扩增；③使用遗传分析仪对扩增产物进行荧光信号检测；④收集荧光信号数据，使用基因分析软件分析得到的33个基因座的DNA分型结果。
8.根据权利要求7所述的复合扩增与检测方法，其特征在于，步骤①中，扩增模板为提取样本或直扩样本，提取样本包括人源的精斑、血液、体液、毛发、组织或血痕，DNA基因组的提取方法为磁珠提取法或Chelex100法；直扩样本包括滤纸、血卡、棉签或FTA卡中的一种或多种载体收集的人类血液或口腔细胞。
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Pledgor: JIANGSU SUPERBIO BIOMEDICAL TECHNOLOGY NANJING CO.,LTD.

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