CN108396068A - 人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用 - Google Patents

人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108396068A
CN108396068A CN201810196770.6A CN201810196770A CN108396068A CN 108396068 A CN108396068 A CN 108396068A CN 201810196770 A CN201810196770 A CN 201810196770A CN 108396068 A CN108396068 A CN 108396068A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dip
kit
sites
amplification
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810196770.6A
Other languages
English (en)
Inventor
朱波峰
沈春梅
靳小业
陈冲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810196770.6A priority Critical patent/CN108396068A/zh
Publication of CN108396068A publication Critical patent/CN108396068A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于法医DNA技术研究领域，具体涉及公开一种39个新始祖插入/缺失（Deletion and Insertion Polymorphisms,DIP）分子遗传标记的法医DNA复合扩增检测试剂盒及检测方法。该试剂盒将39个基因座分成四组，采用四色荧光物质（FAM、HEX、TAMRA和ROX）标记39个位点的引物，实现39个位点在同一扩增体系中进行复合扩增，并同步进行检测。本发明所述的试剂盒，能够兼容检测法医各类人源检材、灵敏度高、特异性强，能够有效推断检材来源人的洲际信息，在法医学领域具有良好的应用前景。

Description

人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于法医DNA技术研究领域，具体涉及公开一种39个新始祖插入／缺失（DeletionandInsertion Polymorphisms, DIP）分子遗传标记的法医DNA复合扩增检测试剂盒及检测方法。
背景技术
随着二十多年的发展，DNA分析分型技术已在法医领域发挥了举足轻重的作用。但目前DNA检验在实践中往往仅提供“被动的”分子信息，对于没有目标嫌疑人的案件，虽然可以利用DNA检验进行排查，但效率低下，无异于“大海捞针”。如果能够很快认定检材来源人的真实身份，特别是检材来源人的洲际人群身份信息，就能够缩小案件的侦查范围，形成DNA 线索，使案件从被动比对、到主动查找，提高破案效率，节省警力和物力，有很好的社会效益和经济效益。然而要解决这些问题必须依靠始祖信息分子遗传标记。
始祖信息位点是指基因组中一系列在不同地域以及不同群体中等位基因频率存在较大差异的高分化位点。始祖多态性位点应用于法医学领域，可以对犯罪现场的物证检材来源人进行生物地理祖先推断，以便缩小侦查范围，有利于锁定目标对象，能够为科技强警提供技术支持和保障。DIP多态性是指不同个体的基因组中单个或多个碱基的插入或缺失，两个等位基因表现为DNA长度的差异。由于DIP兼具单核苷酸多态性（SNP）与短串联重复序列（STR）的优点，使其成为研究祖先信息的理想分子遗传标记之一：DIP位点在基因组中广泛存在，每7.2kb至少存在一个DIP；DIP突变率较低为10-8，突变率明显低于STR基因座10-3；DIP位点的扩增片段也较STR基因座的扩增片段小的多，有助于降解样本的DNA分型；DIP的两个等位基因表现为片段长度多态性，可以采用目前法医实验室常用的荧光标记、复合扩增联合毛细管电泳技术（CE）进行DNA分型检测，而且不会出现影响结果判读的stutter峰等干扰峰，等位基因分型更为简便，所以较STR和始祖信息单核苷多态性有更多优势。所以我们研发了一种39个新始祖DIP分子遗传标记的复合扩增检测试剂盒，并对其在法医学以及群体遗传学中的应用进行了研究。
发明内容
本发明的内容是：研究开发了一种四色荧光标记39个新的始祖DIP位点的引物，复合扩增这些分子遗传标记，并行检测试剂盒。
1）一个目的是一种基于推断检材来源及来源人的洲际地理信息的39个新的始祖DIP位点的检测试剂盒，具体包括：
FAM（蓝色）组，DIP位点如下：rs3029066、rs5891435、rs3045215、rs3839348、rs3831885、rs10533439、rs34477782、rs4647655、rs3028822、rs2307783、rs10555216。
HEX（绿色）组，DIP位点如下：rs10569275、rs10538061、rs35434967、rs3840222、rs36038238、rs34921138、rs11273905、rs3840794、rs146391383、rs3830479、rs10534050、rs5788637、rs147090496。
TAMRA（黑色）组，DIP位点如下：rs16432、rs3835409、rs4147539、rs2307840、rs57406754。
ROX（红色）组，DIP位点如下：rs3216799、rs3044252、rs5896844、rs5788207、rs3034941、rs3842715、rs145119206、rs10580743、rs3047538、rs3033760。
2）39个DIP位点的复合扩增体系的构建。本发明采用Primer5.0软件对各位点进行引物设计，同时通过对PCR引物的优化结合四色荧光物质的调配，实现39个DIP位点在同一反应体系中并行检测。
在检测不同人源样本DNA时，本发明试剂盒的具体扩增体系如下：
组分 终浓度
Nuclease-free water 6µl
2×Master Mix 10µl
Primer Mix 2µl
模版DNA（5～10ng） 2µl
反应终体积 20µl
本发明所述检测试剂盒对非洲，欧洲，美洲以及东亚人群均具有较高的鉴别效能，可以用于不同洲际群体的鉴别；同时还可以检测各种人体检材样本，例如人源性外周血液/斑、月经血/斑、唾液/斑、牙齿、骨骼、精液、尿液/斑、人体组织脏器、毛发等样本的DNA。该检测体系基于毛细管电泳平台对39 个DIP进行分型检测，产物片段大小小于293bp。
3）本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的检测方法，所述检测方法用于鉴别不同洲际群体；具体步骤如下：
1）取人源DNA样本，加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃最后延伸60min。
2）PCR产物与甲酰胺混合，加入阳性、阴性对照，应用毛细管遗传分析仪，进行DNA分型；
3）结果判读、数据处理与分析。
本发明提供一种利用四色检测体系对人类的39个新的始祖DIP位点进行毛细管电泳检测的试剂盒，包括扩增体系，检测组分，以及检测结果的分析。本发明采用新一代法医遗传学标记DIP构建不同洲际群体鉴别的试剂盒。相比SNP试剂盒本发明的试剂盒主要是采用毛细管电泳的方法进行分型检测，这可以在基层法医中推广应用；此外，本发明的试剂盒对未知样本检材进行地缘推断，可以缩减侦查范围，有利于案件的侦破，为科技强警提供技术支持。
附图说明
图1：应用该试剂盒实施1例样本的检测结果DNA分型图（复合扩增39个新的始祖DIP分子遗传标记基因分型图）。
具体实施方式
下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明试剂盒组成：
检测方法：
1）取人源DNA样本1ng/ µl，加入到所述试剂盒中进行PCR复合扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃最后延伸60min。；
2）光谱矫正（以3130型遗传分析仪为例）。
（1）更换测序仪上陈旧的POP7胶和电泳Buffer；
（2）取10µl 5-Dye matrix Standards试剂加到200µl去离子甲酰胺中，震荡混匀，在96孔板的两排16个孔中每孔分装10µl；
（3）95℃变性3分钟，立即放到冰上冷却3分钟；（此步重要，不可省略）
（4）光谱矫正。电泳时，Dye Set选择“E5”，Run Module 选Fragment Analysis36_POP7，具体参数可以根据仪器灵敏度进行调整，使最终检测峰高控制在750rfu-4000rfu之间；
（5）为获得最好的校正效果，建议Q值>0.95，如果未能达到此标准，建议调整电泳参数，重新电泳。
3）PCR产物与甲酰胺充分混合，进行毛细管电泳。
（1）标准毛细管电泳上样体系
组分 体积（µl）
甲酰胺 8.5
Size Standard Org500 0.5
PCR产物 1
（2）批量上样体系：在1ml甲酰胺中加入30～50µl Size Standard Org500，混匀，分装到96孔板中，9µl/孔
（3）电泳protocol的建立：点击Protocol Manager，在页面中点击New，建立新的Protocol，命名为MR 39。Type选择REGULAR，Run Module 选择Fragment Analysis36_POP7，Dye set 选择E5，Fragment Analysis36_POP7中参数设置为默认值，不需要改动，进样电压为3kVolts，进样时间10 sec。
4）数据分析。
（1）打开Genemapper ID软件，初次使用本试剂盒需要先导入Panels&Bins，建立相应的Analysis Method，新建Size Standard（Org500: 50bp，75bp，100bp，139bp，150bp，160bp，200bp，300bp，340bp，350bp，400bp，450bp，490bp，500bp）；
（2）导入电泳数据，选择相应的Panel、Bin、Analysis Method 和Size standard等分析参数，开始分析数据。

Claims (5)

1.一种用于法医学个体识别以及物证检材来源人的洲际地理信息推断研究的39个插入/缺失（Deletion and Insertion Polymorphisms, DIP）位点复合扩增检测试剂盒，其特征在于法医学个体识别及物证检材来源人的洲际地理信息推断研究的39个DIP位点；39个DIP位点的引物对；用于39个DIP位点复合扩增的扩增组分；用于39个DIP位点复合扩增的扩增体系；用于39个DIP位点分型检测的检测组分。
2.根据权利要求书1所述检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒的复合扩增的扩增组分为Nuclease-free water, 2×Master Mix, Primer Mix, Control DNA F312（5ng／µl）。
3.根据权利要求书1所述检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒的20 µl扩增体系中,Nuclease-free water的体积为6 µl；Primer Mix的体积为2µl,2×Master Mix的体积为10µl，模版DNA（5～10ng）的体积为2µl。
4.根据权利要求书1所述检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒的复合扩增的检测组分为Size Standard Org500以及5-Dye matrix Standards。
5.一种用于法医学研究的39个DIP位点复合扩增检测试剂盒，所述检测试剂盒能够推断法医物证检材的来源；DIP作为一种新的始祖分子遗传标记，能够进一步推断检材来源人的洲际地理信息；具体步骤如下：
1）取人源DNA样本，加入到所述试剂盒中进行复合PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃最后延伸60min；
2）取1µl的PCR产物，Size Standard Org 500试剂0.5µl以及去离子甲酰胺8.5µl混匀；并设置阳性、阴性对照，混合物在95℃变性3min，立即置冰上冷却3min；采用毛细管电泳遗传分析仪对39个DIP位点进行分型检测。
CN201810196770.6A 2018-03-10 2018-03-10 人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用 Pending CN108396068A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810196770.6A CN108396068A (zh) 2018-03-10 2018-03-10 人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810196770.6A CN108396068A (zh) 2018-03-10 2018-03-10 人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108396068A true CN108396068A (zh) 2018-08-14

Family

ID=63092681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810196770.6A Pending CN108396068A (zh) 2018-03-10 2018-03-10 人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108396068A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762909A (zh) * 2018-12-09 2019-05-17 朱波峰 一种用于降解检材法医学个体鉴识的44个InDels位点复合扩增检测试剂盒
CN111893167A (zh) * 2020-08-10 2020-11-06 赛济检验认证中心有限责任公司 一种str基因检测法进行样本祖源鉴定的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101956005A (zh) * 2010-08-13 2011-01-26 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种荧光标记的插入缺失遗传多态性位点复合扩增系统及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101956005A (zh) * 2010-08-13 2011-01-26 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种荧光标记的插入缺失遗传多态性位点复合扩增系统及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG ET AL.: "A novel method for the analysis of 20 multi-Indel polymorphisms and its forensic application.", 《ELECTROPHORESIS》 *
MEI ET AL.: "Population genetic structure analysis and forensic evaluation of Xinjiang Uigur ethnic group on genomic deletion and insertion polymorphisms.", 《SPRINGER PLUS》 *
VASUDEVA MURTHY ET AL.: "Forensic Identification by Using Insertion-deletion Polymorphisms", 《INT J HUM GENET》 *
XIE ET AL.: "Genetic Structural Differentiation Analyses of Intercontinental Populations and Ancestry Inference of the Chinese Hui Group Based on a Novel Developed Autosomal AIM-InDel Genotyping System.", 《BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL》 *
ZIDKOVA ET AL.: "Application of the new insertion–deletion polymorphism kit for forensic identification and parentage testing on the Czech population.", 《INT J LEGAL MED》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762909A (zh) * 2018-12-09 2019-05-17 朱波峰 一种用于降解检材法医学个体鉴识的44个InDels位点复合扩增检测试剂盒
CN111893167A (zh) * 2020-08-10 2020-11-06 赛济检验认证中心有限责任公司 一种str基因检测法进行样本祖源鉴定的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1546385B1 (en) Quantification of gene expression
EP3461914A1 (en) Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information
EP2439283B1 (en) Method for the detection of multiple single nucleotide variations or single nucleotide polymorphisms in a single tube
CN105463116B (zh) 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法
CN110904207B (zh) 一种与皮肤老化表征相关的易感基因检测panel及其应用
CN111088329B (zh) 荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用
Sauer Typing of single nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry: principles and diagnostic applications
CN108396068A (zh) 人类39个新的始祖插入/缺失位点试剂盒及其应用
Huang et al. Reliable detection of trisomy 21 using MALDI-TOF mass spectrometry
Tranah et al. Multiple displacement amplification prior to single nucleotide polymorphism genotyping in epidemiologic studies
CN101921860A (zh) 44个snp位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒
Garnis et al. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples
CN108546762A (zh) 一种用于法医学个体识别的35个插入/缺失位点的试剂盒
Romkes et al. Genotyping technologies: application to biotransformation enzyme genetic polymorphism screening
CN111893192B (zh) 混合检材分析微单倍型复合扩增体系及构建及单倍型频率
CN103468800B (zh) 基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN108823294A (zh) 基于20个单倍群d的y-snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
Carson et al. Strategies for the detection of copy number and other structural variants in the human genome
CN111944912A (zh) 一种肤质基因检测方法
CN109762909A (zh) 一种用于降解检材法医学个体鉴识的44个InDels位点复合扩增检测试剂盒
US11680290B2 (en) Efficient methods and compositions for multiplex target amplification PCR
CN111575386B (zh) 一种检测人y-snp基因座的荧光复合扩增试剂盒及应用
Nikolausz et al. The single-nucleotide primer extension (SNuPE) method for the multiplex detection of various DNA sequences: from detection of point mutations to microbial ecology
CN112680530B (zh) 基于18个多重插入缺失遗传标记的高度降解检材检测试剂盒
CN108060233B (zh) 30个y染色体str基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180814

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication