CN113789375A - 一种基于硅基微流片的cyp2c19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法，主要是对突变型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17进行鉴定。该检测试剂包括Tris盐、MgCl2、KCl、海藻糖、Tween20、Triton100、DTT和BSA；该检测试剂的pH值为8.9‑9.2。本发明提供了匹配硅基微流片的taqman荧光定量PCR检测试剂，以较高浓度的Tris和较高pH值及较高浓度的Mg2+为特点；且反应体系中酶浓度相对较高，每个反应体系较现有反应体系更小，更加节省试剂，降低试剂成本。基于该检测试剂和反应体系，本发明提供的检测检测时间可以在20‑30分钟范围内，大幅地提高了CYP2C19的检测效率，检测耗时为现有CYP2C19认证试剂盒检测耗时的30‑50％，且检测成本较现有普通的CYP2C19基因分型检测无显著增加。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法。
背景技术
CYP2C19参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢者(poor metabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285，c.681G＞A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G＞A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因，其中，CYP2C19*2导致剪接缺失，CYP2C19*3为终止密码子突变。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型；PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中75～85％的PM由CYP2C19*2所致，约20～25％的PM由CYP2C19*3所致。CYP2C19*17是CYP2C19超快代谢类型的主要基因型(rs12248560)，CYP2C19的超快代谢类型可能导致氯吡格雷使用者出血风险增加。上述通过CYP2C19代谢的药物随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。因此根据检测CYP2C19基因型的多态性来选择用药策略有重要的临床意义。
目前市场上市的CYP2C19基因分型检测试剂盒，主要基于荧光探针法在荧光定量PCR仪上进行基因分型，检测试剂主要含3个SNP位点的qPCR反应混合液和相应DNA聚合酶液，通常检测时间约在50-70分钟之间，未发现已经上市的显著更加快速的CYP2C19基因分型检测试剂盒。
CYP2C19基因分型检测试剂盒目前主要使用目前常见的qPCR反应采用荧光法进行检测，耗材主要使用目前的96孔板或8连管的方式进行检测。其芯片主要为PMMA、PDMA或聚乙烯材质，主要优势是材质成本较低，但是这些芯片在qPCR反应过程中的升降温速度较慢，是限制检测效率的主要问题之一，qPCR检测的耗时通常比较长。选用廉价方便加工的材质是提高PCR检测效率的重要措施之一。硅基材料升降温速度非常快，单晶硅基材料导热系数可以达到149W/mK，远远高于有机材料的导热系数，其材质决定了使用硅基材料作为qPCR反应容器，升降温速度可以达到15-20摄氏度/秒，结合快速的反应试剂，可以极大的提高qPCR的检测效率，通常的检测可以在20-30min中完成。
基于硅基微流片方式的qPCR试剂目前很少，硅基微流片反应腔体为固定体积的小型体系，在其中进行qPCR反应，具有小型体系反应的特点，常见的反应试剂并不匹配该小型反应体系。小型体系检测容易受到样本质量的影响，通常需要较高强度的缓冲体系及较高浓度的DNA聚合酶，保持小型体系的检测效率；所以反应效率较低的PCR试剂可能无法适配硅基微流片中反应的需求。通常现有的qPCR反应试剂无法很好的匹配硅基微流片中的小型体系的检测。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法，主要是对突变型等位基因CYP2C19*2(rs4244285，c.681G＞A)、CYP2C19*3(rs4986893，c.636G＞A)和CYP2C19*17(rs12248560)进行鉴定。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂，作为qPCR反应的缓冲液，包括Tris盐、MgCl2、KCl、海藻糖、Tween 20、Triton 100、DTT和BSA；该检测试剂的pH值为8.9-9.2。
进一步地，上述检测试剂包括如下终浓度的组分：500-750mM Tris盐、20-40mMMgCl2、500mM KCl、30-40％(m/v)海藻糖、0.1％(v/v)Tween 20、0.2％(v/v)Triton 100、25-50mmol/L DTT和10mg/ml BSA。
进一步地，上述检测试剂的pH值是通过浓盐酸进行调整的。
进一步地，上述检测试剂包括如下终浓度的组分：750mM Tris盐、40mM MgCl2、500mM KCl、40％(m/v)海藻糖、0.1％(v/v)Tween 20、0.2％(v/v)Triton 100、25mmol/LDTT和10mg/ml BSA；该检测试剂的pH值为8.9。
进一步地，上述检测试剂的配制方法包括如下步骤：
步骤一，称取相应重量的KCl、Tris盐、MgCl2加入到DEPC水中溶解，完全溶解后加入加浓盐酸调整到预期pH值；
步骤二，上述溶液中添加相应质量的海藻糖，适当加热搅拌待完全溶解，适当添加DEPC水；
步骤三，待室温后，添加DTT和BSA完全溶解；然后加入相应体积的Tween20和Triton100，充分搅拌混匀；
步骤四，定容，充分搅拌均匀，然后无菌过滤，-20℃保存备用。
本发明的第二方面是提供含有上述检测试剂的基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的试剂盒，主要针对突变型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17进行鉴定。
进一步地，上述试剂盒还包括引物探针组合物、dNTP、DNA聚合酶、ddH2O和硅基微流片。
进一步地，上述引物探针组合物包括序列如SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：7～8和SEQ ID NO：11～12的引物以及选自SEQ ID NO：1～2中的一条探针、选自SEQ ID NO：5～6中的一条探针、SEQ ID NO：9～10中的一条探针。
进一步地，上述探针标记有荧光基团和淬灭基团；该荧光基团选自FAM和VIC中的一种，淬灭基团为MGB。
本发明的第三方面是提供采用上述试剂盒的基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的方法，该方法是基于硅基微流片采用荧光定量PCR技术；该方法包括如下步骤：
步骤一，将qPCR反应体系混合均匀后，使用移液器将qPCR反应液添加到8通道硅基微流片的卡槽中，密封完成，将卡槽置于SPCR超快检测平台；
步骤二，设置荧光定量PCR仪PCR扩增程序，进行检测。
进一步地，上述qPCR反应体系的总体积为10μL，包括如下组分：上述检测试剂1.0μL(缓冲液，含BSA和Mg2+)，引物探针组合物0.2μL，dNTP 0.2μL，DNA聚合酶0.2μL～0.4μL，待测DNA样本2.0μL，余量为水。
进一步地，引物探针组合物中各引物和探针的浓度均为10mM，dNTP的浓度为10mM，DNA聚合酶的浓度为2.5U/μL，待测DNA样本的浓度为0.5-100ng/μL。
进一步地，上述PCR扩增程序为95℃2min；95℃5sec，60℃15sec，40个循环。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供了匹配硅基微流片的taqman荧光定量PCR检测试剂，以较高浓度的Tris和较高pH值(8.9-9.2)及较高浓度的Mg2+(4mM)为特点；且反应体系中酶浓度(1U/10μL反应体系)相对较高，每个反应体系仅0.8-3.6μL，较现有反应体系更小，更加节省试剂，降低试剂成本。其次，耗材硅基微流片及其附件成本与现有qPCR反应管或板成本相近。基于该检测试剂和反应体系，本发明提供的CYP2C19基因分型的方法的检测时间可以在20-30分钟范围内，大幅地提高了CYP2C19的检测效率，检测耗时为现有CYP2C19认证试剂盒检测耗时的30-50％，且检测成本较现有普通的CYP2C19基因分型检测无显著增加。
附图说明
图1是本发明一实施例中rs4244285位点基因分型实时扩增检测结果；其中，“A”表示采用本发明的探针获得的扩增曲线，“B”表示采用现有商业探针获得的扩增曲线；图1a显示了编号为1270128、1270130、1270150、1300074、1300158、1300182的血液样本(分别对应图中编号1-6)rs4244285位点基因分型实时扩增检测结果；图1b显示了编号为1300200、1300201、1300202、1300203和1300160的血液样本以及空白对照H2O(分别对应图中编号7-12)rs4244285位点基因分型实时扩增检测结果；
图2是本发明一实施例中rs12248560位点基因分型实时扩增检测结果；其中，“A”表示采用本发明的探针获得的扩增曲线，“B”表示采用现有商业探针获得的扩增曲线；图1a显示了编号为1270128、1270130、1270150、1300074、1300158、1300182的血液样本(分别对应图中编号1-6)rs12248560位点基因分型实时扩增检测结果；图1b显示了编号为1300200、1300201、1300202、1300203和1300160的血液样本以及空白对照H2O(分别对应图中编号7-12)rs12248560位点基因分型实时扩增检测结果；
图3是本发明一实施例中rs4986893位点基因分型实时扩增检测结果；其中，“A”表示采用本发明的探针获得的扩增曲线，“B”表示采用现有商业探针获得的扩增曲线；图1a显示了编号为1270128、1270130、1270150、1300074、1300158、1300182的血液样本(分别对应图中编号1-6)rs4986893位点基因分型实时扩增检测结果；图1b显示了编号为1300200、1300201、1300202、1300203和1300160的血液样本以及空白对照H2O(分别对应图中编号7-12)rs4986893位点基因分型实时扩增检测结果；
图4是本发明一实施例中rs4244285引物探针灵敏度检测实时扩增曲线；其中，图A-C分别代表针对样本202111、202112和202113的实时扩增曲线(FAM荧光)；图D-F分别代表针对样本202111、202112和202113的实时扩增曲线(VIC荧光)；
图5是本发明一实施例中rs4986893引物探针灵敏度检测实时扩增曲线；其中，图A-C分别代表针对样本202111、202112和202113的实时扩增曲线(FAM荧光)；图D-F分别代表针对样本202111、202112和202113的实时扩增曲线(VIC荧光)；
图6是本发明一实施例中rs12248560引物探针灵敏度检测实时扩增曲线；其中，图A-C分别代表针对样本202111、202112和202113的实时扩增曲线(FAM荧光)；图D-F分别代表针对样本202111、202112和202113的实时扩增曲线(VIC荧光)。
具体实施方式
CYP2C19基因是众多药物的代谢酶，参与氯吡格雷、质子泵抑制剂、抗抑郁药物等很多药物的代谢。CYP2C19基因在个体间基因型存在显著差异，导致其编码的代谢酶活性存在显著差异，存在超快代谢类型、快代谢类型、中等代谢类型和慢代谢类型。分析CYP2C19基因的基因型可以预测上述药物的治疗效果及用药剂量，规避治疗效果较差或产生不良反应的风险。
基于上述，本发明提供了CYP2C19基因分型试剂，结合硅基微流片特定耗材，以taqman方法使用荧光定量PCR仪进行超快速的扩增分型定性检测。
本发明的第一方面是提供一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂，作为qPCR反应的缓冲液，包括Tris盐、MgCl2、KC1、海藻糖、Tween 20、Triton 100、DTT和BSA；该检测试剂的pH值为8.9-9.2。
在本发明一优选的实施方式中，上述检测试剂包括如下终浓度的组分：500-750mMTris盐、20-40mM MgCl2、500mM KCl、30-40％(m/v)海藻糖、0.1％(v/v)Tween 20、0.2％(v/v)Triton 100、25-50mmol/L DTT和10mg/ml BSA。以体积为100ml为例，该检测试剂的组成和各个组分的称量质量或体积如下表1：
表1 10×qPCR缓冲液成分(100ml)
| 原材料名称 | 10×buffer总浓度/总量 | 所需称量的重量，/体积(100m1) |
| Tris盐 | 500-750mM | 6.060-9.092g |
| MgCl<sub>2</sub> | 20-40mM | 0.190-0.381g |
| KCl | 500mM | 3.725g |
| 海藻糖 | 30-40％(m/v) | 30g-40g |
| Tween20 | 0.1％(v/v) | 100uL |
| Triton100 | 0.2％(v/v) | 200μL |
| DTT | 25-50mmol/L | 0.338-0.771g |
| BSA | 10mg/ml | 1.000g |
| pH值 | / | 8.90-9.20 |
| DEPC dH<sub>2</sub>O | / | ／ |
在本发明一优选的实施方式中，上述检测试剂的pH值是通过浓盐酸进行调整的。
在本发明一优选的实施方式中，上述检测试剂包括如下终浓度的组分：750mMTris盐、40mM MgCl2、500mM KCl、40％(m/v)海藻糖、0.1％(v/v)Tween 20、0.2％(v/v)Triton 100、25mmol/L DTT和10mg/ml BSA；该检测试剂的pH值为8.9。
在本发明一优选的实施方式中，上述检测试剂的配制方法包括如下步骤：
步骤一，称取相应重量的KCl、Tris盐、MgCl2加入到DEPC水中溶解，完全溶解后加入加浓盐酸调整到预期PH值；
步骤二，上述溶液中添加相应质量的海藻糖，适当加热搅拌待完全溶解，适当添加DEPC水；
步骤三，待室温后，添加DTT和BSA完全溶解；然后加入相应体积的Tween20和Triton100，充分搅拌混匀；
步骤四，定容，充分搅拌均匀，然后无菌过滤，-20℃保存备用。
本发明的第二方面是提供含有上述检测试剂的基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的试剂盒。
在本发明一优选的实施方式中，上述试剂盒还包括引物探针组合物、dNTP、DNA聚合酶、ddH2O和硅基微流片。
在本发明一优选的实施方式中，上述引物探针组合物包括序列如SEQ ID NO：3～4、SEQ D NO：7～8和SEQ D NO：11～12的引物以及选自SEQ D NO：1～2中的一条探针、选自SEQ ID NO：5～6中的一条探针、SEQ ID NO：9～10中的一条探针。
在本发明一优选的实施方式中，上述探针标记有荧光基团和淬灭基团；该荧光基团选自FAM和VIC中的一种，淬灭基团为MGB。
本发明的第三方面是提供采用上述试剂盒的基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的方法，该方法是基于硅基微流片采用荧光定量PCR技术；该方法包括如下步骤：
步骤一，将qPCR反应体系混合均匀后，使用移液器将qPCR反应液添加到8通道硅基微流片的卡槽中，密封完成，将卡槽置于SPCR超快检测平台；
步骤二，设置荧光定量PCR仪PCR扩增程序，进行检测。
在本发明一优选的实施方式中，上述qPCR反应体系的总体积为10μL，包括如下组分：上述检测试剂1.0μL(缓冲液)，引物探针组合物0.2μL，dNTP 0.2μL，DNA聚合酶0.2μL～0.4μL，待测DNA样本2.0μL，余量为水。
在本发明一优选的实施方式中，引物探针组合物中各引物和探针的浓度均为10mM，dNTP的浓度为10mM，DNA聚合酶的浓度为2.5U/μL，待测DNA样本的浓度为5ng/μL。
在本发明一优选的实施方式中，上述PCR扩增程序为95℃2min；95℃5sec，60℃15sec，40个循环。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以便更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供两种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂，即10×qPCR缓冲液体系(BUF40-860和BUF40-890)，这两种缓冲体系(以总体积为25ml为例)的组成如下表2。
表2两种10×反应缓冲液(BUF40-860和BUF40-890)的配方
基于上述缓冲体系，本实施例还提供了基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的qPCR反应体系，具体如下表3。
表3针对CYP2C19基因三个位点分型的两种qPCR反应体系
实施例2
本实施例提供一种采用上述qPCR反应体系的基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的方法，具体的材料和操作步骤如下：
1.该方法采用的硅基微流片为联合基因生物科技(上海)有限公司开发研制的硅基微流片，单片共8个反应通道，匹配有方便加入PCR反应液的硅基微流片卡槽装置。每张芯片检测2个样本。
2.该方法采用的引物探针组合如下表4(由通用生物有限公司合成(滁州))。
表4CYP2C19基因3个多态性位点的引物和探针组合
3.具体的操作步骤如下：
(1)将qPCR反应体系混合均匀后，使用移液器将PCR反应液添加到8通道硅基微流片的卡槽中，密封完成，将卡槽置于SPCR超快检测平台中。
(2)设置荧光定量PCR仪(自研SPCR超快检测平台)PCR扩增程序：
基于上述流程，PCR实际检测时长约20min。
验证实施例1
本实施例采用实施例2的方法，比较实施例1中的两种反应体系的扩增效果，具体的操作步骤和结果如下：
选择2021年上海临检中心氯吡格雷代谢基因检测室间质评样本2121、2122、2123、2124和2125(质粒样本5ng/μL，稀释1000倍后使用)；选择编号为1300203和1300160的血液样本(来自上海联吉医学检验所)经过医麦赛自动核酸抽提仪抽提的DNA样本(OD260/OD280值在1.65-1.92之间)，进行CYP2C19的三个多态性位点的基因分型测试，qPCR检测结果Ct值比较如下表5。
表5两种反应体系的qPCR检测结果Ct值比较
由上述结果可知：
(1)基于两种缓冲体系的反应液体系检测Ct值的差异(去除结果为Undertermined的配对数据以后)，以两组Ct值进行Paired-sample T-test，SPSS11.5t检验结果显示，两组差异显著(t＝9.678；p＜0.001)。
(2)基于两种缓冲体系的反应液体系检测Ct值的差异值CT(BUF40-890)-CT(BUF40-860)，Ct值差异平均值为-3.612；显示BUF40-890的检测体系扩增效果显著优于BUF40-860的检测体系。BUF40-890和BUF40-860的反应体系差异如下表6：
表6BUF40-890和BUF40-860的反应体系差异
| 差异项目 | BUF40-860(数值) | BUF40-890(数值) |
| Tris浓度 | 50mM | 75mM |
| Mg<sup>2+</sup>浓度 | 2.0mM | 4.0mM |
| 缓冲液pH值 | 8.60 | 8.90 |
| 酶量 | 1U/20μL | 2U/20μL |
验证实施例2
本实施例验证实施例2提供的方法(BUF40-890反应体系)的准确性，具体的操作步骤和结果如下：
选择编号为1270128、1270130、1270150、1300074、1300158、1300182、1300200、1300201、1300202、1300203和1300160的血液样本(来自上海联吉医学检验所)经过医麦赛自动核酸抽提仪抽提的DNA样本(OD260/OD280值在1.65-1.92之间)，采用实施例2提供的方法进行CYP2C19的三个多态性位点的基因分型测试，同时将探针替换为赛默飞(ABI)商业探针作为对照，验证检测结果的一致性。针对CYP2C19三个SNP位点基因型(rs4244285、rs12248560和rs4986893)，本发明和商业探针的判定类型如下表7。
表7本发明探针和商业探针的判定类型
注：1300074样本商业探针检测结果为AG，因实际试验中因误操作加入两个样本(1300074和2030073)所导致。
如图1-3可知，实施例2提供的方法在待测样本中的检测结果是一致的。
验证实施例3
本实施例以已知浓度的时间质评样本评价实施例2提供的方法(BUF40-890反应体系)对于可检DNA样本浓度的测试，验证引物和探针组合物的灵敏度，具体的实验方法和结果如下：
选择编号为202111、202112和202113DNA样本(来自国家卫生健康委临床检验中心的2021年4月室间质评样本，50ng/μL)，进行CYP2C19的三个多态性位点的基因分型的样本浓度检测限(灵敏度)测试。
上述样本原始样本经TE8.0溶液稀释，设置10ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL共4个浓度梯度，进行测试，测试结果如下。
①rs4244285样本浓度检测限测试结果如图4，Ct值见下表8：
表8rs4244285引物探针灵敏度测试Ct值
3个样本的浓度梯度灵敏度测试结果显示，rs4244285位点使用本发明的方法可以适用的待检测样本DNA浓度达到0.2ng/20μL反应体系，即待检测样本DNA浓度达到0.2ng/20μL可以清晰检出结果，具有良好的样本宽容度。
②rs4986893样本浓度检测限测试结果如图5，Ct值见下表9：
表9rs4986893引物探针灵敏度测试Ct值
| 样本名称 | 荧光基团 | CT值 | 荧光基团 | CT值 |
| 202111(10ng/μL) | FAM | 31.08684 | VIC | 31.08458 |
| 202111(1ng/μL) | FAM | 34.41956 | VIC | 33.474 |
| 202111(0.5ng/μL) | FAM | 35.71138 | VIC | 34.73161 |
| 202111(0.1ng/μL) | FAM | 37.53257 | VIC | 37.25965 |
| 202112(10ng/μL) | FAM | 29.94586 | VIC | Undetermined |
| 202112(1ng/μL) | FAM | 33.16383 | VIC | Undetermined |
| 202112(0.5ng/μL) | FAM | 34.72245 | VIC | Undetermined |
| 202112(0.1ng/μL) | FAM | 37.04739 | VIC | Undetermined |
| 202113(10ng/μL) | FAM | 29.94506 | VIC | Undetermined |
| 202113(1ng/μL) | FAM | 33.34328 | VIC | Undetermined |
| 202113(0.5ng/μL) | FAM | 35.10897 | VIC | Undetermined |
| 202113(0.1ng/μL) | FAM | 36.97233 | VIC | Undetermined |
3个样本的浓度梯度灵敏度测试结果显示，rs4986893位点使用本发明的方法可以适用的待检测样本DNA浓度达到0.2ng/20μL反应体系，即待检测样本DNA浓度达到0.2ng/20μL可以清晰检出结果，具有良好的样本宽容度。
③rs12248560样本浓度检测限测试结果如图6，Ct值见下表10：
表10rs12248560引物探针灵敏度测试Ct值
3个样本的浓度梯度灵敏度测试结果显示，rs12248560位点使用本发明的方法可以适用的待检测样本DNA浓度达到0.2ng/20μL反应体系，即待检测样本DNA浓度达到0.2ng/20μL可以清晰检出结果，具有良好的样本宽容度。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 联合基因生物科技（上海）有限公司
<120> 一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> rs12248560-zyFAM（人工序列）
<400> 1
atcagagata ctttgagaac 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> rs12248560-zyVIC（人工序列）
<400> 2
atcagagatg ctttgagaa 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> rs12248560-zyF（人工序列）
<400> 3
ctgataccca tcgtggcg 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> rs12248560-zyR（人工序列）
<400> 4
actaaggttt ggaagttgtt ttgt 24
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> rs4986893-FAMTaq（人工序列）
<400> 5
accccctgga tcca 14
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> rs4986893-VICTaq（人工序列）
<400> 6
ccccctgaat cca 13
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> rs4986893-zyF（人工序列）
<400> 7
attgaatgaa aacatcagga ttgta 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> rs4986893-zyR（人工序列）
<400> 8
atacagaatt ttggatttcc cag 23
<210> 9
<211> 11
<212> DNA
<213> rs4244285-FAMTaq（人工序列）
<400> 9
cccgggaacc c 11
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> rs4244285-VICTaq（人工序列）
<400> 10
tcccaggaac cc 12
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> rs4244285taq-F（人工序列）
<400> 11
atgcaataat tttcccacta tcat 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> rs4244285taq-R（人工序列）
<400> 12
tatcactttc cataaaagca aggt 24
Claims (10)
1.一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂，作为qPCR反应的缓冲液，其特征在于，包括Tris盐、MgCl2、KCl、海藻糖、Tween 20、Triton 100、DTT和BSA；所述检测试剂的pH值为8.9-9.2。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，包括如下终浓度的组分：500-750mMTris盐、20-40mM MgCl2、500mM KCl、30-40％(m/v)海藻糖、0.1％(v/v)Tween 20、0.2％(v/v)Triton 100、25-50mmol/L DTT和10mg/ml BSA。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的pH值是通过浓盐酸进行调整的。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的配制方法包括如下步骤：
步骤一，称取相应重量的KCl、Tris盐、MgCl2加入到DEPC水中溶解，完全溶解后加入加浓盐酸调整到预期pH值；
步骤二，向得到的溶液中添加相应质量的海藻糖，适当加热搅拌待完全溶解，适当添加DEPC水；
步骤三，待冷却至室温后，添加DTT和BSA完全溶解；然后加入相应体积的Tween20和Triton100，充分搅拌混匀；
步骤四，定容，充分搅拌均匀，然后无菌过滤，-20℃保存备用。
5.一种含有如权利要求1-4任一项所述的检测试剂的基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的试剂盒，其特征在于，主要针对突变型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17进行鉴定。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括引物探针组合物、模板DNA、dNTP、DNA聚合酶、ddH2O和硅基微流片。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，引物探针组合物包括序列如SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：7～8和SEQ ID NO：11～12的引物以及选自SEQ ID NO：1～2中的一条探针、选自SEQ ID NO：5～6中的一条探针、SEQ ID NO：9～10中的一条探针；优选地，所述探针标记有荧光基团和淬灭基团；所述荧光基团选自FAM和VIC中的一种，所述淬灭基团为MGB。
8.一种采用如权利要求5-7任一项所述试剂盒的基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的方法，其特征在于，所述方法是基于硅基微流片采用荧光定量PCR技术；所述方法包括如下步骤：
步骤一，将qPCR反应体系混合均匀后，使用移液器将qPCR反应液添加到8通道硅基微流片的卡槽中，密封完成，将卡槽置于SPCR超快检测平台；
步骤二，设置荧光定量PCR仪PCR扩增程序，进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述qPCR反应体系的总体积为10μL，包括如下组分：所述检测试剂1.0μL，引物探针组合物0.2μL，dNTP 0.2μL，DNA聚合酶0.2μL～0.4μL，待测DNA样本2.0μL，余量为水；优选地，所述引物探针组合物中各引物和探针的浓度均为10mM，dNTP的浓度为10mM，DNA聚合酶的浓度为2.5U/μL，待测DNA样本的浓度为0.5-100ng/μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为95℃2min；95℃5sec，60℃15sec，40个循环。
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