CN102242188A - 可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断检测核心试剂 - Google Patents
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Abstract
一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，包括反应缓冲液、三磷酸脱氧核糖核酸(DNTP)、耐热DNA聚合酶、甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)、吐温-20，其特征在于：所述的核心试剂中还掺入了适量的多糖和双糖；并且所述试剂中的反应缓冲液由5mM-50mM的Tris-HCL、20mM-500mM的KCL、1.0mM-5mM的MgCl2、20mM-200mM的(NH4)2SO4组成；同时掺入的三磷酸脱氧核糖核酸为50uM-300uM、耐热DNA聚合酶为0.01U/ul-0.2U/ul、多糖为1mM-15mM双糖为2M-100M、甘油为3％-30％、牛血清蛋白为10-300ug/ml、二硫苏糖醇为0.5-10mM、吐温-20为0.005-0.05v/v。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因诊断检测试剂，尤其是一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断检测核心试剂，属于基因诊断检测技术。
背景技术
PCR技术，即聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年(1993年获诺贝尔化学奖)建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
基本的PCR须具备以下条件：
1.要被复制的DNA模板(Template)
2.界定复制范围两端的引物(Primers).
3.耐热DNA聚合酶(Taq.Polymearse，pfu DNA Polymearse，taq plus DNApolymerase，fast taq DNA polymerase，等)
4.合成的原料及水。
PCR的反应包括三个主要步骤，分别是：
1).Denaturation
2).Annealing of primers，and
3).Extension of primers。
所谓Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板.而Annealing则是令Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-polymerase)的作用下进行引物的延长(Extension of primers)及另一股的合成。
荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称RealTime PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前 确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即(Real-time RT-PCR)是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入(RT-PCR)的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA(RNA)起始量存在相关性，从而实现定量检测。RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
基因诊断
人类的绝大多数疾病都与基因有关，基因变异引起疾病两种类型：
1)内源基因变异：由于先天遗传和后天内外环境因素的影响，人类的基因结构及表达的各个环节都可发生异常，从而导致疾病。分基因结构突变和表达异常。
2)外源基因的入侵：各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖引起各种疾病。基因改变引起各种表型改变，从而引起疾病，从基因水平探测分析病因和疾病的发病机制，并采用针对性的手段矫正疾病是近年基础和临床的方向。
2.基因诊断：利用现代生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。
二、基因诊断的特点：
1.以基因做检查材料和检查目标针对性强；
2.分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强；
3.分子杂交和PCR具有放大效应，故有较大的灵敏度；
4.适用性强，诊断范围广。
技术问题
在基因诊断试剂盒中，主要采用Real time PCR和PCR方法，在这两种方法中，由于其核心试剂(耐热DNA聚合酶，dNTP，反应buffer，引物，SYBR染料，Taqman Probe等)的局限性，导致一系列的问题。
1、由于生物试剂的不稳定性，需低温运输，增加产品成本和能源浪费。在现有的基因诊断试剂盒中，由于其核心所使用的耐热DNA聚合酶，dNTP，引物等试剂在常温下容易失活容易失活而失去扩增能力，导致产品失去检测能力。而且，所有产品必须进行低温运输和低温储存，造成了产品成本上升和能源浪费。
2、由于在诊断试剂中，大部分样品来源于血液、体液、表皮、腹水等。所要检测的基因含量并不是很丰富，其它离子和干扰物质比较多；对于这样的样品，耐热DNA聚合酶对样品的纯度耐受有限，使PCR实验不能够被有效的扩增。导致一些样本的基因不能够被检测到，导致假阴性结果的出现，使基因诊断造成一定的误判。
3、在现有的诊断试剂中，都已经将耐热DNA聚合酶、Dntp、反应缓冲液、引物(探针)进行了预先的混合，以方便检验人员使用。但在混合好的混合试剂中，由于耐热DNA聚合酶能够释放部分的活性，并且在PCR试验的升温过程中，耐热DNA聚合酶也能够释放一定的活性；这就导致非特异性扩增，导致假阳性结果的出现，也为基因诊断造成一定的误判。
发明内容
发明的目的：在于解决现有技术的不足，提供一种能够在常温运输的基因检测混合型试剂，该试剂能够节省检测时间，提高检测灵敏度和特异性，有效的降低检测过程中出现的假阳性和假阴性。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
这种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，包括反应缓冲液、三磷酸脱氧核糖核酸(DNTP)、耐热DNA聚合酶、甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)、吐温-20，其特征在于：所述的核心试剂中还掺入了适量的多糖和双糖；并且所述试剂中的反应缓冲液由5mM-50mM的Tris-HCL、20mM-500mM的KCL、1.0mM-5mM的MgCl2、20mM-200mM的(NH4)2S04组成；同时掺入的三磷酸脱氧核糖核酸 为50uM-300uM、耐热DNA聚合酶为0.01U/ul-0.2U/ul、多糖为1mM-15mM双糖为2M-100M、甘油为3％-30％、牛血清蛋白为10-300ug/ml、二硫苏糖醇为0.5-10mM、吐温-20为0.005-0.05v/v。
所述的多糖为环糊精的一种或者是环糊精的衍生物，其采用的优选浓度为1mM-15mM。
所述的双糖为海藻糖，其采用的优选浓度为2M-10M。
所述反应缓冲液中使用的Tris-HCL缓冲液的浓度50mM；
KCl浓度应低于50mmol/L；
MgCL2的游离镁离子浓度为2.5-3mM。
所述三磷酸脱氧核糖核酸采用的优选浓度为200uM。
所述耐热DNA聚合酶采用的优选浓度为0.01U/ul-0.2U/u1。
所述甘油采用的优选浓度为6％。
所述牛血清蛋白采用的优选浓度为20ug-60ug/ml。
所述二硫苏糖醇采用的优选浓度为3.6-7.2mM。
所述吐温-20采用的优选浓度为0.005-0.05v/v。
核心试剂配方案例：
| 试剂 | 方案1 | 方案2 | 方案3 |
| Tris-HCL | 10mM | 25mM | 50mM |
| KCL | 20mM | 30mM | 50mM |
| MgCl2 | 2.5mM | 2.8mM | 3mM |
| (NH4)2SO4 | 20mM | 50mM | 100mM |
| 三磷酸脱氧核糖核酸 | 200uM | 200uM | 200uM |
| 耐热DNA聚合酶 | 0.01U/u1 | 0.05U/ul | 0.1U/ul |
| 多糖 | 5mM | 10mM | 12.5mM |
| 双糖 | 2.5M | 5M | 7.5M |
[0052]
| 甘油 | 6％ | 6％ | 6％ |
| 牛血清蛋白 | 20ug/ml | 30ug/ml | 50ug/ml |
| 二硫苏糖醇 | 3.6mM | 4.8mM | 6.2mM |
| 吐温-20 | 0.005v/v | 0.01v/v | 0.025v/v |
根据以上技术方案出的这种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，与现有通功能诊断试剂相比较，具有以下有益效果：
1、增加诊断试剂的稳定性，使之能在常温运输，节约能源和成本。并且有利于获得稳定的结果。
2、提高PCR反应的特异性和灵敏度，降低诊断试剂中的假阳性率和假阴性率。
3、对于荧光定量PCR诊断试剂，该试剂具有荧光放大功能，提高诊断试剂的检测敏感度。
4、本发明已将各种非变量试剂组合，减少了实验步骤，也减少了交叉污染；
5、5、本发明能有效的对各种来源的样品，如血液，体液，腹水，菌落都能有效的进行基因诊断检测，省略了基因抽提步骤，为临床诊断节省了时间。
附图说明
图1为环糊精的分子结构示意图；
图2为海藻糖的分子结构示意图；
图3核心试剂在20℃低温保存检测结果示意图；
图4为低拷贝模板实验结果图
图5为全血模板实验结果图
图6为核心试剂PCR扩增特异性的实验结果图
图7.1-7.3为采用实时荧光定量PCR对本发明进行检测其稳定性的实验结果图
图8为本发明在常温状态下1-3个月对beta actin目的基因的稳定性检测柱状图；
图9.1-9.3为本发明在常温状态下1-3个月对BCL2目的基因检测的稳定性检测实验图；
图10为本发明常温状态下1-3个月对BCL2目的基因检测的稳定性检测柱状图；
图11.1-11.3为本发明在常温状态下1-3个月对HPRT1目的基因检测的稳定性检测实验图；；
图12为本发明常温状态下1-3个月对HPRT1目的基因检测的稳定性检测柱状图；
图13为本发明的核心试剂应用于SNP实验扩增曲线结果图
图14为本发明的核心试剂应用于SNP实验斑点实验分布图
图15为本发明的核心试剂制作标准曲线扩增图
图16为本发明的核心试剂制作标准曲线图
具体实施方式
以下结合实施例进一步阐述本发明。
本发明提出的这种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断检测核心试剂，它是对现有高灵敏高特异性的基因诊断检测核心试剂的一种创造性改性。发明人通过在原有试剂组成物的基础上，通过添加适量的多糖和双糖物质，不仅探索出既能保持原有试剂高灵敏高特异性，同时使该试剂还能实现常温运输这一难题。
这种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，包括反应缓冲液、三磷酸脱氧核糖核酸(DNTP)、耐热DNA聚合酶、甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)、吐温-20，其特征在于：所述的核心试剂中还掺入了适量的多糖和双糖；并且所述试剂中的反应缓冲液由5mM-50mM的Tris-HCL、20mM-500mM的KCL、1.0mM-5mM的MgCl2、20mM-200mM的(NH4)2SO4组成；同时掺入的三磷酸脱氧核糖核酸为50uM-300uM、耐热DNA聚合酶为0.01U/ul-0.2U/ul、多糖为1mM-15mM双糖为2M-100M、甘油为3％-30％、牛血清蛋白为10-300ug/ml、二硫苏糖醇为0.5-10mM、吐温-20为0.005-0.05v/v。
所述的多糖为环糊精的一种或者是环糊精的衍生物，其采用的优选浓度为1mM-15mM。
1、通过添加多糖物质提高基因诊断实际的灵敏度和特异性
采用糖化学技术，利用多糖类物质具有环状结构，其中心具有空穴，可通过微弱的范德华力将其他分子络合成包接物的原理，络合PCR反应缓冲液中的小分子(如，Mg2+，dNTP，引物)形成包接物，在温度升高的过程中，重新释放所有的小分子，抑制在PCR反应过程中的非特异性产生，减少甚至杜绝假阳性的出现。
当该多糖物质存在的时候，荧光色素的荧光强度会显著增大，因而可提高荧光定量诊断试剂的灵敏度。
2通过添加某双糖物质提高基因诊断试剂的稳定性，使之可以常温运输和保存利用该双糖物质在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，能有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征的保护作用，在该核心技术中加入一定浓度的双糖，解决整个核心试剂中的酶，dNTP等在常温下容易降解失活。使基因诊断试剂或试剂盒能够在常温下运输和保存。
在添加了多糖和双糖物质的新基因诊断试剂中：
其中KCL是反应缓冲液中的主要离子，它的存在有利于引物与模板之间的退火结合，优选浓度为50mM.KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。
Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa为8.3(20℃)，ΔpKa为0.021/℃。优选浓度为50mM.(PH8.0——9.0，20℃)。
MgCL2中的镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM(注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液)。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。优选浓度为2.5-3mM。
DNTP(三磷酸脱氧核糖核酸)是DNA聚合酶的底物，在DNA聚合酶的作用下合成PCR产物。高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。优选浓度为200uM。
耐热DNA聚合酶作为催化剂DNA链的合成，包括但不限于taq DNA聚合酶、hotstartDNA聚合酶、fast DNA聚合酶，vent DNA聚合酶，优选浓度为0.05U/ul——0.1U/ul。
其中具有代表性的taq DNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性. 在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可保持50％的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65％的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高.
热启动taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了pcr扩增的特异性。第一代热启动taq酶往往直接在taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如clontech、stratagen、gibcol-lti的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。fast DNA聚合酶通过对94kD普通Taq酶进行精简和优化，同时对部分结构进行定点突变，形成了全新的70kD DNA聚合酶，Faster Taq在扩增速度、扩增效率、特异性以及酶本身的稳定性都显著优于普通Taq酶，是与现有DNA聚合酶有本质区别的第二代DNA聚合酶。Faster Taq的聚合速度是普通Taq的2-4倍，延伸时间仅为普通Taq酶的1/4，而且由于Faster Taq的高活性和高扩增效率，能有效缩短变性和退火时间，PCR总耗时仅为普通Taq的30％-40％，一般PCR(1-3kb)均可在30分钟完成。
Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列是一种高耐热性Taq酶，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95℃半衰期近7小时，100℃近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。适合于变性温度较高，需要时间较长的模板。
甘油和BSA(牛血清蛋白)用作抗冻剂和酶稳定，优选浓度分别为：甘油6％，BSA20ug-60ug/ml。
核心试剂中加入5％-20％甘油有助于PCR反应的复性过程，尤其对G十C含量高和二级结构多的靶序列以及扩增长片段(大于1500bp)更适用。优选浓度为：甘油6％。
核心试剂中一定浓度的BSA在PCR体系中有助于耐热DNA酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率。关于BSA的作用机制，Kreader认为可能是BSA作用于多酚体系，BSA通 过其上富含赖氨酸的阳离子与多酚化合物阴离子相互作用或通过疏水作用力消除的作用，阻止其与耐热DNA酶酶结合，而使耐热DNA酶酶活性提高；Al-Soud等认为BSA可以封闭Taq酶抑制物的作用，从而改善PCR过程中酶的稳定性。BSA优选浓度为：20ug-60ug/ml。
DTT作为一种抗氧化剂，可延缓蛋白质的氧化，尤其保护酶中的不饱和二硫键，从而防止延缓酶的失活。用作酶的稳定剂。优选浓度为3.6-7.2mM。
技术方案中采用的多糖物质为环糊精的一种或其衍生物，用作络合反应体系中的小分子和金属离子，阻止酶产生活性，另外也用作荧光色素的增强剂。
环糊精(Cyclodextrin，简称CD-分子结构见图1)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。其中.研究得较多并且具有重要实际意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为alpha-、beta-和gama-环糊精(图1)。根据X-线晶体衍射、红外光谱和核磁共振波谱分析的结果，确定构成环糊精分子的每个D(+)-吡喃葡萄糖都是椅式构象。各葡萄糖单元均以1，4-糖苷键结合成环。由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，环糊精不是圆筒状分子而是略呈锥形的圆环。其中，环糊精的伯羟基围成了锥形的小口，而其仲羟基围成了锥形的大口。
由于环糊精的外缘(Rim)亲水而内腔(Cavity)疏水，因而它能够象酶一样提供一个疏水的结合部位，作为主体(Host)包络各种适当的客体(Guest)，如有机分子、无机离子以及气体分子等。其内腔疏水而外部亲水的特性使其可依据范德华力、疏水相互作用力、主客体分子间的匹配作用等与许多有机和无机分子形成包合物及分子组装体系。这种选择性的包络作用即通常所说的分子识别，其结果是形成主客体包络物(Host-Guest Complex)。环糊精是迄今所发现的类似于酶的理想宿主分子，并且其本身就有酶模型的特性。因此，在催化、分离、食品以及药物等领域中，环糊精受到了极大的重视和广泛应用。由于环糊精在水中的溶解度和包结能力，改变环糊精的理化特性已成为化学修饰环糊精的重要目的之一。
其分子结构和基本参数见图1，优选浓度为1mM——15mM。
海藻糖(Trehalose)是一种安全、可靠的天然糖类，1832年由Wiggers将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来，随后的研究发现海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有神奇的保护作用
海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂其分子结构见图2。双糖物质为海藻糖。优选浓度为2M——10M。
使用核心试剂进行普通PCR检测结果
一、核心试剂稳定性试验：(见附图3)
1-4个月常温保存时间的核心试剂对目的基因都能实现良好扩增，与低温-20度保存6个月的试剂检测结果无明显差异；
以人类CDNA为模板，对常温保存不同时间的基因诊断核心试剂进行对比实验
| 模板 | 人类cDNA |
| 基因名称 | lGF2R |
| 引物 | Primer f：GGTCCACAACGGAGTCTCGTAC Primer r：GGATGCGGTCTTATTTCCACCA |
| 扩增片段长度 | 217bp |
| 扩增片段序列 | Ggtccacaacggagtctcgtactatataaatctgtgccagaaaatatataaagggcccctgggct Gctctgaaagggccagcatttgcagaaggaccacaactggtgacgtccaggtcctgggactcgt Tcacacgcagaagctgggtgtcataggtgacaaagttgttgtcacgtactccaaaggttatccgtg tggtggaaataagaccgcatcc |
| PCR实验体系： | 人类cDNA模板 1ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul 核心试剂 25ul 灭菌水 22ul 总体积 50ul |
[0108]
| PCR实验扩增条件： | 95℃ 2min {95℃ 10sec 61℃ 10sec 72℃ 20sec}×30cycles 72℃ 3min |
二、对于低拷贝模板的试验结果(见附图4)
以人类基因组DNA为模板，对不同浓度的基因组DNA模板进行扩增，检测核心试剂扩增极少量模板的能力；结果表明核心试剂对极少量(1-10ng)基因组DNA均能够良好的扩增，显示出极高的灵敏度和扩增能力；
三、对基因检测试剂中大对数样品为全血样品的实验效果
分别以人类全血和从血液中抽提的基因组DNA为模板，进行TGF-β目的基因的PCR扩增实验，检测核心试剂扩增粗样品模板的能力；
结果表明核心试剂对人类全血粗样品(1-3ul)均能够良好的扩增，和人类基因组DNA模板的扩增结果对比，得到的PCR扩增产物量一致，表明核心试剂没有受血液中夹杂的抑制PCR反应的物质影响。说明核心试剂适用于粗样品(全血)的基因检测；
使用核心试剂进行实时荧光定量PCR检测结果
稳定性检测试验1(见附图7.1-7.3、图8)
以人类cDNA为模板，用不同常温保存时间的核心试剂进行beta actin目的基因的实时荧光定量PCR扩增实验，检测核心试剂常温保存的稳定性；
结果表明核心试剂对人类cDNA样品均能够良好的扩增，从分析结果可以看出，3种常温保存时间的核心试剂得到的结果一致，表明核心试剂常温保存对产品品质没有影响。
| 模板 | 人类cDNA |
| 基因名称 | Beta actin |
| 引物/探针 | Primer f：AAGATGACCCAGATCATGTTTGAG Primer r：TAGATGGGCACAGTGTGGGTG Probe：fam-ACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGT-tamra |
| 扩增片段长度 | 146bp |
| Real time PCR实验 体系： | 模板 1ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul 探针 0.5ul 核心试剂 25ul 灭菌水 21.5ul 总体积 50ul |
| Real time PCR实验 扩增条件： | 95℃ 2min {95℃ 10sec 60℃ 15sec}×40cycles |
稳定性检测试验2(见附图9.1-9.3、图10)
以人类cDNA为模板，用不同常温保存时间的核心试剂进行BCL2目的基因的实时荧光定量PCR扩增实验，检测核心试剂常温保存的稳定性；
结果表明核心试剂对人类cDNA样品均能够良好的扩增，从分析结果可以看出，3种常温保存时间的核心试剂得到的结果一致，表明核心试剂常温保存对产品品质没有影响。
| 模板 | 人类cDNA |
| 基因名称 | Bcl2 |
| 引物/探针 | Primer f：CTTTAGATTCCAGAGACATCAGCAT Primer r：CCAACCAGAAGGTTGTCATTAAATA Probe：fam-CTCAAAGTGCAGCTCCGTTTGGCAG-tamra |
| 扩增片段长度 | 153bp |
| Real time PCR实 验体系： | 模板 1ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul |
[0126]
| 探针 0.5ul 核心试剂 25ul 灭菌水 21.5ul 总体积 50ul |
稳定性检测实验3(见附图11.1-11.3图12)
以人类cDNA为模板，用不同常温保存时间的核心试剂进行HPRT1目的基因的实时荧光定量PCR扩增实验，检测核心试剂常温保存的稳定性；
结果表明核心试剂对人类cDNA样品均能够良好的扩增，从分析结果可以看出，3种常温保存时间的核心试剂得到的结果一致，表明核心试剂常温保存对产品品质没有影响。
| 模板 | 人类cDNA |
| 基因名称 | HPRT1 |
| 引物/探针 | Primer f：TATAATCCAAAGATGGTCAAGGTCG Primer r：CAAGGGCATATCCTACAACAAACTT Probe：fam-CTGGTGAAAAGGACCCCACGAAGTG-tamra |
| 扩增片段长 度 | 146bp |
| Real time PCR 实验体系： | 模板 1ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul 探针 0.5ul 核心试剂 25ul 灭菌水 21.5ul 总体积 50ul |
二.利用核心试剂实时荧光定量PCR扩增全血样品
以人类全血粗样品为模板，用核心试剂进行TNFα目的基因的实时荧光定量PCR扩增实验，检测核心试剂扩增人类全血粗样品的能力；
结果表明核心试剂对人类全血粗样品能够良好的扩增，重复性非常好，得到的荧光定量PCR结果一致，表明核心试剂没有受血液中夹杂的抑制PCR反应的物质影响。说明核心试剂适用于粗样品(全血)的实时荧光定量基因检测；
| 模板 | 人类全血粗样品 |
| 基因名称 | TNFα |
| 引物/探针 | Primer f：GACAATGTGAGAAGGACTCGCTG Primer r：TGTCCTCTCTGTCTGTCATCCCA Probe：fam-TCAAGGGAAGGGTGGAGGAACAGCA-tamra |
[0135]
| 扩增片段长度 | 118bp |
| Real time PCR实验体 系： | 模板 1ul上游引物 1ul下游引物 1ul探针 0.5ul核心试剂 25ul灭菌水 21.5ul总体积 50ul |
| Real time PCR实验扩增 条件： | 95℃ 2min{95℃ 10sec61℃ 15sec}×40cycles |
三、利用核心试剂，采用实时荧光定量PCR技术，扩增检测SNP样品以人类基因组DNA为模板，用核心试剂进行SNP等位基因的实时荧光定量PCR扩增实验，检测核心试剂应用于SNP分型的能力；
结果表明核心试剂对人类基因组DNA样品能够良好扩增，等位基因SNP位点分型非常精确，表明核心试剂可以大规模应用于基因组DNA的SNP分型检测；
| 模板 | 人类基因组DNA样品 |
| SNP位点 | C677T Rs1801133 |
| 引物/探针 | Primer f：CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAG Primer r：CACAAAGCGGAAGAATGTGTCA Probe1：FAM-AGGTGTCTGCGGGAGCCGAT TTCATCAT-TAMRA Probe2：VlC-AGGTGTCTGCGGGAGTCGATT TCATCAT-TAMRA |
| 扩增片段长度 | 95bp |
| Real time PCR实验体 系： | 模板 1ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul 探针1 0.5 探针2 0.5 核心试剂 25ul 灭菌水 21ul 总体积 50ul |
| Real time PCR实验扩增 条件： | 95℃ 2min {95℃ 10sec 60℃ 15sec}×40cycles |
四、利用核心试剂，采用实时荧光定量PCR方法扩增不同浓度(包含超低拷贝浓度模板)样品
以大鼠cDNA为模板，用核心试剂进行18s基因的实时荧光定量PCR扩增实验，检测核心试剂对不同浓度样品的扩增能力；
结果表明核心试剂对10种浓度的样品能够良好的扩增，得到标准曲线间距均一，所有 点均位于标准曲线上，R2值＝0.994，扩增效率非常高，说明核心试剂适用于各种浓度(高浓度到超低拷贝模板)的基因检测；
| 模板 | 大鼠cDNA样品 |
| R2值 | 0.994 |
| 引物/探针 | Primer f：GAAGACGATCAGATACCGTCGTAGT Primer r：AATTCCTTTAAGTTTCAGCTTTGCA Probe：fam-5’-ATAAACGATGCCGACTGGCGATGCG-3’-tamra |
| 扩增片段长度 | 155bp |
| Real time PCR实验体系： | 模板 1ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul 探针 0.5 核心试剂 25ul 灭菌水 21.5ul 总体积 50ul |
| Real time PCR实验扩增条 件： | 95℃ 2min {95℃ 10sec 61℃ 15sec }×40cycles |
| Real time PCR实验结果标 注： | 扩增图15：10种梯度稀释样品(108、107、106、105、104、 103、102、10、1、0.1)浓度模板检测结果； 扩增图16：10种浓度检测结果标准曲线； |
Claims (10)
1.一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，包括反应缓冲液、三磷酸脱氧核糖核酸(DNTP)、耐热DNA聚合酶、甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)、吐温-20，其特征在于：所述的核心试剂中还掺入了适量的多糖和双糖；并且所述试剂中的反应缓冲液由5mM-50mM的Tris-HCL、20mM-500mM的KCL、1.0mM-5mM的MgCl2、20mM-200mM的(NH4)2SO4组成；同时掺入的三磷酸脱氧核糖核酸为50uM-300uM、耐热DNA聚合酶为0.01U/ul-0.2U/ul、多糖为1mM-15mM双糖为2M-100M、甘油为3％-30％、牛血清蛋白为10-300ug/ml、二硫苏糖醇为0.5-10mM、吐温-20为0.005-0.05v/v。
2.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述的多糖为环糊精的一种或者是环糊精的衍生物，其采用的优选浓度为1mM-15mM。
3.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述的双糖为海藻糖，其采用的优选浓度为2M-10M。
4.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述反应缓冲液中使用的Tris-HCL缓冲液的浓度为50mM；KCl浓度应低于50mmol/L；MgCL2的游离镁离子浓度为2.5-3mM。
5.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述三磷酸脱氧核糖核酸采用的优选浓度为200uM。
6.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述耐热DNA聚合酶采用的优选浓度为2.5-3mM。
7.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述甘油采用的优选浓度为6％。
8.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述牛血清蛋白采用的优选浓度为20ug-60ug/ml。
9.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述二硫苏糖醇采用的优选浓度为3.6-7.2mM。
10.如权利要求1所述的一种可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断侧核心试剂，其特征在于：所述吐温-20采用的优选浓度为0.005-0.025v/v
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111116 |