CN109136385A - 一种提高个体识别率的y-str基因座的荧光标记检测试剂盒 - Google Patents

一种提高个体识别率的y-str基因座的荧光标记检测试剂盒 Download PDF

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陈拓
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Abstract

本发明公开了一种提高个体识别率的Y‑STR基因座的荧光标记检测试剂盒，包括样本DNA，所述样本DNA包括待扩增的29个基因座，该试剂盒内还包括有引物的混合物。本发明还公开了本发明公开了一种提高个体识别率的Y‑STR基因座的荧光标记检测试剂盒的使用方法，包括将试剂盒内试剂与样品DNA混合，将试剂盒内溶液置于PCR扩增管中进行扩增，并将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测。本发明了采用26个非核心Y‑STR基因座，提高了系统的累积个体识别能力和累积非父排除率，总体上提高了个体的鉴别力，且本试剂盒中的特异性引物，具有较强的扩增特异性和较高的温度耐受性。

Description

一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒。
背景技术
短串联重复序列（简称STR）也称微卫星DNA，一般是由2-6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列。STR广泛存在于原核及真核生物基因组中，根据其包含的核心序列的重复数的不同，这种由串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中的出现频率都非常的低，也就是说，STR基因座具有极高的个体鉴定能力，此外，STR基因座还具有片段小、易扩增、灵敏度高、准确性强、检测快速、信息量大等优点，因此，STR基因座被作为遗传标记广泛地用于国内外人类学、医学遗传学和法医学等相关领域中。
在实践中，可根据STR基因座核心区域的两端保守性序列，进行引物的设计，为了方便在基因座扩增时观察扩增的反应情况，通常会对引物进行荧光标记，随后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法来检测STR遗传标记的多态性。
人类 Y 染色体的遗传多态性具有多个研究优势，如在遗传过程中不与其他染色体发生重组，而突变是多样性改变的唯一因素，使得按年代先后发生的各种稳定的单倍型得以保存和进化，从而能够构建出很清楚的Y染色体基因进化谱系树；Y染色体的序列结构特征能稳定地由父亲传给儿子并为男性所特有，具有父系遗传特点；非重组区域具有较低的群体内多态性和较高的群体间变异，易产生人群特异性的单倍型，从而使得其分布方式具有极高的地理特异性；Y染色体非重组区域发生回复、平行突变的概率非常低，增加了 Y染色体基因谱系树的可靠性；非重组区域突变率相对稳定，能够很好的区分群体间亲缘关系，STR 的突变率高，能够很好区分近代人群个体之间的亲缘关系。
早期的 Y-STR 复合扩增体系中仅包含有12 个左右的 Y-STR基因座，而随着DNA作为鉴定手段的广泛应用、数据比对和Y-STR 父系遗传特性的不断研究，愈来愈多的基因座被需要，以提供更多的信息量，满足各方面的需求，比如在亲子鉴定或失踪人口比对时，为了避免误判的发生，往往需要辅助多种试剂盒进行联合使用，以满足检测的准确性。另外，长期的DNA检测表明，STR基因座的遗传多态性在种族间存在一定的差异性，各个基因座之间的差别也很大。即使是在美国FBI推荐的13个核心基因座中，也有部分基因座遗传多态性不高，或者在不同不同人群间的差异较大，由此给 DNA 检验技术的应用及其效率造成一定影响。甚而，应用于法医学实践的 Y 染色体遗传标记位于 Y 染色体的非重组区，整个非重组区相当于一个遗传标记，因此 Y 染色体遗传标记的个人识别能力和亲权鉴定能力不能像常染色体那样使用相乘原则。所以，为了达到足够的排除概率和个人识别概率，就必须不断的增加新的 Y 染色体遗传标记。所以，为了提高个人鉴别能力，Y-STR 试剂盒就需要增加多个具有高度遗传多态性的新的 Y 染色体遗传标记。为此我们提出一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，该试剂盒能够同时扩增29个基因座，该试剂盒含有的引物混合物如下。
作为本发明的一种改进，该试剂盒内采用聚合酶链式反应，复合扩增29个人类基因座，其扩增产物用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测。
作为本发明的一种改进，所述的各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端用荧光染料标记。
作为本发明的一种改进，所述基因座分为下列四组，第一组：DYS645，Y-GATA-A10，DYS622，DYS552，DYS587，DYS713和DYS446；第二组：DYS531，DYS526a/b，DYS388，DYS557和DYS385a/b；第三组：DYS459a/b，DYS508，DYS617，DYS520，DYS510，DYS522和DYS443；第四组：Y indel，DYS630，DYS626，DYF404S1a/b，DYS596和DYS593。
作为本发明的一种改进，第一组的引物采用FAM标记；第二组的引物采用HEX标记；第三组的引物采用TAMRA标记；第四组的引物采用ROX标记。
作为本发明的一种改进，其适用的样本DNA，包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA(提取检材的来源包括男性的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官)，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。
一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一：将试剂盒内试剂与样品DNA 混合，通过荧光对引物进行标记；
步骤二：将试剂盒内溶液置于PCR 扩增管中，然后放置在放在热循环仪上，进行PCR 扩增，扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 20s；60℃ 1min；28-30个循环；60℃终延伸30min；4-16℃保持；
步骤三：扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用GeneMapper®片段分析软件进行数据的分析。
作为本发明的一种改进，步骤三中的扩增产物用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、能够同时复合扩增29个基因座，包括2个核心的STR基因座DYS385a/b，1个插入缺失基因座Y indel，和26个非核心的STR基因座DYS645，Y-GATA-A10，DYS622，DYS552，DYS587，DYS713，DYS446，DYS531，DYS526a/b，DYS388，DYS557，DYS459a/b，DYS508，DYS617，DYS520，DYS510，DYS522，DYS443，DYS630，DYS626，DYF404S1a/b，DYS596，DYS593；
2、本发明了采用26个非核心Y-STR基因座，提高了系统的累积个体识别能力和累积非父排除率，总体上提高了个体的鉴别力；
3、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex100法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类男性血液或口腔细胞；
4、本试剂盒中的特异性引物，具有较强的扩增特异性和较高的温度耐受性。对狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鼠、兔、鱼和大肠杆菌这十种不同种属物种的DNA进行检测，无扩增峰出现，表明本发明具有良好的种属特异性。
附图说明
图1为本发明试剂盒的基因座位点排布图。
图2为本发明实施例2中，试剂盒29个基因座等位基因分型标准物图。
图3为本发明实施例2中，扩增男性DNA标准品的分型结果。
图4为本发明实施例3中，侄子的Y-STR分型结果。
图5为本发明实施例3中，叔叔的Y-STR分型结果。
图6为本发明实施例4中，犯罪嫌疑人的Y-STR分型结果。
图7为本发明实施例4中，甲家系成员的Y-STR分型结果。
图8为本发明实施例4中，乙家系成员的Y-STR分型结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒包括样本DNA，所述样本DNA包括待扩增的29个基因座，该试剂盒还包括引物的混合物，具体如下表1所示：
表1：各基因座对应引物序列及其在扩增体系中的终浓度。
首先针对上述29个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃，扩增产物的长度范围为77-495bp，并对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形锋利、峰高较高的扩增峰。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。
29个基因座的等位基因范围、核心重复、GenBank登记号以及参考序列的等位基因如下表2所示。
根据上述29个基因座的特点，将上述基因座分为四组，第一组：DYS645，Y-GATA-A10，DYS622，DYS552，DYS587，DYS713和DYS446；第二组：DYS531，DYS526a/b，DYS388，DYS557和DYS385a/b；第三组：DYS459a/b，DYS508，DYS617，DYS520，DYS510，DYS522和DYS443；第四组：Y indel，DYS630，DYS626，DYF404S1a/b，DYS596和DYS593。
每组引物分别用不同的荧光素进行标记，每对引物中只标记一条。第一组：FAM标记(蓝色)；第二组：HEX标记(绿色)；第三组：TAMRA标记(黄色)；第四组：ROX标记(红色)。复合扩增这四组中的29个基因座，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到40%以上。得到的引物混合物可以用于上述29个基因座复合扩增。
扩增采用聚合酶链式反应，反应可在一定的缓冲体系中进行，2.5×的缓冲液组分为：5mM MgCl2, 125mM Tris-HCl (pH8.3,25℃)，125mM KCl，0.5mM dNTPs（四种脱氧核糖核苷酸的等摩尔混合物），1.5mg/mL BSA，1.5%(V/V) Tween 20及1mM 二硫苏糖醇(DTT)。
反应所需的DNA 聚合酶为热启动耐热DNA 聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰。每个扩增体系(25μL) 需要5U 至10U 的耐热DNA 聚合酶。本发明的扩增体系除了引物混合物、反应缓冲液合热启动耐热DNA聚合酶之外，还包括毛细管电泳检测分型的带荧光标记的分子量内标和等位基因阶梯。
本试剂盒适应不同检材的扩增，具有较大的退火温度范围。通过对引物设计及体系优化，实现了快速扩增。扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI2720、Bio-RadT100和博日Life Pro等) 采用以下的程序可以得到较好的结果：95℃预变性3分钟；94℃变性20秒钟，60℃退火延伸1分钟，28-30个循环；60℃终延伸30分钟；4-16℃保温。
本发明中的模板DNA为人类男性基因组DNA。通过各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法和Chelex100纯化等方法提取的DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)和汗液等。DNA 模板量优选在0.5ng 至2ng 的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致检测时荧光信号超出检测范围，但可通过减少PCR循环数解决。
在上述反应缓冲体系中按照特定的PCR程序扩增模板DNA，可以得到混合的各基因座扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物进行扩增，使得扩增产物也带有荧光标记物，并且可以在激光激发下发出能够被遗传分析仪(如ABI3100、3130、3730和3500) 识别的光信号，通过引物设计和不同荧光素的标记，各基因座扩增片段具有不同长度和不同的荧光标记，所以扩增产物可以在遗传分析仪上电泳分离后进行检测分析。
在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时，首先将扩增产物、分子量内标(Orang-500 , 克劳宁（北京）生物科技有限公司)和甲酰胺（美国life technology）按照一定的比例混合，随后混合物进入仪器毛细管或凝胶中进行电泳分离。分子量内标是由多条带有荧光标记的已知长度的DNA 片段组成，可用来衡量PCR 扩增产物片段长度，从而计算等位基因的大小，与等位基因阶梯进行比对可推测等位基因分型。
电泳后的数据可以在GeneMapper、PeakScanner和GeneScan等数据分析软件上进行分析，从而得到Y-STR 基因分型的图谱和数据。
实施例1. Y-STR复合扩增试剂的制备
1、Y-STR复合扩增系统位点的排布
本发明的Y-STR试剂盒，包含了包括2个核心STR基因座:DYS385a/b，1个插入缺失基因座Y indel，和26个非核心STR基因座DYS645，Y-GATA-A10，DYS622，DYS552，DYS587，DYS713，DYS446，DYS531，DYS526a/b，DYS388，DYS557，DYS459a/b，DYS508，DYS617，DYS520，DYS510，DYS522，DYS443，DYS630，DYS626，DYF404S1a/b，DYS596，DYS593。
上述STR位点的排布方式如附图1所示。
2、Y-STR复合扩增体系专用引物
根据上述位点设计复合扩增引物、引物序列、引物浓度及荧光素标记方式如表1所示。
3、Y-STR荧光复合扩增验证系统的制备
用于大规模样本排查的DNA验证试剂即为PCR扩增体系，具体如下，下面的终浓度为在扩增体系中的终浓度。
5×Primers为表1所示的50条引物按照表2所示的浓度进行混匀。
每25μL的PCR扩增体系如下：
下表为2.5×PCR Mix的组分：
PCR扩增体系即为用于Y染色体STR位点的检验试剂。
因此，DNA检测试剂由具有表2所示终浓度的引物、2.5×PCR Mix 、DNA聚合酶、男性DNA标准品和去离子超纯水组成。
实例2. Y-STR复合扩增验证试剂的应用
1、样本扩增
将24μL由实例1制备的DNA检验试剂加入1μL的0.5ng/μL男性DNA标准品，进行PCR扩增。
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃ 20s、60℃ 1min，28-30个循环；60℃终延伸30min；4-16℃保持。
2、PCR产物的检测
扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3100遗传分析仪进行电泳和检测。
1)、取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数) 配成混合液混匀后分装，每管10μL
2)、再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(ladder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使DNA完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中。
3)、设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测大约40 分钟后，电泳结束。随后，用GeneMapper软件进行数据分析，其检测结果如附图3所示，上述男性DNA标准品得到完整的STR分型，并且峰型尖锐清晰，平衡性好，无Pull-up峰，无stutter带，无非特异性人工产物出现。
实例3. 本发明所提供的试剂盒在亲子鉴定中的应用
用本发明所提供的试剂盒用于叔-侄关系的亲子鉴定。
1、收集亲子鉴定案件中的血斑：亲子鉴定样本由宿迁子渊司法鉴定中心提供。
2、各种检材的基因组DNA提取：参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、扩增检测：按照实施例1-2进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测，侄子的分型结果见附图4，叔叔的分型结果见附图5，其结果见下表：
结果显示：叔-侄29个基因座的检测结果完全一致，说明他们属于同一个男性家族。但是由于Y染色体检测的特殊性，并不能确定他们之间叔侄关系，需要进一步对常染色体，甚至更多家庭成员进行检测。所以，本发明提供的试剂盒在亲子鉴定中可作为常染色体鉴定结果的补充与佐证。
实例4. 本发明所提供试剂盒在司法鉴定中的应用
本发明所提供试剂盒的一个重要应用就是对男性犯罪嫌疑人样本进行检测，且用常染色体比对未找到匹配结果时，结合案情情况可以选择Y-STR排除。
1、使用本发明提供了一种能够同时检测1个插入缺失和28个Y-STR基因座的试剂盒进行检测男性犯罪嫌疑人样本。
对某市公安局家系排查案件的应用，犯罪嫌疑人S1及来自两个家系的成员(S2,S3)的样本，均为血滤纸样本。用1.2mm打孔器取一片血滤纸，加到反应体系中。按照实施例1-2进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测，最后获得实际样品的基因分型数据，分型结果见附图6、图7、图 8，分型结果对比见下表：
2、使用AB公司的Y-filer试剂盒进行检测
用Y-filer试剂盒检测时，嫌疑人与S2个体只有一个基因座有差异，即DYS391上有一个差异。与样本S3有两个基因座有差异，即DYS456和DYS458。
根据目前的国际惯例，必须有两种以上独立的遗传标记同时排除才能否定有血缘关系。德国亲子鉴定专家证人协会认为Y-STR与常染色体STR的判断标准应该相同，即要3个以上的基因座不同才能排除亲权。由上述家系排查原则，用Y-filer试剂盒检测时不能排除嫌疑人是这两个家系是同个家系的可能；而用本发明所提供试剂盒，差异的基因座分别增加了4个和7个。加上Yfiler检测出的突变，嫌疑人s1与s2之间有5个突变，与s3之间存在9个突变，可以排除嫌疑人属于这两个家系的可能。这样也就显现了本发明提供试剂盒中由于增加了被检基因座，提高了整体的识别率和排除率，避免了时间和金钱的浪费，为案情下步的侦破提供方向。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒能够同时扩增29个基因座，该试剂盒含有的引物混合物如下。
2.根据权利要求1所述的一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒内采用聚合酶链式反应，复合扩增29个人类基因座，其扩增产物用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测。
3.根据权利要求1所述的一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：所述的各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端用荧光染料标记。
4.根据权利要求1所述的一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：所述基因座分为下列四组，第一组：DYS645，Y-GATA-A10，DYS622，DYS552，DYS587，DYS713和DYS446；第二组：DYS531，DYS526a/b，DYS388，DYS557和DYS385a/b；第三组：DYS459a/b，DYS508，DYS617，DYS520，DYS510，DYS522和DYS443；第四组：Y indel，DYS630，DYS626，DYF404S1a/b，DYS596和DYS593。
5.根据权利要求4所述的一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：第一组的引物采用FAM标记；第二组的引物采用HEX标记；第三组的引物采用TAMRA标记；第四组的引物采用ROX标记。
6.根据权利要求1所述的一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：其适用的样本DNA，包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA(提取检材的来源包括男性的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官)，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。
7.根据权利要求1-6中任意一条所述的一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将试剂盒内试剂与样品DNA 混合，通过荧光对引物进行标记；
步骤二：将试剂盒内溶液置于PCR 扩增管中，然后放置在放在热循环仪上，进行PCR 扩增，扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 20s；60℃ 1min；28-30个循环；60℃终延伸30min；4-16℃保持；
步骤三：扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用GeneMapper®片段分析软件进行数据的分析。
8.根据权利要求7所述的一种提高个体识别率的Y-STR基因座的荧光标记检测试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤三中的扩增产物用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测。
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