CN111868259B - 具有高热稳定性的经修饰核苷磷酸 - Google Patents

具有高热稳定性的经修饰核苷磷酸 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于通过PCR和RT‑PCR(逆转录酶‑PCR)进行核酸扩增的稳定核苷酸试剂，所述核苷酸试剂包含在末端磷酸例如在γ‑磷酸处的氟化核苷多磷酸。本发明还提供了使用氟化核苷多磷酸在扩增反应中检测样品中是否存在靶核酸序列的方法。

Description

具有高热稳定性的经修饰核苷磷酸
技术领域
本发明提供了稳定的核苷酸试剂、其合成方法、其使用方法以及包含它们的试剂盒。核苷酸试剂可用于许多重组DNA和RNA技术，尤其是通过聚合酶链反应(PCR)进行的核酸扩增。
背景技术
核酸扩增试剂通常由温度敏感组分组成，因此必须经常在远低于周围环境的温度下存储和运输。脱氧核糖核苷三磷酸腺苷或其核糖核苷三磷酸类似物尤其如此。这些试剂易于经由从末端丢失连续的磷酸基团而降解，导致形成核苷二磷酸和核苷一磷酸，它们不再是核酸聚合酶的底物。此外，二磷酸的形成会抑制酶的活性。核苷多磷酸的稳定性可以通过酯化末端磷酸来改善。例如，在末端磷酸含有甲基酯的dNTP类似物在足以完全降解正常dNTP的热应激条件下是完全稳定的。然而，末端磷酸的酯化可能对这些核苷酸用作某些聚合酶的有效底物的能力产生负面影响。因此对于既是热稳定又是聚合酶有效底物的dNTP类似物存在需求。
发明内容
本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR(逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定的核苷酸试剂，其包含经修饰的核苷多磷酸。本发明还提供了使用经修饰的核苷多磷酸检测扩增反应中样品中靶核酸序列存在或不存在的方法。
因此，一方面，本发明涉及一种检测样品中靶核酸序列存在或不存在的方法，所述方法包括进行扩增步骤，所述步骤包括：如果样品中存在靶核酸序列，则使所述样品接触扩增试剂以产生扩增产物，并检测所述扩增产物，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：
其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。在一个实施例中，n＝1。在另一个实施例中，n＝2。在另一个实施例中，n＝3-4。在一些实施例中，扩增步骤重复至少一次。在一些实施例中，扩增步骤重复至少约20次，但是可以重复多达至少40次，至少60次或至少100次。在一些实施例中，扩增产物在扩增发生后被检测一次。在一些实施例中，在扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，在3、5、10、20、30、40或50个扩增步骤期间和/或之后的限定时间点，或在每个扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，扩增试剂包含热稳定的无机焦磷酸酶。在一些实施例中，扩增试剂包含核酸聚合酶。在一些实施例中，核酸聚合酶具有逆转录酶活性。
在另一方面，本发明涉及一种使用扩增试剂扩增靶核酸序列的方法，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：
其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。在一个实施例中，n＝1。在另一个实施例中，n＝2。在另一个实施例中，n＝3-4。在一些实施例中，扩增步骤重复至少一次。在一些实施例中，扩增步骤重复至少约20次，但是可以重复多达至少40次，至少60次或至少100次。在一些实施例中，扩增产物在扩增发生后被检测一次。在一些实施例中，在扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，在3、5、10、20、30、40或50个扩增步骤期间和/或之后的限定时间点，或在每个扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，扩增试剂包含热稳定的无机焦磷酸酶。在一些实施例中，扩增试剂包含核酸聚合酶。在一些实施例中，核酸聚合酶具有逆转录酶活性。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：
其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。在一个实施例中，n＝1。在另一个实施例中，n＝2。在另一个实施例中，n＝3-4。
在另一方面，本发明涉及反应混合物或试剂盒，所述反应混合物或试剂盒包含核酸聚合酶、缓冲液和具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：
其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。在一个实施例中，n＝1。在另一个实施例中，n＝2。在另一个实施例中，n＝3-4。在一些实施例中，试剂盒的反应混合物包含热稳定的无机焦磷酸酶。在一些实施例中，核酸聚合酶具有逆转录酶活性。在一些实施例中，试剂盒组分作为试剂盒中的单独组分包含在单独的小瓶或容器中。在一些实施例中，试剂盒组分中的一种或多种包含在试剂盒中在同一小瓶或容器中。
在本发明的详细说明和附图中更详细地描述了本发明的实施例和优点。
附图简要说明
图1显示了合成的氟化脱氧核糖核苷多磷酸类似物的化学结构。
图2是化学合成2’-脱氧核糖核苷5’-O-(γ-氟-三磷酸)(dNTP-γF)钠盐的示意图。
图3是化学合成2’-脱氧核糖核苷5’-O-(δ-氟-四磷酸)(dN4P-δF)钠盐的示意图。
图4显示了天然dUTP和dUTP-γF在65℃下的热稳定性。
图5显示了使用Z05聚合酶和rTh焦磷酸酶从DNA靶进行定量PCR扩增反应的增长曲线。
图6显示了使用Z05聚合酶和TIP焦磷酸酶从DNA靶进行定量PCR扩增反应的增长曲线。
图7显示了使用C21聚合酶和rTh焦磷酸酶从披甲HIV-1RNA靶进行逆转录酶定量PCR扩增反应的增长曲线。
图8显示了使用C21聚合酶和TIP焦磷酸酶从披甲HIV-1RNA靶进行逆转录酶定量PCR扩增反应的增长曲线。
具体实施方式
本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR(逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定的核苷酸试剂，其包含氟化的脱氧核糖核苷多磷酸。本发明还提供了使用氟化的脱氧核糖核苷多磷酸检测扩增反应中样品中靶核酸序列存在或不存在以及扩增样品中靶核酸序列的方法。脱氧核糖核苷多磷酸的稳定性提高允许在复杂的水性混合物(例如基于PCR的诊断测试中使用的预混试剂)中长期存储。
定义
除非另外指明，本文所用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管基本上任何与本文描述的方法和材料相似的方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是仅描述了示例性方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
除非上下文另外清楚指出，术语“一个”、“一种”、“所述”包含复数指代。
术语“环境温度”是指周围的温度，并且在指代温度受控的室内建筑物的温度时与“室温”同义。通常，环境温度是指15℃至25℃之间的温度范围，尽管仍可以认为在环境温度范围内稍微更凉或稍微更热。
术语“适配体”是指识别并结合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的单链DNA，如美国专利号5,693,502中所述。适配体和dUTP/UNG在RT-PCR中的用途在诸如Smith，E.S.等人(Amplification of RNA：High-temperature Reverse Transcription and DNAAmplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase，in PCRPrimer：A Laboratory Manual，第2版，Dieffenbach，C.W.和Dveksler，G.S.，编辑，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，211-219，(2003))的著作中亦被提及讨论。
如本文所用，“重组”是指通过重组方法有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”是指通常通过限制性核酸内切酶对核酸的操作以自然界中通常不存在的形式而最初体外形成的核酸。因此，出于本发明的目的，分离的线性形式的突变DNA或通过连接通常在自然界中不连接的DNA分子在体外形成的表达载体均被认为是重组。应当理解，一旦制备了重组核酸并将其重新引入宿主细胞，它将使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作非重组地复制；然而，这种核酸一旦被重组产生，尽管随后非重组地复制，但是出于本发明的目的仍被认为是重组。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术，即，通过如上描述的重组核酸表达所制备的蛋白。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，核酸是“有效地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子有效地连接至所述编码序列，或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点被有效地连接至编码序列。
术语“宿主细胞”是指单细胞原核生物和真核生物(例如，细菌、酵母和放线菌属)以及在细胞培养中生长的来自高级植物或动物的单细胞。
术语“载体”是指一段DNA，通常是双链的，其可能已在其中插入了一段外源DNA。载体可以是例如质粒来源的。载体包含“复制子”多核苷酸序列，其促进载体在宿主细胞中的自主复制。外源DNA被定义为异源DNA，其是宿主细胞中天然不存在的DNA，所述异源DNA例如复制载体分子、编码可选择标志物或筛选标志物或编码转基因。载体用于将外源或异源DNA转运到合适的宿主细胞中。一旦进入宿主细胞，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA整合，并且可以生成所述载体及其插入的DNA的多个拷贝。另外，载体还可以包含允许插入的DNA转录成mRNA分子或以其他方式引起插入的DNA复制成RNA的多个拷贝的必需元件。一些表达载体还另外含有与插入的DNA相邻的序列元件，其增加了表达的mRNA的半衰期和/或允许mRNA翻译成蛋白分子。因此，可以快速合成由插入的DNA编码的许多mRNA和多肽分子。
“扩增试剂”是能够扩增核酸的化学或生化组分。这样的试剂包括但不限于核酸聚合酶、缓冲液、单核苷酸(例如核苷三磷酸)、寡核苷酸(例如作为寡核苷酸引物)、盐及其各自的溶液、检测探针、染料等。
如本领域已知的，“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这种杂环碱基的两种最常见的类别是嘌呤和嘧啶。
“核苷酸”是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸基团可以被连接至糖的2′-、3′-抑或5′-羟基部分。核苷酸是“寡核苷酸”的单体单元，该寡核苷酸可以更一般地表示为“寡聚化合物”，或“多核苷酸”，更一般地表示为“聚合化合物”。前述的另一种通用表达是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
“寡聚化合物”是由“单体单元”组成的化合物，其可以是单独的核苷酸或非天然化合物(参见下文)，更具体地，是单独的经修饰的核苷酸(或核苷酸类似物)或非核苷酸化合物或其组合。
“寡核苷酸”和“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是寡聚化合物的亚组。术语“寡核苷酸”是指由多个核苷酸作为其单体单元而形成的组分。磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间骨架。RNA和DNA的正常键或骨架是3′至5′磷酸二酯键。对本发明有用的寡核苷酸和经修饰的寡核苷酸(参见下文)可以如本领域中主要描述的并且为本领域技术人员已知的那样合成。制备具有特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的，并且包括例如克隆和限制适当序列以及直接化学合成。化学合成方法可以包括，例如，NarangS.A.等人在Methods in Enzymology 68(1979)90-98中所描述的磷酸三酯方法，BrownE.L.等人在Methods in Enzymology 68(1979)109-151中所公开的磷酸二酯方法，Beaucage等人在Tetrahedron Letters 22(1981)1859中所公开的亚磷酰胺方法，Garegg等人在Chem.Scr.25(1985)280-282中所公开的H-膦酸酯方法和在US 4,458,066中所公开的固体支持体方法。
在上述方法中，寡核苷酸可以经化学修饰，即引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后，探针或引物是经修饰的寡核苷酸。
“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过一些修饰与天然核苷酸不同，但仍由碱基、戊呋喃糖基糖、磷酸部分、碱基样，戊呋喃糖基糖样和磷酸样部分或其组合组成。例如，标记可以连接到核苷酸的碱基部分，由此获得经修饰的核苷酸。核苷酸中的天然碱基也可以被例如7-脱氮嘌呤取代，由此也获得了经修饰的核苷酸。
术语“甲基化的dNTP(methylated dNTP/methylated-dNTPs)”是指任何在三磷酸部分具有一个或多个添加的甲基基团的脱氧核糖核苷三磷酸或dNTP。实例包括甲基化的dATP、甲基化的dCTP、甲基化的dGTP、甲基化的dTTP和甲基化的dUTP。一个或多个甲基可以使dNTP中的任何α-、β-或γ-磷酸基团中的一个或多个酯化。在一个特定的实例中，甲基化的dNTP使得每个dNTP的末端γ-磷酸基团被甲基基团修饰，与常规的未修饰的dNTP相比，该经修饰的dNTP产生了用于扩增反应(诸如PCR)的更稳定的dNTP组分。
术语“氟化的脱氧核糖核苷多磷酸”是指在一个磷酸基团上被氟化的任何脱氧核糖核苷多磷酸。实例包括dATP-γF、dCTP-γF、dGTP-γF、dTTP-γF和dUTP-γF。进一步的实例包括dA4P-δF、dC4P-δF、dG4P-δF、dT4P-δF和dU4P-δF。氟原子可以取代在脱氧核糖核苷多磷酸中的α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ-磷酸基团中的任何一个上的一个氧。在一个特定的实例中，氟化的多磷酸使得每个脱氧核糖核苷多磷酸的末端磷酸基团被氟化，与常规的未修饰的dNTP相比，产生了用于扩增反应(诸如PCR)的更稳定的多磷酸组分。
术语“热稳定的无机焦磷酸酶(thermostable inorganic pyrophosphatase/thermostable inorganic pyrophosphatase enzyme)”在本文中可互换使用，是指催化无机焦磷酸水解形成正磷酸的酶：P2O7 -4+H2O-＞2HPO4 -2，并能够在PCR条件下所使用的温度(例如90℃以上)保持活性。热稳定的无机焦磷酸酶的一个实例是源自嗜热生物嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的一种，其可从New England BioLabs(Ipswich，MA)商购获得。
属于寡聚化合物的另一特定亚组的“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)具有一个或多个核苷酸和一个或多个经修饰的核苷酸作为单体单元。因此，术语“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是指以基本上类似于寡核苷酸的方式起作用的结构，并且在本发明的上下文中可以互换使用。从合成的观点来看，经修饰的寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)可以例如通过适当修饰磷酸骨架、核糖单位或核苷酸碱基来对寡核苷酸进行化学修饰而制得(Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews 90(1990)543；Verma S.和EcksteinF.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134)。代表性的修饰包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷间键代替磷酸二酯核苷间键；脱氮-或氮杂嘌呤和-嘧啶代替天然嘌呤和嘧啶碱基、在5或6位具有取代基的嘧啶碱；在第2位、第6位或第8位或第7位(如7-脱氮嘌呤)具有改变的取代基的嘌呤碱基；携带烷基-、链烯基-、链炔基或芳基-部分(诸如低级烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基或芳基基团如苯基、苄基、萘基)的碱基；在例如其2′位具有取代基的糖；或碳环或无环糖类似物。其他修饰是本领域技术人员已知的。这种经修饰的寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)最好被描述为与天然寡核苷酸在功能上可互换、但结构上不同。更详细地，示例性的修饰公开在Verma S.和Eckstein F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134或WO 02/12263中。另外，可以做出这样的修饰，其中核苷单元经由取代核苷间磷酸或糖磷酸键的基团连接。这样的键包括在Verma S.和Eckstein F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134中公开的那些。当利用磷酸键以外的键来连接核苷单元时，这样的结构也已经被描述为“寡核苷”。
“核酸”以及“靶核酸”是如本领域的熟练专家已知的核苷酸的多聚化合物。“靶核酸”在本文中用于表示样品中应该分析的核酸，即应该确定其在样品中的存在、不存在和/或量。
术语“引物”在本文中如本领域的熟练专家已知的那样使用，且指能够引发通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA合成的寡聚化合物，主要指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如引物的3′端提供游离的3′-OH基团，另外核苷酸可以通过模板依赖性DNA聚合酶建立3′-至5′-磷酸二酯键与其连接，由此使用脱氧核苷三磷酸且由此释放焦磷酸。
“探针”也表示天然的或经修饰的寡核苷酸。如本领域已知的，探针符合检测分析物或扩增物的目的。在上述的方法的情况下，可以使用探针来检测靶核酸的扩增物。为此目的，探针一般携带标记。
“标记”经常被称作“报告基团”，通常是这样的基团：其使与其结合的核酸，特别是寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸，以及任何核酸与样品的剩余部分可区分开(已经连接标记的核酸也可以被称作标记的核酸结合化合物、标记的探针或仅探针)。示例性的标记是荧光标记，其是诸如荧光染料如荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料和香豆素染料。示例性的荧光染料是FAM、HEX、JA270、CAL635、香豆素343、Quasar705、Cyan500、CY5.5、LC-Red 640、LC-Red 705。
在一些实施例中，标记可以经由“接头”或“接头臂”与嘌呤或嘧啶碱基或类似物连接。接头臂的长度是以埃()表示的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，接头臂为约至约/>接头臂可以是WO84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂连接至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分连接至接头臂的方法。示例性地，受体荧光部分诸如LC Red 640-NHS-酯可以与C6-亚磷酰胺(可得自ABI(Foster City，Calif.)或Glen Research(Sterling，Va.))组合，以产生LC Red 640-亚磷酰胺。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自GlenResearch或ChemGene(Ashland，Mass.)的荧光素-CPG′s)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(San Ramon，Calif.)的荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3′-氨基-CPGs。而且，非核苷接头可以例如是脂肪族、芳香族、芳基、环状、手性、非手性、肽、碳水化合物、脂质、脂肪酸、三-、四-、五-、六-聚乙二醇(HEG)或多-聚乙二醇(PEG)，或杂环部分。其他常规的非核苷接头采用同双功能和异双功能交联剂。同双功能试剂携带2个相同的官能团，而异双功能试剂含有2个不同的官能团，以连接生物制品与生物粘附剂。绝大多数的异双功能交联剂含有伯胺反应基团和硫醇反应基团。共价交联剂选自能够形成二硫键(S--S)、二醇(--CH(OH)--CH(OH)--)、偶氮(--N＝N--)、砜(--S(＝O2--)、酯(--C(＝O)--O--)或酰胺(--C(＝O)--N--)桥的试剂。
任何引物和/或探针可以经化学修饰，即引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后，探针或引物是经修饰的寡核苷酸。
核酸扩增的方法是聚合酶链式反应(PCR)，其公开于美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188以及其他参考文献。PCR通常采用两个或更多个寡核苷酸引物，其与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合。用于核酸分析的引物包括能够充当在靶核酸的核酸序列内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物可以是单链的，但引物可以是双链的。首先将双链引物变性(即处理)以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。“热稳定的聚合酶”是热稳定的聚合酶，即其为催化与模板互补的引物延伸产物的形成并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时没有不可逆地变性的酶。通常，合成在每个引物的3′末端处起始，并且沿着模板链以5′至3′方向前进。例如已从黄栖热菌(Thermus/lavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。
如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至它多数变性(例如大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常范围在约90℃至约105℃，持续取决于反应特征(诸如温度和核酸长度)的一段时间。变性通常进行约5秒至9分钟。为了不使相应的聚合酶(例如Z05 DNA聚合酶)暴露于此类高温太长时间并因此处于损失功能性酶的风险，可以优选使用短的变性步骤。
如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每个引物退火至其在靶核酸上的靶标序列的温度。
用于退火的温度可以是约35℃至约70℃，或约45℃至约65℃；或约50℃至约60℃，或约55℃至约58℃。退火时间可以是约10秒至约1分钟(例如约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。在此上下文中，使用不同的退火温度以增加相应测定的包容性可以是有利的。简而言之，这意味着在相对低的退火温度下，引物也可以结合具有单一错配的靶标，因此也可以扩增某些序列的变体。如果例如某种生物体具有已知或未知的遗传变体(其也应当检测)，则这也是合乎需要的。另一方面，相对高的退火温度具有提供更高特异性的优点，因为朝向更高的温度，引物结合不完全匹配的靶序列的概率连续降低。为了受益于两种现象，在本发明的一些实施例中，上述方法包括在不同温度下退火，例如首先在较低温度下退火，然后在较高温度下退火。如果例如第一孵育在55℃下进行约5个循环，则可以(预)扩增非精确匹配的靶序列。这可以随后例如在58℃下进行约45个循环，在整个实验的主要部分提供更高的特异性。这样，不丢失潜在重要的遗传变体，而保持相对高的特异性。
然后将反应混合物调整至聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度，即足以使延伸从退火引物发生，以生成与待分析的核酸互补的产物的温度。温度应足以从退火至核酸模板的每个引物合成延伸产物，但不应如此高，以使延伸产物变性脱离其互补模板(例如用于延伸的温度通常范围为约40℃至80℃(例如约50℃至约70℃；约65℃))。延伸时间可以是约10秒至约5分钟，或约15秒至2分钟，或约20秒至约1分钟，或约25秒至约35秒。新近合成的链形成可以在反应的以后步骤中使用的双链分子。链分离、退火和延长步骤可以根据需要重复多次，以产生所需数量的对应于靶核酸的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)可以重复至少一次。对于在检测中的使用，循环步骤数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶标序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。
可以实施PCR，其中退火和延伸的步骤在同一步骤中进行(一步PCR)，或者如上所述，在分开的步骤中进行(两步PCR)。一起进行退火和延伸，且因此在相同的物理和化学条件下进行退火和延伸，用合适的酶(诸如例如Z05 DNA聚合酶)，具有节省每个循环中额外步骤的时间并且还消除退火与延伸之间的额外温度调节的需求的优点。因此，一步PCR降低相应测定的总体复杂性。
通常，总体扩增的较短时间可以是优选的，因为至结果的时间减少并且导致可能的较早诊断。
待使用的其他核酸扩增方法包括连接酶链式反应(LCR；Wu D.Y.和Wallace R.B.，Genomics 4(1989)560-69；和Barany F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(WO90/01069)；修复链式反应(EP0439182 A2)，3SR(Kwoh D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)1173-1177；Guatelli J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO 92/08808)，和NASBA(US 5,130,238)。此外，还有链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qb-扩增(对于综述，参见例如Whelen A.C.和Persing D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson R.D.和Myers T.W.，Curr OpinBiotechnol 4(1993)41-47)。
术语“Cp值”或“交叉点”值是指允许对输入的目标核酸进行定量的值。可以根据二阶导数最大法(the second-derivative maximum method)确定Cp值(Van Luu-The等人，“Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurementsusingsecond derivative calculation and double correction，”BioTechniques，第38卷，第2期，2005年2月，第287-293页)。在二阶导数法中，Cp对应二阶导数曲线的第一峰。此峰对应对数线性相的开始。二阶导数法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值，且仅获得一个值。初始Cp方法基于强度值的局部定义的可微分的近似值，例如，通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小的根。也可以使用拟合点法确定Cp，其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉确定Cp(Van Luu-The等人，BioTechniques，第38卷，第2期，2005年2月，第287-293页)。Roche提供的LightCycler仪器通过根据二阶导数最大法计算而提供Cp值。
术语“PCR效率”是指循环至循环扩增效率的指标。使用以下方程式计算每种条件的PCR效率：％PCR效率＝(10(-斜率)-1)x 100计算每种条件的PCR效率，其中通过y轴上绘制的对数拷贝数和x轴上绘制的Cp的线性回归而计算斜率。可以使用完全匹配或错配的引物模板测量PCR效率。
术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”是指至少两个发色团、供体发色团和受体发色团(被称为猝灭剂)之间的能量转移。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。当受体是“黑暗”猝灭剂时，它以除光以外的形式耗散转移的能量。特定的荧光团充当供体还是受体起作用取决于FRET对的其他成员的特性。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHoleQuenchersTM(BHQ)(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)和BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。
上文所述的方法可以基于供体荧光部分与受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)。代表性的供体荧光部分是荧光素，且代表性的对应的受体荧光部分包括LC-Red640、LC-Red 705、Cy5和Cy5.5。通常，检测包括在由供体荧光部分吸收的波长处激发样品并且显现和/或测量由对应的受体荧光部分发射的波长。在根据本发明的方法中，检测之后可以定量FRET。例如，在每个循环步骤之后进行检测。例如，实时进行检测。通过使用商购可得的实时PCR仪器(例如，LightCyclerTM或)，可以以显著减少的循环时间在单个封闭的小杯中组合PCR扩增和扩增产物的检测。由于检测与扩增同时发生，所以实时PCR方法消除了操作扩增产物的需要，并且减少了扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR大大减少周转时间并且是临床实验室中常规PCR技术的有吸引力的替代方案。
以下专利申请描述了如技术中使用的实时PCR：WO97/46707、WO97/46714和WO 97/46712。/>仪器是一种与利用高质量光学器件的微体积荧光计组合的快速热循环仪。此快速热循环技术使用薄玻璃小杯作为反应容器。通过交替加热的和环境的空气来控制反应室的加热和冷却。由于空气的低质量和小杯的高表面积与体积比率，可以在热室内实现非常快速的温度交换速率。
技术利用由两个荧光部分标记的单链杂交探针。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。以此形式使用的典型荧光染料例如尤其是FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan和CY5.5。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶核酸(即扩增产物)结合，并且在后续延长期过程中，通过Taq或如技术人员已知的另一合适的聚合酶(诸如突变Z05聚合酶)的5′至3′外切核酸酶活性来降解。因此，激发的荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。
在上述两种检测形式中，发射的信号的强度可以与原始的靶核酸分子的数量相关。
最近，在美国专利公开号2018/0073056和美国专利公开号2018/0073064中描述了使用“标记的”探针进行多重PCR测定的方法。
作为FRET的替换物，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，SYBRGREEN或/>(分子探针))，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常执行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。
也可以使用连同FRET一起的分子信标来检测使用本公开内容的实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与扩增产物杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。
因而，根据本发明的方法是上述使用FRET的方法，其中所述探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致所述第一荧光部分与第二荧光部分之间的空间接近。
只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。
因而，在一个实施例中，所述供体和受体荧光部分在所述探针上在彼此的不多于5个核苷酸内。在进一步的实施例中，所述受体荧光部分是猝灭剂。
如上所述，在形式中，在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶核酸(即扩增产物)结合，并且在后续延长期过程中，通过Taq或如技术人员已知的另一合适的聚合酶(诸如突变Z05聚合酶)的5′至3′外切核酸酶活性来降解。因而，在一个实施例中，在上述的方法中，扩增采用具有5′至3′外切核酸酶活性的聚合酶。
进一步有利的是，仔细地选择由于上述方法产生的扩增子的长度。通常，相对短的扩增子增加扩增反应的效率。因而，本发明的一个方面是上述的方法，其中扩增的片段包含最多450个碱基、最多300个碱基、最多200个碱基或最多150个碱基。
“序列”是核酸的一级结构，即组成各个核酸的单个核碱基的特定排列。必须理解，术语“序列”不表示特定类型的核酸如RNA或DNA，而是适用于这两者以及其他类型的核酸，诸如例如PNA或其他。如相关领域中众所周知的，在核碱基彼此对应的场合，特别是在尿嘧啶(存在于RNA中)和胸腺嘧啶(存在于DNA中)的情况下，可以认为这些碱基在RNA与DNA序列之间是等同的。
临床上有关的核酸经常是DNA，其可以源自DNA病毒，如例如乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)等，或细菌，如例如砂眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏球菌(NG)等。在这样的情况下，为了反映靶核酸性质，使用由DNA组成的内部对照核酸可以是有利的。术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，且所有这样的名称都包括后代。因而，词语“转化体”或“转化的细胞”包括原代转化的细胞和不考虑转移的数目从该细胞衍生出的培养物。由于故意的或非故意的突变，所有后代可能在DNA含量上不是精确地相同的。在转化体的定义中包括具有与在最初转化的细胞中筛选的功能相同的功能的突变后代。细胞可以是原核的或真核的。
术语“控制序列”指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵基因序列、核糖体结合位点、正反向调控元件(参见美国专利号4,666,848)和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
术语“可操作连接”指编码序列的定位，使得控制序列将起作用以驱动由编码序列编码的蛋白的表达。因而，与控制序列“可操作连接”的编码序列表示这样的构型：其中编码序列可以在控制序列的指导下表达。
术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”指在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA的酶，其通常是细菌起源的。
在本文中定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
术语“试剂溶液”是包含至少一种用于PCR目的需要或使用的试剂的任何溶液。大多数典型成分是聚合酶、核苷酸、引物、离子、镁、盐、pH缓冲剂、核苷酸三磷酸(NTP)或脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、探针、荧光染料(可以连接至探针)、核酸结合剂、核酸模板。试剂还可以是其他聚合酶反应添加剂，其对聚合酶反应或其监测具有影响。
术语“主混合物”指PCR发生所需的所有或大部分成分或因子的混合物，且在一些情况下，指除了样品和扩增子特异性的模板和引物以外的全部。商购可得的主混合物通常是浓缩的溶液。主混合物可以含有多种样品共用的所有试剂，但其也可以仅为一种样品构建。使用主混合物有助于减小由移液的体积之间的差异引起的样品之间的移液错误和变动。
术语“热稳定的聚合酶”指这样的酶：其对热稳定，耐热，并且当遭受升高的温度持续双链核酸变性所需的时间之后保留足够的活性以实现随后的引物延伸反应。核酸变性所需的加热条件是本领域中众所周知的，并且在美国专利号4,965,188和4,889,818中举例说明。如本文所用，热稳定的聚合酶适合用在温度循环反应(诸如PCR)中。热稳定的核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属Z05聚合酶、黄栖热菌聚合酶、海栖热袍菌聚合酶诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能够基于RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。一旦RNA已经被逆转录为单链cDNA，其还能够复制单链或双链DNA。在本发明的一个实施例中，具有逆转录酶活性的聚合酶是热稳定的。
在通过DNA聚合酶的RNA分子扩增中，第一延伸反应是使用RNA模板的逆转录，并且产生DNA链。使用DNA模板的第二延伸反应产生双链DNA分子。因此，通过DNA聚合酶从RNA模板合成互补DNA链为扩增提供原料。
热稳定的DNA聚合酶可以在偶联的单酶逆转录/扩增反应中使用。在此上下文中，术语“同质”是指用于RNA靶标的逆转录和扩增的两步单一加成反应。同质意味着在逆转录(RT)步骤之后，在扩增步骤前不需要打开反应容器或在其他方面调整反应组分。在非同质RT/PCR反应中，在逆转录后且在扩增前，例如调节、添加或稀释一种或多种反应组分(诸如扩增试剂)，对此必须打开反应容器，或至少必须操作其内容物。本发明的范围均包含同质和非同质的实施例。
逆转录是RT/PCR中的一个重要步骤。例如，在本领域中已知RNA模板表现出形成二级结构的倾向，所述二级结构可以妨碍引物结合和/或通过相应的逆转录酶的cDNA链延伸。因而，RT反应的相对高温度就转录的效率而言是有利的。另一方面，提高孵育温度也意味着更高的特异性，即RT引物将不退火至表现出与预期的一个或多个序列的错配的序列。特别是在多个不同靶RNA的情况下，可以期望其也转录并且随后扩增和检测具有单一错配的序列，例如，在流体样品中可能存在未知的或罕见的生物体的亚株或亚种的情况下。
为了受益于上述的两个优点，即二级结构的减少和具有错配的模板的逆转录，可以在多于一个不同的温度实施RT孵育。
因此，本发明的一个方面是上文所述的方法，其中具有逆转录酶活性的聚合酶的所述孵育在30℃至75℃、或45℃至70℃、或55℃至65℃的不同温度下实施。
作为逆转录的一个进一步的重要方面，长RT步骤可以破坏可能存在于流体样品中的DNA模板。如果流体样品同时含有RNA和DNA种类，则因而有利的是保持RT步骤的持续时间尽可能短，但同时确保为随后的扩增和任选的扩增产物检测合成足够量的cDNA。
因而，本发明的一个方面是上文所述的方法，其中用于孵育具有逆转录酶活性的聚合酶的时间段是长达30分钟、20分钟、15分钟、12.5分钟、10分钟、5分钟或1分钟。
本发明的一个进一步方面是上文所述的方法，其中具有逆转录酶活性并且包含突变的聚合酶选自：
a)CS5 DNA聚合酶
b)CS6 DNA聚合酶
c)海栖热袍菌(Thermotoga maritima)DNA聚合酶
d)水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶
e)嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶
f)黄栖热菌(Thermus flavus)DNA聚合酶
g)丝状栖热菌(Thermus filiformis)DNA聚合酶
h)栖热菌属物种sps17(Thermus sp.sps17)DNA聚合酶
i)栖热菌属物种(Thermus sp.)Z05 DNA聚合酶
j)那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DNA聚合酶
k)非洲栖热腔菌(Termosipho africanus)DNA聚合酶
1)Thermus caldophilus DNA聚合酶
特别适用于这些要求的是在聚合酶结构域中携带在更快的延伸速率方面增强其逆转录效率的突变的酶。
因此，在上述方法中，其中具有逆转录酶活性的聚合酶是包括突变的酶，该突变赋予相对于相应的野生型聚合酶改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录酶活性。
在一个实施例中，在上述方法中，具有逆转录酶活性的聚合酶是包括突变的酶，该突变赋予相对于相应的野生型聚合酶改善的逆转录酶活性。
在WO2008/046612中公开了携带使得它们特别有用的点突变的聚合酶。具体而言，待使用的聚合酶可以是在聚合酶结构域中至少包含以下基序的突变DNA聚合酶：
T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N；其中Xb7是选自S或T的氨基酸，且其中Xb8是选自G、T、R、K或L的氨基酸，其中聚合酶包含3′-5′外切核酸酶活性并且具有相对于野生型DNA聚合酶改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录效率，其中在所述野生型DNA聚合酶中，Xb8是选自D、E或N的氨基酸。
一个实例是来自栖热菌物种Z05(例如在US 5,455,170中描述)的热稳定性DNA聚合酶的突变，所述变异包含与相应的野生型酶Z05相比在聚合酶结构域中的突变。用于根据本发明的方法的一个实施例是突变Z05DNA聚合酶，其中位置580处的氨基酸选自：G、T、R、K和L。
对于使用热稳定性聚合酶的逆转录，通常以盐形式包括二价阳离子(诸如Mn2+或Mg2+)，例如氯化锰(MnCl2)或乙酸锰(Mn(OAc)2)或硫酸锰(MnSO4)或氯化镁(MgCl2)，乙酸镁(Mg(OAc)2)或硫酸镁(MgSO4)。如果在含有50mM Tricine缓冲液的反应中包括MnCl2，则例如MnCl2通常以0.5-7.0mM的浓度存在；当使用各200μM的dGTP、dATP、dUTP和dCTP时，通常存在2.5-3.5mM。
“经修饰的”热稳定的聚合酶是指其中至少一个单体不同于参照序列的聚合酶，诸如天然或野生型形式的聚合酶或另一种修饰形式的聚合酶。示例性修饰包括单体插入、缺失和取代。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定的组分序列(例如，结构或功能结构域等)。在经修饰的聚合酶的定义内还包括包含参照序列的化学修饰的那些。经修饰的热稳定的聚合酶的实例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46EL329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶等。
术语“热活性的聚合酶”是指在确保特异性的引发和引物延伸所必需的高温(例如，55-80℃)有活性的酶。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”互换使用。术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用。除非另外指出，否则从氨基末端至羧基末端书写氨基酸序列。除非另外指出，否则从5′至3′书写单链核酸序列。除非另外指出，否则从5′至3′书写双链核酸序列的上链，且从3′至5′书写下链。
核酸扩增试剂通常由温度敏感组分构成，且因此通常必须在远低于环境温度的温度下储存和运输。对于脱氧核苷三磷酸或其核糖核苷类似物的情况尤其如此。这些试剂易于经由从末端失去连续的磷酸酯基团而降解，导致形成核苷二磷酸和单磷酸，这二者都不再具有作为聚合酶底物的活性。
核苷多磷酸的稳定性可以通过酯化末端磷酸来改善。例如，在磷酸末端含有甲基酯的dNTP类似物在足以完全降解正常dNTP的热应激条件下是完全稳定的。然而，末端磷酸的酯化可以对核苷酸充当某些聚合酶的有效底物的能力具有负面影响。
本发明呈现了解决此问题的简单而精妙的方案。标准右旋糖苷三磷酸被类似物取代，从而末端磷酸含有如下所示的氟部分：
其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。
给出以下实例来举例说明本发明的实施例，如其目前优选所实行的。应当理解，所述实例是说明性的，并且除了在所附权利要求中指示以外，本发明不应视作受到限制。
实例
实例1：2′-脱氧核糖核苷5′-O-(γ-氟三磷酸)和2′-脱氧核糖核苷5′-O-(δ-氟四磷酸)的化学合成
2′-脱氧核糖核苷5′-O-(γ-氟三磷酸)(dNTP-γF)和2′-脱氧核糖核苷5′-O-(δ-氟四磷酸)(dN4P-δF)的化学结构在图1中示出，其合成为钠盐的示意图分别在图2和图3中示出。
缩写：DEPC＝焦碳酸二乙酯，dATP＝2′-脱氧腺苷5′-三磷酸，dCTP＝2′-脱氧胞苷5′-三磷酸，dGTP＝2′-脱氧鸟苷5′-三磷酸，DMF＝N，N′-二甲基甲酰胺，DMSO＝二甲基亚砜，dUTP＝2′-脱氧尿苷5′-三磷酸，MeCN＝乙腈，qPCR＝实时聚合酶链反应，RT＝室温，RT-qPCR＝逆转录聚合酶链反应，TBAF＝氟化四丁基铵，THF＝四氢呋喃，UPLC-MS＝质谱联用的超高效液相色谱仪。
A.2′-脱氧腺苷5′-O-(γ-氟三磷酸)，dATP-γF的合成
将dATP(1.5mmol)的钠盐转化为三乙铵盐并冻干。将化合物溶解在干燥的MeCN中，并转移到反应烧瓶中。随后，蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。在氩气下，将三乙基三磷酸铵溶解在DMF(7.7mL)和三丁胺(968μL)的无水混合物中，然后逐滴添加1-氟-2，4-二硝基苯(562μL)。观察到反应混合物立即变为黄色，其在几分钟内变为深橙色。将反应溶液在室温下再搅拌30分钟，然后添加无水TBAF(4.48mL，在THF中为1.0M)。在室温下搅拌过夜后，UPLC-MS分析表明原料已完全消耗。通过将反应溶液滴加到碘化钠在无水丙酮中的搅拌溶液中(20mL，0.5M)进行反淬灭反应。离心分离沉淀物(在4000rpm下4分钟)，弃去上清液。通过反复重悬和离心，用无水丙酮洗涤沉淀。将粗产物干燥并用反相液相色谱法纯化。合并的产物馏分通过固相萃取(C18)浓缩，并通过在无水丙酮(0.5M)中用碘化钠沉淀转化为钠盐。获得最终的无色产物，最终产率为73％(纯度＞99％)。
B.2′-脱氧胞嘧啶5′-O-(γ-氟三磷酸)，dCTP-γF的合成
使用dCTP(1.11mmol)、三丁胺(720μL)、DMF(5.8mL)、TBAF(3.33mL，在THF中为1.0M)和1-氟-2，4-二硝基苯(418μL)类似于实施例1A进行合成。在引入1-氟-2，4-二硝基苯之前，先加入干燥的DMSO(1.0mL)，以获得原料的澄清溶液。分离纯化产物的钠盐，最终产率为55％(纯度＞99％)。
C.2′-脱氧鸟苷5′-O-(γ-氟三磷酸)，dGTP-γF的合成
使用dGTP(1.09mmol)、三丁胺(706μL)、DMF(5.6mL)、TBAF(3.3mL，在THF中为1.0M)和1-氟-2，4-二硝基苯(410μL)类似于实施例1A进行合成。在引入1-氟-2，4-二硝基苯之前，先加入干燥的DMSO(3.0mL)，以获得原料的澄清溶液。分离纯化产物的钠盐，最终产率为27％(纯度＞99％)。
D.2′-脱氧尿苷5′-O-(γ-氟三磷酸)，dUTP-γF的合成
使用dUTP(1.0mmol)、三丁胺(649μL)、DMF(5.2mL)、TBAF(3.0mL，在THF中为1.0M)和1-氟-2，4-二硝基苯(377μL)类似于实施例1A进行合成。在引入1-氟-2，4-二硝基苯之前，将无水DMSO(3.0mL)添加到反应混合物中以获得原料的澄清溶液。分离纯化产物的钠盐，最终产率为42％(纯度＞99％)。
E.2′-脱氧腺苷5′-O-(δ-氟四磷酸)，dA4P-δF的合成
氟磷酸钠(3.909mmol)通过阳离子交换转化为三乙铵盐。蒸发溶剂得到无色化合物，其在高真空下干燥。在氩气下，将氟磷酸溶解在DMSO(8.2mL)和MeCN(5.0mL)的无水混合物中。加入咪唑(1.33g)，并将溶液搅拌10分钟，然后加入三苯膦(2.563g)和2-氨基苯基二硫化物(1.456g)。将反应混合物加热至40℃，直到所有组分完全溶解，并在室温下搅拌过夜。通过UPLC-MS跟踪反应进程，直到没有另外的产物形成为止。通过滴加冷碘化钠在无水丙酮中的搅拌溶液(30mL，0.5M)终止反应。离心分离分离形成的沉淀物(4000rpm下4分钟)。用无水丙酮反复洗涤颗粒。将合并的上清液在4℃冷却过夜，这导致无色产物的进一步沉淀。将合并的氟磷酸咪唑钠的沉淀物在高真空下干燥，无需进一步纯化即可使用。
将dATP(0.25mmol)的钠盐转化为三乙铵盐并冻干。将残余物溶于干燥的MeCN中，转移至反应烧瓶中，在旋转蒸发仪中除去溶剂，并在高真空下干燥。在氩气下将三磷酸酯溶于无水DMF(1.68mL)。在第二个烧瓶中，将氟代磷酸咪唑啉(1.125mmol)溶于无水DMF(1.68mL)中。随后，将1.0mL的咪唑化物溶液逐滴转移至dATP溶液中。加入ZnCl2(273mg)，并将混合物在室温下搅拌2.0小时。然后，将剩余的咪唑啉溶液转移至反应混合物中，并通过UPLC-MS追踪反应进程，直到没有另外的产物形成为止。加入4.0mL EDTA水溶液(0.5M，pH8.0)终止反应。继续剧烈搅拌15分钟，然后将反应混合物滴加到碘化钠在无水丙酮(0.5M)中的搅拌溶液中。离心分离无色沉淀物(在4000rpm下4分钟)，弃去上清液。将粗产物干燥并用反相液相色谱法纯化。合并的产物馏分通过固相萃取(C18)浓缩，并通过在无水丙酮(0.5M)中用碘化钠沉淀转化为钠盐。获得最终的无色产物，反应产率为63％(纯度＞98％)。
F.2′-脱氧胞嘧啶5′-O-(δ-氟四磷酸)，dC4P-δF的合成
使用dCTP(0.25mmol)作为原料，类似于实施例1E进行合成。分离纯化产物的钠盐，反应产率为21％(纯度＞98％)。
G.2′-脱氧鸟苷5′-O-(δ-氟四磷酸)，dG4P-δF的合成
以dGTP(0.25mmol)为起始原料，与实施例1E相似地进行合成，不同之处在于在添加ZnCl2之前将1-甲基-2-吡咯烷酮(1.5mL)添加至反应混合物中。分离纯化产物的钠盐，反应产率为25％(纯度＞98％)。
H.2′-脱氧尿苷5′-O-(δ-氟四磷酸)，dU4P-δF的合成
使用dUTP(0.25mmol)作为起始原料，类似于实施例1E进行合成。分离纯化产物的钠盐，反应产率为68％(纯度＞99％)。
实施例2：dNTP-γ F的稳定性研究
制备包含300μM氟代多磷酸、40％DMSO和1.0M乙酸钾的水性混合物。作为参考，用300μM dNTP代替氟代多磷酸制备另一种混合物。两种溶液(300μL)在Thermoshaker中于65℃孵育。在几个时间点取每种溶液的样品(20μL)并通过UPLC-MS分析。确定在260nm处吸收迹线的峰面积，以计算原料和降解产物的相对百分比。
结果：在使用条件下，常规dNTP迅速降解为单磷酸和二磷酸，这已通过UPLC-MS确认。相反，氟代多磷酸是稳定的，并且在65℃下持续140小时没有观察到降解产物(图4)。
实施例3：使用DNA靶标的扩增反应
所有定量PCR(qPCR)组分均用DEPC处理的水制备。通过合并称为qPCR主混合物(20μL)、缓冲液混合物(20μL)和dNTP混合物(10μL)的三种成分，制备总体积为50μL的qPCR混合物。qPCR主混合物含有Tricine缓冲液(pH 8.2)、乙酸钾、甘油、DMSO、去污剂、靶DNA(400cp/反应)、聚合酶适体、Cy5.5标记的探针DNA、正向和反向引物DNA、SYBRTM绿色染料和聚合酶。缓冲液混合物仅含有乙酸锰(8.3mM)或与乙酸镁的混合物(2.49mM)。dNTP混合物含有dATP、dCTP、dGTP(每个2.0mM)和dUTP(4.0mM)。以相同的浓度制备了另一种含有氟代多磷酸代替天然dNTP的溶液。在不存在和存在热稳定的无机焦磷酸酶的情况下制备qPCR混合物，该酶是New England BioLabs的热稳定无机焦磷酸酶(TIP)或Roche Molecular Systems，Inc.的热稳定焦磷酸酶(rTh)。每个qPCR混合物在96孔板的孔中一式三份制备。将板密封并进行qPCR扩增循环，然后用LightCyclerTM 480系统进行DNA解链。qPCR生长曲线的分析是从Cy5.5通道中收集的荧光数据进行的。
结果：与常规dNTP相比，具有dN4P-δF的靶DNA的qPCR分析显示等于或更早的Ct(ΔCt＝-1.5)，这表明聚合酶以相同或更好的效率接受氟代多磷酸类似物作为底物(图5和图6)。此外，氟代多磷酸裂解产物是热稳定的无机焦磷酸酶的有效底物。这表明使用dN4P-δF底物的qPCR测定与未修饰的和苄基化的引物兼容。
实例4：带有装甲RNA靶的扩增反应
与实施例3类似地进行qPCR实验，但有以下变化。靶DNA被等价序列的RNA替代。在常规热循环之前添加了逆转录(RT)步骤。
结果：与常规dNTP相比，具有dN4P-δF的装甲靶RNA的qPCR-RT显示等于或更早的Ct(ΔCt＝-1.2)，这表明聚合酶在逆转录反应中以相同或更高的效率接受氟化多磷酸类似物作为底物(图7和图8)。此外，氟代多磷酸裂解产物是热稳定的无机焦磷酸酶的有效底物。这表明使用具有dN4P-δF底物的逆转录qPCR测定与未修饰的和苄基化的引物兼容。

Claims (10)

1.一种检测样品中是否存在靶核酸序列的方法，所述方法包括：
a)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括在所述样品中存在所述靶核酸序列的情况下，使所述样品与扩增试剂接触以产生扩增产物，以及
b)检测所述扩增产物，
其特征在于，所述扩增试剂包含具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：
其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝2，并且
其特征在于，所述扩增试剂进一步包含热稳定的无机焦磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增试剂进一步包含核酸聚合酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸聚合酶具有逆转录酶活性。
4.一种使用扩增试剂扩增靶核酸序列的方法，其特征在于，所述扩增试剂包含具有以下结构的核苷多磷酸：
其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝2，并且
其特征在于，所述扩增试剂进一步包含热稳定的无机焦磷酸酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增试剂进一步包含核酸聚合酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述核酸聚合酶具有逆转录酶活性。
7.一种用于扩增靶核酸序列的反应混合物，所述反应混合物包含核酸聚合酶、热稳定的无机焦磷酸酶、缓冲液和具有以下结构的核苷多磷酸：
其特征在于，R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝2。
8.根据权利要求7所述的反应混合物，其特征在于，所述核酸聚合酶具有逆转录酶活性。
9.一种用于扩增靶核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含核酸聚合酶、热稳定的无机焦磷酸酶、缓冲液和具有以下结构的核苷多磷酸：
其特征在于，R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝2。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸聚合酶具有逆转录酶活性。
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