CN103451311B - 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents

一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103451311B
CN103451311B CN201310439926.6A CN201310439926A CN103451311B CN 103451311 B CN103451311 B CN 103451311B CN 201310439926 A CN201310439926 A CN 201310439926A CN 103451311 B CN103451311 B CN 103451311B
Authority
CN
China
Prior art keywords
locus
group
primer
dna
test kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310439926.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103451311A (zh
Inventor
郑卫国
卢文翔
杜蔚安
卢青
葛海鹏
薛佳
郭育林
朱丽君
许峻荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Wuxi AGCU ScienTech Inc.
Original Assignee
GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Wuxi Agcu Scientech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd, Wuxi Agcu Scientech Inc filed Critical GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201310439926.6A priority Critical patent/CN103451311B/zh
Publication of CN103451311A publication Critical patent/CN103451311A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103451311B publication Critical patent/CN103451311B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种同时检测人基因组DNA？26个基因座的五色荧光标记复合扩增系统；本发明将26个基因座分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记；本发明的荧光标记复合扩增系统的灵敏度高，在DNA模板量为0.12？ng的条件下，可检出全部26个基因座；适用于血滤纸、FTA卡采集样本的直接扩增。

Description

一种同时分析人基因组DNA 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用
技术领域
本发明涉及一种26个基因座的荧光标记复合扩增检验系统，具体是涉及一种同时分析人基因组DNA26个基因座的五色荧光标记复合扩增系统，该系统可以应用于个体识别和亲子鉴定。
背景技术
短串联重复序列基因座（STR）是目前普遍应用的遗传标记。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是STR基因座具有片段小容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。因此美国FBI进行了大量研究，选择了13个STR基因座用于建立DNA数据库——CODIS（CombinedDNAIndexSystem）：CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA。这些STR基因座通常被称为13个核心基因座。
正因为STR所具备的优点和应用前景，法医学界以及一些大的公司均投入大量的资金对其进行了开发性的研究。90年代中后期以美国ABI公司为代表的研发商建立起荧光复合扩增体系。目前最具代表性的是ABI（AppliedBiosystems,USA）公司的IdentifilerTM和Promega（USA）公司的PowerPlex-16荧光检测试剂盒。这两个试剂盒均包括上述13个核心基因座。
长期的DNA检验实践表明，短串联重复序列基因座的遗传多态性在种族间存在一定的差异，各个基因座间差别也很大。在美国FBI推荐的13个核心基因座中，有部分基因座遗传多态性不高，或是不同人群间差异较大。由此给DNA检验技术的应用及其效率带来一定的影响。
随着法医DNA分型技术的发展，目前已经能对类似血痕、精斑、唾液斑、毛发、骨骼等进行DNA分型；同时，随着PCR技术的发展，多重复扩体系可检测的基因座数量也越来越多。专利ZL200510096613.6公开了一种同时分析人基因组DNA的多个基因座的荧光标记复合扩增系统，其特征在于：所述的15个基因座为：Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、PentaE、CSF1PO、vWA、FGA。该专利提供了对15个基因座的分型结果，为4色荧光检测系统。2011102293253一种同时分析人基因组DNA22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用，该专利公开了一种同时分析人基因组DNA22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，所述的22个基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaE、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD、D10S1248、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、性别基因座Amelogenin。
我们对中国人群的短串联重复序列基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并以此为依据开发新的短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统，特别是针对男性Y染色体部分丢失样本，加入Y染色体长臂上的2个基因座DYS391和Yindel用以鉴别，以求在5色荧光检测系统中，提供对包括Amelogenin在内的26个基因座的分型结果，是目前国内累计个体识别能力和累积非父排除率最高的试剂盒。
发明内容
本发明的目的之一在于：提供一种通过复合扩增26个基因座来进行个体识别和亲子鉴定的荧光标记STR复合扩增检验系统。涉及检测人基因组中具有多态性的遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个体系中同时扩增多个短串联重复基因座。
为了实现本发明的目的，采用如下技术方案：
一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，所述的26个基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD、D10S1248、D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Yindel、DYS391、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、性别基因座Amelogenin；其特征在于：该试剂盒包括26个基因座对应的引物如下：
。
26个基因座对应的引物的浓度为：
。
所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
所述的荧光染料标记物为蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧光染料标记ROX；内标选用橙色荧光SIZ。
将所述26个基因座分组，具体为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656和PentaE为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM、HEX、TEMRA和ROX的任意一种；D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD和D10S1248为第二组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组不同的荧光染料标记物；D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Yindel为第三组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组和第二组都不同的荧光染料标记物；DYS391、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA，以及性别基因座Amelogenin为第四组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组、第二组和第三组都不同的荧光染料标记物；该试剂盒还设有内标，其选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。引物合成和标记用ABI394合成仪完成。
所述的试剂盒由如下组成：
组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA X ul含量为0.125-5ng
上述所述的引物 5.0μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL
其中所述的ReactionMix为----.MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/ml
一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒的使用方法，其特征在于按如下步骤实现：
A、扩增体系为：
组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA X ul含量为0.125-5ng5 -->
所述的引物 5.0μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL
B、扩增热循环
（l）将PCR扩增管置于热循环仪上；
（2）选择下面推荐的程序进行扩增；
（3）扩增后的样品应避光保存；
热循环仪的扩增程序
C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCUMarkerSIZ-500组成上样混合物〔（0.5μlAGCUMarkerSIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物EX26AllelicLadder（无锡中德美联生物技术有限公司）混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
D、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。
电泳采用多道或单道毛细管电泳。
其中基因组DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液。
具体解释
一、基因座的确定
对现有的STR基因座进行深入分析研究并优选新的高鉴别力基因座。对D1S1656、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、D13S317、D16S539、TPOX、TH01、D5S818、vWA、D18S51、FGA、D2S1338、D19S433、PentaE、PentaD、D19S253、D12S391、D6S1043、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500等40多个STR基因座在中国人群的遗传多态性开展调查研究。对5000多名个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力（DP）、杂合度（H）、非父排除率（PE）等数据，表明在24个STR基因座中，除TH01、TPOX基因座外，其余各基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值大都在0.5以上，这表明它们在法医学上有较好的应用价值。TH01、TPOX基因座在多态性方面较差，但也符合法医应用的要求。多态信息含量（PIC）也是衡量DNA基因座应用价值大小的指标之一。本系统所选STR基因座PIC均大于0.5，故可为生物学检材的检验提供相当大的信息量。
作为Amelogenin基因座的补充，对现有的Y染色体进行深入分析研究，选择Y染色体长臂上2个基因座DYS391和Yindel进行补充鉴定，针对男性Y染色体部分丢失样本，起到补充鉴定作用。
在考虑到与现有数据库兼容的基础上，最终确立了STR基因座构成，即D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD、D10S1248、D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA。该基因座构成突破了现有13个核心基因座的模式，提供了26个基因座的分型结果，提高了系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合法医学DNA检验的技术要求。
二、荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计
本研究对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，优选了5色荧光组合方案。
在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，以下为其中一种产品组合方式：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656和PentaE为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD和D10S1248为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Yinde为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；DYS391、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA，以及性别基因座Amelogenin为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。这种独创的基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这26个基因座的同时检测分析。
在组合方案的基础上，根据26个基因座所在位置的侧翼序列进行引物设计，实现26个基因座在同一反应中的复合扩增。
本发明在国内首次实现26个基因座同时在单一反应中的复合扩增，并以五色荧光标记进行检验。
三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立
1、基因座之间平衡度的调配
随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次反复实验，调节引物浓度与配比，终达到平衡。各基因座引物序列及引物浓度见下表：
以表格中的引物浓度，配置成复扩引物混合物。
2、复合扩增条件的建立
先对26个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究26个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出26个基因座。
有益效果
1、2011102293253一种同时分析人基因组DNA22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用，该专利公开了一种同时分析人基因组DNA22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，所述的22个基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaE、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD、D10S1248、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、性别基因座Amelogenin。实际工作中发现其在检测过程还是存在检测精确度不高的缺陷。为此发明人经过大量筛选，在原有22个基因座基础上增加了还加入Y染色体长臂上的2个基因座，用以鉴别Y染色体部分丢失样本；具体如下：
本发明中23个短串联重复序列基因座STR基因座构成为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD、D10S1248、D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA。本发明对上述23个短串联重复序列基因座及其等位基因遗传特征进行了深入的研究，表明这23个短串联重复序列基因座在人群中具有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。本发明除Amelogenin基因座外，还加入Y染色体长臂上的2个基因座，用以鉴别Y染色体部分丢失样本。上述23个短串联重复序列基因座加上用于鉴别人性别的Amelogenin基因座及用于鉴定Y染色体的DYS391和Yindel构成本发明的复合扩增检验系统。
2、本发明重新设计并合成了26个基因座的引物对，并本发明提供了荧光标记复合扩增体系的基因座组合设计方案。本发明分别选用了蓝、绿、黄、红、橙5色荧光组合方案。这种基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这26个基因座在同一反应中扩增。本发明提供用于复合扩增26个基因座的寡核苷酸引物混合物。
作为本领域公知常识明采用26个基因座对应的引物扩增，其在同一反应体系中进行。发明人筛选并构建了上述引物，并对其浓度进行了限定，克服了随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，难以达到平衡的难题。在引物设计的时候，要考虑基因座排布的问题，排布越合理，在有限的空间才能多放基因座。在一个多引物复合扩增的体系中，必然遇到引物相互作用，相互竞争的关系。理论上每任意两条引物之间都可能产生引物二聚体、非特异扩增的情况，每增加一个基因座，工作量都是成倍增长。引物设计还要兼顾基因座的排布。因此通过设计软件只能解决一个基因座的引物设计，而对不同基因座的引物，以及由引物设计产生的基因座排布，都需要做大量实验摸索获得。本发明在原有22个基因座基础上增加4个基因座，并且将对应基因座引物及浓度重新设计，并验证摸索，其工作量巨大，做了巨大创新。并且在检测试验中如父—女—母三联体亲子鉴定RCP值为大于99.999999%
3、本发明还涉及一种采用该荧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方法；其中，本发明适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液等。
4、本发明提供了一种通过复合扩增26个基因座来进行个体识别和亲子鉴定的检验试剂盒。该基因座构成，突破了现有13个核心基因座的模式，更加符合法医学DNA检验的技术要求与中国人群的群体遗传学特征，并兼顾了国际数据交流与共享的需求。
6、本发明提供的检验系统达到目前国际上STR荧光标记复合扩增试剂盒的最高水平。
附图说明
图1：对DNA标准品9948的STR分型结果；
图2：等位基因分型标准物；
图3：对实施例2样品中的STR分型结果；其中F代表父，M代表母，N代表女孩。
具体实施方式
下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，由如下组成：
组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
26个基因座对应的引物 5.0μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL
其中所述的ReactionMix为MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/mL。
其中26个基因座对应的引物及其引物浓度为：
。
所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
所述的荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX。
将所述26个基因座分组，具体为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656和PentaE为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM、HEX、TEMRA和ROX的任意一种；D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD和D10S1248为第二组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组不同的荧光染料标记物；D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Yindel为第三组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组和第二组都不同的荧光染料标记物；DYS391、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA，以及性别基因座Amelogenin为第四组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组、第二组和第三组都不同的荧光染料标记物；该试剂盒还设有内标，其选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。
一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒的使用方法，其特征在于按如下步骤实现：
A、扩增体系为：
组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA X ul含量为0.125-5ng
如上的26个基因座对应的引物 5.0μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL
B、扩增热循环
（l）将PCR扩增管置于热循环仪上；
（2）选择下面推荐的程序进行扩增；
（3）扩增后的样品应避光保存；
热循环仪的扩增程序
C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCUMarkerSIZ-500组成上样混合物〔（0.5μlAGCUMarkerSIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物EX26AllelicLadder（无锡中德美联生物技术有限公司）混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
D、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤3中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和EX26AllelicLadder（见附图2）比较，得到实际样品的分型数据，结果见附图1。
实施例2
应用26个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行三联体亲子鉴定
1、收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由XX亲子鉴定机构提供。DNA提取采用Chelex-100法分别提取3个全血样本的基因组DNA：取0.5～5μl全血置于灭菌的1.5ml离心管中，加入sdH2O1ml于管中，振荡数秒；置于室温10分钟后，振荡数秒，12,000rpm离心3分钟，弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀；加入200μl5%的Chelex-100，振荡数秒；于56℃保温30分钟，振荡数秒；沸水浴10分钟，振荡数秒；12,000rpm离心5分钟，上清为提取得到的基因组DNA。基因组DNA的提取参考《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。也可以直接以血样检测，通过1.2mm孔径血滤纸片或FTA卡血样片实行。
2、扩增检测
按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果，结果见附图3。
3、结论
结果显示（见表1），被检父、母、女在检测的23个基因座中均符合遗传规律，计算相对亲权概率（RCP）大于99.999999%，可以认定亲子关系。
表1AGCUEX26的检测结果
亲子鉴定的基本原理为：根据孟德尔遗传定律，亲代基因型决定子代基因型。在没有基因突变、分型差错的前提下：①孩子的一对等位基因必定是一个来自父亲，一个来自母亲；②孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。
PI=X/Y＝∑f×c/∑f×p
f表示生母给孩子必需等位基因机会；
c表示父亲给孩子必需等位基因机会；
p表示随机男人给孩子必需等位基因机会，等于必需等位基因频率；
相对亲权概率（RCP）＝（CPI/（CPI+1））×100％；其中CPI，为各个不连锁基因座PI的乘积；
根据上述计算，本实验中父—女—母三联体亲子鉴定RCP值为大于99.999999%，，认定亲子关系。
对比例1
采用2011102293253一种同时分析人基因组DNA22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用检测：
1、收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由XX亲子鉴定机构提供。DNA提取采用Chelex-100法分别提取2个全血样本的基因组DNA：取0.5～5μl全血置于灭菌的1.5ml离心管中，加入sdH2O1ml于管中，振荡数秒；置于室温10分钟后，振荡数秒，12,000rpm离心3分钟，弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀；加入200μl5%的Chelex-100，振荡数秒；于56℃保温30分钟，振荡数秒；沸水浴10分钟，振荡数秒；12,000rpm离心5分钟，上清为提取得到的基因组DNA。基因组DNA的提取参考《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。也可以直接以血样检测，通过1.2mm孔径血滤纸片或FTA卡血样片实行。
结论
检测结果显示（见表1），被检父与某女孩在检测的21个基因座中均符合遗传规律，计算得累计亲权指数CPI为3.669×108，相对亲权概率（RCP）大于99.9999%，可以认定被检父为该女孩的生物学父亲。而该男孩与被检父在VWA、D18S51、D2S1338三个基因座上不符合遗传规律，排除亲子关系。
表1AGCUEX22的检测结果
注：下划线表示不符合遗传规律的基因座
总结：由实施例3（本实验中父—女—母三联体亲子鉴定RCP值为大于99.999999%）和对比例1(RCP大于99.9999%),获知前者更加准确可靠，准确率提高100倍。
SEQUENCELISTING
<110>无锡中德美联生物技术有限公司
<120>一种同时分析人基因组DNA
26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用
<130>
<160>53
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
agtgaaatcaacagaggcttg21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
attccaatctgggtgacaga20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
acttctttagtgggcatccg20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gaacttgggttgagccatagg21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gtcacatttatcctcattga20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gcaggctgactatggagtta20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tactgagtctgccaaggact20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
tgccagcctccaggttcccac21
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tcgtgttgctcaagggtcaact22
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cacaggcatttcagagattatgtcacc27
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
cgagattgaagtgagccgag20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ctaagtgttaaaggggatcag21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
agcttcctgaacccagtcctc21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
atacacccagccataaataac21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
accactagcacccagaaccgt21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
accactagcacccagaaccgt21
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gacttctgtccttgtcagcgtt22
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gtcaggctctagcagcagctca22
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gcgggcttccgagtgcaggtca22
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tatattcagtaagttaaaggattgcag27
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
tgtggagtggaggtgcctaaag22
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
tccacttcgtggtggtcag19
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
caaacccacatggtgccaga20
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
cgtggaaggtcgaagctgaagt22
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
ctctcttagcctgtggcgtgtc22
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
agatcccgtgaagtagttattg22
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
atatcctgtgagaaaccatact22
<210>28
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
acgattttccccgatgatagtagtctc27
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
gacgcgaatgtatgattggca21
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
gtgaaggaaagaaggtaggaag22
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gccagtgatttctgatattttg22
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
tatatgtgacttggattgatc21
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
tggatagatacaaaggatag20
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
tcctgttatgggacttttctca22
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
catgtattagtcaatgttctcc22
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
cgacccgactaccagcaacaac22
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ctttcttgagcccagaaggt20
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
agttctcctgctcttgaac19
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
attgtttcctttcatacagaat22
<210>40
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
acgttagtgctctgtgacataccaatc27
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gaagggaaataacttgattagcacttacat30
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
gtccctgggctctgtaaagaata23
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
gctagtctcgaatttgaccctt22
<210>44
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
tatcattcaatcatacacccatatctgtc29
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
tggtaggcaggcagataggcagat24
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
tccattcgtatctatctgtcta22
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
cacatcactgtatcgtatccca22
<210>48
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
cgcaagtatgtgacaagggtg21
<210>49
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
ctctcagaggaatgctttagt21
<210>50
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
agtcaacaggatcaatggatg21
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
ataccatcagtttccctggtt21
<210>52
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
acatcttaactggcattcatg21
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
gagttgtaggtattatcacgg21

Claims (5)

1.一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，所述的26个基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD、D10S1248、D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS391、Yindel及性别基因座Amelogenin；其特征在于：该试剂盒包括所述的26个基因座对应的引物，且所述引物及其浓度为：
。
2.根据权利要求1所述的一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
3.根据权利要求2所述的一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于所述的荧光染料标记物为蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧光染料标记ROX。
4.根据权利要求3所述的一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于将所述26个基因座分组，具体为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656和PentaE为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM、HEX、TEMRA或ROX的任意一种；D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD和D10S1248为第二组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组不同的荧光染料标记物；D22S1045、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043和Yindel为第三组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组和第二组都不同的荧光染料标记物；DYS391、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA，以及性别基因座Amelogenin为第四组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组、第二组和第三组都不同的荧光染料标记物。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种同时分析人基因组DNA26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒由如下组成：
组分 体积 Reaction Mix 10.0μL 权利要求1-4任意一项中所述的引物 5.0μL2 --> 热启动Taq酶5U/μL 0.5μL sdH2O 补足至25.0μL
其中所述的ReactionMix含有MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/ml。
CN201310439926.6A 2013-09-24 2013-09-24 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用 Active CN103451311B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310439926.6A CN103451311B (zh) 2013-09-24 2013-09-24 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310439926.6A CN103451311B (zh) 2013-09-24 2013-09-24 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103451311A CN103451311A (zh) 2013-12-18
CN103451311B true CN103451311B (zh) 2016-04-20

Family

ID=49734144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310439926.6A Active CN103451311B (zh) 2013-09-24 2013-09-24 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103451311B (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103820564B (zh) * 2014-03-13 2016-09-14 基点认知技术(北京)有限公司 25个短串联重复序列的复合扩增试剂盒
WO2016049877A1 (zh) * 2014-09-30 2016-04-07 深圳华大基因股份有限公司 无创产前亲子鉴定中基于str分型技术的检测方法和系统
CN104745691A (zh) * 2015-03-02 2015-07-01 无锡中德美联生物技术有限公司 一种同时分析人基因组dna 27个基因座的荧光标记复合扩增的引物组、试剂盒及应用
CN104946632A (zh) * 2015-05-28 2015-09-30 宁波海尔施基因科技有限公司 一种具有增强鉴别能力的常染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN105420400A (zh) * 2016-01-11 2016-03-23 中国科学院北京基因组研究所 用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物
CN106591463A (zh) * 2016-12-29 2017-04-26 无锡中德美联生物技术有限公司 一种包含人基因组dna22个基因座的荧光标记复合扩增的引物组、试剂盒及应用
CN106521013B (zh) * 2016-12-30 2019-10-15 无锡中德美联生物技术有限公司 一种针对微量、降解检材的str试剂盒及其应用
CN107944221B (zh) * 2017-11-21 2020-12-29 南京溯远基因科技有限公司 一种并行分离核酸片断的拼接算法及其应用
CN107904317B (zh) * 2017-12-27 2021-06-29 无锡中德美联生物技术有限公司 人类常染色体str多态性位点复合扩增试剂盒及其应用
CN110066792A (zh) * 2018-01-24 2019-07-30 深圳华大法医科技有限公司 一种同步检测23个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒
CN109852704B (zh) * 2019-04-04 2022-06-07 无锡市公安局刑事科学技术研究所 一种同时检测32个y染色体基因座的复合扩增试剂盒
CN110607356B (zh) * 2019-06-14 2021-02-02 山东大学 一种基因组编辑检测方法、试剂盒及应用
CN111876474A (zh) * 2020-07-23 2020-11-03 赛济检验认证中心有限责任公司 一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法
CN114703291B (zh) * 2022-02-17 2023-07-11 苏州市公安局 用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒及应用
CN114427004A (zh) * 2022-03-04 2022-05-03 苏州市公安局 针对疑难检材的八色系统str位点复合扩增试剂盒及应用
CN116987798A (zh) * 2023-09-26 2023-11-03 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 用于检测短串联重复序列的引物组合、试剂盒和方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101698890A (zh) * 2009-11-26 2010-04-28 无锡中德美联生物技术有限公司 22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统
CN102321748A (zh) * 2011-08-11 2012-01-18 无锡中德美联生物技术有限公司 一种同时分析人基因组dna 22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用
CN103298954A (zh) * 2010-11-15 2013-09-11 生命技术公司 用于多重扩增短串联重复基因座的方法和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101698890A (zh) * 2009-11-26 2010-04-28 无锡中德美联生物技术有限公司 22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统
CN103298954A (zh) * 2010-11-15 2013-09-11 生命技术公司 用于多重扩增短串联重复基因座的方法和试剂盒
CN102321748A (zh) * 2011-08-11 2012-01-18 无锡中德美联生物技术有限公司 一种同时分析人基因组dna 22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103451311A (zh) 2013-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103451311B (zh) 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用
dMIQE Group Whale Alexandra S National Measurement Laboratory (NML) at LGC, Teddington, UK De Spiegelaere Ward Ghent University, Ghent, Belgium Trypsteen Wim Ghent University, Ghent, Belgium Nour Afif Abdel School of Engineering, The Holy Spirit University of Kaslik, Jounieh, Lebanon Bae Young-Kyung Center for Bioanalysis, KRISS, Yuseong-gu, Daejeon, Republic of Korea Benes Vladimir Genomics Core Facility, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germany Burke Daniel National Measurement Institute, Lindfield, NSW, Australia Cleveland Megan National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD Corbisier Philippe European Commission, Joint Research Centre (JRC), Geel, Belgium Devonshire Alison S National Measurement Laboratory (NML) at LGC, Teddington, UK Dong Lianhua National Institute of Metrology, Beijing, PR China Drandi Daniela Department of Molecular Biotechnologies and Health Sciences, University of Torino, Turin, Italy Foy Carole A National Measurement Laboratory (NML) at LGC, Teddington, UK Garson Jeremy A Research Department of Infection, Division of Infection and Immunity, UCL, London, UK He Hua-Jun National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD Hellemans Jan Biogazelle, Zwijnaarde, Belgium Kubista Mikael TATAA Biocenter, Sweden and Institute of Biotechnology of the Czech Academy of Sciences, Gothenburg, Sweden Lievens Antoon European Commission, Joint Research Centre (JRC), Geel, Belgium Makrigiorgos Mike G Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA Milavec Mojca Department of Biotechnology and Systems Biology, National Institute of Biology, Ljubljana, Slovenia Mueller Reinhold D RM Consulting, San Diego, CA Nolan Tania Institute of Population Health, Faculty of Medical and Human Sciences, University of Manchester, UK The Gene Team Ltd., UK; Institute of Population Health, Faculty of Medical and Human Sciences, University of Manchester, Manchester, UK O’Sullivan Denise M National Measurement Laboratory (NML) at LGC, Teddington, UK Pfaffl Michael W Animal Physiology and Immunology, Technical University of Munich, School of Life Sciences Weihenstephan, Freising, Germany Rödiger Stefan Faculty of Health Sciences, Joint Faculty of the Brandenburg University of Technology Cottbus–Senftenberg, The Brandenburg Medical School Theodor Fontane and the University of Potsdam, Berlin, German Romsos Erica L National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD Shipley Gregory L Shipley Consulting, LLC, Houston, TX Taly Valerie Centre de Recherche des Cordeliers, INSERM, Sorbonne Université, Université de Paris, Equipe labellisée Ligue Nationale Contre le Cancer, Paris, France Untergasser Andreas Genomics Core Facility, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germany Zentrum für Molekulare Biologie, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany Wittwer Carl T Department of Pathology, University of Utah, Salt Lake City, UT Bustin Stephen A Medical Technologies Research Centre, Faculty of Health, Education, Medicine & Social Care, Anglia Ruskin University, Essex, UK Vandesompele Jo Ghent University, Ghent, Belgium Biogazelle, Zwijnaarde, Belgium et al. The digital MIQE guidelines update: minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments for 2020
US11390917B2 (en) Digital analyte analysis
McKiernan et al. Molecular diagnostic applications in forensic science
US20150037791A1 (en) Methods and kits for multiplex amplification of short tandem repeat loci
Bell et al. Analyzing copy number variation with droplet digital PCR
CN103614361B (zh) 一种人基因组dna24个基因座的复合扩增的试剂盒
Thompson et al. An overview of DNA typing methods for human identification: past, present, and future
CN104745691A (zh) 一种同时分析人基因组dna 27个基因座的荧光标记复合扩增的引物组、试剂盒及应用
CN101440410A (zh) 18个基因座的荧光标记复合扩增检验系统
CN102321748A (zh) 一种同时分析人基因组dna 22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用
CN105385763A (zh) 一种同时分析人基因组dna 24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用
CN106521013B (zh) 一种针对微量、降解检材的str试剂盒及其应用
CN108384842A (zh) 一种对疑是人源的未知生物样本进行物种及人源个体识别鉴定的复合pcr扩增方法
CN107904317A (zh) 人类常染色体str多态性位点复合扩增试剂盒及其应用
CN108060240A (zh) 一种用于插入缺失多态性检测的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN110564861B (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
Iozzi et al. Forensic genetics in NGS era: New frontiers for massively parallel typing
CN104031989B (zh) 一种人基因组dna26个基因座的复合扩增的试剂盒
CN114391042A (zh) 用于将单细胞成像与rna转录组学相关联的系统和方法
Preuner et al. Post-transplant monitoring of chimerism by lineage-specific analysis
CN108517364A (zh) 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN103966332A (zh) 一组检测ctg重复序列的引物及其检测试剂盒
CN103103267A (zh) 检测人21号染色体str基因型的试剂盒
CN104673907B (zh) 一种用于高通量检验str分型的系统及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Effective date: 20140808

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C53 Correction of patent for invention or patent application
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zheng Weiguo

Inventor after: Lu Wenxiang

Inventor after: Du Weian

Inventor after: Lu Qing

Inventor after: Ge Haipeng

Inventor after: Xue Jia

Inventor after: Guo Yulin

Inventor after: Zhu Lijun

Inventor after: Xu Junrong

Inventor before: Zheng Weiguo

Inventor before: Lu Wenxiang

Inventor before: Du Weian

Inventor before: Lu Qing

Inventor before: Ge Haipeng

Inventor before: Xue Jia

Inventor before: Guo Yulin

Inventor before: Zhu Lijun

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHENG WEIGUO LU WENXIANG DU WEIAN LU QING GE HAIPENG XUE JIA GUO YULIN ZHULIJUN TO: ZHENG WEIGUO LU WENXIANG DU WEIAN LU QING GE HAIPENG XUE JIA GUO YULIN ZHU LIJUN XU JUNRONG

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 214714 WUXI, JIANGSU PROVINCE TO: 214174 WUXI, JIANGSU PROVINCE

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140808

Address after: 214174 Jiangsu Province, Wuxi city Huishan District Wen Hui Lu 18-1

Applicant after: Wuxi AGCU ScienTech Inc.

Applicant after: GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 214714 Jiangsu Province, Wuxi city Huishan District Wen Hui Lu 18-1

Applicant before: Wuxi AGCU ScienTech Inc.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant