CN101698890A

CN101698890A - 22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统

Info

Publication number: CN101698890A
Application number: CN200910224287A
Authority: CN
Inventors: 刘未斌; 万慧荣; 夏子芳; 杜蔚安; 汤文文; 熊勇华; 郑卫国
Original assignee: Wuxi Agcu Scientech Inc
Current assignee: Wuxi Agcu Scientech Inc
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2010-04-28

Abstract

本发明涉及一种新的荧光标记复合扩增检验系统，该系统可以同时分析人基因组DNA 22个基因座的遗传多态性，其中的22个基因座分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记。本发明的荧光标记复合扩增检验系统提供用于复合扩增22个基因座的寡核苷酸引物混合物；系统中还包括每个基因座的等位基因标准物，以确定待检DNA样品中各个基因座的基因型；系统中包含的用于鉴别DNA样品性别的基因座是Amelogenin基因座。该系统的检测结果表明其多态性高、平衡性好、灵敏度高、特异性高、分型结果准确，完全能够满足实际案件检验、DNA数据库建设以及亲子鉴定的需要。在中国汉族人群中的总体随机匹配概率为8.3×10^-20，累积非父排除率为0.9999999893。

Description

22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统

技术领域

本发明涉及一种荧光标记复合扩增检验系统，具体涉及通过复合扩增，检测人基因组中21个STR基因座和Amelogenin基因座的荧光标记复合扩增检验系统，该系统可以广泛用于公安部门日常检案、DNA数据库建立、个体识别、亲子鉴定以及考古等方面，有助于解决公安部打拐数据库一子多父母问题和亲子鉴定中突变和近亲鉴定问题。

背景技术

短串联重复序列(STR)是目前普遍应用的遗传标记，由于它具有片段小容易扩增、适宜于检验微量或降解检材、各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增等特点，因而采用STR的检验系统具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点，尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。因此美国FBI选择了13个STR基因座用于建立DNA数据库——CODIS(Combined DNA Index System)：CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA。这些STR基因座通常被称为13个核心基因座。

正是因为STR基因座具备以上优点和应用前景，许多科研机构和公司投入了大量经费对其进行开发性的研究。国内外已有较多基于STR-PCR技术的荧光检测技术产品：

为了提供一种新的荧光标记复合扩增检验系统，使其更适合于中国人群在个体识别和亲子鉴定等方面的应用，进一步提高系统的累计个体识别力和累积非父排除率，该检验系统中必须包含数目更多的、在中国人群中具有高度遗传多态性的STR基因座。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统，用于个体识别和亲子鉴定。为此，本发明者对中国人群中STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并以此为依据，开发了新的STR基因座的5色荧光复合扩增检验系统，提供对包括Amelogenin在内的22个基因座的分型结果，提高了系统的累计个体识别力和累积非父排除率。该系统单独或与其他商品化试剂盒联合使用，有助于解决公安部打拐数据库一子多父母、亲子鉴定中突变和近亲鉴定问题。

本发明的同时分析人基因组DNA的22个基因座的荧光标记复合扩增系统中，所涉及的22个基因座为：Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500。

本发明的荧光标记复合扩增系统还涉及在一个体系中同时扩增22个基因座，将22个基因座分为四组并分别用四种不同的荧光染料FAM、HEX、TAMRA、ROX进行标记。

本发明的荧光标记复合扩增系统优选的一种分组及荧光染料标记方式为：FAM标记的Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463为一组；HEX标记的D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433为一组；TAMRA标记的D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434为一组；ROX标记的D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500为一组。

本发明所采用的22个基因座分别采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记；本发明还提供用于复合扩增22个基因座的寡核苷酸引物混合物。

本发明的系统中包括每个基因座的等位基因标准物，以确定待检DNA样品中各个基因座的基因型；本发明的系统中包含的用于鉴别DNA样品性别的基因座是Amelogenin基因座。

本发明的扩增采用聚合酶链式反应进行，扩增产物的检测方法采用多道或单道毛细管电泳。

本发明的荧光标记复合扩增检验系统适用于：人的精斑、唾液斑、组织、血痕或血液等检材来源DNA样品的检测分析。

为实现本发明的上述目的，采用如下技术方案：

一、基因座的确定

采用STR分型技术进行个体识别和亲子鉴定，一方面是因为STR基因座具有高度多态性，所用的STR基因座都有较多等位基因，具有较高的非父排除率；但另一方面其突变率也很高，往往会对结果分析(尤其是对亲子鉴定样本中的结果分析)及最后作出判断带来许多困难。在实践中，往往可以发现一些案例，在检测的STR基因座中有1-2个出现矛盾现象，此时就需要增加检测的STR基因座数目。

根据中山大学伍新尧教授在第二届“全国亲子鉴定理论与实践研讨会”上发表的《亲子鉴定判断标准和结论表述的推荐意见(讨论稿)》：

对于三联体亲子鉴定案：①最少检测15个STR基因座，若没有发现矛盾基因座，父权指数达10000，可以作出“肯定亲生关系”的结论；②若出现1个矛盾基因座，要增加检测基因座至19个；若发现有2个矛盾基因座，要增加检测至28个，没有新矛盾基因座发现时，父权指数达10000，可作出“肯定亲生关系”的结论；③若发现有3个矛盾基因座，要增加检测至35个，没有新矛盾基因座发现时，父权指数达10000，可作出“肯定亲生关系”的结论；④若有4个矛盾STR基因座，则作出“否定亲生关系”的结论。

对于单亲案亲子鉴定：①至少检测18个STR基因座，没有发现矛盾基因座时，作出“不排除亲生关系”的结论；②若发现有1个矛盾基因座，增加检测至29个以上；若有2个矛盾基因座，要增加检测至41个以上，没有发现新的矛盾基因座，可作出“不排除亲生关系”的结论；③如果出现3个或3个以上矛盾STR基因座，则应作出“否定亲生关系”的结论。

由上述内容可知，仅检测13个CODIS基因座，或只单独使用现常用的商品化试剂盒(如AGCU 17+1STR荧光检测试剂盒、ABI

Identifiler、Promega

16)进行检测，在许多情况下都是远远不够的。因此，开发一系列非CODIS基因座的STR分型检测产品，增加一次性提供所检测基因座的数目，将有利于亲子鉴定和公安部打拐工作的开展。

本发明者对现有文献报道的CODIS以外的常染色体STR基因座进行深入分析研究。首先优选新的高鉴别力基因座，同时考虑到和现常用商品化试剂盒的补充性，对D2S1338、D19S433、Penta E、Penta D、D19S253、D12S391、D6S1043、D1GATA113、D1S1627、D1S1677、D2S441、D2S1776、D3S3053、D3S4529、D4S2364、D4S2408、D5S2500、D6S474、D6S1017、D8S1115、D9S1122、D9S2157、D10S1248、D10S1435、D11S4463、D12ATA63、D14S1434、D17S974、D17S1301、D18S853、D20S482、D20S1082、D22S1045等33个STR基因座在中国人群的遗传多态性开展调查研究，对1800多名个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，最终确立了21个STR基因座的构成：D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500，表明这21个STR基因座在人群中具有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。将上述21个STR基因座加上用于鉴别人性别的Amelogenin基因座即构成本发明的复合扩增检验系统。

该基因座构成突破了现有13个核心基因座的模式，提供了非CODIS基因座以外的21个基因座的分型结果，是世界上首个完全非CODIS基因座的荧光检测系统，单独使用时是目前市场上单管反应提供最多基因座分型结果(21个STR基因座加Amelogenin基因座)的产品，具有更高的累计个体识别力和累积非父排除率；或联合现常用商业化试剂盒使用(如下表)，有助于解决公安部打拐数据库一子多父母、亲子鉴定中突变和近亲鉴定的问题。

二、荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计

本研究对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了FAM、HEX、TAMRA、ROX和SIZ五种荧光标记物，构建了5色荧光组合方案。

在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，在国内首次自行设计出基因座组合以及荧光标记的方式。从生产成本、各基因座各引物扩增效率等方面考虑，选择了蓝色7个基因座、绿色6个、黄色5个、红色4个。采用这种标记组合后，没有发现非目的片段以外的扩增峰，这表明各基因座引物序列之间没有错配的情况，不会产生和DNA模板在非目标区域的结合和扩增，即使更换各组的标记荧光素也不会产生非目的扩增峰。以下为其中一种优选的产品组合方式：Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463为一组，荧光标记物为6-FAM；D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433为一组，荧光标记物为HEX；D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434为一组，荧光标记物为TAMRA；D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500为一组，荧光标记物为ROX。内标选用荧光标记物为SIZ。这种独创的基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这22个基因座的同时检测分析。结果表明我们所使用的这种组合和分色方式，能够满足分析的要求，各基因座能够得到正确的分型结果，且峰值相对均衡。

在组合方案的基础上，根据22个基因座的侧翼序列进行引物设计，实现22个基因座在同一反应中的复合扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在400bp以内而实现高灵敏度，更加适宜于检验微量或降解检材。

本发明在国内首次实现22个基因座同时在单一反应中的复合扩增，并以5色荧光标记进行检验。

三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立

1、基因座之间平衡度的调配

随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于扩增竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次反复实验，优化引物序列、浓度，终达到平衡。

2、复合扩增条件的建立

先对22个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究22个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出22个基因座。

本发明的荧光标记复合扩增检验系统良好的应用效果主要表现在下述几个方面：

1.系统的灵敏度高

本发明中22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统在DNA模板量为0.12ng的条件下，可检出全部22个基因座。

2、特异性强

通过大量反复验证，本发明复合扩增结果无22个基因座之外的扩增产物。

3.遗传学调查

用22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统对中国汉族群体进行遗传学调查，结果表明：在中国汉族人群中的总体随机匹配概率为8.3×10^-20，累积非父排除率为0.9999999893，高于现有技术所达到的水平。

4.实际应用的效果

本发明中22个基因座的荧光标记复合扩增系统已在国内10个省市的公安单位中测试与试用，结果表明该系统多态性高，平衡性好，灵敏度高，特异性高，分型结果准确，完全能够满足实际案件检验、DNA数据库建设以及亲子鉴定的需要。

附图说明

图1：对无关个体DNA样品的STR分型结果。

图2：22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统的等位基因分型标准物。

图3：对实施例2样品中的STR分型结果。

图4：对实施例3样品中的STR分型结果。

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例122个基因座的荧光标记复合扩增检验系统的复合扩增以及荧光检测

1、22个基因座的分组及荧光标记：

Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463为一组，荧光标记物为6-FAM；D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433为一组，荧光标记物为HEX；D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434为一组，荧光标记物为TAMRA；D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500为一组，荧光标记物为ROX。内标选用荧光标记物SIZ。

2、PCR扩增体系

3、扩增热循环

(1)将PCR扩增管置于热循环仪上；

(2)选择下面推荐的程序进行扩增；

(3)扩增后的样品应避光保存；

热循环仪的扩增程序

4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(AGCU Marker SIZ-500)组成上样混合物〔(0.5μLAGCU Marker SIZ-500)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物或系统中等位基因分析标准物(21+1Allelic Ladder)混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。

5、分型分析

用片段分析软件GeneMapper分析步骤4中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和21+1 Allelic Ladder(见附图2)比较，得到实际样品的基因分型数据，结果见附图1。

实施例2应用22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行亲子鉴定(三联体)

1、收集亲子鉴定案件中的血样

本实验中样品由××亲子鉴定所提供。

2、Chelex-100法提取基因组DNA

取0.5～5μL全血或1～3mm×2～5mm的血斑置于灭菌的1.5mL离心管中，加入1mL超纯水，振荡数秒。置于室温10分钟，振荡数秒。用12,000rpm离心3分钟。弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀。加入200μL 5％的Chelex-100，振荡数秒。于56℃保温30分钟，振荡数秒。沸水浴10分钟，振荡数秒。用12,000rpm离心5分钟，上清中为提取得到的人基因组DNA。

3、扩增检测

按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。

4、结论

由附图3得到本实验的亲子鉴定父-子-母基因分型如下表1：

表1：

在本例三联体亲子鉴定中，共检测21个STR基因座，其中出现1个矛盾基因座(如上表中D19S433的分型结果)，超过“若出现1个矛盾基因座，要增加检测基因座至19个”的要求，父权指数为84416799，超过10000，可作出“肯定亲生关系”的结论。实施例3应用22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行亲子鉴定(单亲)

1、收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由黑龙江省公安厅提供。

2、Chelex-100法提取基因组DNA

按照实施例2，使用Chelex-100法提取基因组DNA。

3、扩增检测

4、结论

由附图4得到本实验的亲子鉴定父-子基因分型如下表2：

表2：

在本例单亲亲子鉴定中，共检测21个STR基因座，没有发现矛盾基因座，可以作出“不排除亲生关系”的结论。

实施例4应用22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行个体识别

1、收集血样

本实验中样品由××市公安局提供提供。采集犯罪现场血样和被害人血样，采集数名犯罪嫌疑人血样(本实施例中以3名嫌疑人样本为例)。

2、Chelex-100法提取基因组DNA

按实施例2中方法提取血样中的DNA。

3、扩增检测

除22个基因座的分组及荧光标记如以下所述之外，其余按照实施例1所述进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果：

Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463为一组，荧光标记物为HEX；D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433为一组，荧光标记物为6-FAM；D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434为一组，荧光标记物为ROX；D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500为一组，荧光标记物为TAMRA。内标选用荧光标记物SIZ。

4、结论

本实验的各人员基因分型如下表：

在本个体识别案例中，共检测21个STR基因座，犯罪嫌疑人C的基因型和犯罪现场的血样基因型完全一致，可以判断犯罪嫌疑人C在本案中有重大犯罪嫌疑。

Claims

1.一种同时分析人基因组DNA 22个基因座的荧光标记复合扩增系统，其特征在于：复合扩增分析的22个基因座为：Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500。

2.如权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于：所说的22个基因座在一个复合扩增反应体系中同时扩增。

3.如权利要求2所述的复合扩增系统，其特征在于：所述的22个基因座分为四组并分别用四种不同的荧光染料进行标记。

4.如权利要求3所述的复合扩增系统，其特征在于：所述的22个基因座的分组及荧光标记的方式为：Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463为一组；D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433为一组；D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434为一组；D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500为一组，使用FAM、HEX、TAMRA、ROX分组标记。

5.如权利要求4所述的复合扩增系统，其特征在于：所述的22个基因座的荧光标记的方式为：FAM标记的Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463为一组；HEX标记的D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433为一组；TAMRA标记的D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434为一组；以及ROX标记的D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500为一组。

6.如权利要求5所述的复合扩增系统，其特征在于：所述的22个基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。

7.如权利要求6所述的复合扩增系统，其特征在于：所述的系统中包括每个基因座所对应的等位基因标准物的混合物，以确定待检DNA样品中各个基因座的基因型。

8.如权利要求7所述的复合扩增系统，其特征在于：所述的系统中用于鉴别待检DNA样品性别的基因座是Amelogenin基因座。

9.如权利要求8所述的复合扩增系统，其特征在于：其多个基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测方法采用多道或单道毛细管电泳。

10.一种同时分析人基因组DNA的方法，其特征在于应用权利要求1-9任一项所述的复合扩增系统来进行DNA样品分析。

11.如权利要求1-9任一项所述的复合扩增系统，其特征在于：其适用的DNA样品来源包括精斑、唾液斑、组织、血痕或血液。