CN111876474A - 一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法 - Google Patents

一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法，包括如下步骤：步骤一：提取细胞样品基因组并准备阳性对照样本和阴性对照样本待用；步骤二：通过带有荧光基团标记的引物对步骤一当中的细胞样品基因组、阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增处理；将扩增产物里的若干STR位点标记上不同颜色的荧光后待用；步骤三：通过毛细管电泳分离后的到大小不同的片段，将片段大小转换为等位基因峰图，通过峰图与参考图谱进行对比后分析是否存在细胞交叉污染。本发明的方法通过短串联重复序列基因(STR)分型法在样本库中鉴定细胞交叉污染，相比现有方法更加快速便捷和直观。

Description

一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法。
背景技术
标准化生物样本库是基因组、功能基因组等生命科学研究与生物医药研发的关键源头，是众多重要基因、蛋白等科研成果快速产业化、应用到临床、预防及个性化治疗等的重要保证，毫无疑问的也是生命科学与生物医药技术自主创新体系中至关重要的环节与保证。
使用样本库中错误和污染的细胞系进行研究实验，将导致研究结果错误，进而造成巨大的经济损失和社会损失。例如，在生物学研究中，如果原先计划针对A细胞进行探索研究，但是细胞实验时，A细胞与B细胞交叉污染了，得到的实验结果是无效的，必然造成研究经费的浪费，如果没有发现污染，而直接将研究结果用于临床试验，那么后果十分可怕。
目前检测细胞交叉污染的方法很多，如染色体分析法、同工酶图谱分析法，但相比之下短串联重复序列基因(STR)分型法在样本库中鉴定细胞交叉污染最为快速便捷。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法。通过短串联重复序列基因(STR)分型法在样本库中鉴定细胞交叉污染
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法，包括如下步骤：
步骤一：提取细胞样品基因组并准备阳性对照样本和阴性对照样本待用，其中，细胞样品基因组是通过磁珠法或Chelex-100法提取后定量至0.1ng/μL-2ng/μL待用；
步骤二：
通过带有荧光基团标记的引物对步骤一当中的细胞样品基因组、阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增处理，其中，所述PCR的循环参数如表一所示：
表一
Figure BDA0002597677640000021
将扩增产物里的若干STR位点标记上不同颜色的荧光后待用；其中，所述带有荧光基团标记的引物为中德美联的AGCU EX25荧光检测试剂盒中的引物；
步骤三：
通过毛细管电泳分离后的到大小不同的片段，将片段大小转换为等位基因峰图，通过峰图与参考图谱进行对比后分析是否存在细胞交叉污染。
在本发明的一个优选实施例中，所述是否存在细胞交叉污染的判断的标准是阴性对照结果中不应有特异信号，Allelic Ladder与Control DNA 9948的基因分型正确。
本发明的有益效果在于：
本发明的鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法通过短串联重复序列基因(STR)分型法在样本库中鉴定细胞交叉污染，相比现有方法更加快速便捷和直观。
附图说明
图1为X25 Allelic Ladder分型结果示意图。
图2为Control DNA 9948分型结果示意图。
图3为样本库中A细胞的参考图一。
图4为样本库中A细胞的参考图二。
图5为样本库中A细胞的参考图三。
图6为样本库中A细胞的参考图四。
图7为样本库中A细胞测定峰图(1)。
图8为样本库中A细胞测定峰图(2)。
图9为样本库中A细胞测定峰图(3)。
具体实施方式
本发明的主要原理在于：
AGCU EX25荧光检测试剂盒(以下简称EX25)是一个多重短串联序列检测试剂盒，采用六色荧光技术(FAM蓝色、HEX绿色、SUM黄色、LYN红色、PUR紫色用于标记位点，SIZ橙色用于标记分子量内标)，可以同时扩增和检测25个基因座。
本发明的具体实施流程如下：
1.DNA模板的制备：选取Whatman FTA卡、博坤卡、滤纸等上面的细胞涂痕处，用1.0或1.2mm孔径打孔器打下一片，放于96孔板或0.2mL PCR管中备用。
2.PCR反应
2.1基因组DNA的准备如下表1
表1
Figure BDA0002597677640000031
2.2PCR反应构成
组分 加样体积
DNA模板 约0.1-2ng的细胞基因DNA
Super Mix 4.0μL
EX25Primers 2.0μL
SdH2O 补足至10.0μL
2.3 PCR仪器及循环参数
2.3.1仪器
AGGU EX25荧光检测试剂盒在具有96孔反应基座的标准PCR热循环仪上扩增。
2.3.2热循环参数如下表2
表2
Figure BDA0002597677640000041
3.A6Dye Matrix和光谱校正(Spectral Calibration)
光谱校正(Spectral Calibration)是为检测设备提供荧光类型识别，对于检测数据分析至关重要。AGCU EX25荧光检测试剂盒选择J6模式，配套的A6Dye Matrix标准品包含FAM、HEX、SUM、LYN、PUR和SIZ标记的片段各一条。
3.1 13130/3130xl Data Collection V2.x或V3.x版本创建J6Matrix文件方法
3.1.1 A6Dye Matrix标准品准备
Hi-Di甲酰胺192μL+A6dye Matrix标准品8μL→混匀→分装12.5μL至96孔板的16个孔(如A1-H2)中→95℃变性3min，冰浴3min(也可先变性再分装)→3000rpm离心3min→置于遗传分析仪自动进样架上。
3.1.2参数设置
1)新建Matrix Run Module
点击Module Manager，点击New，在其Run Module Editor界面，分别编辑如下内容：
A)、命名Run Module：AGCU_Matrix；
B)、选择Type：选择SPECTRAL；
C)、选择Template：选择Spect36_POP4；
D)、参数修改：Injection_Voltage为3KV，Injection_Time为10s；
E)、点击OK
2)新建Matrix Instrument Protocol
点击Protocol Manager，点击New，在Protocol Editor界面，分别编辑如下内容：
A)、命名Protocol：AGCU_J6Dye_Matrix；
B)、选择Type：选择SPECTRAL；
C)、选择Dye Set：选择J6；
D)、选择Polymer：选择POP4；
E)、选择Array Length：36；
F)、选择Chemistry：Matrix Standard；
G)、选择Run Module：AGCU_Matrix；
H)、编辑其他参数：点击Edit Param，修改如下：
a)、Matrix Condition Number Bounds：Lower：2；Upper：17；
b)、Locate Start Point：After Scan：1200；Before Scan：5000；
c)、点击OK。
I)、点击OK。
3.1.3新建Matrix进样表
点击Plate Manager，点击New，打开New Plate Dialog界面编辑如下内容：
A)、命名Plate：AGCU_A6Dye_Matrix_20161220；
B)、选择Application：选择Spectral Calibration；
C)、选择Plate Type：选择96-Well；
D)、编辑Owner Name：实验者名字首字母缩写；
E)、编辑Operator Name：操作者名字首字母缩写；
F)、点击OK，弹出Spectral Calibration Plate Editor界面，编辑参数如下：在样品对应位置(A1-H2)填入样品名(任意名称均可)→在Instrument Protocol栏选择AGCU_J6_HID→点击OK。
3.1.4连接电泳
在Run Scheduler里的Plate View中查找名称为AGCU_J6_Matrix_20161220的进样表，选中后联接对应样品盘(A或B)，此时Run按钮▲被激活，点击▲运行。
3.1.5查看J6 Matrix文件
创建成功的Matrix文件可以从Spectral Viewer观察，在Dye Set中选择J6，界面显示的即是刚创建成功的J6 Matrix文件(可以点击Rename重新命名)。如果重复建立了几次J6 Matrix文件后，需要激活之前的J6 Matrix文件，可以选择需激活的J6 Matrix文件，点击Set即可。
PCR产物的检测
4.1 PCR产物电泳前准备
4.1.1根据需电泳的样品数计算电泳混合液中Hi-Di去离子甲酰胺和分子量内标AGCU Marker SIZ-500的量，它们混合的比例如下表3：
表3
试剂 每个反应体积(μL)
AGCU Marker SIZ-500 0.5
Hi-Di去离子甲酰胺 12
4.1.2每管加入12.5μL上样混合物、1μL扩增产物或EX25Allelic Ladder，混匀，避免产生气泡
4.1.3加好样的96孔板盖紧硅胶盖，3000rpm离心1min，放置PCR仪上95℃变性3min，结束后立即冰浴3min。
4.2 3130/3130xl测序仪检测步骤(Data Collection3.x版本)
4.2.1启动3130/3130xl Data Collection，新建一个protocol：选择protocolmanager；
点击“New”，命名Name，如AGCU-A6Dye-HID；
Type：regular；Dye Set：J6；
Run Module：HID Fragment Analysis36_POP4_1或Fragment Analysis 36_POP4_1；
4.2.2打开Plate Manager
点击New，命名Name：如20161220；Application：GeneMapper-Generic；PlateType：96-well；注：自动分析数据时选择GeneMapper-Applied模式)
点击“OK”，出现样品编辑表，编辑样品名称，选择Results Group1、InstrumentProtocol 1；
4.2.3点击3130或3130xl栏
点击Run Scheduler，点击plate view，点击find all找到步骤2中已经命名编辑好的样品表，点击放置样品的A或者B盘联接激活按钮▲，点击按钮▲开始电泳。
使用GeneMapper ID-X软件分析数据
5.1 AGCU EX25荧光检测试剂盒的Panel和Bins输入
5.1.1将提供的AGCU_EX25_STR_Panels.txt和AGCU_EX25_STR_Bins.txt两个文件复制到GeneMapper的Panels文件夹中。
5.1.2启动软件GeneMapper ID-X，从Tools下拉栏中找到Panel Manager并点中，选择左下窗口中的Panel Manager。
5.1.3点击File菜单下的Import Panels，弹出文件栏，找到AGCU_EX25_STR_Panels，点击输入该Panels。
5.1.4选择左下窗口中的Panel Manager栏下的AGCU_EX25_STR_Panels：
5.1.5点击File菜单下的Import Bins，弹出文件栏，找到AGCU_EX25_STR_bins，点中输入该Bins，点击Apply键，点击OK键。点击File菜单下的Import Marker Stutter，弹出文件栏，找到AGCU_EX25_STR__stutter，点中输入该Marker Stutter。点击Apply键，点击OK键。
5.1.6点击Tools菜单下的
Figure BDA0002597677640000071
ID-X Manager，弹出文件栏，选择弹出文件栏上的Analysis Methods标签，点击文件栏下方的Import按钮。在弹出窗口中找到AGCU_EX25_STR_Analysis Methods，点中输入该Analysis Methods。点击Done键。至此，成功输入AGCU EX25STR荧光检测系统分析所需文件。
5.2数据分析
5.2.1输入样品源数据
从File菜单栏中找到Add Sample to Project并点击，找到要分析的收集文件夹，点击Add to List后点击Add加入到分析界面。
5.2.2选择试剂盒类型
在分析界面上，Panels栏选中AGCU_EX25_STR_kit荧光检测试剂盒并利用FillDown向下填充。
5.2.3定义Size standard
选取New Size Standard，弹出选择对话框，选择Basic or Advanced后，点击OK，在弹出内标定义框中如下设置：Size Standard Dye：Orange；Size in Basepairs：75、100、139、150、160、200、300、340、350、400、450、490、500，点击OK。之后，利用Fill Down操作向下填充。
5.2.4定义Analysis Method
确定分析起始点，该起始点必须是分子量内标75bp之前的数据分析点，如2600。同时要观察内标的所有片段是否完全。
5.2.5数据分析
点击new analysis method，在弹出的对话框中进行如下设置：HID、GeneralName：例如AGCU System：选AGCU_EX25_STR_Kit_System_Bins、点击OK键。利用Fill Down操作向下填充，即可进行后续分析。
5.2.6分型
判断的标准是阴性对照结果中不应有特异信号，Allelic Ladder与Control DNA9948的基因分型正确，如图1的EX25 Allelic Ladder分型结果和图2的Control DNA 9948分型结果。
实施例：
将A细胞(ips细胞)进行如上操作后的结果如图3-9所示，对比细胞的参考图和测定峰图可以知道两者各个峰相符合，则为同一细胞系，A细胞并没有被污染。

Claims (2)

1.一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：提取细胞样品基因组并准备阳性对照样本和阴性对照样本待用，其中，细胞样品基因组是通过磁珠法或Chelex-100法提取后定量至0.1ng/μL-2ng/μL待用；
步骤二：
通过带有荧光基团标记的引物对步骤一当中的细胞样品基因组、阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增处理，其中，所述PCR的循环参数如表一所示：
表一
Figure FDA0002597677630000011
将扩增产物里的若干STR位点标记上不同颜色的荧光后待用；其中，所述带有荧光基团标记的引物为中德美联的AGCU EX25荧光检测试剂盒中的引物；
步骤三：
通过毛细管电泳分离后的到大小不同的片段，将片段大小转换为等位基因峰图，通过峰图与参考图谱进行对比后分析是否存在细胞交叉污染。
2.如权利要求1所述的一种鉴定样本库中细胞系交叉污染的方法，其特征在于，所述是否存在细胞交叉污染的判断的标准是阴性对照结果中不应有特异信号，Allelic Ladder与Control DNA 9948的基因分型正确。
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