CN111893167A - 一种str基因检测法进行样本祖源鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种STR基因检测法进行样本祖源鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：提取细胞样品基因组并准备阳性对照样本和阴性对照样本待用；步骤二：通过带有荧光基团标记的引物对步骤一当中的细胞样品基因组、阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增处理，将扩增产物里的若干STR位点标记上不同颜色的荧光后待用；其中；步骤三：通过毛细管电泳分离后的到大小不同的片段，将片段大小转换为样本等位基因峰图，通过样本等位基因峰图与已知祖源信息样本峰图进行对比后分析是否为样本组源。本发明的方法通过短串联重复序列基因(STR)分型法进行样本祖源鉴定，相比现有方法更加快速便捷和直观。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种STR基因检测法进行样本祖 源鉴定的方法。
背景技术
样本的祖源信息在使用样本进行治疗或进行科学研究时起着重要的 作用。错误的样本祖源信息会在利用样本进行疾病治疗或科学研究时导致 非常严重的不良后果，然而在实际的样本培养过程中，样本的祖源信息发 生错误是难免的，它受多种因素的影响。因此，抱着科学严谨的态度确认 样本的祖源信息是十分必要的。
短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)，是广泛存在于生物 基因组中的一类具有高度多态性的遗传学标记。由于其具有片段小、易扩 增、灵敏性好、准确度高、检测速度快、信息含量大，适宜于微量或降解 样品检测，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增等特点，将STR 基因鉴定发应用于样本的祖源鉴定具有极大的优越性。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种STR基因 检测法进行样本祖源鉴定的方法。通过STR技术对样本进行祖源鉴定，以 确保样本的祖源信息与已知的祖源信息保持一致。避免在利用样本对患者 进行治疗时，使用错误的样本导致患者产生一些不良反应，或利用样本进 行某项科学研究时，使用错误的样本产生不客观严谨的实验数据。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种STR基因检测法进行样本祖源鉴定的方法，包括如下步骤：
步骤一：提取细胞样品基因组并准备阳性对照样本和阴性对照样本待 用，其中，细胞样品基因组是通过磁珠法或Chelex-100法提取后定量至 0.1ng/μL-2ng/μL待用；
步骤二：
通过带有荧光基团标记的引物对步骤一当中的细胞样品基因组、阳性 对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增处理，其中，所述PCR的循环参数 如表一所示：
表一
所述PCR的反应构成如表二所示：
表二
| 组分 | 加样体积 |
| DNA模板 | 约0.1-2ng的细胞基因DNA |
| Super Mix | 4.0μL |
| EX25 Primers | 2.0μL |
| SdH2O | 补足至10.0μL |
；
将扩增产物里的若干STR位点标记上不同颜色的荧光后待用；其中， 所述带有荧光基团标记的引物为中德美联的AGCU EX25荧光检测试剂盒中 的引物；
步骤三：
通过毛细管电泳分离后的到大小不同的片段，将片段大小转换为样本 等位基因峰图，通过样本等位基因峰图与已知祖源信息样本峰图进行对比 后分析是否为样本组源。
在本发明的一个优选实施例中，所述是否为样本组源的判断方法为阴 性对照结果中不应有特异信号，Allelic Ladder与Control DNA 9948 的基因分型正确。
本发明的有益效果在于：
本发明的方法通过短串联重复序列基因(STR)分型法进行样本祖源 鉴定，相比现有方法更加快速便捷和直观。
附图说明
图1为EX25 Allelic Ladder分型结果示意图。
图2为Control DNA 9948分型结果示意图。
图3为已知祖源样本峰图一。
图4为已知祖源样本峰图二。
图5为已知祖源样本峰图三。
图6为已知祖源样本峰图四。
图7为检测样本峰图一。
图8为检测样本峰图二。
图9为检测样本峰图三。
图10为检测样本峰图四。
具体实施方式
本发明的主要原理在于：
AGCU EX25荧光检测试剂盒(以下简称EX25)是一个多重短串联序列 检测试剂盒，采用六色荧光技术(FAM蓝色、HEX绿色、SUM黄色、LYN 红色、PUR紫色用于标记位点，SIZ橙色用于标记分子量内标)，可以同时 扩增和检测25个基因座。
1.DNA模板的制备：选取Whatman FTA卡、博坤卡、滤纸等上面的 细胞涂痕处，用1.0或1.2mm孔径打孔器打下一片，放于96孔 板或0.2mL PCR管中备用。
2.PCR反应
2.1基因组DNA的准备如表1：
表1
2.2 PCR反应构成如表2
表2
| 组分 | 加样体积 |
| DNA模板 | 约0.1-2ng的细胞基因DNA |
| Super Mix | 4.0μL |
| EX25 Primers | 2.0μL |
| SdH2O | 补足至10.0μL |
2.3 PCR仪器及循环参数
2.3.1仪器
AGGU EX25荧光检测试剂盒建议在具有96孔反应基座的标准 PCR热循环仪上扩增。
2.3.2热循环参数见表3
表3
3.A6Dye Matrix和光谱校正(Spectral Calibration)
光谱校正(Spectral Calibration)是为检测设备提供荧光类型 识别，对于检测数据分析至关重要。AGCU EX25荧光检测试剂盒 选择J6模式，配套的A6Dye Matrix标准品包含FAM、HEX、 SUM、LYN、PUR和SIZ标记的片段各一条。
3.1 13130/3130xl Data Collection V2.x或V3.x版本创建J6 Matrix文件方法
3.1.1 A6Dye Matrix标准品准备
Hi-Di甲酰胺192μL+A6dye Matrix标准品8μL→混匀→分装 12.5μL至96孔板的16个孔(如A1～H2)中→95℃变性3min， 冰浴3min(也可先变性再分装)→3000rpm离心3min→置于 遗传分析仪自动进样架上。
3.1.2参数设置
1)新建Matrix Run Module
点击Module Manager，点击New，在其Run Module Editor界 面，分别编辑如下内容：
A)、命名Run Module：AGCU_Matrix；
B)、选择Type：选择SPECTRAL；
C)、选择Template：选择Spect36_POP4；
D)、参数修改：Injection_Voltage为3KV，Injection_Time为 10s；
E)、点击OK
2)新建Matrix Instrument Protocol
点击Protocol Manager，点击New，在Protocol Editor界面， 分别编辑如下内容：
A)、命名Protocol：AGCU_J6Dye_Matrix；
B)、选择Type：选择SPECTRAL；
C)、选择Dye Set：选择J6；
D)、选择Polymer：选择POP4；
E)、选择Array Length：36；
F)、选择Chemistry：Matrix Standard；
G)、选择Run Module：AGCU_Matrix；
H)、编辑其他参数：点击Edit Param，修改如下：
a)、Matrix Condition Number Bounds：Lower：2；Upper： 17；
b)、Locate Start Point：After Scan：1200；Before Scan： 5000；
c)、点击OK。
I)、点击OK。
3.1.3新建Matrix进样表
点击Plate Manager，点击New，打开New Plate Dialog界 面编辑如下内容：
A)、命名Plate：AGCU_A6Dye_Matrix_20161220；
B)、选择Application：选择Spectral Calibration；
C)、选择Plate Type：选择96-Well；
D)、编辑Owner Name：实验者名字首字母缩写；
E)、编辑Operator Name：操作者名字首字母缩写；
F)、点击OK，弹出Spectral Calibration Plate Editor界面， 编辑参数如下：在样品对应位置(A1-H2)填入样品名(任意名 称均可)→在Instrument Protocol栏选择AGCU_J6_HID→点 击OK。
3.1.4连接电泳
在Run Scheduler里的Plate View中查找名称为 AGCU_J6_Matrix_20161220的进样表，选中后联接对应样品盘(A 或B)，此时Run按钮▲被激活，点击▲运行。
3.1.5查看J6 Matrix文件
创建成功的Matrix文件可以从Spectral Viewer观察，在 Dye Set中选择J6，界面显示的即是刚创建成功的J6 Matrix文 件(可以点击Rename重新命名)。如果重复建立了几次J6 Matrix文件后，需要激活之前的J6 Matrix文件，可以选择需 激活的J6 Matrix文件，点击Set即可。
4.PCR产物的检测
4.1 PCR产物电泳前准备
4.1.1根据需电泳的样品数计算电泳混合液中Hi-Di去离子甲 酰胺和分子量内标AGCU Marker SIZ-500的量，它们混合的比例如下表 4：
表4
| 试剂 | 每个反应体积(μL) |
| AGCU Marker SIZ-500 | 0.5 |
| Hi-Di去离子甲酰胺 | 12 |
4.1.2每管加入12.5μL上样混合物、1μL扩增产物或EX25 Allelic Ladder，混匀，避免产生气泡
4.1.3加好样的96孔板盖紧硅胶盖，3000rpm离心1min， 放置PCR仪上95℃变性3min，结束后立即冰浴3min。
4.2 3130/3130xl测序仪检测步骤(Data Collection3.x版本)
4.2.1启动3130/3130xl Data Collection，新建一个
protocol：选择protocol manager；
点击“New”，命名Name，如AGCU-A6Dye-HID；
Type：regular；Dye Set：J6；
Run Module：HID Fragment Analysis36_POP4_1或Fragment Analysis 36_POP4_1；
4.2.2打开Plate Manager
点击New，命名Name：如20161220；Application：
GeneMapper-Generic；Plate Type：96-well；注：自动分析数 据时选择GeneMapper-Applied模式)
点击“OK”，出现样品编辑表，编辑样品名称，选择Results
Group1、Instrument Protocol 1；
4.2.3点击3130或3130xl栏
点击Run Scheduler，点击plate view，点击find all找到步 骤2中已经命名编辑好的样品表，点击放置样品的A或者B盘 联接激活按钮▲，点击按钮▲开始电泳。
5.使用GeneMapper ID-X软件分析数据
5.1 AGCU EX25荧光检测试剂盒的Panel和Bins输入
5.1.1将提供的AGCU_EX25_STR_Panels.txt和AGCU_EX25_STR _Bins.txt两个文件复制到GeneMapper的Panels文件夹中。
5.1.2启动软件GeneMapper ID-X，从Tools下拉栏中找到 Panel Manager并点中，选择左下窗口中的Panel Manager。
5.1.3点击File菜单下的Import Panels，弹出文件栏，找到AGCU _EX25_STR_Panels，点击输入该Panels。
5.1.4选择左下窗口中的Panel Manager栏下的 AGCU_EX25_STR_Panels：
5.1.5点击File菜单下的Import Bins，弹出文件栏，找到 AGCU_EX25_STR_bins，点中输入该Bins，点击Apply键，点 击OK键。点击File菜单下的Import Marker Stutter，弹出 文件栏，找到AGCU_EX25_STR__stutter，点中输入该Marker Stutter。点击Apply键，点击OK键。
5.1.6点击Tools菜单下的
ID-X Manager，弹出文 件栏，选择弹出文件栏上的Analysis Methods标签，点击文件 栏下方的Import按钮。在弹出窗口中找到AGCU_EX25_STR_Analysis Methods，点中输入该Analysis Methods。点击Done键。至此，成功输入AGCU EX25 STR荧光 检测系统分析所需文件。
5.2数据分析
5.2.1输入样品源数据
从File菜单栏中找到Add Sample to Project并点击，找到要分 析的收集文件夹，点击Add to List后点击Add加入到分析界面。
5.2.2选择试剂盒类型
在分析界面上，Panels栏选中AGCU_EX25_STR_kit荧光检测试剂 盒并利用FillDown向下填充。
5.2.3定义Size standard
选取New Size Standard，弹出选择对话框，选择Basic or Advanced 后，点击OK，在弹出内标定义框中如下设置：Size Standard Dye： Orange；Size in Basepairs：75、100、139、150、160、200、 300、340、350、400、450、490、500，点击OK。之后，利用Fill Down操作向下填充。
5.2.4定义Analysis Method
确定分析起始点，该起始点必须是分子量内标75bp之前的数据分析 点，如2600。同时要观察内标的所有片段是否完全。
5.2.5数据分析
点击new analysis method，在弹出的对话框中进行如下设置：HID、 GeneralName：例如AGCU System：选
AGCU_EX25_STR_Kit_System_Bins、点击OK键。利用Fill Down操 作向下填充，即可进行后续分析。
5.2.6分型
判断的标准是阴性对照结果中不应有特异信号，Allelic Ladder与 Control DNA9948的基因分型正确，如下图1或图2所示。
之后逐一分析样本等位基因峰图1到4与已知祖源信息样本峰图一到 四进行对比后分析是否为样本组源。
Claims (2)
1.一种STR基因检测法进行样本祖源鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：提取细胞样品基因组并准备阳性对照样本和阴性对照样本待用，其中，细胞样品基因组是通过磁珠法或Chelex-100法提取后定量至0.1ng/μL-2ng/μL待用；
步骤二：
通过带有荧光基团标记的引物对步骤一当中的细胞样品基因组、阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增处理，其中，所述PCR的循环参数如表一所示：
表一
所述PCR的反应构成如表二所示：
表二
；
将扩增产物里的若干STR位点标记上不同颜色的荧光后待用；其中，所述带有荧光基团标记的引物为中德美联的AGCU EX25荧光检测试剂盒中的引物；
步骤三：
通过毛细管电泳分离后的到大小不同的片段，将片段大小转换为样本等位基因峰图，通过样本等位基因峰图与已知祖源信息样本峰图进行对比后分析是否为样本组源。
2.如权利要求1所述的一种STR基因检测法进行样本祖源鉴定的方法，其特征在于，所述是否为样本组源的判断方法为阴性对照结果中不应有特异信号，Allelic Ladder与Control DNA 9948的基因分型正确。
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