CN112143816B - 用于家族搜索和父系生物地理祖先推断的29-plex Y-STR分型系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于家族搜索和父系生物地理祖先推断的29‑plex Y‑STR分型系统。具体地，本发明提供的Y染色体短串联重复序列分型试剂盒含有特异性检测以下组(a)、组(b)和组(c)的Y染色体STR基因座的检测试剂：组(a)DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y‑GATA‑H4；组(b)DYS526a、DYS526b、DYS570、DYS576和DYS626；和组(c)DYS388、DYS460、DYS481、DYS593、DYS596、DYS643和DYS645。本发明的分型系统具有操作简单、分型易读、扩增特异性高、分型结果峰值均衡以及性能可靠稳定等优点。

Description

用于家族搜索和父系生物地理祖先推断的29-plex Y-STR分 型系统

技术领域

本发明属于法医学技术领域，具体地涉及用于家族搜索和父系生物地理祖先推断的29-plex Y-STR分型系统。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeats,STR)又称微卫星DNA或简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)，是目前在法医物证鉴定中应用最广泛的长度多态性遗传标记，它的重复序列单位(又称核心序列)短，仅2～6个bp，由核心序列首尾串联重复排列组成。基于PCR技术的STR-PCR分型技术已成为当代个体识别和亲权鉴定最主流的手段。

法医DNA分型技术为案件侦破提供了重要手段。基于短串联重复序列STR遗传标记的理论和方法已经成为法医物证鉴定的主流技术。

Y染色体属于性染色体的一种，是近端着丝粒染色体。Y染色体非重组区(non-recombining portion of the Y-chromosome,NRY)的遗传标记为解决上述问题提供了重要方向。因为男性特有和严格的父系遗传方式以及高度的多态性，Y染色体短串联重复序列(Y-chromosome Short Tandem Repeats,Y-STR)被广泛用于男性家系排查和性犯罪男女混合成分检验等公安实战当中，成为追溯父系来源的最佳选择，具有重要的法医学应用价值。

然而，由于Y-STR突变率和单倍型多样性在不同地域人群中表现出明显差异，加之目前广泛使用的商品化Y-STR试剂盒均是以欧美人群为主要参考样本而开发的，使其在我国公安实战应用中存在一定局限性，而且也带来了诸多困扰。比如，经常出现无关个体间享有同一个单倍型或同一父系个体间单倍型存在差异等现象。

Y染色体为男性特有染色体，除拟常染色体区(pseudo autosomal region,PAR)域外，95％的Y染色体特异区在减数分裂中不会发生同源重组，因而被称为非重组区(NRY)，能够在世代中稳定遗传，可用于父系血缘追溯，并且存在于Y染色体非重组区域内的STR基因座呈现高度多态性，故Y-STR具有重要的法医学应用价值，被广泛用于性犯罪男女混合成分检验以及父系血缘关系的评价。

Y-STR应用于法医学领域取得了巨大的成功。2016年，轰动全国的白银案成功告破就是对Y-STR重要性最好的诠释。与常染色体相比，Y-STR除具有常染色体STR分型简便快速、检测灵敏度高、分型标准化、检测效能高(能复合扩增)等优点之外，其优势还在于：1)最重要的优势是Y-STR可有效地用于家系排查，实现点对面的识别，即一旦现场检材的Y-STR单倍型与某个已知男性家系的单倍型相同，即可推测嫌疑人有来自该家系男性的可能，即可在该家系内实施有效排查，从而节省大量人力物力和时间。2)在性侵案件等男女混合样本的分析中，Y-STR可直接分析出男性成分避免女性成分的干扰；3)Y-STR检测的灵敏度高于常染色体STR试剂盒。4)对男性亲属间的亲缘关系鉴定有特别的优势。

Y-STR在取得可喜成绩的同时也遇到了诸多问题，主要有：1)由于STR在不同种族和不同地区的遗传异质性，以及Yfiler、PPY23和Yfiler Plus等目前广泛使用的商品化试剂盒均基于以欧美人群为主体的样本开发的，虽经过少量中国人群验证，但是其中一些位点在大规模应用中已经表现出了适应性不佳等问题。因此，甄选适于中国人群的Y-STR标记系统具有十分必要的现实意义；2)检验体系的效率尚有提高空间。理论上说构成单倍型的Y-STR基因座数目越多，其个体识别能力越强。目前市场上普遍使用的Y-STR检验试剂盒中位点容量最高的是美国Thermo Fisher公司新推出的Yfiler Plus试剂盒，其基因座容量为27个。3)快速突变Y-STR基因座的法医学应用策略尚未明确。Ballantyne等人筛选出的13个高突变率Y-STR基因座(突变率为7.73×10^-3～1.19×10^-2，即大约每100次等位基因传递可发生数次突变)，称之为快速突变Y染色体STR(Rapidly Mutating Y-STR,RM Y-STR)。Yfiler Plus试剂盒则是在Yfiler试剂盒基础上新增了10个Y-STR位点，其中则包括6个RMY-STR位点，RM Y-STR位点的引入在提高试剂盒位点系统单倍型识别能力的同时，也给结果评判和线索锁定带来了干扰，甚至可能导致错误排除有价值信息，因为STR突变现象的发生使得亲缘关系个体之间表现出不符合遗传规律的矛盾现象；4)针对中国人群的系统的法医学应用评估不足，最新出现的Yfiler Plus试剂盒尚处于大规模人群样本的验证阶段，尤其是其新增位点在中国人群的法医学参数和突变率数据尚不明确。众所周知，法医物证检验最终的证据价值评判是通过一定的统计学分析实现，与常染色体STR相比，Y-STR因为其单倍型遗传的特点需要更大的群体数量才能科学地显示其分布情况，并且表现出更具明显的地域和人种特征。

综上所述，目前尚缺乏令人满意、适合中国人群的Y-STR分型系统。

因此，本领域迫切需要开发具有操作简单、分型易读、扩增特异性高、分型结果峰值均衡以及性能可靠稳定等优点的Y-STR分型系统。

发明内容

本发明的目的就是提供具有操作简单、分型易读、扩增特异性高、分型结果峰值均衡以及性能可靠稳定等优点的Y-STR分型系统。

在本发明的第一方面，提供了一种Y染色体短串联重复序列分型试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测以下组(a)、组(b)和组(c)的Y染色体STR基因座的检测试剂：

组(a)DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y-GATA-H4中全部17个Y染色体STR基因座；

组(b)DYS526a、DYS526b、DYS570、DYS576和DYS626中至少4个或全部5个Y染色体STR基因座；和

组(c)DYS388、DYS460、DYS481、DYS593、DYS596、DYS643和DYS645中至少5个、至少6个或全部7个Y染色体STR基因座。

在另一优选例中，DYS385含二个基因座DYS385a和DYS385b，故作为二个基因座计。

在另一优选例中，所述试剂盒含有特异性检测以下组(a)中全部17个Y染色体STR基因座、组(b)中全部5个Y染色体STR基因座和组(c)中全部7个Y染色体STR基因座的检测试剂。

在另一优选例中，在所述试剂盒中，所述的用于检测各Y染色体STR基因座的检测试剂被分为3-5个组。

在另一优选例中，所述的分组如下：

第一组：DYS392、DYS389I、DYS456、DYS389II、DYS19、DYS460、DYS385；

第二组：DYS437、DYS576、DYS439、Y-GATA-H4、DYS438、DYS391、DYS388、DYS645；

第三组：DYS570、DYS635、DYS481、DYS393、DYS390、DYS448；

第四组：DYS526a、DYS458、DYS593、DYS596、DYS526b、DYS643、DYS626。

在另一优选例中，各个组的检测试剂(如引物和/或探针)分别采用不同的可检测标记进行标记。

在另一优选例中，所述的不同的可检测标记产生不同的荧光或发射光谱或激发光谱。

在另一优选例中，所述的可检测标记是荧光团或荧光染料。

在另一优选例中，所述的可检测标记选自下组：FAM、HEX、TAMRA和ROX。

在另一优选例中，第一组、第二组、第三组和第四组分别采用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)和ROX(红色)作为可检测标记。

在另一优选例中，所述的分型试剂盒还包括：分子量内标。

在另一优选例中，所述的分子量内标为荧光染料，更佳地为ORG500橙色荧光标记。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒为引物，优选地，所述的引物的序列选自SEQID No.:1-56。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有SEQ ID No.:1-56中全部56条引物。

在另一优选例中，所述的引物如表2所示。

在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面中所述的试剂盒的用途，它用于制备用于法医物证鉴定的试剂盒。

此外，本发明还提供了本发明第一方面中所述的试剂盒的用途，它用于进行法医物证鉴定。

在另一优选例中，所述法医物证鉴定包括：家族搜索、父系生物地理祖先推断、或其组合。

在本发明的第三方面，提供了一种法医物证鉴定方法，包括步骤：

(a)提供待鉴定DNA样本；

(b)用本发明第一方面中所述的Y染色体短串联重复序列分型试剂盒或针对相应的Y染色体STR基因座的检测试剂进行检测，从而获得Y染色体STR基因座的检测结果；

(c)基于所述Y染色体STR基因座的检测结果，得出法医物证鉴定结论。

在另一优选例中，所述的鉴定结论包括：家族搜索结论、父系生物地理祖先推断结论、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的样本是犯罪现场提取的样本。

在另一优选例中，所述的样本是含人体DNA的样本。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明29个Y-STR荧光标记复合扩增系统技术路线示意图。

图2显示了29个Y-STR复合扩增体系matrix光谱校正图。

图3显示了ORG500分子量内标。

图4显示了9948男性标准品DNA(1ng/μL)在三种退火温度下的电泳图谱。

图5显示了9948男性标准品DNA样本的29个Y-STR电泳分型图。

图6显示了29个Y-STR复合扩增体系等位基因ladder电泳图谱。

图7显示了9948男性标准品DNA在不同模板量下的等位基因平均检出率。

图8显示了9947A女性标准品DNA样本的电泳图。

图9显示了马的29个Y-STR复合体系检测的电泳图谱。

图10显示了猴子的29个Y-STR复合体系检测的电泳图谱。

图11显示了男性混合样本在不同比例下的等位基因平均检出率。

图12显示了男性混合样本比例在1:1时的电泳图谱。

图13显示了男性混合样本比例在19:1时的电泳图谱。

图14显示了29个Y-STR复合扩增体系的精确度结果。

图15显示了29个Y-STR复合扩增体系的准确度结果。

图16显示了父子对29个Y-STR复合扩增体系电泳图(左：父右：子)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种适合我国人群的Y-STR分型系统。本发明的29-plex Y-STR分型系统具有操作简单、分型易读、扩增特异性高、分型结果峰值均衡以及性能可靠稳定等特点。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人针对现有技术中存在的问题，结合Y-STR的实际应用需求，以中国男性人群为参考样本：1)对已有文献中报道的Y-STR位点进行全面筛选，从而获得单倍型识别力较强、突变率适当、兼容性较好的优选Y-STR标记系统；2)建立包含不少于29个Y-STR基因座的高效复合扩增检测体系，提高Y-STR标记系统的个体的识别能力；3)对优选Y-STR标记系统进行了验证和法医学评价，结果表明：本发明的29-plex Y-STR分型系统具有操作简单、分型易读、扩增特异性高、分型结果峰值均衡以及性能可靠稳定等显著优点，非常适合我国人群的Y-STR分型。

术语

如本文所用，术语“本发明的分型系统”、“本发明的Y-STR分型”、“本发明的29-plex Y-STR分型系统”、“本发明的29重Y-STR分型系统”或“本发明的29Y-STR分型系统”可互换使用，指基于本发明特有的29个Y-STR基因座进行分型的系统。应理解，所述术语包括分型试剂盒、分型平台、基因座复合检测体系、或类似分析系统。

29个Y-STR基因座

在本发明中，共涉及29个Y-STR基因座，其中包括AmpFISTR Y filer^TM试剂盒中全部17个基因座(DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385(DYS385含二个基因座DYS385a和DYS385b)、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y-GATA-H4)，此外还包括按照突变率尽可能低和单倍型区分能力尽可能强的原则，筛选并验证的额外的12个基因座。在这12个基因座中，DYS526a、DYS526b、DYS570、DYS576和DYS626是5个快速突变基因座；而DYS388、DYS460、DYS481、DYS593、DYS596、DYS643和DYS645是高度多态性的7个基因座。

基因座分组

在本发明的一个优选例中，采用五色荧光标记，将29个基因座分为四组，使用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)和ROX(红色)荧光染料分组标记，分子量内标用第五色荧光染料ORG500橙色荧光标记，组成29个Y-STR基因座复合扩增体系。

优选的分组如下：

第一组：DYS392、DYS389I、DYS456、DYS389II、DYS19、DYS460、DYS385；

第二组：DYS437、DYS576、DYS439、Y-GATA-H4、DYS438、DYS391、DYS388、DYS645；

第三组：DYS570、DYS635、DYS481、DYS393、DYS390、DYS448

第四组：DYS526a、DYS458、DYS593、DYS596、DYS526b、DYS643、DYS626。

在另一优选例中，各个分组的检测试剂(如引物和/或探针)分别采用不同的可检测标记进行标记。更佳地，所述的不同的可检测标记产生不同的荧光或发射光谱或激发光谱。

优选地，所述的可检测标记是荧光团或荧光染料。代表性的例子包括(但并不限于)：FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)和ROX(红色)。

在另一优选例中，第一组、第二组、第三组和第四组分别采用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)和ROX(红色)进行标记；或分别采用其他任意互换后的荧光染料组合。

在本发明的另一优选例中，还通过先对29个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究29个基因座复合扩增PCR反应条件，通过反复实验确定了复合扩增体系的循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、复合扩增反应体积以及荧光标记引物浓度等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立稳定、均衡的复合扩增体系，从而首次实现了同一反应体系内同时扩增29个Y-STR基因座。

基因分型

本发明还提供了基于本发明分型系统进行基因分型的方法。典型地，可以用本发明的分型系统对含核酸的样本进行检测(如PCR扩增)，然后对扩增产物进行分型分析。

在本发明中，可以用任何常规的或已知的方法，并使用已知的或市售的设备进行人工分型或通过软件进行自动分型。

在一个优选例中，本发明人使用混合单基因座扩增产物方法制作等位基因分型标准物Allelic Ladder，并使用五色荧光Matrix与SIZ(ORG500)分子量内标，建立了基于3130XL遗传分析仪的自动毛细管电泳检验方法。

代表性地，PCR扩增产物可使用3130XL型遗传分析仪进行电泳检测，通过通过例如GeneMapper ID v3.2.1软件进行Y-STR基因分型和分析。

法医学应用和评价

在本发明中，在29个复合扩增体系建立之后，对其进行法医学应用评价。从灵敏度、男性特异性、种属特异性、混合样本、重复性、精确性和准确性，Stutter率等方面进行法医学评价和验证。对6个民族742例男性无关个体进行基因多态性的调查。同时应用AmpFISTR Yfiler^TM试剂盒进行平行检测，得到Y-STR单倍型数据后，计算相应的法医学参数。

本发明分型系统的一个主要应用是用于法医物证鉴定，例如用于家族搜索、父系生物地理祖先推断、或类似鉴定。应理解，如法医领域的技术人员所知晓的那样，法医物证鉴定不涉及疾病的诊断和治疗。因此，在本发明中，法医物证鉴定不涉及也不包括任何诊断或治疗目的，故是非诊断和非治疗性的。

主要结果

1.本发明人采用五色荧光标记通过基因座选择、引物设计和优化、单基因座扩增、全体系基因座复合扩增等过程，利用自建panel和bins以及等位基因Ladder，基于3130XL遗传分析仪的自动毛细管电泳检验方法构建一个全新的29个Y-STR复合扩增检测体系，具有操作简单、分型易读、扩增特异性高、分型结果峰值均衡以及性能可靠稳定等特点，满足目前法医学应用需求。

2.经验证，本发明的29Y-STR复合扩增检测体系灵敏度高，最低检测DNA模板量是0.125ng。具有男性特异性，在女性样本上没有扩增产物或者有扩增产物但并不影响男性等位基因分型的判读。具有种属特异性，与常见的动物物种无交叉反应。

该系统还可以准确地对混合物的分型。在男性与男性的核酸物的混合比例为1:3、1:1和3:1时，较少样本的等位基因平均检出率为100％；当男/男的核酸物的混合比例在1:9和9:1时，平均检出率大于90％；当男/男混合比例1:19和19:1时，平均检出率大于60％。男性与女性的核酸样本按1:1、1:10、1:100、1：1 000的比例混合后用本方法检测，结果表明男性样本在每个比例下均可准确分型，得到完整分型结果。

在本发明的一个优选例中，利用29个Y-STR基因座等位基因分型标准物Allelicladder在3130XL遗传分析仪上12道毛细管同时电泳，计算12次Allelic ladder中的每一个等位基因片段大小的平均值和标准差的值。结果显示在所有等位基因中标准差在0.15以内，观察到的最高的标准差是0.084。

通过计算50个男性样本与相应等位基因分型标准物Allelic ladder之间每一个等位基因片段大小的差值来评估该体系的准确性，结果显示所有的等位基因片段大小都在±0.5bp以内。

通过对10对父子和5个家系中3名成员个体进行29个Y-STR基因座检测，结果显示：10对父子对分型结果完全一致，5个家系中3名成员的分型结果也完全一致。

3.对742份无关男性个体进行29个Y-STR复合扩增检测系统检测，同时随机抽取100份男性样本用AmpFISTR YfilerTM试剂盒进行平行检测，结果显示：用Yfiler试剂盒检测得到的分型数据与29个Y-STR分型数据中相同的17个基因座的分型数据结果一致。

742名男性无关个体经29个Y-STR复合扩增体系检测，共检测到732种单倍型，其中725种单倍型出现1次，5种单倍型出现2次，1种单倍型出现3次，1种单倍型出现4次。GD值为0.1960(DYS645)～0.9682(DYS385)。HD值为0.999949，DC值为0.986523。

本发明的主要优点包括：

1)本发明的29个Y-STR复合扩增检测体系，具有操作简单、分型易读、扩增特异性高、分型结果峰值均衡以及性能可靠稳定等特点，可应用于目前法医学Y-STR的检测。

2)本发明的分型系统具有灵敏度高、优良的男性特异性、种属特异性、重复性好，还可用于混合样本的检测，可满足日常法医物证Y-STR检验需要。

3)本发明的分型系统对中国人群具有很优异的适用性，相比目前常使用的商业化AmpFISTR Yfiler^TM试剂盒，本发明分型系统识别率显著提高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料与方法

1、实验样本

单基因座和29个基因座全体系扩增优化时使用的样本：9948男性标准品DNA样本(获自北京基点认知有限公司)。

灵敏性研究的样本：原始浓度为2ng/μL的9948男性标准品DNA样本(获自北京基点认知有限公司)按比例连续稀释，设立模板DNA量的梯度为：2ng、1ng、500pg、250pg、125pg、62.5pg、31.25pg和15.625pg。

男性特异性研究样本：9947A女性标准品DNA(10ng/μL)样本(美国Promega公司)和提取10名无亲缘关系的健康女性志愿者血液样本，EDTA管抗凝-20℃保存。

种属特异性研究样本：鸡、鸭、牛、羊、猪、马、狗、猫、兔子、小鼠、鱼和猴子DNA样本。

混合样本研究的样本：分别提取2份男性志愿者和1份女性志愿者的新鲜血液样本，抗EDTA抗凝-80℃保存。

重复性研究样本：9948男性标准品DNA样本(北京基点认知有限公司)、007男性标准品DNA样本(美国Thermo Fisher公司)和2800M男性标准品DNA样本(美国Promega公司)三种不同的男性标准品DNA样本，提取5名男性志愿者的精液样本和血液样本，共10份。血液抗EDTA抗凝-80℃保存。精液收集管-80℃保存。

家系样本：提取10对父子对、5个家系每个家系中3名个体的血液样本，抗EDTA管-80℃保存，取自XX实验室。

法医学参数统计和一致性研究样本：9948男性标准品DNA样本用于每整板扩增的阳性对照样本。6个民族无关男性个体样本742例外周血和FTA血卡，汉族(n＝445),回族(n＝89),维吾尔族(n＝59),藏族(n＝61),蒙古族(n＝21),哈萨克族(n＝89)。

以上样本的采集和使用是在经过志愿者知情同意的原则下进行的，并且通过了司法鉴定科学研究院伦理委员会。

2、实验方法

2.1技术路线

目的是建立一个单倍型识别能力较强、突变率适当、兼容性较好的Y-STR多基因座复合检测体系。通过对已有文献中报道的Y-STR基因座进行全面筛选，利用文献中报道的背景信息，应用NCBI、UCSC网站、oligo、primer等工具，自行设计引物，并根据目标片段大小应用五色荧光标记技术，设计29个基因座复合扩增基因座分布，应用分子量内标(sizestandard)、Matrix(荧光校准物)，制备等位基因分型标准物(Allelic Ladder)，实现整个扩增体系在3130XL基因分析仪上检测。通过对单个基因座扩增、29个基因座一起复合扩增来进行检测该系统的稳定性、均衡性，并根据出现的问题通过反复试验摸索利用各种方法加以调整，同时依据分析方法科学工作组对新的扩增反应体系进行有效性验证，并且通过大规模群体多态性调查来评估该体系的法医学应用。技术路线图见图1。

2.2基因座选择

通过查阅文献从中选取DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、GATA H4、DYS460、DYS576、DYS388、DYS645、DYS570、DYS481、DYS526a、DYS593、DYS596、DYS526b、DYS643和DYS626共29个基因座，其中包括AmpFISTR Y filer^TM试剂盒中全部17个基因座(DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y GATA H4)和按照突变率尽可能低和单倍型区分能力尽可能强的原则，筛选并添加了DYS460、DYS576、DYS388、DYS645、DYS570、DYS481、DYS526a、DYS593、DYS596、DYS526b、DYS643和DYS626 12个基因座。其中DYS526a、DYS526b、DYS570、DYS576和DYS626是快速突变基因，另外新添加的7个基因座(DYS388、DYS460、DYS481、DYS593、DYS596、DYS643和DYS645)是高度多态性基因座。根据所选29个Y-STR基因座的核心序列与等位基因范围，计算基因座片段大小范围，采用五色荧光技术，将所选择的29个基因座分为4组，分别用FAM、HEX、TAMRA、ROX 4色荧光标记，并以此进行29个基因座排布，建立29个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系。29个Y-STR基因座的详细信息见表1。29个Y-STR基因座的侧翼序列可在UCSC(http://genome.ucsc.edu/)网站查阅。

表1 29个Y-STR基因座的详细信息

2.3引物设计和优化

根据29个Y-STR基因座核心重复单位的侧翼序列使用引物设计软件Primer v5.0和Oligo v6.0进行引物设计，设计时遵循引物设计原则：1)引物长度(primer length)控制在在15-35bp；2)引物GC含量在45％-55％之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应；3)退火温度Tm值在50℃-60℃；4)扩增产物长度控制在50-500bp以内。对于获得的引物通过NCBI网站中BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行非特异性检测，在优化阶段，用已知分型的9948男性标准品样本先进行单个基因座的扩增，扩增产物经测序，测序结果与基因座的核心重复序列和长度片段进行比对来确定分型是否成功。在单个基因座扩增成功后，将29个基因座按照扩增产物的片段大小进行排布，通过实验反复摸索和优化，最终使29个基因座在同一反应体系里进行复合扩增。在成功建复合扩增反应体系后对反应体系从退火温度、循环次数、反应体积等方便进行优化。29个Y-STR基因座前后引物序列见表2。

表2 29个Y-STR基因座扩增引物及标记的荧光种类

2.4DNA的提取和定量

2.4.1.使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取全血样本DNA

2.4.2.使用QIAamp DNA Investigator Kit试剂盒提取精液样本DNA

2.4.3.DNA定量

通过Epoch^TM微孔板分光光度计来测定提取样品DNA的浓度(ng/μL)和纯度(OD260/280)。

2.5PCR扩增

2.5.1.29个Y-STR复合扩增体系PCR扩增

通过实验反复摸索和优化最终实现了29个基因座中在同一反应体系中的复合扩增，并且通过对PCR反应预混液进行优化实现既能对提取DNA样本进行扩增和免提取DNA进行直接扩增，大大的节省了时间。扩增体系分为提取DNA样本扩增和直接扩增。

2.5.1.1.PCR反应体系

该体系采用25μL和10μL两个反应体积，对于提取的DNA样本采用25μL和10μL反应体系，对于直接扩增的样本，选用10μL反应体系。提取DNA样本扩增反应体系(25μL)、提取DNA样本扩增反应体系(10μL)和对FTA卡血样用1.2mm打孔器打孔后直接扩增的反应体系(10μL)详细配置表见表3、表4、表5。

表3提取DNA样本扩增反应体系配置组成(25μL)

扩增体系组分	加量(μL)
		5×PCR反应预混液Ⅳ	4
5×29Y引物混合物	4
		去离子水+DNA模板	17
反应总体积	25

表4提取DNA样本扩增反应体系配置组成(10μL)

扩增体系组分	加量(μL)
		5xPCR反应预混液Ⅳ	2
5x29Y引物混合物	2
		去离子水+DNA模板	6
反应总体积	10

表5直接扩增反应体系配置组成(10μL)

扩增体系组分	加量(μL)
		5xPCR反应预混液Ⅳ	2
5x29Y引物混合物	2
		去离子水	6
血痕	直径1.2mm
		反应总体积	10

2.5.1.2.PCR扩增程序

利用PCR System 9700型金座热循环仪进行PCR扩增，加热模式设为“Max”,具体PCR扩增条件如表6：

表6 PCR扩增程序

2.6毛细管电泳检测和数据分析

2.6.1.光谱校正

1、替换3130XL遗传分析仪上陈旧的POP4电泳凝胶和电泳Buffer。

2、取一个1.5mL EP管，先用1000μL可调移液器取200μL去离子甲酰胺至管中，再用10μL移液器取8μL 5色系统光谱校准试剂加到EP管中，震荡混匀，离心后，在96孔板的两排16个孔中，每孔分装10μL混合物。

3、将96孔板在PCR仪上进行95℃变性3min，然后立即放到冰上冷却3min，短暂离心后放在3130XL遗传分析仪上进行毛细管电泳。

4、打开Run 3130xl Data Collection v3.0软件，点击Module Manager，在页面中点击New，建立新的protocol，命名为“29Y-G5-matrix”，Type选择“Spectral”，Template选择“Spect36-POP4”，点击“OK”。

5、打开Run 3130xl Data Collection v3.0，点击ga3130xl，点击ProtocolManager，在页面中点击New，建立新的protocol，命名为“29Y-G5-matrix”，光谱校正电泳时，Type选择“Spectral”，Dye Set选择“G5”，Run Module选择“Spect36-POP4-1”，参数设置如下：Edit Parameter中，Matrix Condition Number Bounds的Lower设置为“2.0”，Sensitivity设置为“0.1”，Minimum Quality Score设置为“0.8”，为了使最终的峰高在750RFU-4000RFU范围内，其他具体电泳参数，例如进样时间等，根据不同仪器的不同灵敏度调整设置。

6、参数设置好后连接板子和建好的表格，点击“Run”绿色按钮进行电泳。29个Y-STR复合扩增体系Matrix光谱校正命名为“29Y-G5-20170918”，见图2。

2.6.2.电泳检测

1、标准上样体系为：取8.5μL甲酰胺加0.5μL分子量内标ORG500加1μLPCR产物，震荡混匀离心。

2、批量上样体系为：向将1.5mL EP管中分装好的1mL甲酰胺中加入50μL分子量内标ORG500，震荡混匀离心后，在96孔板上的每个加样孔中加入9μL上述混合物，在A1和A7孔中加入1μL Allelic Ladder，其他94加样空中用排枪加入1μLPCR产物。

3、短暂离心后经过95℃变性3min后在3130XL遗传分析仪上进行毛细管电泳。

4、电泳Protocol的建立：点击Protocol Manager，在页面中点击New，建立新的protocol，命名为“29Y-G5”，Type选择“REGULAR”，Dye Set选择“G5”，Run Module选择“HIDFragment Analysis36-POP4”，HID Fragment Analysis36-POP4参数设置为默认值，不需要改动，进样时间为10s，进样电压为3K Volts。

5、点击Plate Manager，在页面中点击New，编辑样本表格，选择相应的panel、analysis method和size standard等分析参数，选择结果保存的位置，选择相应的Instrument Protocal。在“Sample Type”栏中，将Ladder样本改为“Allelic Ladder”，检查确认无误后点击“OK”。

6、点击Run Scheduler，点击Plate View，连接板子和表格，点击绿色按钮，开始电泳。16道毛细管同时电泳，一个Run大约需要40分钟。

2.6.3.片段分析和基因分型

打开GeneMapper ID v3.2.1软件，新建project文件，引进电泳文件，命名文件名，点击分析按钮，开始分析数据。分子量内标荧光染料为ORG 500(橙色荧光)，片段长度为65、70、80、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、330、360、390、420、450、490和500，见图3。以等位基因分型标准物(Allelic ladder)为标准，根据扩增片段的大小来确实能够各个基因座的基因型，并根据国际法医遗传学会(the International Society forForensic Genetics，ISFG)推荐的最新指南标准对各个基因座Y-STR进行等位基因命名。

2.7 panel、bin文件制作和等位基因分型标准物Allelic Ladder的制备

2.7.1. panel、bins文件制作

panel、bins文件制作是利用GeneMapper ID v3.2.1软件进行STR片段分型的必须文件，它存储了复合检测系统的基本信息，包括基因座名称，每个基因座包含的等位基因命名，片段大小等数据。应用GeneMapper ID v3.2.1软件(美国Thermo Fisher公司)，根据建立的检测体系基因座排布以及报道的等位基因信息，新建一个panel文件，并根据设计引物的长度及单位点扩增电泳结果，根据内标判读的片段大小编辑bins。

2.7.2.等位基因分型标准物Allelic Ladder的制备

等位基因分型标准物Allelic Ladder的制备按照方法进行，对9948男性标准品DNA样本进行单基因座扩增，并且进行产物测序，再根据核心重复序列数目确定等位基因分型，收集分型不同的样本提取模板并混合，对混合模板引物进行荧光标记单基因座扩增则制成该基因座等位基因分型标准物Allelic Ladder，再将各基因座的Ladder混合作为复合检测体系的Ladder，最后进行3130XL遗传分析仪电泳检测，调整扩增模板量来保证Ladder峰值均衡。

2.8对29个Y-STR基因座复合扩增体系的法医学评价

2.8.1.系统灵敏度研究

为了验证系统的灵敏度，将原始浓度为2ng/μL的男性标准品9948DNA连续稀释，设立模板DNA量的梯度为：2ng、1ng、500pg、250pg、125pg、62.5pg、31.25pg和15.625pg。

在相同的扩增反应条件下，分别进行29个Y-STR基因座复合扩增体系的检测。每个DNA模板量重复检测3次。

2.8.2.男性特异性研究

为了研究该体系的男性特异性，选取10名无亲缘关系的女性个体血液样本以及女性标准品9947A DNA(10ng/μL)进行检验。根据方法2.4.1中所描述的方法提取10名女性血液DNA，经定量DNA浓度都在10ng/μL以上。这11个样本进行29个Y-STR基因座复合扩增体系的检测，用于该体系的男性特异性研究。

2.8.3.种属特异性研究

对鸡、鸭、牛、羊、猪、马、狗、猫、兔子、小鼠、鱼和猴子DNA样本进行定量稀释，保持DNA浓度在2ng/μL。并进行29个Y-STR基因座复合扩增体系的检测。每个DNA模板量重复检测3次。

2.8.4.混合样本研究

根据方法2.4.1、2.4.3中所描述的方法将2名男性和(M1、M2)和1名女性(Female1)新鲜血液样本进行DNA提取定量，进行混合样本的研究。此外还有男性标准品9948DNA。

男-男(M1/M2)混合比例设置为(1:1、1:3、3:1、1:9、9:1、1:19和19:1)，DNA总量保持在1ng。

男-女(9948男性标准品/Female 1)比例设置为混合为1：l、l：10、l：100、l：1000，即女性DNA保持在125ng，男性样本DNA的量依次为125ng、12.5ng、1.25ng和125pg。混合样本按照以上比例进行29个Y-STR复合扩增体系的检测，每个模板量重复检测3次。

2.8.5.重复性研究

重复性研究能确保29个Y-STR复合扩增体系得到可靠的结果。5份精斑的DNA提取方法和5份血液DNA提取按照方法2.4提取DNA，此外三种不同的男性标准品9948、007和2800M共13份样本分别在2个不同的实验室用同一批次的29个Y-STR复合扩增体系进行检测。

2.8.6.分型精确性和准确性研究

分型的精确性和准确性对于一个新的复合扩增体系是至关重要的，它决定了数据的可靠性。

精确性：利用自主建立的29个Y-STR复合扩增体系的Allelic ladder在3130XL遗传分析仪中的12道毛细管上同时进行电泳。计算12次Allelic ladder中的每一个等位基因片段大小的平均值和标准差的值。

准确性：使用29个Y-STR复合扩增体系对50份男性样本进行PCR扩增及3130XL遗传分析仪的电泳分型。计算每份样本中每个等位基因与其相应的Allelic ladder等位基因片段长度的差值。

2.8.7.Stutter峰计算

由于基因组复制过程中会出现STR复制滑脱，复制滑脱使Stutter峰在PCR扩增中很常见，在本实验中，使用29个Y-STR复合扩增体系对100份男性样本进行PCR扩增及3130XL遗传分析仪的电泳分型。通过计算100份男性样本中Stutter峰的个数、Stutter率的平均值、3倍标准差等数值来评估29个Y-STR复合扩增体系Stutter率。其中，Stutter峰的阈值(滤过系数)等于Stutter峰的平均值加上3倍标准差的和。Stutter峰的最小阈值设定为10RFU。

2.8.8.家系调查

根据方法2.4.1中所描述的方法，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取10对父子对和5个家系样本的DNA，进行29个Y-STR基因座复合扩增体系检测。

2.8.9.群体研究和一致性研究

群体研究：为了研究该复合扩增体系在群体中的应用，采集742例男性无关个体静脉血和FTA卡血样。通过计算相应的法医学参数来评估该复合扩增体系的法医学应用价值。

一致性研究：为了研究该复合扩增体系的一致性，从742例男性无关个体中随机抽取100名男性个体，使用Yfiler^TM试剂盒与29个Y-STR基因座复合扩增体系平行检测。

2.9统计分析

每个基因座的等位基因频率和单倍型频率用直接计数法来计算。

等位基因频率(pi)计算为该基因座第i个等位基因频数/n(n为群体样本数)。

单倍型频率(Pi)计算为单倍型的个数/n(n为群体样本数)。

基因多态性(Gene Diversity，GD)及单倍型多样性(Haplotype Diversity，HD)，按公式GD＝n(1-∑P_i ²)/(n-1)、HD＝n(1-∑P_i ²)/(n-1)计算，其中P_i为第i个等位基因的频率或第i个单倍型的频率，n为检测样本总量。

单倍型的识别能力(Discrimination Capacity，DC)由公式DC＝N_diff/N，其中N_diff为单倍型种类数目，N为样本总量。

2.10基于29个Y-STR的单倍型预测

在本实施例中，评价了29个Y-STRs在单倍群分类中的应用。

方法如下：首先利用MALDI-TOF质谱联用技术(multiplexes)对742例男性样本进行了基于SNPs基因分型的Y染色体单倍群分类鉴定，然后，将每一类单倍群中70％的个体对组合成一个参照组(n＝523)，其余30％组合成一个测试组(n＝219)。然后以参照组的29个Y-STRs基因型进行单倍型分类，最后，利用测试组对基于29个Y-STRs基因型的SVM预测单倍型分类的能力进行评价。

实施例1：29个Y-STR复合扩增体系的建立和优化

对于29个Y-STR复合扩增体系每一个基因座的详细信息如GeneBank登记号、核心重复序列、等位基因范围等见上表1。

每一个基因座的详细的引物信息见上表2。

引物设计完成后，先是单个基因座扩增，电泳分型结果确定引物设计的好坏，引物设计失败定义的标准为出现不完全加A现象、出现PCR非特异峰、出现PCR伪峰、低信号峰和没有产物峰。引物确定好后调整引物浓度，再通过反复摸索条件和优化，使29个基因座在一个反应体系里同时复合扩增，最终以电泳分型结果为准。

1.1最终基因座排布和引物浓度

经过多次反复调整，最终确立各基因座引物浓度，如下：

FAM	DYS392	DYS389I	DYS456	DYS389II	DYS19	DYS460	DYS385
									C/μM	0.08	0.02	0.04	0.12	0.1	0.09	0.07
HEX	DYS437	DYS576	DYS439	Y GATA H4	DYS438	DYS391	DYS388	DYS645
									C/μM	0.12	0.08	0.09	0.1	0.15	0.1	0.3	0.11
TAMRA	DYS570	DYS635	DYS481	DYS393	DYS390	DYS448
									C/μM	0.14	0.08	0.2	0.13	0.1	0.1
ROX	DYS526a	DYS458	DYS593	DYS596	DYS526b	DYS643	DYS626
									C/μM	0.04	0.07	0.08	0.1	0.5	0.15	0.3

1.2.退火温度优化

在退火温度优化阶段，退火温度在58℃、60℃和62℃都进行了调试，结果发现在这3个不同的退火温度下，都能呈现完整的电泳分型结果，见图4。

1.3.最终扩增程序确定

通过单基因座扩增到29个Y-STR基因座在同一反应体系里扩增，不断反复优化反应体系和反应条件，使用PCR System 9700型金座热循环仪进行PCR扩增，加热模式设为“Max”,最终确定了PCR反应程序如下：

经过最终调整反应后的9948男性标准品DNA电泳分型图谱见图5。如图所示，经过调整各组分的29个Y-STR基因座复合扩增检测系统在对9948男性标准品DNA的检测表现良好，各个基因座得到有效扩增，其扩增特异性好，未出现非特异性扩增条带，分型结果明确易判读。

1.4.等位基因分型标准物Allelic Ladder

将每个基因座上含不同等位基因的样品进行单个扩增，扩增产物按一定比例混合，平衡后再将等位基因混合物再次扩增，将扩增产物进行测序依据测序结果按核心重复序列的重复次数命名各等位基因，再将各基因座的Ladder混合作为复合检测体系的AllelicLadder(图6)。

实施例2：29个Y-STR复合扩增体系的法医学评价

2.1.系统灵敏度

男性标准品9948DNA被稀释为8个不同浓度梯度：2ng、1ng、500pg、250pg、125pg、62.5pg、1.25pg和15.625pg。在相同的反应条件下，分别进行29Y-STR复合扩增体系的检测。结果显示：29个Y-STR基因座复合扩增系统在模板量高于0.125ng的情况下可以获得29个Y-STR基因座完整的分型结果，当模板量小于0.125ng时出现基因座丢失。当模板量分别为62.5pg、31.25pg和15.625pg时，基因座等位基因平均检测率分别为95％、78.16％和47.13％，见图7。当模板量在62.5pg时，平均等位基因丢失率为5％，随着模板量的减少，等位基因丢失率也随之增大，从21.84％(31.25pg)增加到52.87％(15.625pg)。

2.2.男性特异性研究

对11份女性样本模板进行29个Y-STR复合检测体系扩增，扩增产物经3130XL遗传分析仪检测，在峰阈值设在50RFU时，女性样本可检见1～2个标记为“OL”(Off-Ladder)非特异性峰。但这并不影响等位基因的判读，因为这些“OL”非特异性峰落在bin之外。其中9947A女性标准品DNA样本的电泳图如图8所示。

2.3.种属特异性研究

对鸡、鸭、牛、羊、猪、马、狗、猫、兔子、小鼠、鱼和猴子DNA样本进行29个Y-STR复合扩增体系检测，峰阈值设为50RFU，常见的动物如鸡、鸭、牛、羊、猪、马、狗、猫、兔子、小鼠、鱼等动物均未检测出任何产物峰。图9为马的29个Y-STR复合体系检测的电泳图谱。在猴子样本上检测到一个峰高大于50RFU的产物峰，但是与人类男性检测分型结果不一致。图10为猴子的29个Y-STR复合体系检测的电泳图谱。

2.4.混合样本研究

对于男-男混合的样本，在DNA总量保持在1ng情况下，分别设置混合比例为19:1、9:1、3:1、1:1、1:3、1:9和1:19来进行29个Y-STR复合体系的检测。并且在每个混合比例重复检测3次时计算贡献者较少的唯一等位基因平均检出率。

结果显示在混合比例3:1、1:1和1:3时，较少贡献者的唯一等位基因平均检出率为100％，在混合比例为1:9和9:1时，平均检出率大于90％，当混合比例增加到1:19和19:1时，平均检出率大于60％，见图11。

其中混合比例为1:1时29个Y-STR复合检测体系图谱见图12，混合比例为19:1时29个Y-STR复合检测体系图谱见图13。

对男性DNA和女性DNA混合比例为1：1、1：10、1：100、1：1000的样本进行检测，即在女性DNA保持在125ng，男性DNA模板量依次为125ng、12.5ng、1.25ng和125pg，结果显示29个Y-STR的分型结果不受女性成分的干扰，在男性模板量为125pg时仍能得到完整分型图谱，进一步验证本发明建立的29个Y-STR检测体系的灵敏度。

2.5.重复性研究

三种不同的男性标准品(9948、007和2800M)和10份男性DNA样本分别在2个不同的实验室用相同的复合扩增体系和扩增条件，结果显示2个实验室里13份样本分型结果完全一致。

2.6.分型精确性和准确性研究

利用29个Y-STR基因座等位基因分型标准物Allelic ladder在3130XL遗传分析仪上12道毛细管同时电泳，计算12次Allelic ladder中的每一个等位基因片段大小的平均值和标准差的值。结果见图14。其中在所有等位基因中观察到的最高的标准差是0.084。

通过计算50个男性样本与相应等位基因分型标准物Allelic ladder之间每一个等位基因片段大小的差值来评估该体系的准确性。

结果见图15。结果显示所有的等位基因片段大小都在±0.5bp以内。

2.7.Stutter率的计算

Stutter率的计算包括增加一个重复单位(Plus)和减少一个重复单位(Minus)。100个男性样本Stutter率的计算结果见表6。

在Minus Stutter峰中，检测到最多的基因座是DYS570(96％)，最少的基因座是DYS593(3％)；平均值在0.0196(DYS645)到0.1901(DYS596)之间；标准差在0.004(DYS643)到0.3316(DYS596)之间；滤过系数在0.0343(DYS645)到1.1849(DYS596)之间。

在Plus Stutter峰中，检测到最多的基因座是DYS392(68％)；平均值最大为0.2841(DYS438)；标准差最大为0.3794(DYS438)；滤过系数最大为1.4222(DYS438)。

表6 29个Y-STR基因座Stutter率计算结果(n＝100)

2.8.家系调查

通过对10对父子和5个家系中3名成员个体进行29个Y-STR基因座检测，结果显示10对父子对分型结果完全一致，5个家系中3名成员的分型结果也完全一致。图16为一父子对电泳分型结果。

2.9.群体研究和一致性研究以及相关法医学参数

对742份无关男性个体进行29个Y-STR复合扩增检测系统检测，同时随机抽取100份男性样本用AmpFISTR YfilerTM试剂盒进行平行检测。

结果显示用Yfiler试剂盒检测得到的分型数据与29个Y-STR分型数据中相同的17个基因座的分型数据结果一致。

742名男性无关个体经29个Y-STR复合扩增体系检测，共检测到732种单倍型。其中725种单倍型出现1次，5种单倍型出现2次，1种单倍型出现3次，1种单倍型出现4次。GD值为0.1960(DYS645)～0.9682(DYS385)。HD值为0.999949，DC值为0.986523。

2.10.基于Y-STR单倍型推测单倍群分类的准确性

为了检测基于29个Y-STR基因座来推测单倍群的准确性，742个男性无关个体采用MALDI-TOF质谱联用仪进行单倍群SNP分型。结果742个样本被分成了12个主要的单倍群：CF(n＝70),C(n＝107),F(n＝7),G(n＝10),J2(n＝18),K2(n＝73),O1(n＝86),O2(n＝317),Q(n＝28),R(n＝1),R1(n＝20)和R2(n＝5),其中403个属于O单倍群的样本又被细分到15个亚群：O1(n＝42),O1a1(n＝42),O2a1a(n＝1),O2a1a1(n＝8),O1a2(n＝1),O2a1c1(n＝72),O2a1c2(n＝3),O2a2a(n＝4),O2a2a1(n＝25),O2a2a2(n＝4),O2a2b1(n＝182),O2a2b2(n＝13),O2b1(n＝4),O2b1a1(n＝1)和O1b2(n＝1)。用29个Y-STR推测单倍群相对于用Yfiler试剂盒中17个Y-STR基因座来说，预测的准确率更高(从89.5％提高到96.35％))。

讨论

1、29个Y-STR荧光标记复合扩增体系的建立

目前法医物证Y-STR检验最常用的技术手段就是荧光标记复合扩增，使用最多的还是商品化的试剂盒，比如美国Thermo Fisher公司的AmpFISTR YfilerTM试剂盒。但是这些试剂盒在基因座选择和设计上主要参考欧美人群，在中国人群中应用已经出现适应性不佳的问题。因此，研发一个针对中国人群具有一定的兼容性，单倍型识别能力高的复合扩增体系成为了热门的研究问题。稳定性、检测特异性、以及检测结果的均衡性都是衡量一个系统的重要指标，也是影响一个体系能否能够得以广泛应用的关键。

本发明首次建立一个针对中国人群的高识别力Y-STR多基因座荧光复合扩增体系。

本发明在基因座位点选择上，考虑到兼容性，包括了AmpFISTR YfilerTM试剂盒中全部17个基因座，另增加7个高度多态性基因座和5个快速突变位点，总共29个。

在本发明中，应用引物设计软件工具与实际检验测试结合的方法，从NCBIGenbank上获取选择的目标基因座的基因序列，作为引物设计模板序列在NCBI blast中比对。根据29个基因座核心重复序列的侧翼序列使用引物设计软件Primer v5.0和Oligov6.0进行引物设计，设计时遵循引物设计原则，优先考虑引物扩增效率和特异性，同时控制全部基因座扩增产物在500bp以内，再将设计完的引物进行primer blast，寻找与其他模板非特异结合最少的引物。最后使用获得的引物进行样本扩增电泳检验，替换存在扩增效率低和非特异性扩增的基因座引物，最终确定引物序列。

根据电泳检测片段产物大小进行复合扩增体系的基因座排布，共分为4组，使用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)、ROX(红色)荧光素分组标记，加之橙色荧光素ORG 500标记分子量内标，构成五色荧光标记复合扩增系统。本发明分型系统应用的引物遵循单基因座扩增到单色荧光分组扩增再到全系统复合扩增的实验过程，充分测试每一个基因座在不同条件下的扩增效率与扩增特异性。

在本发明中，先对29个基因座的单一基因座扩增条件进行优化，完成体系配置后用9700PCR仪扩增，扩增产物使用3130XL遗传分析仪检测峰高和峰面积，根据峰高和峰面积调整合适的引物浓度。然后根据由上述步骤选取出来的各个单个基因座扩增引物浓度，配置复合扩增的引物浓度。

本发明构建的扩增体系采用10μL和25μL反应体系，在分别成功地建立了29个单基因座扩增条件的基础上，总体研究29个基因座复合扩增反应条件，通过反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如循环参数、退火温度、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到均衡、特异的要求，最终建立起29个Y-STR基因座的复合扩增体系。通过对反应体系中反应混合物的优化，系统不仅对提取的DNA样本进行扩增，而且还可以不用提取DNA进行直接扩增，比如对FTA卡上的血斑和唾液斑，可以直接扩增，大大节省了时间。设置循环数30±1个，测试退火温度在58℃、60℃、62℃时的扩增结果，通过3130XL遗传分析仪检测结果，结果显示在58℃、60℃、62℃这三个温度扩增均衡性、峰高都较好，没有等位基因丢失现象，都获得完整等位基因分型。考虑到对于各种不同检材的扩增效率及扩增特异性，确定退火温度60℃。最终PCR反应程序为95℃初始变性2分钟，94℃变性5秒，60℃退火1分钟，30±1个循环，60℃延伸60分钟。整个反应过程在1个小时左右完成。

综上所述，本发明建立的29Y-STR复合扩增检测体系，具有扩增特异性高，性能可靠稳定，分型结果峰值均衡，分型易读，操作简单等显著优点，适合推广应用。

2、对29个Y-STR复合扩增体系的法医学应用评价

本发明人还从灵敏度、男性特异性、种属特异性、重复性、混合物研究、分型准确性和精确性、Stutter峰计算、分型一致性和对大规模群体样本多态性调查，来对29个Y-STR复合检测体系进行法医学应用评价。

在实际案发现场会遇到各种各样的检材，有的检材非常微量，但是有可能这些微量的检材就是破案的关键，所以一个高灵敏度检测系统是至关重要的。在STR基因座复合扩增分型中，DNA量过少会导致STR基因座等位基因丢失，尤其是大片段丢失；DNA量过多会产生渗透，影响等位基因分型，所以一个合适的DNA检测限度是非常重要的。灵敏度的检测是确保该体系能获得理想分型结果的范围经检测该体系的最佳检测范围是0.125ng～2ng，低于0.125ng时会出现等位基因丢失现象。等位基因丢失最先发生在大片段基因座上，并且随着模板量的减少，等位基因平均检出率越来越少。该体系检测灵敏度高，最低检测量0.125ng已经充分满足日常法医学检案的需求，对于微量检材的DNA具有很好的应用。

虽然Y染色体为男性特有，理论上说女性样本不会出现Y-STR分型结果，但有些基因座与X染色体同源，因此不可避免的有时在女性样本上会出现基因座产物峰，但是这并不影响结果的判读，因为这些产物峰大多是处于bin外。有报道个别女性样本在DYS391和DYS393基因座上出现产物峰，但是采用本发明的分型系统和条件，这11个女性样本在这两个基因座上均未出现，因此本发明的分型系统具有男性特异性。

在案发现场可能会有各种动物留下的检材，本发明人通过对常见动物(鸡、鸭、牛、羊、猪、马、狗、猫、兔子、小鼠、鱼和猴子)对该体系进行检测，具有种属特异性。除了猴子，未在其他动物上检测出产物峰。但是这并不影响对一个人类男性基因分型的判读。

在犯罪现场混合检材很常见，尤其是在性犯罪案件中男女混合斑迹，轮奸案中多个男性混合斑迹等检材。混合物研究有助于确定混合物有几个参与者，进而确定犯罪人数，以及确定混合物中主要成分和较少成分的基因分型和成分比例。该体系在混合样本检测中在保持DNA总量1ng情况下男-男混合比例设置为1:3、1:1和3:1时仍能得到两者完整图谱。在混合比例为1:9和9:1时，成分较少唯一等位基因平均检测率在90％以上，在混合比例达到1:19和19:1时，成分较少唯一等位基因平均检测率在60％以上，此外在男-女混合样本比例高达1:1000时，仍能得到男性完整分型结果，反映了本发明分型系统具有优异的区分混合物样本的能力。

一个反应体系的重复性是该系统能正确分型的关键。在本发明中，重复性检测是利用3种不同男性分型标准品和10份男性样本分别在2个实验室用不同的操作人员进行检测，结果一致。这表明，本发明的分型系统重复性好、稳定，利于实验室之间数据的交流。

电泳分型的精确性和准确性对于分型结果的准确性至关重要。本发明分型系统的精确性的验证通过在3130XL遗传分析仪12道毛细管电泳加入Allelic ladder，计算ladder中包括的每一个等位基因的电泳片段长度的平均数与标准差。本发明分型系统的准确性是通过对50个样本上每一个基因座上的等位基因和相应Allelic ladder上的等位基因的片段长度的差值和标准差来检测的。一般来说样本中每个等位基因与其相应的Allelicladder等位基因片段长度的差值在±0.50bp之内，同时电泳多个Allele ladder的等位基因片段的平均标准差在0.15bp以内时，能准确的命名微变异的等位基因，还可排除由于电泳室内温度、缓冲液、POP凝胶和毛细管自身差异以及在同一电泳仪器的不同批次的电泳结果导致的系统误差。

STR扩增过程中，常出现复制滑脱现象。在PCR过程中滑脱倾向于减少一个重复单位。Stutter峰是指在STR分型图谱中，在一个真实等位基因峰前小一个重复单位的位置出现一个信号较弱的峰。一般情况下，Stutter峰高或峰面积不应该超过目标等位基因峰的15％，位置一般出现在目标等位基因峰前小一个重复单位的位置。Stutter峰容易对混合样本的分型结果造成干扰。因此使用Stutter峰的峰高平均值与3倍标准差的和作为评估Stutter峰的阈值(又称滤过系数)来区分Stutter峰和混合样本的峰。

虽然本发明分型系统包含5个快速突变基因座(DYS526a、DYS526b、DYS570、DYS576和DYS626)，通过对大量父子对和家系样本的检测，结果表明本发明分型系统选取的基因座遗传稳定。

检测结果表明：本发明分型系统在法医学上的应用是可行的，本发明分型系统同时与YfilerTM试剂盒进行比对检测，验证共有17个基因座(DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y GATA H4)分型结果一致，证明29个Y-STR复合扩增体系结果准确可信。通过对742例无关个体的法医学参数统计表明，针对所检测的中国人群，本发明的29个Y-STR复合检测体系的遗传多样性从整体上要显著优于YfilerTM试剂盒。

742名男性无关个体经29个Y-STR复合扩增体系检测，共检测到732种单倍型，其中唯一单倍型共有725种。HD值为0.999949，DC值为0.986523。29个Y-STR基因座复合检测体系中基因座GD值小于0.5的基因座仅为3个(DYS438、DYS391和DYS645))。这表明，本发明的29Y-STR检测体系所选取的基因座针对所统计人群具有更好的基因多态性。

为了检测本发明分型系统的基于29个Y-STR基因座来推测单倍群的准确性，742个男性无关个体采用MALDI-TOF质谱联用仪进行单倍群SNP分型。结果显示：与用Yfiler试剂盒中17个Y-STR基因座(预测准确率为89.5％)相比，采用本发明的用29个Y-STR推测单倍群进行预测的准确率更高(96.35％)。

单倍群在地理(亚)区域或种群间具有较强的频率差异，可用于父系生物地理祖先推断的法医应用。因此，调查了6个人群中每个单倍群的频率，除了单倍群O2，大部分在不同人群中具有不同的频率分布。这些结果表明：本发明的29Y STR分型系统具有在单倍群分类和提供生物地理祖先线索方面的潜力，可以有力地协助帮助警方调查。

综上所述，本发明的29个Y-STR基因座复合检测体系(或分型系统)是一种专门针对中国人群而研发的高识别率Y-STR检测系统，与其他方法相比具有更大的兼容性、更高的单倍型多样性。经过以上法医学应用检测评价，本发明分型系统在法医学应用、遗传学研究中有较大的应用潜力并且满足法医学实际应用需求。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种Y染色体短串联重复序列分型试剂盒，其特征在于，所述分型试剂盒含有特异性检测以下组(a)、组(b)和组(c)的Y染色体STR基因座的检测试剂：

组(a)DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a、DYS385b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y-GATA-H4中全部17个Y染色体STR基因座；

组(b)DYS526a、DYS526b、DYS570、DYS576和DYS626中全部5个Y染色体STR基因座；和

组(c)DYS388、DYS460、DYS481、DYS593、DYS596、DYS643和DYS645中全部7个Y染色体STR基因座。

2.如权利要求1所述的分型试剂盒，其特征在于，所述的分型试剂盒还包括：分子量内标。

3.如权利要求1所述的分型试剂盒，其特征在于，在所述分型试剂盒中，所述的用于检测各Y染色体STR基因座的检测试剂被分为3-5个组。

4.如权利要求3所述的分型试剂盒，其特征在于，所述的分组如下：

第一组：DYS392、DYS389I、DYS456、DYS389II、DYS19、DYS460、DYS385；

第二组：DYS437、DYS576、DYS439、Y-GATA-H4、DYS438、DYS391、DYS388、DYS645；

第三组：DYS570、DYS635、DYS481、DYS393、DYS390、DYS448；

第四组：DYS526a、DYS458、DYS593、DYS596、DYS526b、DYS643、DYS626。

5.如权利要求3所述的分型试剂盒，其特征在于，各个组的检测试剂分别采用不同的可检测标记进行标记。

6.如权利要求5所述的分型试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括引物和/或探针。

7.如权利要求5所述的分型试剂盒，其特征在于，所述的可检测标记选自下组：FAM、HEX、TAMRA和ROX。

8.如权利要求5所述的分型试剂盒，其特征在于，第一组、第二组、第三组和第四组分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX作为可检测标记；

其中所述FAM为蓝色可检测标记，HEX为绿色可检测标记，TAMRA为黄色可检测标记，ROX为红色可检测标记。

9.如权利要求1-8中任一项所述的分型试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒为引物，所述的引物的序列选自SEQ ID No.:1-56。

10.一种权利要求1-9中任一项所述的分型试剂盒的用途，其特征在于，用于制备用于法医物证鉴定的试剂盒。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述法医物证鉴定包括：家族搜索、父系生物地理祖先推断、或其组合。

12.一种法医物证鉴定方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供待鉴定DNA样本，

(b)用权利要求1中所述的Y染色体短串联重复序列分型试剂盒或针对相应的Y染色体STR基因座的检测试剂进行检测，从而获得Y染色体STR基因座的检测结果；

(c)基于所述Y染色体STR基因座的检测结果，得出法医物证鉴定结论。

13.如权利要求12所述的法医物证鉴定方法，其特征在于，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

14.如权利要求12所述的法医物证鉴定方法，其特征在于，所述的样本是犯罪现场提取的样本。

15.如权利要求13所述的法医物证鉴定方法，其特征在于，所述的样本是含人体DNA的样本。