CN107002064A - 稳定的反应混合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了稳定的干燥的反应混合物、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述稳定的干燥的反应混合物在许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增中是有用的。
Description
技术领域
本发明提供了稳定的反应混合物、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述稳定的反应混合物在许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增中是有用的。
背景技术
为了解决生产稳定的多肽组合物的挑战,通常以固体形式制备蛋白质来提供可接受的贮存期限。一种用于制备固体形式蛋白质组合物的标准方法是冷冻干燥(冻干),但是该方法会产生应激,所述应激可以使蛋白质在不同程度上变性(Wang, W. (2000)International Journal of Pharmaceutics 203; 1-60)。很少有生物反应化合物会以溶解形式稳定任何时间长度,且这对于室温贮存而言是特别真实的。结果,已经执行众多研究来评价增强处于干燥形式的生物反应化合物的贮存能力的可能性。普遍接受的是,为了确保例如聚合酶在再溶解以后的生物活性,必须使用至少一种稳定性添加剂。
WO 2008/36544描述了为了提供干燥的组合物的所谓的填充材料的应用,所述填充材料是例如碳水化合物诸如聚蔗糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、葡聚糖或甘露醇,蛋白质诸如BSA、明胶或胶原,和聚合物诸如PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在美国专利号5,098,893、5,200,399和5,240,843中进一步描述了用于稳定生物试剂的形成玻璃的填充材料。填充材料聚蔗糖是在美国专利号3,300,474中公开的共聚物。干燥液体反应混合物的方法在大多数情况下在性质上是非常复杂的,且因此,干燥程序是严苛的和昂贵的。
冻干(美国专利号5,593,824)或真空干燥(美国专利号5,565,318)被用于干燥在碳水化合物聚合物基质中的生物学材料。冷冻干燥或冻干是充分确立的用于贮存蛋白质的技术,其被公开在许多现有技术文件中(例如Passot, S., 等人, PharmaceuticalDevelopment and Technology 12 (2007) 543-553; Carpenter, J. F., 等人,Pharmaceutical Research 14(8) (1997) 969-975; Schwegman, J. J., 等人,Pharmaceutical Development and Technology 10 (2005) 151-173)。
在美国专利号7,407,747中描述了不同反应混合物的干燥条件的选择,所述反应混合物用于包含Taq聚合酶的遗传修饰的测序应用。使用的干燥程序是冻干、没有额外热的真空离心蒸发(speedvac)、具有额外热的真空离心蒸发和在室温风干。关于多种冷冻保护剂诸如海藻糖、蔗糖、葡萄糖和三甲胺-N-氧化物(TMANO),测试了在该专利内的反应混合物。此外,还在根本没有冷冻保护剂的情况下执行实验,但是没有公开关于那些反应混合物随时间的稳定性的数据。仅对于包含海藻糖和牛血清白蛋白质(BSA)的反应混合物报道了长达8周的良好稳定性。
此外,美国专利号7,407,747公开了使用在不同测序混合物中的聚合酶的实验,其中每种测序混合物包含缓冲溶液、核苷酸三磷酸、以及具有荧光标记和引物的核苷酸的不同组合物。但是,没有公开是否可以在不影响聚合酶的PCR活性的情况下干燥和储存用于实时PCR扩增的混合物(即包含缓冲溶液、核苷酸三磷酸、引物和检测探针的混合物)中的聚合酶。
美国专利号8,652,811公开了一种干燥在实时PCR混合物内的Taq DNA聚合酶的方法,而得到的干燥的组合物可以在不影响耐热性DNA聚合酶的PCR性能的情况下储存。
发明概述
本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR (逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定的反应混合物,其包含在不需要冷冻干燥或冻干下已经干燥的糖(例如,蔗糖)。本发明也提供了用于制备干燥的反应混合物的方法。
因此,在一个方面,本发明涉及一种干燥的反应混合物组合物,其包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷单体和糖,其中所述组合物是非冷冻干燥的。在某些实施方案中,所述组合物与(i)冷冻干燥的和/或(ii)缺少糖的反应混合物相比具有改善的稳定性。在某些实施方案中,所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。在某些实施方案中,所述组合物还包含醋酸锰(Mn(OAc)2)。在某些实施方案中,所述组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。在某些实施方案中,所述组合物还包含至少一种选自适体、去污剂、缓冲剂、盐和寡核苷酸的组分。在某些实施方案中,所述至少一种核酸扩增相关酶是选自以下的热稳定的聚合酶:水生栖热菌(Thermusaquaticus)Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus sp.)Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermusflavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。在某些实施方案中,所述糖以一定量存在,使得如果在水溶液中重构所述组合物,所述糖的浓度是在约50 mM至约1000 mM之间。在某些实施方案中,所述糖是蔗糖。在某些实施方案中,所述组合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。
在另一个方面,本发明涉及一种制备干燥的反应混合物组合物的方法,所述方法包括:在没有冷冻干燥存在下干燥含水形式的反应混合物,其中所述含水形式的反应混合物包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷单体和糖。在某些实施方案中,所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。在某些实施方案中,所述组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。在某些实施方案中,在环境温度执行所述方法。在某些实施方案中,所述糖在含水形式的反应混合物中是在约50 mM至约1000 mM之间的浓度。在某些实施方案中,所述糖是蔗糖。在某些实施方案中,所述至少一种核酸扩增相关酶是选自以下的热稳定的聚合酶:水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶、那不勒斯栖热袍菌聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。在某些实施方案中,所述组合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。
在发明详述中和在附图中更详细地描述了本发明的实施方案和优点。
附图说明
图1显示了在42℃贮存的第1天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图2显示了在42℃贮存的第15天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图3显示了在42℃贮存的第29天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图4显示了在42℃贮存的第49天由冷冻干燥的(A)和非冷冻干燥的(B)干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图5显示了在42℃贮存的第90天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图6显示了在环境温度贮存的第26天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图7显示了在环境温度贮存的第71天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图8显示了在环境温度贮存的第222天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图9显示了在环境温度贮存的第299天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图10显示了在环境温度贮存的第353天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
图11显示了在环境温度贮存的第379天由非冷冻干燥的干燥的反应主混合物产生的RT-PCR生长曲线。
发明详述
本发明提供了稳定的反应混合物、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述稳定的反应混合物在许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增中是有用的。具体地,本发明提供了稳定的非冷冻干燥的反应混合物,其含有酶(例如,在核酸扩增中使用的酶)和糖。这样的酶混合物可以在没有冷冻干燥存在下干燥并在没有显著损失酶活性的情况下在室温长期储存。
I. 定义
除非另外定义,在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管基本上与本文描述的那些相似的任何方法和材料都可以用在本发明的实践或测试中,但是仅仅描述了示例性的方法和材料。就本发明的目的而言,下列术语定义如下。
术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物,除非上下文另外清楚地指出。
术语“约”在本发明的上下文中包括所指值±15%、±10%、±5%、±3%、±2%或±1%的变化和所指值自身。
术语“冷冻干燥”表示通过冷冻产物在高真空下的快速冷冻和脱水来制备生物物质的稳定制备物,并且也通常被称作“冻干”。
术语“非冷冻干燥”、“干燥”表示不利用冷冻干燥的工艺干燥生物物质的方法。
术语“环境温度”表示周围的温度,并且当表示控温室内建筑物的温度时与“室温”同义。通常,环境温度表示在15℃至25℃之间的温度范围,尽管稍微更冷的或更暖的温度仍然可以被视为在环境温度的范围内。
术语“适体”表示识别并结合DNA聚合酶且有效地抑制聚合酶活性的单链DNA(如在美国专利号5,693,502中所述)。还在例如以下文献中讨论了适体和dUTP/UNG在RT-PCR中的应用:Smith, E.S. 等人, (Amplification of RNA: High-temperature ReverseTranscription and DNA Amplification with a Magnesium-activated ThermostableDNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 第2版, Dieffenbach, C.W.和Dveksler, G.S., 编, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York, 211-219, (2003))。
本文中使用的“重组体”表示已经通过重组方法有意地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“重组核酸”在本文中是指最初在体外形成(一般而言,通过限制性内切核酸酶对核酸的操作)的核酸,其呈在自然界中通常不存在的形式。因此,呈线性形式的分离的突变体DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子在体外形成的表达载体都被认为是用于本发明的目的的重组体。应当理解,一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞,它将非重组地复制(即,使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作);但是,这样的核酸一旦重组地产生,尽管随后非重组地复制,仍然被认为是用于本发明的目的的重组体。“重组蛋白质”是使用重组技术(即,通过上述重组核酸的表达)制备的蛋白质。
当核酸放置成与另一个核酸序列在功能上关联时,所述核酸“可操作地连接”。例如,启动子或增强子与编码序列可操作地连接(如果其影响所述序列的转录);或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接(如果其被定位为促进翻译)。
术语“宿主细胞”表示当在细胞培养物中培养时的单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如,细菌、酵母和放线菌)以及来自高等植物或动物的单个细胞。
术语“载体”表示一段DNA,通常是双链的,其可以在其中已经插入一段外源DNA。载体可以是例如质粒起源的。载体含有在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA被定义为异源DNA,其是在宿主细胞中天然不存在的DNA,例如,其复制载体分子,编码可选择的或可筛选的标记物,或者编码转基因。载体用于将外源的或异源的DNA运输进合适的宿主细胞中。一旦在宿主细胞中,载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制,并且可以产生载体和它的插入的DNA的数个拷贝。另外,载体还可以含有允许插入的DNA转录为mRNA分子或者以其它方式使插入的DNA复制为RNA的多个拷贝的必要元件。一些表达载体另外含有在插入的DNA附近的序列元件,其增加表达的mRNA的半衰期和/或允许所述mRNA翻译为蛋白质分子。因此,可以迅速地合成由插入的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。
除了表示天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外,术语“核苷酸”在本文中还应当理解为表示其有关的结构变体,包括衍生物和类似物,它们就在其中使用所述核苷酸(例如,与互补碱基杂交)的特定背景而言在功能上等同,除非上下文另外清楚地指出。
术语“核酸”或“多核苷酸”表示聚合物,其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸(诸如RNA和DNA)的聚合物,以及它们的合成形式、修饰(例如,化学修饰或生化修饰)形式,和混合的聚合物(例如,包括RNA和DNA亚基)。示例性修饰包括甲基化、用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如不带电荷的键(例如,膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)、延伸的部分(pendent moieties)(例如,多肽)、嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和经修饰的键(例如,α端基异构的核酸等)。也包括合成的分子,其在它们的通过氢键合和其它化学相互作用结合指定序列的能力方面模仿多核苷酸。通常,经由磷酸二酯键连接核苷酸单体,尽管合成形式的核酸可以包含其它键(例如,在Nielsen等人(Science254:1497-1500, 1991)中描述的肽核酸)。核酸可以是或可以包括,例如,染色体或染色体段、载体(例如,表达载体)、表达盒、裸露DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是,例如,单链的、双链的、或三链的,且不限于任何特定长度。除非另有说明,除了明确指出的任何序列以外,特定核酸序列任选地包含或编码互补序列。
术语“寡核苷酸”表示包括至少2个核酸单体单元(例如,核苷酸)的核酸。寡核苷酸通常包括约6至约175个核酸单体单元,更通常地约8至约100个核酸单体单元,且更通常地约10至约50个核酸单体单元(例如,约15个、约20个、约25个、约30个、约35个或更多个核酸单体单元)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素,包括寡核苷酸的最终功能或用途。任选地通过任意合适的方法制备寡核苷酸,所述方法包括、但不限于,现有或天然序列的分离、DNA复制或扩增、反转录、适当序列的克隆和限制酶切消化、或通过以下方法的直接化学合成:诸如Narang等人的磷酸三酯方法(Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979);Brown等人的磷酸二酯方法(Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979);Beaucage等人的二乙基氨基亚磷酸酯方法(Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981);Matteucci等人的三酯方法(J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981);自动化的合成方法;或Caruthers等人美国专利号4,458,066的固体支持物方法,或本领域技术人员已知的其它方法。
本文中使用的术语“引物”表示当被置于起始多核苷酸延伸的条件下(例如,在包括在适当缓冲液中存在所需的三磷酸核苷(由被拷贝的模板决定)和聚合酶以及在合适的温度或温度循环(例如,如在聚合酶链式反应中)的条件下)能够充当模板指导的核酸合成的起始点的多核苷酸。为了进一步举例说明,引物还可以用在多种其它寡核苷酸介导的合成方法中,包括作为从头RNA合成和体外转录相关的方法(例如,基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等)的引发剂。引物通常是单链寡核苷酸(例如,寡脱氧核糖核苷酸)。引物的适当长度取决于所述引物的预期用途,但是通常范围为6-40个核苷酸,更通常为15-35个核苷酸。短的引物分子通常需要更低的温度以与模板形成足够稳定的杂合复合物。引物不需要反映模板的精确序列,但是必须是充分互补的以与模板杂交从而使引物延伸发生。在某些实施方案中,术语“引物对”是指一组引物,其包括与要扩增的核酸序列的5'末端的补体杂交的5'同义引物(有时称为"正向")以及与要扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为"反向")(例如,如果靶序列被表达为RNA或者是RNA)。如果需要的话,通过掺入用光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法可检测的标记,可以标记引物。例如,有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(如在ELISA测定中常用的)、生物素、或者可得到针对它的抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。
当提及核酸碱基、三磷酸核苷或核苷酸时,术语“常规的”或“天然的”表示在所描述的多核苷酸中天然存在的那些(即,对于DNA,这些是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外,在体外DNA合成反应诸如测序中,经常利用dITP和7-脱氮-dGTP来代替dGTP,且可以利用7-脱氮-dATP来代替dATP。共同地,这些可以被称作dNTP。
当提及核酸碱基、核苷或核苷酸时,术语“非常规的”或“修饰的”包括在特定多核苷酸中天然存在的常规碱基、核苷或核苷酸的修饰、衍生物或类似物。与常规的dNTP相比,某些非常规核苷酸在核糖的2'位处被修饰。因而,尽管对于RNA,天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即,ATP、GTP、CTP、UTP,共同称作rNTP),因为这些核苷酸具有在糖的2'位处的羟基,与之相比,所述羟基在dNTP中不存在,本文中使用的核糖核苷酸是作为DNA聚合酶的底物的非常规核苷酸。本文中使用的非常规核苷酸包括、但不限于在核酸测序中用作终止剂的化合物。示例性的终止剂化合物包括、但不限于具有2',3'二脱氧结构的那些化合物,且被称作二脱氧核苷三磷酸。二脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP共同地被称为ddNTP。终止剂化合物的其它例子包括核糖核苷酸的2'-PO4类似物(参见,例如,美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398)。其它非常规的核苷酸包括硫代磷酸酯dNTP ([α-S]dNTP)、5'-[α-硼代]-dNTP、[α]-甲基-膦酸酯dNTP和核糖三磷酸核苷(rNTP)。可以用以下物质标记非常规的碱基:放射性同位素诸如32P、33P或35S;荧光标记;化学发光标记;生物发光标记;半抗原标记诸如生物素;或酶标记诸如抗生蛋白质链菌素或抗生物素蛋白质。荧光标记可以包括带负电荷的的染料,诸如荧光素家族的染料,或电荷中性的染料,诸如罗丹明家族的染料,或带正电荷的染料,诸如酞菁家族的染料。荧光素家族的染料包括,例如,FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA。用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、德克萨斯红和TAMRA标记的各种染料或核苷酸由Perkin-Elmer (Boston, MA)、Applied Biosystems (Foster City, CA)或Invitrogen/MolecularProbes (Eugene, OR)销售。酞菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7,且由GE HealthcareUK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, 英国)销售。
术语“Cp值”或“交叉点”值表示允许输入靶核酸的定量的值。可以根据二阶导数最大法确定Cp值(Van Luu-The, 等人, “Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and doublecorrection,”BioTechniques, 第38卷, 第2期, 2005年2月, 第287-293页)。在二阶导数方法中,Cp对应于二阶导数曲线的第一个峰。此峰对应于对数线性阶段的开始。二阶导数方法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值,且仅获得一个值。初始Cp方法是基于强度值的局部地定义的可区分的近似值,例如,通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小根。还可以使用拟合点法确定Cp,其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉点确定Cp (Van Luu-The, 等人, BioTechniques, 第38卷, 第2期, 2005年2月, 第287-293页)。通过根据二阶导数最大法计算,确定由Roche提供的LightCycler仪器所提供的Cp值。
术语“PCR效率”表示循环至循环扩增效率的指标。使用以下方程式计算每种条件的PCR效率:%PCR效率= (10(-斜率)-1) x 100,其中通过y-轴上绘制的对数拷贝数和x-轴上绘制的Cp的线性回归而计算斜率。使用完美匹配的或错配的引物模板可以测量PCR效率。
术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”表示至少两个生色团,供体生色团和受体生色团(被称作猝灭剂)之间的能量转移。当供体被适当波长的光辐射激发时,供体通常向受体转移能量。受体通常将转移的能量以不同波长的光辐射的形式重新发射。当受体是“暗”猝灭剂时,它会以光以外的形式消散转移的能量。特定的荧光团是否充当供体或受体取决于FRET对的其它成员的性能。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™(BHQ)(Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、Iowa Black™(Integrated DNATech., Inc., Coralville, Iowa)和BlackBerry™Quencher 650 (BBQ-650) (Berry &Assoc., Dexter, Mich.)。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用,且所有这样的命名包括后代。因而,词语“转化体”或“转化的细胞”包括原代转化的细胞和不论传代的数目从该细胞衍生出的培养物。由于故意的或非故意的突变,所有后代可以在DNA含量上不是精确地相同的。在转化体的定义中包括具有相同官能性的突变体后代(如在最初转化的细胞中筛选的)。所述细胞可以是原核的或真核的。
术语“控制序列”表示在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵基因序列、核糖体结合位点、正性反向调节元件(positive retroregulatory element)(参见美国专利号4,666,848)和可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
术语“可操作地连接”表示编码序列的定位,使得控制序列将起作用以驱动由编码序列编码的蛋白质的表达。因而,与控制序列“可操作地连接”的编码序列表示这样的构型:其中编码序列可以在控制序列的指导下表达。
术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”表示在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA的酶,其通常在起源上是细菌的。
在本文中定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸),酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如,天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)、β-分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
术语“试剂溶液”是含有至少一种试剂的任何溶液,所述试剂是PCR目的所需的或用于PCR目的。大多数通常成分是聚合酶、核苷酸、引物、离子、镁、盐、pH缓冲剂、核苷酸三磷酸(NTP)或脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、探针、荧光染料(可以连接至探针)、核酸结合剂、核酸模板。所述试剂还可以是其它聚合酶反应添加剂,其对聚合酶反应或它的监测具有影响。
术语“主混合物”表示PCR发生所需的所有或大部分成分或因子的混合物,且在某些情况下,指的是除了样品和扩增子特异性的模板和引物以外的全部。商购可得的主混合物经常是浓缩的溶液。主混合物可以含有多种样品共有的所有试剂,但是它也可以仅为一种样品构建。使用主混合物有助于减小由吸量的体积之间的差异引起的样品之间的吸量错误和变动。
术语“热稳定的聚合酶”表示这样的酶:其对热稳定,耐热,并且当遭受升高的温度持续实现双链核酸的变性所需的时间以后保留足够的活性以实现随后的引物延伸反应。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的,并且在美国专利号4,965,188和4,889,818中举例说明。本文中使用的热稳定的聚合酶适合用在温度循环反应(诸如PCR)中。热稳定的核酸聚合酶的例子包括水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
“经修饰的”热稳定的聚合酶表示其中至少一个单体不同于参照序列的聚合酶,诸如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一种修饰形式。示例性修饰包括单体插入、缺失和置换。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶,其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定的组分序列(例如,结构或功能结构域等)。在经修饰的聚合酶的定义内还包括包含参照序列的化学修饰的那些。经修饰的热稳定的聚合酶的例子包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46EL329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G耐热性DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶等。
术语“热活性的聚合酶”表示在确保特异性的引发和引物延伸所必需的高温(例如,55-80℃)有活性的酶。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用。术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用。除非另外指出,否则从氨基端至羧基端书写氨基酸序列。除非另外指出,否则从5'至3'书写单链核酸序列。除非另外指出,否则从5'至3'书写双链核酸序列的上链,从3'至5'书写下链。
II. 干燥的反应混合物组合物
本发明的干燥的反应混合物组合物包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷酸三磷酸和糖,其中所述组合物是非冷冻干燥的。与缺少糖或冷冻干燥的干燥反应混合物或者缺少糖并冷冻干燥的干燥反应混合物相比,本发明的干燥的反应混合物具有改善的稳定性。在干燥的反应混合物的一个实施方案中,所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物具有至少一种选自适体、去污剂、缓冲剂、盐和寡核苷酸的组分。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物还包含醋酸锰(Mn(OAc)2)。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物具有扩增相关酶,其为选自以下的热稳定的聚合酶:水生栖热菌TaqDNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、那不勒斯栖热袍菌聚合酶、Tth DNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物组合物具有以一定量存在的糖,所述量使得如果在水溶液中重构所述组合物,所述糖的浓度是在约50 mM至约1000 mM之间。在另一个实施方案中,所述糖是蔗糖。
III. 制备干燥的反应混合物组合物的方法
通过在没有冷冻干燥存在下干燥呈含水形式的反应混合物,制备本发明的干燥的反应混合物组合物,其中所述含水形式的反应混合物包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷酸三磷酸和糖。在一个实施方案中,在环境温度执行所述干燥。在另一个实施方案中,在所述干燥的反应混合物中的糖在含水形式的反应混合物中的浓度是在约50 mM至约1000 mM之间。在另一个实施方案中,所述糖是蔗糖。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物还包含醋酸锰(Mn(OAc)2)。在另一个实施方案中,所述干燥的反应混合物具有扩增相关酶,其为选自以下的热稳定的聚合酶:水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。在另一个实施方案中,使用本发明的方法制备的干燥的反应混合物组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。在另一个实施方案中,使用本发明的方法制备的干燥的反应混合物组合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。
尽管为了清楚和理解的目的已经比较详细地描述了前述发明,但是本领域技术人员通过阅读本发明将清楚,可以在形式和细节上做出各种变化。例如,上述的所有组合物和方法可以以不同的组合使用。
给出以下实施例来举例说明本发明的实施方案,因为目前优选实践它。应该理解,所述实施例是示例性的,并且除了在所附权利要求中指示以外,本发明不应视作受到限制。
实施例
实施例1: 干燥的反应5X RT-PCR主混合物的制备
首先从具有以下组成的水溶液制备干燥的反应5X RT-PCR主混合物:250mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(pH 8.3), 500mM KOAc (pH 7.5), 0.05%吐温20, 1.326 μM适体(用于热启动PCR), 1000 μM dATP, 1000 μM dCTP, 1000 μM dGTP, 1500 μM dUTP, 150 μM dTTP,0.029%NaN3, 0.5mM EDTA, 0.2U/ μl尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG), 2.2U/ μl Z05-D DNA聚合酶。将1.5M蔗糖加入一半5X RT-PCR主混合物[(+)蔗糖],且不加入另一半5X RT-PCR主混合物[(-)蔗糖]。将一组(+)蔗糖和(-)蔗糖5X RT-PCR主混合物通过冷冻干燥干燥并在45℃温育。将另一组(+)蔗糖和(-)蔗糖5X RT-PCR主混合物在45℃无盖试管中干燥并在45℃温育。通过在3个月时间段中执行RT-PCR确定干燥的反应5X RT-PCR主混合物的稳定性。
实施例2: 通过RT-PCR分析干燥的反应主混合物
将干燥的反应RT-PCR主混合物重构至1X浓度并在RT-PCR反应中分析。根据GeneAmp®Gold RNA PCR Reagent Kit (P/N 4308206, Applied Biosystems, Foster City, CA)的方案执行RNA靶标的反转录和扩增。简而言之,将对照pAW109 RNA转录物的1x 104个输入拷贝加入各0.2 μM的DM151和DM152引物中,这会从IL-1α 基因产生308个碱基对的靶标。使用0.1 μM浓度的TaqMan探针AL42F检测扩增产物。在某些反应中,加入醋酸锰(Mn(OAc)2)至1.5mM的终浓度。在LightCycler®480 Instrument (Roche Diagnostics)上执行RT-PCR,其中反转录阶段在55℃进行5分钟、在60℃进行5分钟和在65℃进行5分钟,随后是55个在92℃持续15秒和在60℃持续40秒的循环的PCR。
实施例3: RT-PCR反应的结果
对已经储存1天、15天、29天、49天和90天的干燥的反应RT-PCR主混合物进行RT-PCR反应,并将在每种所述天进行的RT-PCR反应的结果描绘在图1-5所示的生长曲线中。1天以后,冷冻干燥的和干燥的(+)蔗糖主混合物是稳定的,而冷冻干燥的(-)蔗糖主混合物完全降解,且干燥的(-)蔗糖主混合物开始表现出降解(图1A, B)。15天以后,冷冻干燥的和干燥的(+)蔗糖主混合物是稳定的并表现出类似的生长曲线(图2A,B)。29天以后,冷冻干燥的(+)主混合物开始表现出降解,在不含醋酸锰的主混合物中观察到更多的降解(图3A)。相反,干燥的(+)主混合物仍然是稳定的,其生长曲线几乎没有表现出与第15天的生长曲线的差异(图3B)。49天以后,冷冻干燥的(+)蔗糖主混合物完全降解(图4A),而含有Mn(OAc)2的干燥的(+)蔗糖主混合物仍然是稳定的。最后,90天以后,不含Mn(OAc)2的干燥的(+)蔗糖主混合物完全降解,且含有Mn(OAc)2的主混合物表现出一些降解,但是仍然能够产生生长曲线(图5)。这些结果不仅清楚地表明蔗糖和醋酸锰的稳定效应,而且表明非冷冻干燥的主混合物与冷冻干燥的主混合物相比优良的性能。
实施例4: 在环境温度制备和分析干燥的反应5X RT-PCR主混合物
将具有如实施例1所述的组成(在主混合物中含有或不含蔗糖)的干燥的反应5X RT-PCR主混合物移入2 ml聚丙烯试管中。将Mn(OAc)2加入一半试管中,并将另一半保持不含Mn(OAc)2。将这些样品在无帽2 ml聚丙烯试管中在45℃和在常压下干燥。在45℃保持7天结束时,将2 ml试管盖帽并在环境室温避光储存。在1年时段中确定稳定性时间点。使用如实施例2所述的扩增试剂和条件,通过RT-PCR反应分析这些主混合物。
RT-PCR反应的结果描绘在图6-11所示的生长曲线中。图6表明,在环境(房间)温度保持26天以后,含有蔗糖的干燥的RT-PCR主混合物是稳定的并产生曲线生长,而不含蔗糖的干燥的RT-PCR主混合物完全降解且不产生生长曲线。含有蔗糖的RT-PCR主混合物在71天(图7)、222天(图8)、299天(图9)、353天(图10)和379天(图11)以后表现出在环境温度的贮存稳定性。用加入的Mn(OAc)2干燥的RT-PCR主混合物表现出等于或大于不用所述金属干燥的相同物质的稳定性。这些RT-PCR结果表明,在环境(房间)温度在暗处放置超过12个月以后,用含有蔗糖的RT-PCR主混合物制剂实现了有效扩增。
Claims (18)
1.一种干燥的反应混合物组合物,其包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷酸三磷酸和糖,其中所述组合物是非冷冻干燥的。
2.根据权利要求1的组合物,所述组合物与(i)冷冻干燥的和/或(ii)缺少糖的反应混合物相比具有改善的稳定性。
3.根据权利要求1或2中的任一项的组合物,其中所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。
4.根据权利要求1-3中的任一项的组合物,所述组合物还包含醋酸锰(Mn(OAc)2)。
5.根据权利要求1-4中的任一项的组合物,其中所述组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。
6.根据权利要求1-5中的任一项的组合物,所述组合物还包含至少一种选自适体、去污剂、缓冲剂、盐和寡核苷酸的组分。
7.根据权利要求1-6中的任一项的组合物,其中所述至少一种核酸扩增相关酶是选自以下的热稳定的聚合酶:水生栖热菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus sp.)Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。
8.根据权利要求1-7中的任一项的组合物,其中所述糖以一定量存在,所述量使得如果在水溶液中重构所述组合物,所述糖的浓度是在约50 mM至约1000 mM之间。
9.根据权利要求1-8中的任一项的组合物,其中所述糖是蔗糖。
10.根据权利要求1-9中的任一项的组合物,其中所述组合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。
11.一种制备干燥的反应混合物组合物的方法,所述方法包括:在没有冷冻干燥存在下干燥含水形式的反应混合物,其中所述含水形式的反应混合物包含至少一种核酸扩增相关酶、核苷酸三磷酸和糖。
12.根据权利要求11的方法,其中所述糖选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽糊精和葡聚糖。
13.根据权利要求11或12中的任一项的方法,其中所述组合物在或等同于在45℃保持3个月的条件下贮存后保留活性。
14.根据权利要求11-13中的任一项的方法,所述方法在环境温度实现。
15.根据权利要求11-14中的任一项的方法,其中所述糖在含水形式的反应混合物中的浓度是在约50 mM至约1000 mM之间。
16.根据权利要求11-15中的任一项的方法,其中所述糖是蔗糖。
17.根据权利要求11-16中的任一项的方法,其中所述至少一种核酸扩增相关酶是选自以下的热稳定的聚合酶:水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶、那不勒斯栖热袍菌聚合酶、TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶、以及经修饰的热稳定的聚合酶或它们的任意组合。
18.根据权利要求11-17中的任一项的方法,其中所述干燥的组合物在或等同于在环境温度保持12个月的条件下贮存后保留活性。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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