ES2939721T3 - Nucleósidos fosfato modificados con alta estabilidad térmica - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona reactivos de nucleótidos estables utilizados para la amplificación de ácidos nucleicos por PCR y RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) que comprende nucleósidos polifosfatos fluorados en el fosfato terminal, por ejemplo, en el gamma-fosfato. La presente invención también proporciona métodos para usar los nucleósidos polifosfatos fluorados para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra en una reacción de amplificación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nucleósidos fosfato modificados con alta estabilidad térmica

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a reactivos nucleotídicos estables, procedimientos para su síntesis, procedimientos para su uso y kits que comprenden los mismos. Los reactivos nucleotídicos son útiles en muchas técnicas de ADN y ARN recombinantes, especialmente en la amplificación de ácido nucleico por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Antecedentes de la invención

Los reactivos de amplificación de ácido nucleico típicamente están compuestos por componentes sensibles a la temperatura y, por lo tanto, a menudo se deben almacenar y transportar a una temperatura muy por debajo de la temperatura ambiente. Este es, en particular, el caso de los desoxirribonucleósidos trifosfato o sus análogos de ribonucleósido trifosfato. Estos reactivos son propensos a degradación por medio de la pérdida de grupos fosfato consecutivos de los extremos, lo que da como resultado la formación de nucleósidos difosfato y monofosfato, no siendo ya ambos sustratos de ácido nucleico polimerasas. Además, la acumulación de difosfatos puede inhibir la actividad enzimática. La estabilidad de los nucleósidos polifosfato se puede mejorar esterificando los fosfatos terminales. Por ejemplo, los análogos de dNTP que contenían un éster metílico en el fosfato terminal eran completamente estables en condiciones de sobrecarga calórica que eran suficientes para degradar por completo los dNTP normales. Sin embargo, la esterificación del fosfato terminal puede tener un efecto negativo sobre la capacidad de estos nucleótidos de servir como sustratos eficaces para determinadas enzimas polimerasas. El documento EP 1970445 divulga un procedimiento de replicación/amplificación y, por tanto, detección de un ácido nucleico diana, en el que los reactivos de amplificación comprenden un desoxirribonucleósido 5' fosfato, en el que se sustituye el grupo hidroxilo del ácido fosfórico en la posición gamma. Existe una necesidad de tener análogos de dNTP que sean sustratos tanto térmicamente estables como eficaces de las enzimas polimerasas.

Sumario de la invención

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

La presente invención proporciona reactivos nucleotídicos estables usados para amplificación de ácido nucleico por PCR y RT-PCR (PCR con retrotranscriptasa) que comprenden nucleósidos polifosfato modificados. La presente invención también proporciona procedimientos para usar los nucleósidos polifosfato modificados para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra en una reacción de amplificación.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención implica un procedimiento de detección de la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra que comprende realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con reactivos de amplificación para producir un producto de amplificación si la secuencia de ácido nucleico diana está presente en la muestra, y detectar el producto de amplificación, en el que los reactivos de amplificación comprenden un nucleósido polifosfato modificado que tiene una estructura de:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2 y en el que los reactivos de amplificación comprenden una enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable. En algunos modos de realización, la etapa de amplificación se repite al menos una vez. En algunos modos de realización, la etapa de amplificación se repite al menos aproximadamente 20 veces, pero se puede repetir tanto como al menos 40, al menos 60 o al menos 100 veces. En algunos modos de realización, el producto de amplificación se detecta una vez después de que se produzca la amplificación. En algunos modos de realización, el producto de amplificación se detecta durante y/o después de la etapa de amplificación. En algunos modos de realización, el producto de amplificación se detecta en un punto de tiempo definido durante y/o después de 3, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 etapas de amplificación o durante y/o después de cada etapa de amplificación. Los reactivos de amplificación comprenden una ácido nucleico polimerasa. En algunos modos de realización, la ácido nucleico polimerasa posee actividad retrotranscriptasa.

En otro aspecto, la presente invención implica un procedimiento de amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana usando reactivos de amplificación, en el que los reactivos de amplificación comprenden un nucleósido polifosfato modificado que tiene una estructura de:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2 y en el que los reactivos de amplificación comprenden una enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable. En algunos modos de realización, la etapa de amplificación se repite al menos una vez. En algunos modos de realización, la etapa de amplificación se repite al menos aproximadamente 20 veces, pero se puede repetir tanto como al menos 40, al menos 60 o al menos 100 veces. En algunos modos de realización, el producto de amplificación se detecta una vez después de que se produzca la amplificación. En algunos modos de realización, el producto de amplificación se detecta durante y/o después de la etapa de amplificación. En algunos modos de realización, el producto de amplificación se detecta en un punto de tiempo definido durante y/o después de 3, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 etapas de amplificación o durante y/o después de cada etapa de amplificación. Los reactivos de amplificación comprenden una ácido nucleico polimerasa. En algunos modos de realización, la ácido nucleico polimerasa posee actividad retrotranscriptasa.

En otro aspecto, la presente invención implica mezclas o bien kits de reacción que comprenden una ácido nucleico polimerasa, una enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable, tampón y un nucleósido polifosfato modificado que tiene una estructura de:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2. En algunos modos de realización, la ácido nucleico polimerasa posee actividad retrotranscriptasa. En algunos modos de realización, los componentes del kit se incluyen en el kit como componentes separados, en viales o recipientes separados. En algunos modos de realización, uno o más de los componentes del kit se incluyen en el kit en el mismo vial o recipiente.

Los modos de realización y ventajas de la invención se describen con más detalle en la descripción detallada de la invención y en las figuras.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra las estructuras químicas de los análogos de desoxirribonucleósido polifosfato fluorado que se sintetizaron.

La FIG. 2 es un esquema para la síntesis química de la sal sódica de 2'-desoxirribonucleósido 5'-0-(Y-fluoro-trifosfato) (dNTP-YF).

La FIG. 3 es un esquema para la síntesis química de la sal sódica de 2'-desoxirribonucleósido 5'-0-(5-fluoro-tetrafosfato) (dN4P-5F).

La FIG. 4 muestra la termoestabilidad de dUTP natural y dUTP-YF a 65 °C.

La FIG. 5 muestra las curvas de crecimiento de las reacciones de amplificación de PCR cuantitativa a partir de una diana de ADN, usando las enzimas polimerasa de Z05 y pirofosfatasa rTh.

La FIG. 6 muestra las curvas de crecimiento de las reacciones de amplificación de PCR cuantitativa a partir de una diana de ADN, usando las enzimas polimerasa de Z05 y pirofosfatasa TIP.

La FIG. 7 muestra las curvas de crecimiento de las reacciones de amplificación de PCR cuantitativa con retrotranscriptasa a partir de una diana de ARN de VI H-1 blindado, usando las enzimas polimerasa de C21 y pirofosfatasa rTh.

La FIG. 8 muestra las curvas de crecimiento de las reacciones de amplificación de PCR cuantitativa con retrotranscriptasa a partir de una diana de ARN de VI H-1 blindado, usando las enzimas polimerasa de C21 y pirofosfatasa TIP.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona reactivos nucleotídicos estables usados para amplificación de ácido nucleico por PCR y RT-PCR (PCR con retrotranscriptasa) que comprenden desoxirribonucleósidos polifosfato fluorados. La presente invención también proporciona procedimientos para usar los desoxirribonucleósidos polifosfato fluorados para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra en una reacción de amplificación y para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. La estabilidad incrementada de los desoxirribonucleósidos polifosfato fluorados permite el almacenamiento a largo plazo en mezclas acuosas complejas, tales como los reactivos de mezclas maestras usados en pruebas de diagnóstico basadas en PCR.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque esencialmente se puede usar cualquier procedimiento y material similares a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, solo se describen procedimientos y materiales ejemplares. Para los propósitos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

Los términos "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

El término "temperatura ambiente" se refiere a la temperatura del entorno y es sinónimo de "temperatura ambiente" cuando se refiere a la temperatura de un edificio interior con control de temperatura. Típicamente, la temperatura ambiente se refiere a un intervalo de temperatura de entre 15 °C y 25 °C, aunque todavía se pueden considerar temperaturas ligeramente más frías o más calientes dentro del intervalo de temperatura ambiente.

El término "aptámero" se refiere a un ADN monocatenario que reconoce y se une a ADN polimerasa e inhibe eficazmente la actividad polimerasa como se describe en la pat. de EE. UU. n.° 5.693.502. El uso de aptámero y dUTP/UNG en RT-PCR también se analiza, por ejemplo, en Smith, E.S. et al., (Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, en PCR Primer: A Laboratory Manual, 2.a edición, Dieffenbach, C.W. y Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003)).

"Recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se ha modificado intencionadamente por procedimientos recombinantes. Con el término "ácido nucleico recombinante" en el presente documento se quiere decir un ácido nucleico, formado originalmente in vitro, en general, por la manipulación de un ácido nucleico por endonucleasas de restricción, en una forma no encontrada normalmente en la naturaleza. Por tanto, tanto un ADN mutante aislado, en forma lineal, como un vector de expresión formado in vitro fijando moléculas de ADN que no están unidas normalmente se consideran recombinantes para los propósitos de la presente invención. Se entiende que una vez que se prepara un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula huésped, se replicará de forma no recombinante, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente replicados de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para los propósitos de la invención. Una "proteína recombinante" es una proteína preparada usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se representa anteriormente.

Un ácido nucleico se "enlaza de forma funcional" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se enlaza de forma funcional a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se enlaza de forma funcional a una secuencia codificante si se sitúa para facilitar la traducción.

El término "célula huésped" se refiere tanto a los organismos eucariotas (por ejemplo, bacterias, levaduras y actinomicetos) como procariotas unicelulares y células sueltas de animales o plantas de orden superior cuando se cultivan en cultivo celular.

El término "vector" se refiere a un fragmento de ADN, típicamente bicatenario, que puede tener insertado en él un fragmento de ADN exógeno. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias de polinucleótido de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. Se define ADN exógeno como ADN heterólogo, que es ADN no encontrado de forma natural en la célula huésped, que, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable o codifica un transgén. El vector se usa para transportar el ADN exógeno o heterólogo en una célula huésped adecuada. Una vez en la célula huésped, el vector se puede replicar independientemente de o coincidiendo con el ADN cromosómico del huésped, y se pueden generar varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector también puede contener los elementos necesarios que permiten la transcripción del ADN insertado en una molécula de ARNm o de otro modo provocar la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN. Algunos vectores de expresión contienen adicionalmente elementos de secuencia contiguos al ADN insertado que incrementan la semivida del ARNm expresado y/o permiten la traducción del ARNm en una molécula de proteína. Por tanto, se pueden sintetizar rápidamente muchas moléculas de ARNm y polipéptido codificadas por el ADN insertado.

Los "reactivos de amplificación" son componentes químicos o bioquímicos que posibilitan la amplificación de ácidos nucleicos. Dichos reactivos comprenden, pero no se limitan a, ácido nucleico polimerasas, tampones, mononucleótidos tales como nucleósidos trifosfato, oligonucleótidos, por ejemplo, como cebadores oligonucleotídicos, sales y sus respectivas soluciones, sondas de detección, tintes y más.

Como es conocido en la técnica, un "nucleósido" es una combinación base-glúcido. La porción de base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son purinas y pirimidinas.

Los "nucleótidos" son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción glucídica del nucleósido. Para los nucleósidos que incluyan un glúcido pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar enlazado al resto 2'-, 3'- o bien 5'-hidroxilo del glúcido. Un nucleótido es la unidad monomérica de un "oligonucleótido", que se puede indicar más en general como un "compuesto oligomérico", o un "polinucleótido", indicado más en general como un "compuesto polimérico". Otra expresión general para lo mencionado anteriormente es ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).

Un "compuesto oligomérico" es un compuesto que consiste en "unidades monoméricas" que pueden ser nucleótidos solos o compuestos no naturales (véase a continuación), más específicamente nucleótidos modificados (o análogos nucleotídicos) o compuestos no nucleotídicos, solos o combinaciones de los mismos.

Los "oligonucleótidos" y "oligonucleótidos modificados" (o "análogos oligonucleotídicos") son subgrupos de compuestos oligoméricos. El término "oligonucleótido" se refiere a componentes formados a partir de una pluralidad de nucleótidos como sus unidades monoméricas. Se hace referencia comúnmente a que los grupos fosfato forman la cadena principal internucleosídica del oligonucleótido. El enlace o cadena principal normal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados (véase a continuación) útiles para la invención se pueden sintetizar como se describe principalmente en la técnica y es conocido por el experto en el campo. Los procedimientos para preparar compuestos oligoméricos de secuencias específicas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química directa. Los procedimientos de síntesis química pueden incluir, por ejemplo, el procedimiento de fosfotriéster descrito por Narang S. A. et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98, el procedimiento de fosfodiéster divulgado por Brown E. L., et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151, el procedimiento de fosforamidita divulgado en Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859, el procedimiento de H-fosfonato divulgado en Garegg et al., Chem. Scr. 25 (1985) 280-282 y el procedimiento en soporte sólido divulgado en el documento US 4.458.066.

En el procedimiento descrito anteriormente, los oligonucleótidos se pueden modificar químicamente, es decir, el cebador y/o la sonda comprenden un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. La sonda o el cebador es entonces un oligonucleótido modificado.

Los "nucleótidos modificados" (o "análogos nucleotídicos") difieren de un nucleótido natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base, un glúcido pentofuranosilo, una porción fosfato, una porción similar a base, similar a glúcido pentofuranosilo y similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se puede fijar un marcador a la porción de base de un nucleótido, con lo que se obtiene un nucleótido modificado. Una base natural en un nucleótido también se puede remplazar, por ejemplo, por una 7-desazapurina, con lo que también se obtiene un nucleótido modificado.

El término "dNTP metilado" o "dNTP metilados" se refiere a cualquier desoxirribonucleósido trifosfato o dNTP que tenga uno o más grupos metilo añadidos al resto trifosfato. Los ejemplos incluyen dATP metilado, dCTP metilado, dGTP metilado, dTTP metilado y dUTP metilado. Uno o más grupos metilo pueden esterificar uno o más de cualquiera de los grupos a-, 13- o Y-fosfato encontrados en los dNTP. En un ejemplo particular, los dNTP metilados son de modo que el grupo Y-fosfato terminal de cada dNTP se modifica con un grupo metilo, lo que proporciona un componente de dNTP más estable para su uso en reacciones de amplificación, tales como PCR, en comparación con los dNTP convencionales no modificados.

El término "desoxirribonucleósido polifosfato fluorado" se refiere a cualquier desoxirribonucleósido polifosfato que se ha fluorado en uno de los grupos fosfato. Los ejemplos incluyen dATP-YF, dCTP-YF, dGTP-YF, dTTP-YF y dUTP-YF. Otros ejemplos incluyen dA4P-5F, dC4P-5F, dG4P-5F, dT4P-5F y dU4P-5F. El átomo de flúor puede reemplazar un oxígeno en uno de cualquiera de los grupos a-, 13-, y-, 6-, £-, Z- fosfato encontrados en los desoxirribonudeósidos polifosfato. En un ejemplo particular, los polifosfatos fluorados son de modo que el grupo fosfato terminal de cada desoxirribonucleósido polifosfato está fluorado, lo que proporciona un componente de polifosfato más estable para su uso en reacciones de amplificación, tales como PCR, en comparación con los dNTP convencionales no modificados.

Los términos "pirofosfatasa inorgánica termoestable" y "enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable" se usan de manera intercambiable en este texto y se refieren a una enzima que cataliza la hidrólisis del pirofosfato inorgánico para formar ortofosfato: P²O^7"4 + H²O -> 2HPÜ^4"2 y puede retener su actividad a las temperaturas usadas en las condiciones de PCR (por ejemplo, por encima de 90 °C). Un ejemplo de una pirofosfatasa inorgánica termoestable es una que se deriva del organismo termófilo Thermococcus litoralis que está disponible comercialmente en New England BioLabs (Ipswich, MA).

Un "oligonucleótido modificado" (o "análogo oligonucleotídico"), que pertenece a otro subgrupo específico de compuestos oligoméricos, posee uno o más nucleótidos y uno o más nucleótidos modificados como unidades monoméricas. Por tanto, el término "oligonucleótido modificado" (o "análogo oligonucleotídico") se refiere a estructuras que funcionan de una manera sustancialmente similar a los oligonucleótidos y se puede usar de manera intercambiable en el contexto de la presente invención. Desde un punto de vista sintético, se puede preparar un oligonucleótido modificado (o un análogo oligonucleotídico), por ejemplo, por modificación química de oligonucleótidos por modificación apropiada de la cadena principal de fosfato, unidad de ribosa o las bases nucleotídicas (Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; Verma S. y Eckstein F., Annu. Rev. Biochem.

67 (1998) 99-134). Las modificaciones representativas incluyen enlaces internucleosídicos fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster o fosforamidato en lugar de enlaces internucleosídicos fosfodiéster; desaza- o azapurinas y -pirimidinas en lugar de bases purínicas y pirimidínicas naturales, bases pirimidínicas que tienen grupos sustituyentes en la posición 5 o 6; bases purínicas que tienen grupos sustituyentes alterados en las posiciones 2, 6 u 8 o en la posición 7 como 7-desazapurinas; bases que llevan restos alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo, por ejemplo, grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo, propilo, butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo o grupos arilo como fenilo, bencilo, naftilo; glúcidos que tienen grupos sustituyentes, por ejemplo, en su posición 2'; o análogos de glúcidos carbocíclicos o acíclicos. Otras modificaciones son conocidas por los expertos en la técnica. Dichos oligonucleótidos modificados (o análogos oligonucleotídicos) se describen mejor como que son funcionalmente intercambiables con, aunque estructuralmente diferentes de, oligonucleótidos naturales. Con más detalle, se divulgan modificaciones ejemplares en Verma S., y Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134 o el documento WO 02/12263. Además, se puede realizar una modificación en la que las unidades nucleosídicas se unan por medio de grupos que sustituyan los enlaces fosfato o enlaces fosfato-glúcido internucleosídicos. Dichos enlaces incluyen los divulgados en Verma S. y Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134. Cuando se utilizan enlaces distintos de fosfato para enlazar las unidades nucleosídicas, dichas estructuras también se han descrito como "oligonucleósidos".

Un "ácido nucleico", así como el "ácido nucleico diana", es un compuesto polimérico de nucleótidos como es conocido por el experto en la técnica. En el presente documento se usa "ácido nucleico diana" para indicar un ácido nucleico en una muestra que se debe analizar, es decir, se debe determinar la presencia, no presencia y/o cantidad del mismo en una muestra.

En el presente documento se usa el término "cebador" como es conocido por el experto en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden cebar la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3', por ejemplo, del cebador proporciona un grupo 3'-OH libre al que se pueden fijar otros nucleótidos por una ADN polimerasa dependiente de molde estableciendo un enlace fosfodiéster de 3' a 5' con lo que se usan desoxirribonucleósidos trifosfato y con lo que se libera pirofosfato.

Una "sonda" también indica un oligonucleótido natural o modificado. Como es conocido en la técnica, una sonda tiene el propósito de detectar un analito o amplificado. En el caso del procedimiento descrito anteriormente, se pueden usar sondas para detectar los amplificados de los ácidos nucleicos diana. Para este propósito, típicamente las sondas llevan marcadores.

"Marcadores", a menudo denominados "grupos indicadores", en general, son grupos que hacen que un ácido nucleico, en particular, oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados, así como cualquier ácido nucleico unido a los mismos, sea distinguible del resto de la muestra (los ácidos nucleicos que tienen un marcador fijado también se pueden denominar compuestos de unión a ácidos nucleicos marcados, sondas marcadas o simplemente sondas). Los marcadores ejemplares son marcadores fluorescentes, que son, por ejemplo, tintes fluorescentes tales como un tinte de fluoresceína, un tinte de rodamina, un tinte de cianina y un tinte de cumarina. Los tintes fluorescentes ejemplares son FAM, HEX, JA270, CAL635, Coumarin343, Quasar705, Cyan500, CY5.5, LC-Red 640, LC-Red 705.

En algunos modos de realización, el marcador se puede fijar a la base purínica o pirimidínica o un análogo por medio de un "conector" o un "brazo conector". La longitud de un brazo conector es la distancia en Angstroms (Á) de la base nucleotídica al resto fluorescente. En general, un brazo conector es de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. El brazo conector puede ser de la clase descrita en el documento WO 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para fijar brazos conectores a una base nucleotídica particular, y también para fijar restos fluorescentes a un brazo conector. De forma ejemplar, un resto fluorescente aceptor, tal como un LC Red 640-éster de NHS, se puede combinar con C6-fosforamiditas (disponibles de ABI (Foster City, Calif.) o Glen Research (Sterling, Va.)) para producir LC Red 640-fosforamidita. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donante, tal como fluoresceína, a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de fluoresceína-éster de NHS, tales como fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, Calif.)) o 3'-amino-CPG, que requieren el acoplamiento de fluoresceína-éster de NHS después de la síntesis oligonucleotídica. Además, otros conectores no nucleosídicos pueden ser, por ejemplo, alifáticos, aromáticos, arilos, cíclicos, quirales, aquirales, un péptido, un carbohidrato, un lípido, un ácido graso, tri-, tetra-, penta-, hexa-polietilenglicol (HEG) o poli-polietilenglicol (PEG), o un resto heterocíclico. Otros conectores no nucleosídicos convencionales emplean reactivos de reticulación homobifuncionales y heterobifuncionales. Los reactivos homobifuncionales llevan dos grupos funcionales idénticos, mientras que los reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales distintos para enlazar los productos biológicos al bioadhesivo. Una gran mayoría de los agentes de reticulación heterobifuncionales contienen un grupo reactivo con amina primaria y un grupo reactivo con tiol. Los agentes de reticulación covalentes se seleccionan de reactivos que pueden formar puentes disulfuro (S--S), glicol (--CH(OH)--CH(OH)--), azo (--N=N--), sulfona (--S(=O²--), éster (--C(=O)--O--) o amida (--C(=O)--N--).

Cualquier cebador y/o sonda se puede modificar químicamente, es decir, el cebador y/o la sonda comprenden un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. La sonda o el cebador es entonces un oligonucleótido modificado.

Un procedimiento de amplificación de ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se divulga, entre otras referencias, en las patentes de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188. La PCR típicamente emplea dos o más cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles para el análisis de ácidos nucleicos incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico de los ácidos nucleicos diana. Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador puede ser monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan primero, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento de desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento. Una "polimerasa termoestable" es una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, es una enzima que cataliza la formación de productos de extensión del cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y continúa en dirección de 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Las polimerasas termoestables, por ejemplo, se han aislado de Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no sean termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de las hebras se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado que incluya medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento de separación de las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal del tampón y la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se desnaturalizan, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo dependiendo de rasgos característicos de la reacción, tales como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización se realiza típicamente durante aproximadamente de 5 s a 9 min para no exponer la polimerasa respectiva como, por ejemplo, la ADN polimerasa de Z05, a temperaturas tan altas durante demasiado tiempo y, por tanto, con el riesgo de una pérdida de enzima funcional, puede ser preferente usar etapas de desnaturalización cortas.

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador a su secuencia diana en los ácidos nucleicos diana.

La temperatura para la hibridación puede ser de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 70 °C, o de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 65 °C; o de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 60 °C, o de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 58 °C. Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 1 min (por ejemplo, de aproximadamente 20 s a aproximadamente 50 s; de aproximadamente 30 s a aproximadamente 40 s). En este contexto, puede ser ventajoso usar temperaturas de hibridación diferentes para incrementar la inclusividad del respectivo ensayo. En resumen, esto quiere decir que a temperaturas de hibridación relativamente bajas, los cebadores también se pueden unir a dianas que tengan emparejamientos erróneos únicos, por lo que también se pueden amplificar variantes de determinadas secuencias. Esto puede ser deseable si, por ejemplo, un determinado organismo tiene variantes genéticas conocidas o desconocidas que también se deben detectar. Por otra parte, las temperaturas de hibridación relativamente altas tienen la ventaja de proporcionar una mayor especificidad, puesto que hacia mayores temperaturas la probabilidad de que el cebador se una a secuencias diana que no se emparejan exactamente disminuye continuamente. Para beneficiarse de ambos fenómenos, en algunos modos de realización de la invención el procedimiento descrito anteriormente comprende la hibridación a temperaturas diferentes, por ejemplo, en primer lugar a una temperatura menor y, a continuación, a una mayor. Si, por ejemplo, una primera incubación tiene lugar a 55 °C durante aproximadamente 5 ciclos, se pueden (pre)amplificar secuencias diana que no se emparejan exactamente. Esto puede estar seguido, por ejemplo, de aproximadamente 45 ciclos a 58 °C, lo que proporciona una mayor especificidad en la mayor parte del experimento. De esta manera, no se obvian variantes genéticas potencialmente importantes, mientras que la especificidad permanece relativamente alta.

A continuación, la mezcla de reacción se ajusta a una temperatura a la que se promueve u optimiza la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico que se va a analizar. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía, en general, de aproximadamente 40 ° a 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 65 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 s a aproximadamente 5 min, o de aproximadamente 15 s a 2 min, o de aproximadamente 20 s a aproximadamente 1 min, o de aproximadamente 25 s a aproximadamente 35 s. Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación de las hebras, hibridación y alargamiento se pueden repetir tan a menudo como se necesite para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a los ácidos nucleicos diana. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se pueden repetir al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana lo suficiente para su detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tantas como 40, 60 o incluso 100 veces.

Se puede llevar a cabo una PCR en la que las etapas de hibridación y extensión se realicen en la misma etapa (PCR en una etapa) o, como se describe anteriormente, en etapas separadas (PCR en dos etapas). Realizar la hibridación y extensión conjuntamente y, por tanto, en las mismas condiciones físicas y químicas, con una enzima adecuada, tal como, por ejemplo, la ^a Dⁿ polimerasa de Z05, tiene la ventaja de ahorrar tiempo para realizar una etapa adicional en cada ciclo y también de suprimir la necesidad de un ajuste de temperatura adicional entre la hibridación y extensión. Por tanto, la PCR en una etapa reduce la complejidad global del respectivo ensayo.

En general, pueden ser preferentes tiempos más cortos para la amplificación global, ya que el tiempo hasta el resultado se reduce y da lugar a un posible diagnóstico más temprano.

Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico que se van a usar comprenden la reacción en cadena de la ligasa (LCR; Wu D. Y. y Wallace R. B., Genomics 4 (1989) 560-69; y Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193); reacción en cadena de la polimerasa-ligasa (Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16); LCR-hueco (documento WO 90/01069); reacción en cadena con reparación (documento ^e P 0439182 A2), 3^s R (Kwoh D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli J.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; documento WO 92/08808) y NASBA (documento US 5.130.238). Además, existen amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA) y amplificación por Qb (para una revisión, véanse, por ejemplo, Whelen A. C. y Persing D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50(1996) 349-373; Abramson R. D. y Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47).

El término "valor de Cp" o valor de "punto de corte" se refiere a un valor que permite la cuantificación de ácidos nucleicos diana de entrada. Se puede determinar el valor de Cp de acuerdo con el procedimiento del máximo de la segunda derivada (Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction", BioTechniques, vol. 38, n.° 2, febrero de 2005, pp.

287-293). En el procedimiento de la segunda derivada, un Cp corresponde al primer pico de una curva de segunda derivada. Este pico corresponde al comienzo de una fase semilogarítmica. El procedimiento de la segunda derivada calcula un valor de la segunda derivada de la curva de intensidad de fluorescencia en tiempo real y solo se obtiene un valor. El procedimiento de Cp original se basa en una aproximación diferenciable definida localmente de los valores de intensidad, por ejemplo, por una función polinómica. A continuación, se computa la tercera derivada. El valor de Cp es la raíz más pequeña de la tercera derivada. También se puede determinar el Cp usando el procedimiento de punto de ajuste, en el que se determina el Cp por la intersección de una paralela a la línea umbral en la región semilogarítmica (Van Luu-The, et al., BioTechniques, vol. 38, n.° 2, febrero de 2005, pp. 287-293). El valor de Cp proporcionado por el instrumento LightCycler ofrecido por Roche por cálculo de acuerdo con el procedimiento del máximo de la segunda derivada.

El término "eficacia de la PCR" se refiere a una indicación de la eficacia de la amplificación de ciclo a ciclo. Se calcula la eficacia de la PCR para cada condición usando la ecuación: % de eficacia de la PCR = (10(-pendienteM ) x 100, en la que la pendiente se calculó por regresión lineal con el logaritmo del número de copias representado en el eje y Cp representado en el eje x. Se puede medir la eficacia de la PCR usando un molde de cebador emparejado perfectamente o emparejado erróneamente.

El término "FRET" o "transferencia de energía de resonancia fluorescente" o "transferencia de energía por resonancia de Forster" se refiere a una transferencia de energía entre al menos dos cromóforos, un cromóforo donante y un cromóforo aceptor (denominado extintor). El donante típicamente transfiere la energía al aceptor cuando se excita el donante por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptor típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. Cuando el aceptor es un extintor "oscuro", disipa la energía transferida en una forma distinta de la luz. Que un fluoróforo particular actúe como donante o aceptor depende de las propiedades del otro miembro del par de FRET. Los pares donante-aceptor usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), lowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, lowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

Los procedimientos expuestos anteriormente se pueden basar en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre un resto fluorescente donante y un resto fluorescente aceptor. Un resto fluorescente donante representativo es fluoresceína, y los restos fluorescentes aceptores correspondientes representativos incluyen LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5 y Cy5,5. Típicamente, la detección incluye excitar la muestra a una longitud de onda absorbida por el resto fluorescente donante y visualizar y/o medir la longitud de onda emitida por el resto fluorescente aceptor correspondiente. En el procedimiento de acuerdo con la invención, la detección puede estar seguida de la cuantificación de FRET. Por ejemplo, la detección se realiza después de cada etapa de ciclado. Por ejemplo, la detección se realiza en tiempo real. Usando instrumentación de PCR en tiempo real disponible comercialmente (por ejemplo, LightCycler™ o TaqMan®), se pueden combinar amplificación y detección por PCR del producto de amplificación en una única cubeta cerrada con un tiempo de ciclado drásticamente reducido. Puesto que la detección se produce simultáneamente con la amplificación, los procedimientos de PCR en tiempo real evitan la necesidad de manipular el producto de amplificación y disminuyen el riesgo de contaminación cruzada entre los productos de amplificación. La PCR en tiempo real reduce, en gran medida, el tiempo de respuesta y es una alternativa atractiva a las técnicas de PCR convencionales en el laboratorio clínico.

Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR en tiempo real como se usa en la tecnología LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712. El instrumento LightCycler® es un termociclador rápido combinado con un fluorómetro de microvolumen que utiliza óptica de alta calidad. Esta técnica de termociclado rápido usa cubetas de vidrio fino como recipientes de reacción. El calentamiento y enfriamiento de la cámara de reacción se controlan alternando aire calentado y ambiente. Debido a la baja masa de aire y la alta proporción de área de superficie con respecto al volumen de las cubetas, se pueden lograr tasas de intercambio de temperaturas muy rápidas dentro de la cámara térmica.

La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada con dos restos fluorescentes. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente es, en general, una molécula extintora. Los tintes fluorescentes típicos usados en este formato, por ejemplo, son, entre otros, FAM, HEX, CY5, JA270, Cyan y CY5.5. Durante la etapa de hibridación de la reacción ^p C^r , la sonda de hibridación marcada se une al ácido nucleico diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la Taq u otra polimerasa adecuada como es conocido por el experto en la técnica, tal como una polimerasa de Z05 mutante, durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente excitado y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente.

En ambos formatos de detección descritos anteriormente, la intensidad de la señal emitida se puede correlacionar con el número de moléculas de ácido nucleico diana originales.

Recientemente, se han descrito procedimientos que usan sondas TaqMan® "marcadas" para realizar ensayos de PCR multiplexados en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2018/0073056 y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2018/0073064.

Como alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificación usando un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de unión a ADN fluorescente (por ejemplo, SYBRGREEN I® o SYBRGOLD® (Molecular Probes)). Tras la interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos tintes de unión a ADN fluorescentes emiten una señal de fluorescencia después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un tinte de unión a ADN bicatenario, tal como un tinte de intercalación de ácido nucleico. Cuando se usan tintes de unión a ADN bicatenario, normalmente se realiza un análisis de la curva de fusión para confirmar la presencia del producto de amplificación.

También se pueden usar balizas moleculares junto con FRET para detectar la presencia de un producto de amplificación usando los procedimientos de PCR en tiempo real de la invención. La tecnología de balizas moleculares usa una sonda de hibridación marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente es, en general, un extintor, y los marcadores fluorescentes típicamente se localizan en cada extremo de la sonda. La tecnología de balizas moleculares usa un oligonucleótido de sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructuras secundarias (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de estructuras secundarias dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Después de la hibridación a los productos de amplificación, se altera la estructura secundaria de la sonda y los restos fluorescentes se separan entre sí de modo que después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada se puede detectar la emisión del primer resto fluorescente.

Por tanto, un procedimiento de acuerdo con la invención es el procedimiento descrito anteriormente que usa FRET, en el que dichas sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico que permite la formación de estructuras secundarias, en el que dicha formación de estructuras secundarias da como resultado una proximidad espacial entre dicho primer y segundo resto fluorescente.

La FRET eficaz solo puede tener lugar cuando los restos fluorescentes están en proximidad local directa y cuando el espectro de emisión del resto fluorescente donante se solapa con el espectro de absorción del resto fluorescente aceptor.

Por tanto, en un modo de realización, dichos restos fluorescentes donante y aceptor están separados en no más de cinco nucleótidos entre sí en dicha sonda. En otro modo de realización, dicho resto fluorescente aceptor es un extintor.

Como se describe anteriormente, en el formato TaqMan®, durante la etapa de hibridación de la reacción PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ácido nucleico diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la Taq u otra polimerasa adecuada como es conocido por el experto en la técnica, tal como una polimerasa de Z05 mutante, durante la fase de alargamiento posterior. Por tanto, en un modo de realización, en el procedimiento descrito anteriormente, la amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad exonucleasa de 5' a 3'.

Es además ventajoso seleccionar cuidadosamente la longitud del amplicón que se proporciona como resultado del procedimiento descrito anteriormente. En general, los amplicones relativamente cortos incrementan la eficacia de la reacción de amplificación. Por tanto, un aspecto de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que los fragmentos amplificados comprenden hasta 450 bases, hasta 300 bases, hasta 200 bases o hasta 150 bases.

Una "secuencia" es la estructura primaria de un ácido nucleico, es decir, la disposición específica de las mononucleobases de las que consisten los respectivos ácidos nucleicos. Se ha de entender que el término "secuencia" no indica un tipo específico de ácido nucleico, tal como ARN o ADN, sino que se aplica a ambos, así como a otros tipos de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, APN u otros. Cuando las nucleobases se corresponden entre sí, en particular, en el caso de uracilo (presente en ARN) y timina (presente en ADN), estas bases se pueden considerar equivalentes entre secuencias de ARN y ADN, como es bien conocido en la técnica pertinente.

Los ácidos nucleicos clínicamente pertinentes son a menudo ADN que se puede derivar, por ejemplo, de virus de ADN como, por ejemplo, virus de la hepatitis B (VHB), citomegalovirus (CMV) y otros, o bacterias como, por ejemplo, Chlamydia trachomatis (CT), Neisseria gonorrhoeae (NG) y otras. En dichos casos, puede ser ventajoso usar un ácido nucleico de control interno que consista en ADN para reflejar las propiedades de los ácidos nucleicos diana. Los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se pueden usar de manera intercambiable y todas estas designaciones incluyen la descendencia. Por tanto, las palabras "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula transformada primaria y cultivos derivados de esa célula independientemente del número de transferencias. Es posible que toda la descendencia no sea precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. La descendencia mutante que tiene la misma funcionalidad que la que se criba en la célula transformada originalmente se incluye en la definición de transformantes. Las células pueden ser procariotas o eucariotas.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada de forma funcional en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, un sitio de unión a ribosoma, elementos retrorreguladores positivos (véase la pat. de EE. UU. n.° 4.666.848), y posiblemente otras secuencias. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El término "enlazado de forma funcional" se refiere al posicionamiento de la secuencia codificante de modo que las secuencias de control funcionen para fomentar la expresión de la proteína codificada por la secuencia codificante. Por tanto, una secuencia codificante "enlazada de forma funcional" a secuencias de control se refiere a una configuración en la que las secuencias codificantes se pueden expresar bajo la dirección de una secuencia de control.

Los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas, típicamente de origen bacteriano, que cortan ADN bicatenario en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica.

En el presente documento se definen familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína, glicina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

El término "solución de reactivo" es cualquier solución que contenga al menos un reactivo necesario o usado para propósitos de PCR. Los ingredientes más típicos son polimerasa, nucleótido, cebador, iones, magnesio, sales, agentes de tamponación del pH, nucleósidos trifosfato (NTP) o desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP), una o más sondas de ácido nucleico, tinte fluorescente (se puede fijar a la sonda), agente de unión a ácido nucleico, un molde de ácido nucleico. El reactivo también puede ser otro aditivo de reacción de polimerasa, que tiene una influencia en la reacción de polimerasa o su supervisión.

El término "mezcla maestra" se refiere a una mezcla de todos o la mayoría de los ingredientes o factores necesarios para que se produzca la PCR, y, en algunos casos, todos excepto el molde y los cebadores que son específicos de muestra y amplicón. Las mezclas maestras disponibles comercialmente normalmente son soluciones concentradas. Una mezcla maestra puede contener todos los reactivos comunes a múltiples muestras, pero también se puede preparar solo para una muestra. Usar mezclas maestras ayuda a reducir los errores y variaciones de pipeteo entre muestras debidos a las diferencias entre volúmenes pipeteados.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima que es estable frente al calor, es resistente al calor y retiene suficiente actividad para efectuar reacciones de extensión del cebador posteriores después de someterse a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para desnaturalizar los ácidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos son bien conocidas en la técnica y se ejemplifican en las patentes de EE. UU. n.os 4.965.188 y 4.889.818. Como se usa en el presente documento, una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en una reacción de termociclado, tal como PCR. Los ejemplos de ácido nucleico polimerasas termoestables incluyen ADN polimerasa de Thermus aquaticus Taq, polimerasa de Thermus sp. Z05, polimerasa de Thermus flavus, polimerasas de Thermotoga marítima, tales como las polimerasas TMA-25 y TMA-30, ADN polimerasa de Tth y similares.

Una "polimerasa con actividad retrotranscriptasa" es una ácido nucleico polimerasa que puede sintetizar ADN en base a un molde de ARN. También puede replicar un ADN mono- o bicatenario una vez que el ARN se ha retrotranscrito en ADNc monocatenario. En un modo de realización de la invención, la polimerasa con actividad retrotranscriptasa es termoestable.

En la amplificación de una molécula de ARN por una ADN polimerasa, la primera reacción de extensión es la retrotranscripción que usa un molde de ARN, y se produce una hebra de ADN. La segunda reacción de extensión, que usa el molde de ADN, produce una molécula de ADN bicatenario. Por tanto, la síntesis de una hebra de ADN complementaria de un molde de ARN por una ADN polimerasa proporciona el material de partida para la amplificación.

Se pueden usar ADN polimerasas termoestables en una reacción de retrotranscripción/amplificación de una enzima acoplada. El término "homogéneo", en este contexto, se refiere a una reacción de adición única en dos etapas para la retrotranscripción y amplificación de una diana de ARN. Por homogéneo se quiere decir que tras la etapa de retrotranscripción (RT), no existe ninguna necesidad de abrir el recipiente de reacción o ajustar de otro modo los componentes de reacción antes de la etapa de amplificación. En una reacción RT-PCR no homogénea, tras la retrotranscripción y antes de la amplificación, uno o más de los componentes de reacción, tales como los reactivos de amplificación, por ejemplo, se ajustan, añaden o diluyen, para lo que se ha de abrir el recipiente de reacción o, al menos se ha de manipular su contenido. Tanto los modos de realización homogéneos como no homogéneos están comprendidos por el alcance de la invención.

La retrotranscripción es una etapa importante en una RT-PCR. Por ejemplo, es conocido en la técnica que los moldes de ARN muestran una tendencia hacia la formación de estructuras secundarias que pueden dificultar la unión a cebador y/o el alargamiento de la hebra de ADNc por la respectiva retrotranscriptasa. Por tanto, temperaturas relativamente altas para una reacción de RT son ventajosas con respecto a la eficacia de la transcripción. Por otra parte, elevar la temperatura de incubación también implica una mayor especificidad, es decir, los cebadores de RT no se hibridarán a secuencias que presenten emparejamientos erróneos con la secuencia o secuencias esperadas. En particular, en el caso de múltiples ARN diana diferentes, también puede ser deseable transcribir y posteriormente amplificar y detectar secuencias con emparejamientos erróneos únicos, por ejemplo, en el caso de la posible presencia de subcepas o subespecies de organismos desconocidas o infrecuentes en la muestra de fluido.

Para beneficiarse de ambas ventajas descritas anteriormente, es decir, la reducción de estructuras secundarias y la retrotranscripción de moldes con emparejamientos erróneos, la incubación de RT se puede llevar a cabo a más de una temperatura diferente.

Por lo tanto, un aspecto de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que dicha incubación de la polimerasa con actividad retrotranscriptasa se lleva a cabo a diferentes temperaturas de 30 °C a 75 °C, o de 45 °C a 70 °C, o de 55 °C a 65 °C.

Como otro aspecto importante de la retrotranscripción, las etapas de RT largas pueden dañar los moldes de ADN que pueden estar presentes en la muestra de fluido. Si la muestra de fluido contiene especies tanto de ARN como de ADN, por tanto, es favorable mantener la duración de las etapas de RT lo más corta posible, pero, al mismo tiempo, garantizar la síntesis de cantidades suficientes de ADNc para la posterior amplificación y detección opcional de los amplificados.

Por tanto, un aspecto de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que el período de tiempo para la incubación de la polimerasa con actividad retrotranscriptasa es de hasta 30 min, 20 min, 15 min, 12,5 min, 10 min, 5 min o 1 min.

Otro aspecto de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que la polimerasa con actividad retrotranscriptasa y que comprende una mutación se selecciona del grupo que consiste en

a) una ADN polimerasa CS5

b) una ADN polimerasa CS6

c) una ADN polimerasa de Thermotoga marítima

d) una ADN polimerasa de Thermus aquaticus

e) una ADN polimerasa de Thermus thermophilus

f) una ADN polimerasa de Thermus flavus

g) una ADN polimerasa de Thermus filiformis

h) una ADN polimerasa de Thermus sp. sps17

i) una ADN polimerasa de Thermus sp. Z05

j) una ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana

k) una ADN polimerasa de Termosipho africanus

l) una ADN polimerasa de Thermus caldophilus

En particular son adecuadas para estos requisitos las enzimas que llevan una mutación en el dominio de polimerasa que potencia su eficacia de retrotranscripción en términos de una tasa de extensión más rápida. Por lo tanto, en el procedimiento descrito anteriormente, en el que la polimerasa con actividad retrotranscriptasa es una polimerasa que comprende una mutación que confiere una tasa de extensión de ácido nucleico mejorada y/o una actividad retrotranscriptasa mejorada con respecto a la respectiva polimerasa natural.

En un modo de realización, en el procedimiento descrito anteriormente, la polimerasa con actividad retrotranscriptasa es una polimerasa que comprende una mutación que confiere una actividad retrotranscriptasa mejorada con respecto a la respectiva polimerasa natural.

Las polimerasas que llevan mutaciones puntuales que las hacen, en particular, útiles se divulgan en el documento WO 2008/046612. En particular, las polimerasas que se van a usar pueden ser ADN polimerasas mutadas que comprenden al menos el siguiente motivo en el dominio de polimerasa:

T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N; en el que Xb7 es un aminoácido seleccionado de S o T y en el que Xb8 es un aminoácido seleccionado de G, T, R, K o L, en el que la polimerasa comprende actividad exonucleasa 3'-5' y tiene una tasa de extensión de ácido nucleico mejorada y/o una eficacia de retrotranscripción mejorada con respecto a la ADN polimerasa natural, en el que en dicha ADN polimerasa natural Xb8 es un aminoácido seleccionado de D, E o N.

Un ejemplo son los mutantes de la ADN polimerasa termoestable de la especie Z05 de Thermus (descritos, por ejemplo, en el documento US 5.455.170), comprendiendo dichas variaciones mutaciones en el dominio de polimerasa en comparación con la respectiva enzima Z05 natural. Un modo de realización para el procedimiento de acuerdo con la invención es una ADN polimerasa de Z05 mutante en la que el aminoácido en la posición 580 se selecciona del grupo que consiste en G, T, R, K y L.

Para la retrotranscripción que usa una polimerasa termoestable, un catión divalente tal como Mn2+ o Mg2+ se incluye típicamente como una sal, por ejemplo, cloruro de manganeso (MnCh) o acetato de manganeso (Mn(OAc)²) o sulfato de manganeso (MnSO4) o cloruro de magnesio (MgCh), acetato de magnesio (Mg(OAc)²) o sulfato de magnesio (MgSO4). Si se incluye MnCh en una reacción que contenga tampón tricina 50 mM, por ejemplo, el MnCh está presente, en general, a una concentración de 0,5-7,0 mM; está presente, en general, a 2,5-3,5 mM cuando se utilizan 200 |jM de cada dGTP, dATP, dUTP y dCTP.

Una polimerasa termoestable "modificada" se refiere a una polimerasa en la que al menos un monómero difiere de la secuencia de referencia, tal como una forma natural de la polimerasa u otra forma modificada de la polimerasa. Las modificaciones ejemplares incluyen inserciones, deleciones y sustituciones de monómeros. Las polimerasas modificadas también incluyen polimerasas quiméricas que tienen secuencias de componentes identificables (por ejemplo, dominios estructurales o funcionales, etc.) derivadas de dos o más orígenes. También se incluyen dentro de la definición de polimerasas modificadas las que comprenden modificaciones químicas de la secuencia de referencia. Los ejemplos de polimerasas termoestables modificadas incluyen ADN polimerasa CS5 G46E E678G, ADN polimerasa CS5 G46E L329A E678G, ADN polimerasa CS5 G46E L329A ^d 640G S671F, ADN polimerasa CS5 G46E L329A D640G S671F E678G, una ADN polimerasa CS6 G46E E678G, ADN polimerasa de Z05, polimerasa de AZ05, polimerasa de AZ05-Gold, polimerasa de AZ05R, ADN polimerasa Taq E6l5G, polimerasa de TMA-25 E678G, polimerasa de TMA-30 E678G y similares.

El término "polimerasa termoactiva" se refiere a una enzima que es activa a temperaturas elevadas necesarias para garantizar el cebado específico y la extensión del cebador (por ejemplo, 55-80 °C).

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable. Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan de manera intercambiable. Las secuencias de aminoácidos se escriben del extremo amínico al extremo carboxílico, a menos que se indique de otro modo. Las secuencias de ácido nucleico monocatenario se escriben de 5' a 3', a menos que se indique de otro modo. La hebra superior de una secuencia de ácido nucleico bicatenario se escribe de 5' a 3' y la hebra inferior se escribe de 3' a 5', a menos que se indique de otro modo.

Los reactivos de amplificación de ácido nucleico típicamente están compuestos por componentes sensibles a la temperatura y, por lo tanto, a menudo se deben almacenar y transportar a temperaturas muy por debajo de la ambiente. Este es, en particular, el caso de los desoxirribonucleósidos trifosfato o sus análogos ribonucleosídicos. Estos reactivos son propensos a degradación por medio de la pérdida de grupos fosfato consecutivos de los extremos, lo que da como resultado la formación de nucleósidos difosfato y monofosfato, ya no siendo ambos activos como sustratos de polimerasa.

La estabilidad de los nucleósidos polifosfato se puede mejorar esterificando los fosfatos terminales. Por ejemplo, los análogos de dNTP que contenían un éster metílico en el fosfato terminal eran completamente estables en condiciones de sobrecarga calórica que eran suficientes para degradar por completo los dNTP normales. Sin embargo, la esterificación del fosfato terminal puede tener un efecto negativo sobre la capacidad de los nucleótidos de servir como sustratos eficaces para determinadas enzimas polimerasas.

La presente invención presenta una solución simple y elegante para abordar este problema. Los desoxinucleósidos trifosfato estándar se reemplazan por análogos con lo que el fosfato terminal contiene un resto de flúor como se muestra a continuación:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2.

Se dan los siguientes ejemplos para ilustrar modos de realización de la presente invención como es preferente poner en práctica actualmente. Se entenderá que los ejemplos son ilustrativos y que la invención no se considera como restringida, excepto como se indica en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1: síntesis química de 2'-desoxirribonudeósido 5'-O-(Y-fluorotrifosfato) y 2'-desoxirribonucleósido 5'-O-(5-fluorotetrafosfato)

Las estructuras químicas de 2'-desoxirribonucleósido 5'-0-(Y-fluorotrifosfato) (dNTP-YF) y 2'-desoxirribonucleósido 5'-0-(5-fluorotetrafosfato) (dN4P-5F) se muestran en la FIG. 1 y los esquemas de su síntesis como sales sódicas se muestran en la FIG. 2 y la FIG. 3, respectivamente.

Abreviaturas: DEPC = pirocarbonato de dietilo, dATP = 2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato, dCTP = 2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, dGTP = 2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato, DMF = W,W-dimetilformamida, DMSO = dimetilsulfóxido, dUTP = 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato, MeCN = acetonitrilo, qPCR = reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, t. a. = temperatura ambiente, RT-qPCR = reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción, TBAF = fluoruro de tetrabutilamonio, THF = tetrahidrofurano, UPLC-EM = cromatografía de líquidos de ultra rendimiento acoplada a un espectrómetro de masas.

A. Síntesis de 2'-desoxiadenosina 5'-0-(Y-fluorotrifosfato), dATP-YF

Se convirtió la sal sódica de dATP (1,5 mmol) en la sal de trietilamonio y se liofilizó hasta sequedad. Se disolvió el compuesto en MeCN seco y se transfirió al matraz de reacción. Posteriormente, se evaporó el disolvente y se secó el residuo a alto vacío. Bajo argón, se disolvió el trifosfato de trietilamonio en una mezcla anhidra de DMF (7,7 ml) y tributilamina (968 |jl), seguido de la adición gota a gota de 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (562 |jl). Se observó una coloración inmediata de la mezcla de reacción a amarillo, que se volvió naranja oscuro en pocos minutos. Se agitó la solución de reacción durante 30 min adicionales a t. a., seguido de la adición de TBAF anhidro (4,48 ml, 1,0 M en THF). Después de agitar durante la noche a t. a., el análisis de UPLC-EM indicó el consumo total del material de partida. Se realizó una extinción inversa de la reacción por la adición gota a gota de la solución de reacción a una solución agitada de yoduro de sodio en acetona seca (20 ml, 0,5 M). Se aisló el precipitado por centrifugación (4 min a 4000 rpm) y se descartó el sobrenadante. Se lavó el sedimento con acetona seca por resuspensión y centrifugación repetidas. Se secó el producto bruto y se purificó con cromatografía de líquidos de fase inversa. Se concentraron las fracciones de producto combinadas por extracción en fase sólida (Cis) y se convirtió en la sal sódica por precipitación con yoduro de sodio en acetona seca (0,5 M). El producto incoloro final se obtuvo con un rendimiento final del 73 % (pureza >99 %).

B. Síntesis de 2'-desoxicitosina 5'-0-(Y-fluorotrifosfato), dCTP-YF

Se realizó la síntesis de forma análoga al Ejemplo 1A, usando dCTP (1,11 mmol), tributilamina (720 jl), DMF (5,8 ml), TBAF (3,33 ml, 1,0 M en THF) y 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (418 jl). Antes de introducir 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, se añadió DMSO seco (1,0 ml) para obtener una solución transparente del material de partida. Se aisló la sal sódica del producto purificado con un rendimiento final del 55 % (pureza >99 %).

C. Síntesis de 2'-desoxiguanosina 5'-0-(Y-fluorotrifosfato), dGTP-YF

Se realizó la síntesis de forma análoga al Ejemplo 1A, usando dGTP (1,09 mmol), tributilamina (706 jl), DMF (5,6 ml), TBAF (3,3 ml, 1,0 M en THF) y 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (410 jl). Antes de introducir el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, se añadió DMSO seco (3,0 ml) para obtener una solución transparente del material de partida. Se aisló la sal sódica del producto purificado con un rendimiento final del 27 % (pureza >99 %).

D. Síntesis de 2'-desoxiuridina 5'-0-(Y-fluorotrifosfato), dUTP-YF

Se realizó la síntesis de forma análoga al Ejemplo 1A, usando dUTP (1,0 mmol), tributilamina (649 jl), DMF (5,2 ml), TBAF (3,0 ml, 1,0 M en THF) y 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (377 jl). Antes de introducir 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, se añadió DMSO seco (3,0 ml) a la mezcla de reacción para obtener una solución transparente del material de partida. Se aisló la sal sódica del producto purificado con un rendimiento final del 42 % (pureza >99 %).

E. Síntesis de 2'-desoxiadenosina 5'-0-(5-fluorotetrafosfato), dA4P-5F

El fluorofosfato de sodio (3,909 mmol) se convirtió en la sal de trietilamonio por intercambio catiónico. La evaporación del disolvente dio un compuesto incoloro, que se secó a alto vacío. Bajo argón, se disolvió el fluorofosfato en una mezcla anhidra de DMSO (8,2 ml) y MeCN (5,0 ml). Se añadió imidazol (1,33 g) y se agitó la solución durante 10 min, seguido de la adición de trifenilfosfina (2,563 g) y disulfuro de 2-aminofenilo (1,456 g). Se calentó la mezcla de reacción hasta 40 °C hasta que se disolvieron todos los componentes por completo y se mantuvo en agitación durante la noche a t. a. El progreso de la reacción se siguió de UPLC-EM hasta que no se formó ningún producto adicional. Se detuvo la reacción por la adición gota a gota a una solución agitada de yoduro de sodio frío en acetona seca (30 ml, 0,5 M). Se aisló el precipitado formado por centrifugación (4 min a 4000 rpm). Se lavó el sedimento repetidamente con acetona seca. Se enfriaron los sobrenadantes combinados durante la noche a 4 °C, lo que dio lugar a una mayor precipitación del producto incoloro. Se secaron los precipitados combinados de imidazolida de fluorofosfato de sodio a alto vacío y se usaron sin purificación adicional.

Se convirtió la sal sódica de dATP (0,25 mmol) en la sal de trietilamonio y se liofilizó hasta sequedad. Se disolvió el residuo en MeCN seco, se transfirió a un matraz de reacción, se liberó del disolvente en el evaporador rotatorio y se secó a alto vacío. Bajo argón, se disolvió el trifosfato en DMF anhidro (1,68 ml). En un segundo matraz, se disolvió la imidazolida de fluorofosfato (1,125 mmol) en DMF anhidra (1,68 ml). Posteriormente, se transfirió gota a gota 1.0 ml de la solución de imidazolida a la solución de dATP. Se añadió ZnCh (273 mg) y se agitó la mezcla durante 2.0 h a t. a. Posteriormente, se transfirió la solución de imidazolida restante a la mezcla de reacción y se siguió el progreso de la reacción por UPLC-EM hasta que no se formó ningún producto adicional. Se detuvo la reacción añadiendo 4,0 ml de una solución acuosa de EDTA (0,5 M, pH 8,0). Se continuó con agitación enérgica durante 15 min, después de lo que se añadió la mezcla de reacción gota a gota a una solución agitada de yoduro de sodio en acetona seca (0,5 M). Se aisló el precipitado incoloro por centrifugación (4 min a 4000 rpm) y se descartó el sobrenadante. Se secó el producto bruto y se purificó con cromatografía de líquidos de fase inversa. Se concentraron las fracciones de producto combinadas por extracción en fase sólida (C¹⁸) y se convirtió en la sal sódica por precipitación con yoduro de sodio en acetona seca (0,5 M). El producto incoloro final se obtuvo con un rendimiento de reacción del 63 % (pureza >98 %).

F. Síntesis de 2'-desoxicitosina 5'-0-(5-fluorotetrafosfato), dC4P-5F

Se realizó la síntesis de forma análoga al ejemplo 1E usando dCTP (0,25 mmol) como material de partida. Se aisló la sal sódica del producto purificado con un rendimiento de reacción del 21 % (pureza >98 %).

G. Síntesis de 2'-desoxiguanosina 5'-0-(5-fluorotetrafosfato), dG4P-5F

Se realizó la síntesis de forma análoga al Ejemplo 1E usando dGTP (0,25 mmol) como material de partida, excepto que se añadió 1 -metil-2-pirrolidona (1,5 ml) a la mezcla de reacción antes de la adición de ZnCh. Se aisló la sal sódica del producto purificado con un rendimiento de reacción del 25 % (pureza >98 %).

H. Síntesis de 2'-desoxiuridina 5'-0-(5-fluorotetrafosfato), dU4P-5F

Se realizó la síntesis de forma análoga al Ejemplo 1E usando dUTP (0,25 mmol) como material de partida. Se aisló la sal sódica del producto purificado con un rendimiento de reacción del 68 % (pureza >99 %).

Ejemplo 2 : estudios de estabilidad con dNTP-YF

Se preparó una mezcla acuosa que contenía fluoropolifosfato 300 ^|j M, 40 % de DMSO y acetato de potasio 1,0 M. Como referencia se preparó otra mezcla con dNTP 300 j M en lugar del fluoropolifosfato. Se incubaron ambas soluciones (300 j l) a 65 °C en un Thermoshaker. En varios puntos de tiempo, se tomaron muestras (20 j l) de cada solución y se analizaron por UPLC-EM. Se determinaron las áreas de los picos de indicio de absorción a 260 nm para calcular los porcentajes relativos de material de partida y productos de degradación.

Resultados: En las condiciones empleadas, dNTP normal se degradó rápidamente a mono- y difosfatos, como se confirma por UPLC-EM. Por el contrario, los fluoropolifosfatos eran estables y no se observaron productos de degradación a 65 °C durante 140 h (FIG. 4).

Ejemplo 3 : reacciones de amplificación con una diana de ADN

Todos los componentes de PCR cuantitativa (qPCR) se prepararon con agua tratada con DEPC. Se prepararon mezclas de qPCR con un volumen total de 50 j l combinando tres componentes denominados mezcla maestra de qPCR (20 jl), mezcla de tampón (20 j l) y mezcla de dNTP (10 jl). La mezcla maestra de qPCR contenía tampón tricina (pH 8,2), acetato de potasio, glicerol, DMSO, detergente, ADN diana (400 cp/reacción), aptámero de polimerasa, ADN de sonda marcado con Cy5.5, ADN de cebador directo e inverso, tinte verde SYBR™ y enzima polimerasa. La mezcla de tampón contenía acetato de manganeso (8,3 mM) solo o una combinación con acetato de magnesio (2,49 mM). La mezcla de dNTP contenía dATP, dCTP, dGTP (2,0 mM cada uno) y dUTP (4,0 mM). Se preparó otra solución que contenía fluoropolifosfatos en lugar de los dNTP naturales a concentraciones iguales. Se prepararon las mezclas de qPCR en ausencia y presencia de una pirofosfatasa inorgánica termoestable, que era la pirofosfatasa inorgánica termoestable (TIP) de New England BioLabs o bien la pirofosfatasa termoestable (rTh) de Roche Molecular Systems, Inc. Se preparó cada mezcla de qPCR por triplicado en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Se selló la placa y se sometió a ciclos de amplificación de qPCR y posterior fusión de ADN con un sistema LightCycler™ 480. Se realizó el análisis de las curvas de crecimiento de qPCR a partir de datos de fluorescencia recopilados en el canal Cy5.5.

Resultados: los ensayos de qPCR del ADN diana con dN4P-5F muestran Ct iguales o anteriores (ACt = -1,5) en comparación con los dNTP normales, lo que demuestra que las enzimas polimerasas aceptan análogos de polifosfato fluorado como sustratos con igual o mejor eficacia (FIG. 5 y FIG. 6). Además, los productos de escisión de fluoropolifosfato son sustratos eficaces para enzimas pirofosfatasas inorgánicas termoestables. Esto demuestra que los ensayos de qPCR con sustratos dN4P-5F son compatibles con cebadores no modificados y bencilados.

Ejemplo 4: reacciones de amplificación con una diana de ARN blindado

Se realizaron los experimentos de qPCR de forma análoga al Ejemplo 3 con los siguientes cambios. El ADN diana se reemplazó por ARN de una secuencia equivalente. Se añadió una etapa de retrotranscripción (RT) antes del termociclado habitual.

Resultados: qPCR-RT de ARN diana blindado con dN4P-5F muestra Ct iguales o anteriores (ACt = -1,2) en comparación con los dNTP normales, lo que demuestra que las enzimas polimerasas aceptan análogos de polifosfato fluorado como sustratos en reacciones de retrotranscripción con igual o mejor eficacia (FIG. 7 y FIG. 8). Además, los productos de escisión de fluoropolifosfato son sustratos eficaces para enzimas pirofosfatasas inorgánicas termoestables. Esto demuestra que los ensayos de qPCR de retrotranscripción con sustratos dN4P-5F son compatibles con cebadores no modificados y bencilados.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de detección de la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra que comprende:

a) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con reactivos de amplificación para producir un producto de amplificación si la secuencia de ácido nucleico diana está presente en la muestra, y

b) detectar el producto de amplificación,

en el que los reactivos de amplificación comprenden un nucleósido polifosfato modificado que tiene una estructura de:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2, y

en el que los reactivos de amplificación comprenden además una enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable, en el que los reactivos de amplificación comprenden además una ácido nucleico polimerasa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la ácido nucleico polimerasa posee actividad retrotranscriptasa.

3. Un procedimiento de amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana usando reactivos de amplificación, en el que los reactivos de amplificación comprenden un nucleósido polifosfato que tiene una estructura de:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2, y

en el que los reactivos de amplificación comprenden además una enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable, en el que los reactivos de amplificación comprenden además una ácido nucleico polimerasa.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la ácido nucleico polimerasa posee actividad retrotranscriptasa.

5. Una mezcla de reacción para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana que comprende una ácido nucleico polimerasa, una enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable, tampón y

un nucleósido polifosfato que tiene una estructura de:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2.

6. La mezcla de reacción de la reivindicación 5, en la que la ácido nucleico polimerasa posee actividad retrotranscriptasa.

7. Un kit para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana que comprende una ácido nucleico polimerasa, una enzima pirofosfatasa inorgánica termoestable, tampón y un nucleósido polifosfato que tiene una estructura de:

donde R = base purínica o pirimidínica o un análogo, y n = 2.

8. El kit de la reivindicación 7, en el que la ácido nucleico polimerasa posee actividad retrotranscriptasa.