JP7342017B2 - 高熱安定性を持つ修飾ヌクレオシドホスフェート - Google Patents
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Description
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様である本質的に任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験で使用され得るが、例示的な方法及び材料のみを記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下のように定義する。
用語「熱安定性無機ピロホスファターゼ」及び「熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素」とは、本文中で同義的に使用され、無機ピロホスフェートの加水分解を触媒してオルトホスフェートを生成する酵素を指し
(a)CS5 DNAポリメラーゼ
(b)CS6 DNAポリメラーゼ
(c)Thermotoga maritimaDNAポリメラーゼ
(d)Thermus aquaticusDNAポリメラーゼ
(e)Thermus thermophilusDNAポリメラーゼ
(f)Thermus flavusDNAポリメラーゼ
(g)Thermus filiformisDNAポリメラーゼ
(h)Thermus sp.sps17DNAポリメラーゼ
(i)Thermus sp.Z05 DNAポリメラーゼ
(j)Thermotoga neapolitanaDNAポリメラーゼ
(k)Termosipho africanusDNAポリメラーゼ
(l)Thermus caldophilusDNAポリメラーゼ
それらを特に有用にする点変異を担持するポリメラーゼは、国際公開第2008/046612号に開示されている。特に、使用するポリメラーゼは、ポリメラーゼドメインに少なくとも以下:
2’-デオキシリボヌクレオシド5’-O-(γ-フルオロトリホスフェート)(dNTP-γF)及び2’-デオキシリボヌクレオシド5’-O-(δ-フルオロテトラホスフェート)(dN4P-δF)の化学構造を図1に示し、ナトリウム塩としてのそれらの合成の概略図を、それぞれ図2及び図3に示す。
dATPのナトリウム塩(1.5mmol)をトリエチルアンモニウム塩に変換し、凍結乾燥した。化合物を乾燥MeCN中に溶解し、反応フラスコに移した。続いて、溶媒を蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。アルゴン下において、トリエチルアンモニウムトリホスフェートを、DMF(7.7mL)とトリブチルアミン(968μL)との無水混合物中に溶解し、続いて、1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(562μL)を滴下した。即座に反応混合物の黄色への着色が観察され、数分以内に濃いオレンジ色になった。反応液を更に室温で30分間撹拌し、続いて無水TBAF(4.48mL、THF中1.0M)を加えた。室温で一晩撹拌した後に、UPLC-MS分析は、出発物質の完全な消費を示した。反応物の逆クエンチを、乾燥アセトン(20mL、0.5M)中のヨウ化ナトリウムの撹拌溶液に反応液を滴下することにより実施した。沈殿物を遠心分離(4000rpmで4分間)で単離し、上清を廃棄した。ペレットは、再懸濁と遠心分離とを繰り返すことによって、乾燥アセトンで洗浄した。原産物を乾燥し、逆相液体クロマトグラフィで精製した。合わせた生成物画分を、固相抽出(C18)によって濃縮し、乾燥アセトン(0.5M)中においてヨウ化ナトリウムで沈殿させてナトリウム塩に変換した。最後に無色の生成物を、最終収率73%で得た(純度99%超)。
合成を、dCTP(1.11mmol)、トリブチルアミン(720μL)、DMF(5.8mL)、TBAF(3.33mL、THF中1.0M)、及び1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(418μL)を用いて、実施例1Aと同様に行った。1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼンを導入する前に、乾燥DMSO(1.0mL)を添加して、出発物質の透明な溶液を得た。精製物のナトリウム塩を、最終収率55%で単離した(純度99%超)。
合成を、dGTP(1.09mmol)、トリブチルアミン(706μL)、DMF(5.6mL)、TBAF(3.3mL、THF中1.0M)、及び1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(410μL)を用いて、実施例1Aと同様に行った。1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼンを導入する前に、乾燥DMSO(3.0mL)を添加して、出発物質の透明な溶液を得た。精製物のナトリウム塩を、最終収率27%で単離した(純度99%超)。
合成を、dUTP(1.0mmol)、トリブチルアミン(649μL)、DMF(5.2mL)、TBAF(3.0mL、THF中1.0M)、及び1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(377μL)を用いて、実施例1Aと同様に行った。1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼンを導入する前に、乾燥DMSO(3.0mL)を反応混合物に添加して、出発物質の透明な溶液を得た。精製物のナトリウム塩を、最終収率42%で単離した(純度99%超)。
フルオロリン酸ナトリウム塩(3.909mmol)を、陽イオン交換によってトリエチルアンモニウム塩に変換した。溶媒を蒸発させると無色の化合物が得られ、これを高真空下で乾燥させた。アルゴン下において、フルオロホスフェートを、DMSO(8.2mL)とMeCN(5.0mL)との無水混合物中に溶解した。イミダゾール(1.33g)を加え、溶液を10分間撹拌し、続いてトリフェニルホスフィン(2.563g)及び2-アミノフェニルジスルフィド(1.456g)を加えた。反応混合物を、全成分が完全に溶解するまで40℃に加熱し、室温で一晩撹拌し続けた。反応の進行を、追加の生成物が形成されなくなるまでUPLC-MSによって追跡した。反応を、乾燥アセトン(30mL、0.5M)中の冷たいヨウ化ナトリウムの撹拌溶液に滴下することで停止した。形成された沈殿物を遠心分離(4000rpmで4分間)によって単離した。ペレットを乾燥アセトンで繰り返し洗浄した。合わせた上清を4℃で一晩冷却し、無色の生成物を更に沈殿させた。合わせたフルオロリン酸ナトリウムイミダゾリド塩の沈殿物を高真空下において乾燥させ、更に精製することなく使用した。
合成は、出発物質としてdCTP(0.25mmol)を用いて実施例1Eと同様に実施した。精製物のナトリウム塩を、反応収率21%で単離した(純度98%超)。
合成は、ZnCl2の添加前に1-メチル-2-ピロリドン(1.5mL)を反応混合物へ加えたことを除いて、出発物質としてdGTP(0.25mmol)を用いて、実施例1Eと同様に実施した。精製物のナトリウム塩を、反応収率25%で単離した(純度98%超)。
合成は、出発物質としてdUTP(0.25mmol)を用いて実施例1Eと同様に実施した。精製物のナトリウム塩を、反応収率68%で単離した(純度99%超)。
300μMのフルオロポリホスフェート、40%のDMSO、及び1.0Mの酢酸カリウムを含有する水性混合物を調製した。参照として、フルオロポリホスフェートの代わりに300μMのdNTPを用いた別の混合物を調製した。両溶液(300μL)を、サーモシェーカ中で65℃にてインキュベートした。いくつかの時点で、各溶液の試料(20μL)を採取し、UPLC-MSで分析した。260nmでの吸収トレースのピーク面積を判定し、出発物質と分解生成物との相対的な割合を算出した。
定量的PCR(quantitative PCR:qPCR)の全成分を、DEPC処理水で調製した。qPCRマスタ混合物(20μL)、緩衝混合物(20μL)、及びdNTP混合物(10μL)と称される3つの成分を組み合わせて、総量50μLのqPCR混合物を調製した。qPCRマスタ混合物は、トリシン緩衝液(pH8.2)、酢酸カリウム、グリセロール、DMSO、洗浄剤、標的DNA(400cp/反応)、ポリメラーゼアプタマ、Cy5.5標識プローブDNA、順方向及び逆方向プライマーDNA、SYBR(商標)緑色素、並びにポリメラーゼ酵素を含有した。緩衝混合物は、酢酸マンガン(8.3mM)単独、又は酢酸マグネシウム(2.49mM)とのブレンドのいずれかを含有した。dNTP混合物は、dATP、dCTP、dGTP(各2.0mM)、dUTP(4.0mM)を含有した。天然dNTPの代わりにフルオロポリホスフェートを含有する別の溶液を、等濃度で調製した。qPCR混合物を、New England BioLabs製のThermostable Inorganic Pyrosphatase(TIP)又はRoche Molecular Systems,Inc.製のThermostable Pyrophosphatase(rTh)のいずれかである、熱安定性無機ピロホスファターゼの不在及び存在下において調製した。各qPCR混合物は、96ウェルプレートのウェルで三重に調製した。プレートを密封し、qPCR増幅サイクルに供し、続いてLightCycler(商標)480システムでのDNA融解に供した。qPCR増殖曲線の分析は、Cy5.5チャネルで収集した蛍光データから行った。
qPCR実験は、以下の変更を加えて実施例3と同様に実施した。標的DNAを同等の配列のRNAで置換した。通常のサーモサイクリングの前に、逆転写(RT)工程を追加した。
Claims (8)
- 試料中の標的核酸配列の存在又は不在を検出する方法であって、
(a)前記標的核酸配列が前記試料中に存在する場合、前記試料を増幅試薬と接触させて増幅産物を生成することを含む、増幅工程を実施することと、
(b)前記増幅産物を検出することと、を含み、
ここで、前記増幅試薬は、次の構造を有する修飾されたヌクレオシドポリホスフェートを含み、
- 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項1に記載の方法。
- 増幅試薬を用いて標的核酸配列を増幅する方法であって、前記増幅試薬が、次の構造を有するヌクレオシドポリホスフェートを含み、
- 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項3に記載の方法。
- 核酸ポリメラーゼと、熱安定性無機ピロホスファターゼと、緩衝液と、下記の構造を有するヌクレオシドポリホスフェートとを含む、標的核酸配列を増幅するための反応混合物であって、
- 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項5に記載の反応混合物。
- 核酸ポリメラーゼと、熱安定性無機ピロホスファターゼと、緩衝液と、下記の構造を有するヌクレオシドポリホスフェートとを含む、標的核酸配列を増幅するためのキットであって、
- 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項7に記載のキット。
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