CN101365791B - 核酸的复制方法及新型人工碱基对 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸的复制方法及新型人工碱基对。本发明的核酸的复制方法的特征在于：在复制反应中使用了γ位磷酸羟基已被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代的脱氧核糖核苷5’-三磷酸作为底物。本发明的新型人工碱基对的特征在于：7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)或其类似物与吡咯-2-甲醛(Pa)或其类似物形成碱基对。

Description

核酸的复制方法及新型人工碱基对
技术领域
本申请要求2005年12月9日提出的日本国申请特愿2005-356883和2006年7月10日提出的日本国申请特愿2006-189806的优先权，其全部内容并入本说明书中。
本发明涉及核酸的复制方法及新型人工碱基对。
背景技术
核酸通过A-T(U)和G-C碱基对的自身互补性进行扩增，并且作为催化剂和配体发挥功能。然而，与天然型蛋白质中的20种不同氨基酸相比，天然型核酸仅由4种不同的碱基所构成的核苷酸形成，这种数量上的限制制约了DNA和RNA分子的功能。非天然型碱基对系统可以增加核酸碱基的种类、扩展遗传信息，因而是上述问题的解决之道(非专利文献1-5)。作为非天然型碱基对，要求其具有高特异互补性，可以通过聚合酶催化反应在DNA和RNA中位点特异性地导入特殊的核苷酸类似物。这如能实现，则受天然存在碱基的数量制约的当前的基因工程将被使用非天然型碱基对系统的新技术替代。
Benner等进行了构建非天然型碱基对的最初尝试(非专利文献6-7)。他们采用不同于天然型碱基对的氢键模式开发出数种非天然型碱基对，诸如异鸟嘌呤-异胞嘧啶(isoG-isoC)和黄苷-二氨基嘧啶等。最近，这些非天然型碱基对被应用于含有该碱基对的DNA片段的PCR扩增(非专利文献8-9)、和序列分析(非专利文献10)。然而，其保真度不高、和/或需要麻烦的方法。除这些问题外，像isoC和二氨基嘧啶这样的2-氨基嘧啶类似物不能作为底物被T7RNA聚合酶所识别。因此，这碱基对的应用受到了限制。
接着，Kool等合成了具有与天然型碱基相类似的形状，但在碱基配对中缺乏形成氢键的能力的疏水性碱基(非专利文献11-12)。这些疏水性碱基可以被DNA聚合酶选择性地识别，因而这提示：在复制中，碱基对间的几何学的形状的互补性比氢键相互作用更为重要。最近，Romesberg等开发了一系列疏水性碱基对，而且利用大肠杆菌来源的DNA聚合酶I的克列诺片段将这些碱基对互补地导入到了DNA中(非专利文献13-15)。然而，在复制中，通过酶反应疏水碱基出现了不遵从形状互补性的疏水性碱基间非选择性导入(非专利文献14)。而且，尚未有报道说这些疏水性碱基对在转录中具有功能。
通过组合氢键模式与形状互补性的概念，本发明人等开发出如下非天然型碱基对：2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(s)与2-氧代吡啶(y)(非专利文献16-17)、以及2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤(v)与y(非专利文献18)。s和v的6位的大取代基有效地抑制其与天然型碱基形成不希望的碱基对(non-cognatepairing)，而且，通过T7RNA聚合酶能够将y和修饰y碱基底物(核苷5’-3磷酸)部位特异性地导入到RNA中，来与模板中的s或v互补。这种特异性转录可以作为开发功能性RNA分子的方法而实用化(非专利文献19-21)，但复制中s-y和v-y碱基对的选择性不如转录中的选择性那么高(非专利文献16、18)。
为了解决上述问题，需要在复制和转录(功能性核酸的创造)、或者复制·转录·翻译的全过程中(功能性蛋白质的创造)效率、选择性良好的新型人工碱基对。
以下文献的全部内容引入本文作为参考文献。
专利文献1WO2001/005801
专利文献2WO2004/007713
专利文献3WO2005/026187
专利文献4特愿2005-226492号
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非专利文献47Stumber，M.，Herrmann，C.，Wohlgemuth，S.，Kalbitzer，H.R.，Jahn，W.&Geyer，M.Synthesis，characterization and application of twonucleoside triphosphate analogues.GTPγNH2and GTP F.Eur.J.Biochem.269，3270-3278(2002).
非专利文献48Knorre，D.G.，Kurbatov，V.A.&Samukov，V.V.Generalmethod for the synthesis of ATP gamma-derivatives.FEBS Lett.70，105-108(1976).
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发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供以下的方案1-27。
方案1核酸的复制方法，其特征在于：在复制反应中，使用γ位磷酸羟基被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代的脱氧核糖核苷5’-三磷酸作为底物。
方案2方案1的方法，其中，所述替代基团为氨基。
方案3方案1或2的方法，其中，在复制反应中使用具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
方案4方案1～3任一项的方法，其中，具有外切核酸酶活性的聚合酶选自具有3’→5’外切核酸酶活性的克列诺片段、T4DNA聚合酶及嗜热菌来源的DNA聚合酶。
方案5方案1～4任一项的方法，其中，作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸具有非天然型碱基。
方案6方案1～4任一项的方法，其中，作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸具有天然型碱基。
方案7方案1～5任一项的方法，其中，作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸具有用式1表示的碱基：
化学式1
此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH。
方案8方案1～5任一项的方法，其中，作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸具有用式2表示的碱基：
化学式2
Figure GSB00000653789400082
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3的烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团，而且
R4为甲酰基或硝基。
方案9一种脱氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸羟基已被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代。
方案10一种脱氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸的羟基已被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代，且其具有非天然型碱基。
方案11一种脱氧核糖核苷5’-三磷酸，其γ位磷酸的羟基已被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代，且其具有天然型碱基。
方案12γ位磷酸的羟基被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代了的脱氧核糖核苷5’-三磷酸的应用，其在方案1～8任一项的核酸的复制方法中用作底物。
方案13一种核酸，其中具有用式1表示的碱基的核苷酸与具有用式2表示的碱基的核苷酸形成碱基对：
式1
化学式3
此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH；
式2：
化学式4
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且
R4为甲酰基或硝基。
方案14方案13的核酸，其中，式1的碱基选自下组：
A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A3)7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A6)5-氨基-7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A7)4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；
A8)4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；
A-9)4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基：
A-10)6-氨基-4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；
A-11)6-氨基-4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；及
A-12)6-氨基-4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基。
方案15方案13的核酸，其中式2的碱基选自下组：
B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基；
B2)2-甲酰基-4-碘-1H-吡咯-1-基；
B3)2-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；
B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B5)2-甲酰基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；
B6)2-甲酰基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B7)2-硝基-1H-吡咯-1-基；
B8)2-硝基-4-碘-1H-吡咯-1-基；
B9)2-硝基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；
B10)2-硝基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B11)2-硝基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；及
B12)2-硝基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基。
方案16方案13～15任一项的核酸，其碱基对是在转录、逆转录、复制或翻译步骤中形成的。
方案17包含具有用式1表示的碱基的核苷酸的核酸的制备方法，其中，以包含具有用式2表示的碱基的核苷酸的核酸作为模板，进行转录、逆转录或复制，在所述具有式2的碱基的核苷酸的互补位置掺入所述具有式1的碱基的核苷酸：
式1
化学式5
Figure GSB00000653789400101
此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH；
式2：
化学式6
Figure GSB00000653789400111
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且
R4为甲酰基或硝基。
方案18包含具有式2表示的碱基的核苷酸的核酸的制备方法，其中，以包含具有式1表示的碱基的核苷酸的核酸作为模板，进行转录、逆转录或复制，在所述具有式1的碱基的核苷酸的互补位置掺入所述具有式2的碱基的核苷酸：
式2
化学式7
Figure GSB00000653789400112
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且
R4为甲酰基或硝基；
式1：
化学式8
Figure GSB00000653789400113
此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH。
方案19包含具有式1及/或式2的碱基的核苷酸的核酸，其是采用方案17或18的方法制备的。
方案20方案19的核酸，其为tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶、适体或siRNA。
方案21
具有式1表示的碱基的核糖核苷5’-三磷酸：
式1
化学式9
Figure GSB00000653789400121
此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH。
方案22具有式2表示的碱基的核糖核苷5’-三磷酸：
式2
化学式10
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且
R4为甲酰基或硝基。
方案23具有式3表示的碱基的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷：
式3
化学式11
Figure GSB00000653789400131
此处，
R5为氢或取代氨基，
R6为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH。
方案24具有式4表示的碱基的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷：
式4
化学式12
Figure GSB00000653789400132
此处，
R7为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且
R8为甲酰基或硝基，
但不包括R7为氢或1-丙炔基且R8为甲酰基的情况。
方案25采用方案18的方法制备的、包含具有式2表示的碱基的核苷酸的核酸，其中，式2的取代基R3为用生物素或荧光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
方案26方案22的核糖核苷5’-三磷酸，其中，R3为用生物素或荧光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
方案27方案24的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷，其中，R7为用生物素或荧光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
解决问题的手段
本发明人等为解决上述问题进行了创造性研究，结果完成了本发明。
本发明的非天然型碱基对系统开发的来龙去脉
本发明者为了获得在复制和转录反应中效率和选择性良好的人工碱基对，通过将自行开发的数个非天然型碱基对进行组合，对构建的碱基对进行了研究。
本发明者发现：2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基(s)(非专利文献17、33)和2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)(非专利文献26)的组合在转录中显示高度的选择性和效率(专利文献4：未公开)。而且，在本发明中进一步制备了将s嘌呤环中的6员环的2个N原子之一替代为CH并将2位的氨基替换成氢(即脱氮杂、脱氨基化)的7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)，考察了Ds与Pa人工碱基对的匹配性。其结果，Ds与Pa人工碱基对在复制和转录中无论哪一个作为模板或底物，均显示出高度的选择性和效率，从而完成了本发明。
具体地，发现了7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)间、以及Ds和4-丙炔基吡咯-2-甲醛(Pa’)(图1a)间的疏水性碱基对在体外复制和转录中显示出高选择性(图1c)。在复制中，本发明人等将常规的5’-三磷酸与修饰5’-三磷酸即5’-γ-三磷酸酰胺(5’-γ-アミド三リン酸)(图1b)底物组合，进一步通过使用具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，实现了能够对含有Ds-Pa碱基对的DNA片段进行PCR扩增的高选择性。进一步，在基于T7RNA聚合酶的常规转录中将这些非天然型碱基互补地导入到了RNA中。
更详细地说，本发明人等考虑到以下的两个理念对Ds-Pa碱基对进行了设计：1)为了提高碱基对的选择性，采用了形状与天然型碱基不同的疏水性碱基(非专利文献12、22)、2)增加了与聚合酶相互作用所必需的(非专利文献23-25)质子受体基团，例如Ds的4位的氮(对应于A和G的3位)和Pa的醛基(对应于C和T的2位的酮基)。
疏水性碱基对的致命问题是：会有效地形成不遵从碱基形状互补性的疏水性碱基-疏水性碱基间的碱基对(例如，Ds-Ds配对)(非专利文献14、29)。为了测定复制中Ds-Pa碱基对的选择性，本发明人等通过使用了无外切核酸酶活性的克列诺片段(KF exo-)的单核苷酸插入实验，考察了底物与模板间的碱基对形成能力(图2a)(非专利文献30-32)。
实验中使用的底物(dDsTP和dPaTP)以及含Ds或Pa的模板DNA是化学合成的(实施例I及II)。实验结果显示：形成Ds-Pa碱基对和形成A-T碱基对的选择性高于其它组合的碱基间配对的选择性(图2b和表1及2)。
表1利用克列诺片段的针对模板DNA的单核苷酸导入实验
表1
a.测定如下进行：在含50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT和0.05mg/ml牛血清白蛋白的溶液(10μl)中，使用5μM模板-引物双链、5-50nM酶、和0.3-1500μM核苷5’-三磷酸，于37℃进行1-35分钟。各变量用3～8个数据组平均化。
b.标准偏差示于括号中。
c.使用1500μM核苷5’-三磷酸和50nM酶进行20分钟温育后，基本上未检出产物(＜2％)。
d.该术语的单位为％min-1M-1
表2利用克列诺片段的针对模板DNA的单核苷酸导入实验
表2-1
Figure GSB00000653789400161
a.测定如下进行：在含50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT和0.05mg/ml牛血清白蛋白的溶液(10μl)中，使用5μM模板-引物双链、5-50nM酶、和0.3-1500μM核苷5’-三磷酸，于37℃进行1-35分钟。各数据用3～8个数据组平均化。
b.标准偏差示于括号中。
c.使用1500μM核苷5’-三磷酸和50nM酶温育20分钟后，基本上未检出产物(＜2％)。
d.单位为％min-1M-1。
然而，对应于模板中的Ds高效地掺入了dDsTP(Vmax/KM＝2.0×105)，这比对应于Ds的dPaTP的导入效率(Vmax/KM＝6.2×104)还要高。该Ds-Ds对是成问题的不遵从碱基形状互补性的疏水性碱基-疏水性碱基间形成的碱基对，因此改变了B型DNA结构。其结果，对应于模板中的Ds，一旦导入了dDsTP，其后复制的延伸停止。例如，如果使用含Ds的模板DNA、在含dPaTP和dDsTP两种底物的溶液中进行引物延伸反应，则随着dDsTP的增加(dPaTP的0.5或1摩尔当量)，对应于模板中的Ds掺入了dDsTP，因而阻碍了通过具有3’→5’外切核酸酶活性的克列诺片段(KF exo+)进行的引物延伸(图2d、泳道3和4)。
因此，为了解决复制中的这种疏水碱基对的本质问题，本发明人等进一步采用了Ds的修饰5’-三磷酸即5’-γ-三磷酸酰胺(图1b)(以dDsTPN表示)作为底物。本发明人等发现：对应于模板中的Ds的dDsTPN的导入效率(Vmax/KM＝9.9×103)显著下降。但是，进一步的问题是：对应于模板中的Pa的dDsTPN的导入效率(Vmax-KM＝6.7×104)降低，接近于对应于模板中的Pa的A的导入效率(Vmax/KM＝4.3×104)的水平。这个问题通过使用A的5’-γ-三磷酸酰胺(dATPN)得到了解决。通过使用dATPN替代dATP，对应于模板Pa的dDsTPN的导入效率比对应于模板Pa的dATPN的导入效率(Vmax/KM＝1.8×103)高37倍，能够保持Pa-Ds碱基对的高选择性。
因此，本发明人等通过组合使用常规的5’-三磷酸即dPaTP、dGTP、dCTP和dTTP、与5’-γ-三磷酸酰胺即dDsTPN和dATPN，在复制中实现了非天然型碱基对的高互补选择性(图2c)。
在修饰底物dDsTPN的存在下，针对模板Ds导入Pa后的引物延伸反应无阻碍地进行(图2d、泳道5和6)。而且，针对模板Pa导入dDsTPN、或者针对模板T导入dATPN后的引物延伸也有效地进行(图2e、泳道2和图2e、泳道14)。有趣的是，与针对模板Pa错误导入了dATP后的延伸反应相比，针对模板Pa错误导入了dATPN后的延伸反应的反应效率显著降低(图2e、泳道4和5)。
为了进一步改善非天然型碱基对的选择性，本发明人等在本系统中使用了具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。通过使用KF exo+，显著地降低了形成不希望的A-Pa和Ds-T碱基对后的引物延伸反应效率，引物延伸在非天然型碱基位置附近中止(图2d泳道1、以及图2e泳道9，10，17和18)。
因此，本发明人等优选将常规5’-三磷酸底物和修饰5’-三磷酸底物与具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶相组合，制成了在复制中与A-T和G-C碱基对一起发挥功能的特异性非天然型碱基对系统。
非天然型碱基对因碱基间特异性形状的互补性而形成，两者之间不存在氢键相互作用。在复制中，通过将常规5’-三磷酸与修饰5’-三磷酸即5’-γ-三磷酸酰胺的组合作为DNA聚合酶的底物，该非天然型碱基对显示出非常高的选择性，其中，所述DNA聚合酶具有3’→5’外切核酸酶活性(exonuclease-proficient)，能够进行优选为实用水平的高可信度的PCR扩增。含非天然型碱基的DNA片段的序列可以通过基于添加非天然型碱基底物的双脱氧核苷酸链终止法的测序进行确定。而且，非天然型碱基对的互补性还能够介导这些碱基通过常规T7转录导入RNA。
本发明提供新型核酸扩增系统，其使用了以下1)-3)之一或者它们的组合。
1)在复制反应中使用下述脱氧核糖核苷5’-三磷酸作为底物，所述脱氧核糖核苷5’-三磷酸的γ位磷酸羟基已被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代；
2)在复制反应中使用具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶；以及
3)利用后述的具有式1所示碱基的核苷酸与具有式2所示碱基的核苷酸的人工碱基对。
以上，为了理解本发明，说明了直至构思出本发明的来龙去脉，但本发明的范围不受上述说明的限制，而是由权利要求书的记载决定。
核酸的复制方法
本发明在一个方案中提供核酸的新复制方法。本发明的方法，其特征在于：在复制反应中使用γ位磷酸羟基被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代的脱氧核糖核苷5’-三磷酸作为底物。
在复制反应中，通过用上述基团替代作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸的γ位磷酸羟基，进一步提高复制反应的选择性。通过利用这样的修饰5’-三磷酸，即使是在底物的摄取效率较使用无取代物低的情况下，通过提高选择性，掺入人工碱基对的复制反应也能够以实质上可利用的方式进行。
优选所述替代基团为氨基。
对于脱氧核糖核苷5’-三磷酸γ位磷酸羟基的修饰方法没有特殊限制，可以采用公知的方法进行。例如，本说明书的实施例I-3-(15)及(16)公开了对应于取代基为氨基的情况的从核苷开始的合成例。或者，非专利文献47也公开了γ-酰胺化核苷酸的合成方法。
当取代基为甲氨基、二甲氨基、巯基、氟基等、氨基以外的基团时，本领域技术人员同样可以采用公知的方法进行合成。
对于复制反应，只要使用上述底物，没有特殊限制，可以采用公知方法进行。并非限定，但例如，复制反应中为了防止形成不希望的非特异性碱基对，优选使用具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。具有外切核酸酶活性的聚合酶选自克列诺片段、T4DNA聚合酶及嗜热菌来源的DNA聚合酶(例如，Thermococcus litoralis来源的Vent DNA聚合酶)，它们具有3’→5’外切核酸酶活性。
作为本发明方法的一个方案，可以使用具有非天然型碱基的脱氧核糖核苷5’-三磷酸作为底物。近年来进行了具有异于天然型碱基对的氢模式、且能够通过空间位阻来排斥与天然型碱基配对的碱基对的创造研究，已经报导了数种人工碱基对。已知人工碱基对是利用了碱基间的氢键的组合，或是利用了碱基的疏水性的组合，等等。本发明通过在具有这些非天然型碱基的核酸中对γ位磷酸羟基进行修饰，能够提高转录、复制及/或翻译反应中的选择性、效率。
对于本发明中的非天然型碱基的种类没有特殊限制，包括利用例如具有下述公知的任意非天然型碱基的脱氧核糖核苷酸。
2-氨基-6-二甲基氨基嘌呤(x)和2-氨基-6-噻吩基嘌呤(s)(非专利文献33)
2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s)和2-氧代-(1H)吡啶-3-基(y)(专利文献1、非专利文献17)
2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基(v)和2-氧代-(1H)吡啶-3-基(y)(专利文献3、非专利文献18)
吡咯-2-甲醛(Pa)和7-甲基-咪唑并[4，5-b]吡啶(Q)(非专利文献26、非专利文献34)
本发明者进一步考察了新型人工碱基对，于2005年8月4目进行了专利申请(特愿2005-226492号)。上述申请涉及吡咯-2-甲醛(Pa)与2-氨基-6-(2-噻吩基)-9H-嘌呤-9-基(s)的人工碱基对。上述碱基对特别是在以Pa为模板、以s为底物的转录反应中显示出良好的选择性。
进一步，本发明人等在本发明中提供另外的新型人工碱基对。该新型人工碱基对也可以有效地用于本发明的复制反应。因而，并非限定，作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸是具有以下式1表示的碱基的脱氧核糖核苷5’-三磷酸，
式1
化学式13
Figure GSB00000653789400201
[此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH]。
或者，作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸是具有以下式2表示的碱基的脱氧核糖核苷5’-三磷酸：
式2
化学式14
Figure GSB00000653789400202
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团，而且
R4为甲酰基或硝基]。
在将式1的碱基及式2的碱基中的任何一个用于底物和/或模板时，在复制反应中显示良好的选择性、效率。而且，在转录反应中显示良好的选择性、效率。
关于本发明中提供的式1的碱基与式2的碱基的新型人工碱基对，将在“基于本发明的人工碱基对的核酸”一项中进行详细描述。
或者，作为底物的脱氧核糖核苷5’-三磷酸也可以具有天然型碱基。脱氧核糖核苷的天然型碱基已知有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)4种。与具有非天然型碱基的情况相同，在具有这些天然型碱基的情况下，γ位磷酸羟基被替代的脱氧核糖核苷5’-三磷酸也能够作为底物有效地用于核酸的复制反应。
脱氧核糖核苷5’-三磷酸
本发明还提供γ位磷酸羟基已被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代的脱氧核糖核苷5’-三磷酸。
本发明的脱氧核糖核苷5’-三磷酸可以具有非天然型碱基，也可以具有天然型碱基。关于“非天然型碱基”及“天然型碱基”，如关于核酸的复制方法的描述。
本发明的脱氧核糖核苷5’-三磷酸可以在上述本发明的核酸的复制方法中，作为底物使用。
基于本发明的人工碱基对的核酸
本发明者为了得到在复制、转录及翻译的全部反应中效率和选择性良好的人工碱基对，对通过自行开发的数种非天然型碱基对的组合而构建的碱基对进行了研究。其结果发现了：2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤-9-基(s)(非专利文献17、33)与2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)(非专利文献26)的组合在转录中显示高度的选择性和效率(专利文献4：未公开)。
而且，在本发明中进一步制备了将s嘌呤环中的6员环的2个N原子之一替代为CH并将2位的氨基替换成氢(即脱氮杂、脱氨基化)的7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)，考察了Ds与Pa人工碱基对的匹配性。其结果，发现Ds与Pa人工碱基对在复制和转录中无论哪一个作为模板或底物，均显示出高度的选择性和效率，从而想到了本发明。
因而，本发明在其一个方案中提供下述核酸，所述核酸中，具有以下式1表示的碱基的核苷酸与具有以下式2表示的碱基的核苷酸形成了碱基对：
式1
化学式15
Figure GSB00000653789400211
此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且、
A为N或CH]。
式2
化学式16
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团，而且
R4为甲酰基或硝基。
在本发明中，“核苷”是指：核酸碱基与糖的还原基团通过糖苷键结合而形成的糖苷化合物。而且，“核酸碱基”的概念包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及这些碱基的衍生物。对“衍生物”的种类没有特殊限制，具体地，可以列举出例如上述式1表示的碱基、式2表示的碱基等。“核苷酸”是指：所述核苷的糖部分与磷酸成酯而形成的化合物。更优选的是一、二、或三磷酸酯。核苷或核苷酸的糖部分可以是呋喃核糖基、2’-脱氧呋喃核糖基、或者2’位具有卤素等取代基的2’-取代呋喃核糖基。并非限定，磷酸部分优选γ位磷酸羟基已被选自氨基、甲氨基、二甲氨基、巯基及氟基的基团替代。糖部分及磷酸部分可以采取见于公知的核苷、核苷酸或者其衍生物的结构。糖部分为呋喃核糖基的核糖核苷酸是RNA的构成成分，糖部分为脱氧呋喃核糖基的脱氧核糖核苷酸为DNA的构成成分。
在式1的碱基中，R2的噻吩基、噻唑基或咪唑基可以无取代，或者，其4位及/或5位可以被独立地选自甲基基、氨基、硝基及羟基中的一种或多种基团取代。
在本发明的式1的碱基中，当R2为取代或无取代的2-噻吩基时，在本说明书的上下文中称作“Ds”或“Ds类似物”。在本发明式1的碱基中，当R2为取代或无取代的2-噻唑基时，在本说明书的上下文中称作「Dv」或「Dv类似物」。在本发明式1的碱基中，当R2为取代或无取代的1H-2-咪唑基时，在本说明书的上下文中称作「Dm」或[Dm类似物」。
在本说明书中，式1的R1，例如在称作“Ds”时，包括R1为氢或者氨基的任何情况。与此相对，在现有技术文献中，有时会根据R1的形式而区别描述，例如，R1为氨基时称为“s”，R1为氢时称为“s’”。
A可以是N，也可以是CH。A为N的二氮杂物表述为例如“Ds”、“Dv”、“Dm”。A为CH时，表述为例如“DDs”、“DDv”、“DDm”。在本申请说明书中，例如，“Ds类似物”包括“DDs”等。进一步，根据上下文，有时将“DDs”、“Ds类似物”统称表述为“Ds”。
并非限定，优选式1的碱基选自以下基团：
A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)；
A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)；
A3)7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)；
A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)；
A6)5-氨基-7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A7)4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDs)；
A8)4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDv)；
A-9)4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；
A-10)6-氨基-4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDs)；
A-11)6-氨基-4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基(DDv)；及
A-12)6-氨基-4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基。
上述碱基中，A1和A4为Ds，A7和A10为DDs。A2和A5为Dv，A8和A11为DDv。A3和A6为“Dm”，A9和A12为“DDm”。
更优选的是：A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)、A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)、A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)、或A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dv)。最优选的是：7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)(实施例I的化合物10或14)。
本发明式1的碱基及包含该碱基的核苷、核苷酸可以采用公知方法合成。具体的，例如，本申请说明书的实施例I-3中公开了：从2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(实施例I的化合物1)(非专利文献41)开始合成7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds)的核苷5’-三磷酸及5’-γ-三磷酸酰胺(实施例I的化合物10或14)的方法。此外，实施例II-1公开了合成7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5]吡啶(实施例II的化合物4)(Dv)的核苷5’-三磷酸的方法。
进一步，实施例II-3公开了合成4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDs)及4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDv)的核苷5’-三磷酸的方法。
此外，其它具有本发明式1的碱基的核苷、核苷酸、5’-γ-三磷酸酰胺也可以采用与本申请说明书具体公开的方法相同的方法及/或本领域技术人员已知的方法来合成。
在本发明式2的碱基中，R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团。
上述烷基、烯基或炔基等可以进一步被用独立地选自低级烷基、卤素基、羟基、氨基、烷基氨基、及芳香族杂环中的一种或多种基团取代。
或者，上述烷基、烯基或炔基等可以进一步被生物素或荧光分子取代。
生物素又称辅酶R，其是B族维生素中的1种。已知生物素可以与存在于卵清中的一种糖蛋白质即抗生物素蛋白特异性结合，形成复合体。因而，具有生物素作为取代基的核苷等可以与抗生物素蛋白特异性结合。因此，含有结合了生物素的核苷等的核酸能够与结合了抗生物素蛋白的载体结合，所以能够对核酸进行固定化、分离，而如果固定化结合特定分子的核酸(适体等)，则可以用于例如特定物质的检测、分离，此外还可以用作诊断试剂。为了在式2碱基中的R3的烷基、烯基或炔基等上导入生物素，可以通过氨基直接结合生物素，也可以通过接头来结合。
荧光分子可以利用公知的荧光分子，优选从下组中选择：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、5-二甲基氨基-1-萘磺酸(DANSYL)、5-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(5-HEX)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素(6-HEX)、5-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(5-TET)、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素(6-TET)、5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)、6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)和它们的衍生物。荧光素及罗丹明一般以开环型及螺环型两种形式表示。
例如，FAM的吸收极大波长为493nm、荧光极大波长为522nm。此外，TAMRA的吸收极大波长为553nm、荧光极大波长为578nm。DANSYL的吸收极大波长为335nm、荧光极大波长为518nm。HEX的吸收极大波长为535nm、荧光极大波长为556nm。TET的吸收极大波长为521nm、荧光极大波长为536nm。5-ROX的吸收极大波长为567nm、荧光极大波长为591nm。6-ROX的吸收极大波长为570nm、荧光极大波长为590nm。具有具有用荧光分子取代的R3的式2的碱基的核苷或核苷酸，可以根据荧光分子的种类进行核酸的检测。因而，包含具有在式2的碱基中R3的烷基、烯基或炔基等被荧光分子取代的碱基的核苷酸的核酸，可以作为标记核酸而用作检测与该核酸相互作用的物质的探针。此外，因各荧光分子不同而荧光颜色不同，还可以用于多重染色。为了在式2碱基中R3的烷基、烯基或炔基等上导入荧光分子，可以通过氨基直接结合荧光分子，也可以通过接头来结合。
而且，当通过接头在式2碱基中R3的烷基、烯基或炔基等上结合生物素或荧光分子时，对接头的种类没有特殊限制，本领域技术人员能够适当地采用。并非限定，但接头优选从下述的化学式I和II中选择：
化学式17
Figure GSB00000653789400251
[式I中、n为选自1～5的整数]
及
化学式18
Figure GSB00000653789400252
[式II中、m及l为独立地选自1～5的整数]。
R4为甲酰基或硝基。在式2的碱基中，当R4为甲酰基时，在本说明书中根据上下文称作“Pa”或“Pa类似物”。当R4为硝基时，在本说明书根据上下文称作“Pn”或“Pn类似物”。有些情况下，将“Pa”、“Pa类似物”、“Pn”、[Pn类似物”等统称为“Pa”。
并非限定，优选式2的碱基选自下组：
B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)；
B2)2-甲酰基-4-碘-1H-吡咯-1-基；
B3)2-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；
B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B5)2-甲酰基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；
B6)2-甲酰基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B7)2-硝基-1H-吡咯-1-基(Pn)；
B8)2-硝基-4-碘-1H-吡咯-1-基；
B9)2-硝基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；
B10)2-硝基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B11)2-硝基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；及
B12)2-硝基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基。
在上述碱基中，B1-B6为“Pa”或“Pa衍生物”，B7-B12为“Pn”或“Pn衍生物”。
更优选的是：B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基(Pa)(实施例I的化合物19)、或B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基(实施例I的化合物20)。
具有本发明式2的碱基的核苷、核苷酸可以采用公知方法合成。例如，Pa的起始原料例如吡咯-2-甲醛，可以从例如Aldrich公司[1003-29-8]、Merck公司[807574]购买。此外，Pa衍生物基本上是从Pa衍生合成。例如Pa的4位导入了丙炔的衍生物在Bioorg.Med.Chem.Lett.，13，p.4515-4518(2003)(非专利文献28)中有所描述。
本说明书实施例I的实施例I-3-(12)中，由吡咯-2-甲醛合成了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物17)。此外，在(13)中，由4-丙炔基-2-吡咯甲醛(化合物16)(非专利文献40)合成了4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物18)。而且，合成了这些核苷5’-三磷酸及5’-γ-三磷酸酰胺(化合物19及20)。
此外，在本说明书的实施例II-2中，由2-硝基吡咯(化合物1)(非专利文献49)合成了2-硝基吡咯(化合物1)(Pn)的核苷5’-三磷酸。
本发明提供具有式1的碱基的核苷酸与具有式2的碱基的核苷酸形成了碱基对的核酸。在本说明书中，“核酸”是指：多于1个的核苷酸、沿5’→3’方向结合而形成的核酸链分子。本发明的核酸包括单链或双链的RNA或DNA。双链可以是DNA/DNA、RNA/RNA、或DNA/RNA。此外，DNA包括以RNA为模板逆转录而成的cDNA。或者，核酸可以形成3链、4链等。
本发明人等以进一步扩展核酸的功能为目标，开展了具有非天然型碱基的核苷或核苷酸的创造。作为新开发的人工碱基对的方案，包括具有式1的碱基的核苷酸与具有式2的碱基的核苷酸的碱基对。无论是具有式1的碱基的核苷酸还是具有式2的碱基的核苷酸，均能够在复制和/或转录机制中，作为底物和/或模板高效率及/或高选择性地发挥功能。
尽管式1的碱基和式2的碱基之间例如，Ds和Pa之间不存在显著的氢键相互作用(非氢键Ds-Pa碱基对)，但形成Ds-Pa碱基对的效率和选择性却与形成天然型碱基对的效率和选择性同样程度地高。该Ds-Pa碱基对显示出比先前开发的亲水性S-z碱基对更高的效率。可以认为：Ds与Pa的互补形状彼此匹配，但与天然型嘌呤类及嘧啶类的形状不同。这种特异性立体化学匹配排除了与天然型碱基之间的不希望的碱基配对，其结果是，在复制和转录中得到了Ds-Pa的高选择性。这样，形状-互补性对于复制、转录中的特异性碱基对形成起到了重要作用。
本发明的、具有式1的碱基的核苷酸与具有式2的碱基的核苷酸，可以存在于不同的2条核酸上，通过碱基对形成双链。或者，两核苷酸可以存在于同一条核酸上。此时，单链可以通过碱基对形成环结构。
本发明的具有式1的碱基的核苷酸及具有式2的碱基的核苷酸能够通过复制、转录或逆转录反应掺入DNA或RNA等核酸。或者，可以与具有天然型碱基的核苷或核苷酸一样，通过化学合成掺入DNA或RNA。
复制、转录或逆转录反应可以按照公知方法进行。并非限定，例如，转录反应可以使用T7RNA聚合酶(Takara等)，复制反应可以使用克列诺片段(KF)，逆转录反应可以使用AMV Reverse Transcriptase XL(AMV-RT)(LifeScience公司)。
并非限定，在一类方案中，本发明的核酸在核酸的复制、转录、或逆转录步骤中形成碱基对。当本发明的核酸在转录步骤形成碱基对时，可以是这样的：具有式1的碱基的核苷酸是DNA的一部分，具有式2的碱基的核苷酸是RNA的一部分，或者与此相反，具有式2的碱基的核苷酸是DNA的一部分，具有式2的碱基的核苷酸是RNA的一部分。
本发明的非天然型碱基对系统的概要示于图1c。本发明的系统在复制中的效果例如图2b-e、图3b-i、图8～图20所示。本发明的系统在转录中的效果例如图4c-e、图5a-c所示。
核酸的制备方法
本发明还提供制备包含具有以下式1表示的碱基的核苷酸的核酸的方法：
式1
化学式19
Figure GSB00000653789400281
[此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH]，
该方法包括，以包含具有以下式2表示的碱基的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在所述具有式2的碱基的核苷酸的互补位置掺入所述具有式1的碱基的核苷酸：
式2
化学式20
Figure GSB00000653789400282
[此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团，而且
R4为甲酰基或硝基]。
本发明还提供制备包含具有以下式2表示的碱基的核苷酸的核酸的方法：
式2
化学式21
Figure GSB00000653789400283
此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团，而且
R4为甲酰基或硝基，
该方法包括，以包含具有以下式1表示的碱基的核苷酸的核酸为模板进行转录、逆转录或复制，在所述具有式1的碱基的核苷酸的互补位置掺入所述具有式2的碱基的核苷酸：
式1
化学式22
Figure GSB00000653789400291
[此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH]。
关于具有式1表示的碱基的核苷酸、及具有式2表示的碱基的核苷酸的定义，如本说明书前面的“基于本发明的人工碱基对的核酸”一项中所述。
本发明的目的还在于：提供采用上述本发明的方法制备的、包含具有式1及/或式2的碱基的核苷酸的核酸。
掺入了本发明的核苷酸的核酸可以用作tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶或适体。反义DNA或RNA是指抑制指定的基因表达的DNA或RNA。其因与目标基因序列(正义链)的全长或部分序列互补而得名。其可以用作人工调节基因表达的方法。掺入了本发明的核苷酸的反义DNA或RNA因为含有非天然型碱基，所以能够创造出对于目标的互补性与只使用天然型碱基的时候不同的产品。核酶是以RNA为构成成分的催化剂的总称。适体是通过体外筛选法获得的、具有与蛋白质等一定分子结合功能的核酸。
此外，掺入了本发明的核苷酸的核酸(DNA或RNA)(例如mRNA、合成RNA)也可以编码蛋白质、肽的全体或其一部分。本发明的核酸可以用作基因片段和探针等。本发明中还包含天然基因的一部分或全部用本发明的核酸替代的方案，向天然基因中加入1个或者多个本发明的核苷酸的产物，或者这些情况的组合。
此外，掺入了本发明的具有非天然碱基的核苷酸的核酸还可以用于RNA干涉(RNA interference、RNAi)。RNA干涉是指如下现象：通过双链RNA(dsRNA)序列特异性地使mRNA分解，其结果抑制基因表达。RNA干涉的典型实例是：属于RNA酶III家族的切丁酶将dsRNA加工成3’末端具有2个碱基左右的突出端的约21碱基-23碱基的siRNA(short interferingRNA)。siRNA插入称为RISC的siRNA-蛋白质复合体，序列特异性地分解mRNA。RNA干涉是在哺乳动物(人、小鼠等)、线虫、植物、果蝇、真菌等广泛的物种之间保守的现象。掺入了本发明的具有非天然碱基的核苷酸的核酸可以用作RNA干涉中的siRNA，或者将被分解的mRNA的一部分。
核糖核苷5’-三磷酸
本发明还提供具有以下式1表示的碱基的核糖核苷5’-三磷酸：
式1
化学式23
Figure GSB00000653789400301
[此处，
R1为氢或氨基，
R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH]。
关于取代基等式1的结构，如上述关于脱氧核糖核苷酸的描述。
本发明还提供具有以下式2表示的碱基的核糖核苷5’-三磷酸：
式2
化学式24
Figure GSB00000653789400302
[此处，
R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团，而且
R4为甲酰基或硝基]。
关于取代基等式2的结构，如上述关于脱氧核糖核苷酸的描述。
本发明还提供具有以下式3表示的碱基的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷：
式3
化学式25
[此处，
R5为氢或取代氨基，
R6为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且
A为N或CH]。
R5的取代氨基包括用甲基、异丁酰基、苯甲酰基等取代的氨基。
R6与式1的R2相同。
作为式3包含的化合物的例子，在实施例I中合成了化合物8。
式3的化合物作为例如，复制及转录中的DNA模板的化学合成原料是有用的。
此外，还提供具有以下式4表示的碱基的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷：
式4
化学式26
[此处，
R7为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基中的基团，而且
R8为甲酰基或硝基，
但，排除R7为氢或1-丙炔基且R8为甲酰基的情况]。
R7与式2的R3相同。
R8与式2的R4相同。
式4的化合物作为例如，复制及转录的DNA模板的化学合成原料是有用的。
附图说明
图1a：图1a-c显示了能够进行特异性复制和转录的非天然型碱基对系统。图1a显示了非天然型Ds-Pa碱基对和天然型碱基对。
图1b：图1a-c显示了能够进行特异性复制和转录的非天然型碱基对系统。图1b显示了作为PCR和引物延伸的底物的非修饰5’-三磷酸(dNTP)和修饰5’-γ-三磷酸酰胺的结构。
图1c：图1a-c显示了能够进行特异性复制和转录的非天然型碱基对系统。图1c显示了在PCR扩增、引物延伸、DNA测序、和T7转录中发挥功能的非天然型碱基对系统。
图2a：图2a-e显示了使用Ds-Pa碱基对的非天然型碱基对系统的单核苷酸插入和引物延伸实验。图2a为用于单核苷酸插入实验的模板引物双链的序列。
图2b：图2a-e显示了使用Ds-Pa碱基对的非天然型碱基对系统的单核苷酸插入和引物延伸实验。图2b显示了使用KF exo-时、针对各模板碱基的各非修饰底物(dN’TP)的导入效率。
图2c：图2a-e显示了使用Ds-Pa碱基对的非天然型碱基对系统的单核苷酸插入和引物延伸实验。图2c显示了使用KF exo-时、针对各模板碱基的各底物(非修饰底物dN’TP、N＝Pa、G、C、和T，以及修饰底物dN’TPN、N＝Ds和A)的导入效率。
图2d：图2a-e显示了使用Ds-Pa碱基对的非天然型碱基对系统的单核苷酸插入和引物延伸实验。图2d显示了在存在或不存在dDsTP或dDsTPN的情况下，使用dPaTP与天然型底物和含有Ds的模板，用KF exo+进行5分钟引物延伸反应的结果。
图2e：图2a-e显示了使用Ds-Pa碱基对的非天然型碱基对系统的单核苷酸插入和引物延伸实验。图2e为使用KF exo-或exo+进行的、添加一系列底物(DSN＝dDsTPN和AN＝dATPN)的、使用了含Pa的模板或者天然型模板的3分钟引物延伸。各反应中不存在dGTP，因此全长产物主要为33-mer。
图3a：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3a显示了实验方案。使用含有Ds和Pa的化学合成的DNA片段(91-mer和81-mer)通过引物延伸制备了双链DNA片段(150-mer、DNA1)。
图3b：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3b显示了初始DNA片段(0循环)以及5和10循环后的PCR产物的琼脂糖凝胶分析。DNA1是使用0.04/μl VENT DNA聚合酶，用下述PCR循环扩增得到的：(94℃、0.5分；45℃、0.5分；65℃、4分)。仅含有天然型碱基的DNAcontl是使用0.01单位/μl VENT DNA聚合酶，用下述PCR循环扩增得到的：(94℃、0.5分；45℃、0.5分；72℃、1分)。
图3c：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3c-i显示了按图3a及b中说明的要领进行PCR及序列测定的结果。在存在(c-f)或不存在(g-i)dPa’TP的条件下，对使用非天然型碱基对系统进行10(d、g)和10+10(e，h)循环PCR后的、或者仅使用天然型底物进行10循环PCR(f)后的PCR产物，和PCR前的DNA1(c、g)进行测序。
图3c为PCR前(0循环)的dPa’TP存在下的测序结果。第40位的碱基是与模板的Ds的互补位置对应的碱基，测序反应中该位置掺入了Pa’。因而，仅在该部位，A、G、C、T中任何一个的峰均消失。
图3d：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3c-i显示了按图3a及b中说明的要领进行PCR及序列测定的结果。图3d为10循环PCR后的dPa’TP存在下的测序结果。第40位的碱基是与模板的Ds的互补位置对应的碱基，测序反应中该位置掺入了Pa’。因而，仅在该部位，A、G、C、T中任何一个的峰均消失。
图3e：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3c-i显示了按图3a及b中说明的要领进行PCR及序列测定的结果。图3e为10+10循环PCR后的dPa’TP存在下的测序结果。第40位的碱基是与模板的Ds的互补位置对应的碱基，测序反应中该位置掺入了Pa’。因而，仅在该部位，A、G、C、T中任何一个的峰均消失。
图3f：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3c-i显示了按图3a及b中说明的要领进行PCR及序列测定的结果。图3f为仅使用天然型底物而不存在Ds及Pa底物的条件下的PCR(10循环)后的dPa’TP存在下的测序结果。相当于第40位碱基的、模板DNA1中的Ds-Pa碱基对完全被替换成A-T碱基对(第40位的碱基T)。
图3g：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3c-i显示了按图3a及b中说明的要领进行PCR及序列测定的结果。图3g为PCR前(0循环)的不存在dPa’TP条件下的测序结果。第40位的碱基为与模板的Ds的互补位置对应的碱基，但因为不存在与Ds形成特异性碱基对的碱基，所以该位置以后的峰基本消失。
图3h：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3c-i显示了按图3a及b中说明的要领进行PCR及序列测定的结果。图3h为10循环PCR后的不存在dPa’TP条件下的测序结果。第40位的碱基为与模板的Ds的互补位置对应的碱基，但因为不存在与Ds形成特异性碱基对的碱基，所以该位置以后的峰基本消失。然而，还观察到了碱基的非特异性掺入(通读)。该通读的峰随PCR扩增的循环数增加而略微增大。
图3i：图3a-i显示了含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的DNA测序和PCR扩增。图3c-iは、显示了按图3a及b中说明的要领进行PCR及序列测定的结果。图3i为10+10循环PCR后的不存在dPa’TP条件下的测序结果。第40位的碱基为与模板的Ds的互补位置对应的碱基，但因为不存在与Ds形成特异性碱基对的碱基，所以该位置以后的峰基本消失。然而，还观察到了碱基的非特异性掺入(通读)。该通读的峰随PCR扩增的循环数增加而略微增大。
图4a：图4显示了由Ds-Pa碱基对介导的T7转录。图4a及图4b为实验方案。
图4b：图4显示了由Ds-Pa碱基对介导的T7转录。图4a及图4b为实验方案。
图4c：图4显示了由Ds-Pa碱基对介导的T7转录。图4c显示了在存在(1mM)或不存在PaTP、Pa’TP或DsTP的条件下、使用天然型NTP(1mM)与模板(N＝Ds、Pa、Pa’、A或C)获得的转录物的凝胶电泳。转录物是用[γ-32P]GTP标记的。各转录物的收率是通过与天然型转录物进行比较来确定的，所述天然型转录物是通过由天然型碱基构成的模板(N＝A或C)获得的。各自的转录效率(收率)是3组数据的平均值。
图4d：图4显示了由Ds-Pa碱基对介导的T7转录。图4d及图4e显示了通过转录物(17-mer)的核酸酶消化得到的标记核糖核苷3’-一磷酸的2D-TLC分析结果。
图4e：图4显示了由Ds-Pa碱基对介导的T7转录。图4d及图4e显示了通过转录物(17-mer)的核酸酶消化得到的标记核糖核苷3’-一磷酸的2D-TLC分析结果。
图5a：图5显示了含有非天然型反密码子的tRNA分子的特异性T7转录。图5a为在Pa’TP(3mM)或DsTP(2mM)的存在下、使用天然型NTP(2或3mM)和模板(DNA11-14和DNAcont4)获得的tRNA转录物的凝胶电泳结果。对转录物进行了[α-32P]GTP内部标记。各转录物的收率是通过与由DNAcont4获得的阻抑基因tRNACUA转录物相比较来确定的。各自的转录效率(收率)是3组数据的平均值。
图5b：图5显示了含有非天然型反密码子的tRNA分子的特异性T7转录。图5b及图5c显示了由tRNACPa’A和tRNACUDs的转录物的核酸酶消化得到的标记核糖核苷3’-一磷酸的2D-TLC分析结果。
图5c：图5显示了含有非天然型反密码子的tRNA分子的特异性T7转录。图5b及图5c显示了由tRNACPa’A和tRNACUDs的转录物的核酸酶消化得到的标记核糖核苷3’-一磷酸的2D-TLC分析结果。
图5d：图5显示了含有非天然型反密码子的tRNA分子的特异性T7转录。图5d显示了大肠杆菌无细胞系统(RTS-100、Roche)中的tRNA转录物的氨酰化。将用[α-32P]GTP内部标记的tRNA转录物在无细胞系统中于30℃温育30分钟，用含0.2M Tris-醋酸(pH4.75)和3mM EDTA的10％聚丙烯酰胺凝胶对氨酰化tRNA进行电泳分析。
图6：图6显示了用于PCR、测序和转录实验的DNA片段的序列。
图7a：图7显示了化学合成的DNA片段的序列。
图7b：图7显示了化学合成的DNA片段的序列。
图8：图8显示了含0-10％DNAcontl的DNAl的不存在dPa’TP条件下的染料终止测序。通过将该峰模式与含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的PCR峰模式相比较，可以考察Ds-Pa碱基对在PCR中的保真度。
图9：图9显示了来自300μM的dDsTPN、dPaTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP与DNA1的PCR产物的染料终止测序。存在(a-c)或不存在(d-f)dPa’TP的条件下，对DNA1的10循环(b、e)或10+10循环(c，f)后的PCR产物、和初始DNA1(a、d)进行测序。使用dATP代替dATPN进行PCR，则保真度明显降低(e，f)。
图10：图10显示了使用32P-标记5’-或3’-引物获得的PCR产物的放射自显影。使用32P-标记5’-和非标记3’-引物、或32P-标记3’-和非标记5’-引物，在含DNA1(a)或DNAcontl(b)的Vent DNA聚合酶用缓冲液(100μl)中进行PCR。从1、3、5、10及15个PCR循环后的各反应溶液中，取出一部分(10μl)在10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上进行分析。使用生物影像分析仪对凝胶上的产物进行分析、定量。各循环各自的效率(Y)是通过使用以下一般曲线拟合的KaleidaGraph计算的。Nf＝N0×(1+Y)n[此处，n为PCR循环数(n＝1、3、5及10)，N0为最初的拷贝数，Nf为n个循环后的产物拷贝数]。Nf由下式确定。Nf＝N0+P0×(Ifull/Itotal)[此处，P0为32P-标记引物数，Ifull为相当于全长产物的条带的计数(カウント)，Itotal为泳道中的条带的总计数]。确定的Y值示于下表。
表2-2
图11：图11为含有Ds及Pa的化学合成片段的从不同样品(a-d)制备的DNA2及4片段的PCR产物的不存在dPa’TP条件下的染料终止测序结果。由该结果可知：化学合成的含Ds-Pa碱基对的DNA片段的纯度影响PCR后的峰模式。即，此前求出的PCR中Ds-Pa碱基对的保真度(99.8％)依赖于化学合成DNA片段的纯度，因此，其保真度可以认为比99.8％更高。
图12：图12显示了通过琼脂糖凝胶电泳确定的由DNA1、DNA3-10及DNAcontl得到的PCR产物的扩增效率。PCR产物在4％琼脂糖凝胶上进行检测，用溴化乙啶染色。而且，使用Molecular Imager FX Pro系统及QuantityOne软件(Bio-Rad)对染色条带的强度进行了定量。使用下式确定扩增效率：(PCR产物的强度)/(用于PCR的输入DNA的强度)。效率是3-4组数据的平均值。在括号内示出标准偏差。
图13：图13显示了使用引物2时、由DNA2得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图14：图14显示了使用引物2时、由DNA3得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图15：图15显示了使用引物2时、由DNA4得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图16：图16显示了使用引物1时、由DNA5得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图17：图17显示了使用引物1时、由DNA6得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图18：图18显示了使用引物2时、由DNA7得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图19：图19显示了使用引物2时、由DNA8得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图20：图20显示了使用引物2时、由DNA9得到的PCR产物的染料终止测序结果。
图21：图21显示了大肠杆菌来源的无细胞翻译系统中含有非天然型反密码子的tRNA的氨酰化方案。
图22：图22显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核苷衍生物的合成方案。试剂及简写：(a)二氯双(三苯基膦)合钯、2-(三丁基甲锡烷基)噻吩、DMF；(b)碳化钯、硼氢化钠、乙醇、乙酸乙酯；(c)甲酸；(d)NaH、2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(ペントフラノシルクロリド)、CH3CN；(e)NH3、甲醇；(f)及(l)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶(g)2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(テトライソプロピルホスホルジアミダイト)、四唑、CH3CN；(h)及(m)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(i)及(n)2-氯-4H-1，3，2，-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱(ベンゾジオキサホスフオリン)-4-酮、二噁烷、吡啶、三丁胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、DMF、然后是I2/吡啶、水、NH4OH(5’-三磷酸时)、I2/吡啶、NH4OH(5’-γ-三磷酸酰胺时)；(j)四-O-乙酰-β-D-呋喃核糖、氯醋酸；(k)氨饱和甲醇。Tol：甲苯酰、DMT：4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac：乙酰基
图23：图23显示了吡咯-2-甲醛、4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷衍生物、及6-氨基-9-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)嘌呤5’-γ-三磷酸酰胺的合成方案。试剂及简写：(a)NaH、2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(b)氨饱和甲醇；(c)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(d)2-氰乙基-N，N’-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺、二异丙基乙基胺、THF；(e)1，8-双二甲氨基萘(质子スポンジ)、POCl3、三甲基磷酸、然后是三丁胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、DMF；(f)NaH、CH3CN、接着，2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基氯化物；(g)BBr3、二氯甲烷；(h)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮、二噁烷、吡啶、三丁胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、DMF、接着，I2/吡啶、水、NH4OH(5’-γ-三磷酸酰胺时)；Tol：甲苯酰、DMT：4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac：乙酰基
图24a：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24a为化合物6及11的1H NMR(270MHz、DMSO-d6)谱。
图24b：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24b为化合物6及11的1H NMR(270MHz、DMOSO-d6)谱(7.0-9.0ppm)。
图24c：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24c为化合物6的1D NOE谱(DMOSO-d6中)。
图24d：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24d为化合物11的1D NOE谱(DMOSO-d6中)。
图24e：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24e为化合物6的13C NMR(75MHz、DMOSO-d6)谱。
图24f：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24f为化合物6的2D COSY谱。
图24g：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24g为化合物6的2D NOESY谱。
图24h：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24h为化合物6的2D HSQC谱。
图24i：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24i为化合物6的2D HMBC谱。
图24j：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24j为化合物6的2D HMBC谱(放大)。
图24k：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24k为化合物11的13C NMR(75MHz、DMOSO-d6)谱。
图24l：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图241为化合物11的2D COSY谱。
图24m：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24m为化合物11的2D NOESY谱。
图24n：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24n为化合物11的2D HSQC谱。
图24o：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24o为化合物11的2D HMBC谱。
图24p：图24显示了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)的核苷的NMR谱。图24p为化合物11的2D HMBC谱(放大)。
图25a：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25a为化合物17的1H NMR(300MHz、DMOSO-d6)谱。
图25b：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25b为化合物17的13C NMR(75MHz、DMOSO-d6)谱。
图25c：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25c为化合物17的2D COSY谱。
图25d：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25d为化合物17的2D HSQC谱。
图25e：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25e为化合物17的2D HMBC谱。
图25f:图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25f为化合物17的2D NOESY谱。
图25g：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25g为化合物18的1H NMR(300MHz、DMOSO-d6)谱。
图25h：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25h为化合物18的13C NMR(75MHz、DMOSO-d6)谱。
图25i：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25i为化合物18的2D COSY谱。
图25j：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25j为化合物18的2D NOESY谱。
图25k：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25k为化合物18的2D HSQC谱。
图25l：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25l为化合物18的2D HMBC谱。
图25m：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25m为化合物17的1D NOE谱(DMOSO-d6中)。
图25n：图25显示了吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷的NMR谱。图25n为化合物18的1D NOE谱(DMOSO-d6中)。
图26：图26显示了脱氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的DEAESephadex离子交换柱洗脱模式。白圈为260nm的结果，黑圈为280nm的结果。
图27：图27为脱氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的ESI-质谱。
图28a：图28a为脱氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的1H NMR(270MHz、D2O)谱。
图28b：图28b为脱氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的1P NMR(109MHz、D2O)谱。
图29a：图29a显示了7-(2-噻吩基)-3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-γ-三磷酸酰胺(上)与5’-三磷酸(下)的1H NMR(270MHz、D2O)谱。
图29b：图29b显示了7-(2-噻吩基)-3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-γ-三磷酸酰胺(上)与5’-三磷酸(下)的1P NMR(109MHz、D2O)谱。
图30a：图30a显示了7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物14)的1H NMR(300MHz、D2O)谱。
图30b：图30b显示了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物19)的1H NMR(270MHz、D2O)谱。
图30c：图30c显示了4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物20)的1H NMR(270MHz、D2O)谱。
图31a：图31a显示了7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物14)的31P NMR(109MHz、D2O)谱。
图31b：图31b显示了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物19)的31P NMR(109MHz、D2O)谱。
图31c：图31c显示了4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物20)的31P NMR(109MHz、D2O)谱。
图32：图32显示了C35H40O17P2S的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)结果。C35H40O17P2S：计算值：924.17(1-)；461.58(2-)测定值：924.02(1-)；461.70(2-)
图33：图33显示了7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核苷衍生物的合成方案。试剂及简写：(a)二氯双(三苯基膦)合钯、2-(三丁基甲锡烷基)噻唑、DMF；(b)碳化钯、硼氢化钠、乙醇、乙酸乙酯；(c)甲酸；(d)NaH、2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(e)氨饱和甲醇；(f)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(g)2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺、二异丙基乙基胺，THF；(h)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(i)2-氯-4H-1，3，2，-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、I2/吡啶、水、NH4OH。Tol：甲苯酰、DMT：4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac：乙酰基
图34：图34显示了2-硝基吡咯(化合物1)的核苷衍生物的合成方案。试剂及简写：(a)NaH、2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(b)氨饱和甲醇；(c)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(d)2-氰乙基-N，N’-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺、二异丙基乙基胺、THF；(e)乙酸酐、吡啶、接着，二氯醋酸、二氯甲烷；(f)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、I2/吡啶、水、NH4OH。Tol：甲苯酰、DMT：4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac：乙酰基
图35：图35显示了4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDs)及4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDv)的核苷衍生物的合成方案。试剂及简写：(a)mCPBA、EtOAc、接着，甲磺酰氯、DMF；(b)NaI、CH3COCl、CH3CN；(c)NaH、2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物、CH3CN；(d)二氯双(三苯基膦)合钯、2-(三丁基甲锡烷基)噻吩或2-(三丁基甲锡烷基)噻唑、DMF；(e)氨饱和甲醇；(f)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(g)2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺、二异丙基乙基胺，THF；(h)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(i)2-氯-4H-1，3，2，-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、I2/吡啶、水、NH4OH。Tol：甲苯酰、DMT：4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac：乙酰基
图36：图36显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的合成方案。试剂和简写：(a)NaH、CH3CN、然后是2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基氯化物；(b)BBr3、二氯甲烷；(c)3-(二氯乙酰胺)-1-丙炔、四(三苯基膦)钯、CuI、三乙胺、DMF；(d)4，4’-二甲基三苯甲基氯化物、吡啶；(e)乙酸酐、吡啶、接着，二氯醋酸、二氯甲烷；(f)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、DMF、接着，I2/吡啶、水、NH4OH；(g)生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(ヒドロキシスクシンイミド)、DMF、碳酸钠缓冲液(pH8.6)、然后是NH4OH。DMTr：4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac：乙酰基。
图37：图37显示了4-碘吡咯-2-甲醛的核糖核苷的1H NMR(500MHz、DMSO-d6)谱。
图38a：图38显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR谱。图38a为化合物24的1H NMR(300MHz、DMSO-d6)谱。
图38b：图38显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)得NMR谱。图38b为化合物24的13C NMR(75MHz、DMSO-d6)谱。
图38c：图38显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR谱。图38c为化合物24的2D COSY谱。
图38d：图38显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR谱。图38d为化合物24的2D NOESY谱。
图38e：图38显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR谱。图38e为化合物24的2D HMQC谱。
图38f：图38显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR谱。图38f为化合物24的2D HMBC谱。
图38g：图38显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的NMR谱。图38g为化合物24的2D HMBC谱(放大)。
图39：图39显示了1-[5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物25)的1HNMR(500MHz、DMSO-d6)谱。
图40：图40显示了1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物26)的1H NMR(500MHz、DMSO-d6)谱。
图41：图41显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-氨基-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物27)和1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的DEAESephadex离子交换柱洗脱模式。
图42：图42显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-氨基-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物27：上谱)和1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28：下谱)的ESI质谱。
图43a：图43显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的NMR谱。图43a为化合物28的1HNMR(300MHz、D2O)谱。
图43b：图43显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的NMR谱。图43b为化合物28的2DCOSY谱。
图43c：图43显示了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的NMR谱。图43c为化合物28的31PNMR(109MHz、D2O)谱。
图44a：图44a显示了生物素化的PaTP(Bio-PaTP：化合物28)的化学结构。
图44b：图44b显示了关于RNA分子部位特异性生物素化的转录和转录物分析实验方案，所述RNA分子的部位特异性生物素化利用了使用Ds-Pa碱基对的T7转录。
图44c：图44c为RNA分子部位特异性生物素化实验所得的转录物的凝胶电泳照片，所述RNA分子部位特异性生物素化利用了使用Ds-Pa碱基对的T7转录。泳道1-4为使用通过连接得到的模板时的结果、泳道5-12为使用PCR扩增的模板时的结果。使用DNA6(泳道1、2、5、6、9、10)作为模板，并且使用DNAcont2(泳道3、4、7、8、11、12)作为对照，在存在(2mM)或不存在Bio-PaTP的条件下，与天然型NTPs(2mM)一起进行转录反应。转录物用[γ-32P]GTP标记。
图44d：图44d为照片，其显示用于生物素化转录物分析的凝胶电泳迁移测定(ゲルシフトアツセイ)的结果。将使用Bio-PaTP由通过连接而得的模板即DNA6和PCR扩增(20循环)出的模板即DNAcont2转录的152-merRNA、以及使用生物素化UTP(Bio-UTP)由通过连接而得的模板即DNAcont5和DNAcont6转录的152-mer RNA与链霉菌抗生物素蛋白混合。在7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上分离生物素化RNA-链霉菌抗生物素蛋白复合体与单独的RNA，然后根据条带的强度确定复合体的比例(收率)。
图44e：图44e为照片，其显示了在第59位含有Bio-Pa或A的152-mer转录物的序列分析结果。将5’末端用32P的标记的转录物用RNase T1(T1)或碱(AL)部分消化。将一部分用碱部分消化的转录物用链霉菌抗生物素蛋白磁珠处理，捕捉含Bio-Pa的RNA片段(AL+SA)，其余的进行电泳。各消化片段在10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上进行分析。
图45：图45显示了2-硝基吡咯的4位修饰核苷衍生物的合成方案。试剂及简写：(a)N-碘琥珀酰亚胺、CH3CN；(b)丙炔基-1-三丁基锡、Pd(PPh3)2Cl2、DMF或N-(2-丙炔基)-二氯乙酰胺、Pd(PPh3)4、CuI、三乙胺、DMF；(c)4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷、吡啶；(d)2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺、二异丙基乙基胺、THF；(e)乙酸酐、吡啶、然后是二氯醋酸、二氯甲烷；(f)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮、二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、双(三丁基铵)焦磷酸盐、I2/吡啶、水、NH4OH。DMTr：4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac：乙酰基。
图46：图46显示了NH2-hx-dPnTP、ROX-hx-dPnTP及FAM-hx-dPnTP的合成方案。试剂及简写：(a)CuI、Pd[P(C6H5)3]4、DMF、三乙胺、室温、接着，N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺(N-(2-プロピニル)-6-トリフルオロアセトアミドヘキサンアミド)；(b)DMTr-Cl、吡啶、室温；(c)乙酸酐、吡啶、室温、接着，二氯醋酸、二氯甲烷、0℃；(d)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮/二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、三(三正丁铵)焦磷酸、DMF、接着，I2/吡啶、水、NH4OH、室温；(e)R-N-羟基琥珀酰亚胺酯(R＝FAM或ROX)/DMF，0.1M NaHCO3-Na2CO3缓冲液(pH8.5)、室温、8小时、接着，NH4OH。
图47：图47显示了NH2-hx-PaTP、FAM-hx-PaTP及TAMRA-hx-PaTP的合成方案。试剂及简写：(a)CuI，Pd[P(C6H5)3]4、DMF、三乙胺、室温、接着，N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺；(b)DMTr-Cl、吡啶、室温；(c)乙酸酐、吡啶、室温、接着，二氯醋酸、二氯甲烷、0℃；(d)2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮/二噁烷、吡啶、三-正丁基胺、双(三正丁铵)焦磷酸、DMF、接着，I2/吡啶、水、NH4OH、室温；(e)R-N-羟基琥珀酰亚胺酯(R＝FAM或TAMRA)/DMF，0.1M NaHCO3-Na2CO3缓冲液(pH8.5)、室温、8小时、接着，NH4OH。
图48：图48显示了利用使用克列诺片段的复制将结合有氨基、荧光染料的底物Pn导入DNA(55-mer)中的方案及其结果。
图49：图49显示了利用使用T7RNA聚合酶的转录将结合有荧光染料的底物Pa导入RNA(17-mer)中的方案及其结果。
实施例
以下，通过实施例具体说明本发明，但这些实施例并不是对本发明技术的范围的限定。本领域技术人员能够基于本说明书的记载容易地对本发明加以修饰、变更，这些也包含在本发明的技术范围内。
实施例I化学合成-1
1.一般方法及材料
试剂及溶剂购自标准的供应商，不做进一步纯化而直接使用。二维薄层色谱(2D TLC)使用含254nm荧光指示剂(Merck)的0.25mm硅胶60板，对转录反应进行监测。1H NMR、13C NMR及31P NMR谱在JEOL EX270及BRUKER核磁共振谱仪(300MHz及600MHz)上进行记录。在具备分离型(分取用)C18柱(Waters Microbond Sphere、150×19mm)的Gilson HPLC系统上进行核苷纯化。用DEAE-Sephadex A-25柱(300×15mm)及分析型C18柱(Synchropak RPP、250×4.6mm、Eichrom Technologies)进行三磷酸衍生物的纯化。
高分辨率质谱(HRMS)及电喷雾离子化质谱(ESI-MS)分别在具备Waters2690LC系统的JEOL HX-110或JM700质谱仪及WatersMICROMASS ZMD4000上进行记录。荧光测定使用FP-6500荧光光谱仪(JASCO)进行。
吡咯-2-甲醛(非专利文献39)及4-丙炔基吡咯-2-甲醛(非专利文献40)按已有文献的记载合成。
2.化合物合成的说明
7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的合成通过图22记载的反应进行。具体地，7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物4)是从2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(化合物1)(非专利文献41)出发经3个步骤合成的(72％)。7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的脱氧核糖核苷(化合物6)是如下获得的：1-氯-2-脱氧-3，5-二-O-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖(ペントフラノ一ス)(非专利文献42)与化合物4的钠盐反应、然后，通过使用甲醇铵的化合物5的甲苯酰基脱保护，由化合物4以单一产物的形式得到，收率为61％。
7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核糖核苷(化合物11)是在200℃下，使用催化剂量的氯醋酸，通过四-O-乙酰-β-D-呋喃核糖与4的反应合成的。化合物11是在氨饱和甲醇脱保护及RP-HPLC纯化后得到的，其收率为29％。
通过NMR及高分辨核磁共振波谱学确认了核苷6及11的结构(1.“一般方法及材料”项中的化合物6及11的NMR谱)。化合物6和化合物11的芳香族质子峰显示出相同的化学位移。此外，化合物6和化合物11的HMBC及HSQC显示出在糖C1’与咪唑并[4，5-b]吡啶碱基部分的N-3位之间形成有N-糖苷键。进一步，本发明人等通过2D NOESY及2D HMBC谱确认了：化合物6及11的噻吩基部分结合在咪唑并[4，5-b]吡啶环的7位。化合物6及11的异头物结构通过2D NOESY及1D NOE确定为β体。1DNOE实验的主要结果是：H1’质子照射在化合物6及11中分别带来了H4’信号的2％和3％的增强，以及H2信号的8％及9％的增强。差别NOE实验中，当照射H2质子时，得到了H1’信号的9％及10％增强、H2’及H3’信号的3-5％增强。因而，基于NOE实验，将化合物6及11的异头物结构确定为β结构。采用常规方法将化合物6转化为亚磷酰胺(アミダイト)，而且通过电喷雾离子化质谱仪(ESI-MS)确认了Tp(6)pT三聚体的生成。参见“吡咯-2-甲醛、4-丙炔基吡咯-2-甲醛的核苷衍生物、及6-氨基-9-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)嘌呤5’-γ-三磷酸酰胺”项中的三聚体的质谱)。采用常规方法(非专利文献43)合成了化合物10及14的核苷5’-三磷酸作为酶反应的底物。
吡咯-2-甲醛(化合物15)及4-丙炔基吡咯-2-甲醛(化合物16)的核苷衍生物的合成通过图23记载的反应实现。化合物15及16的脱氧核苷衍生物的合成已有报导(非专利文献39及40)。化合物15及16的核糖核苷如下合成：2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基氯化物(非专利文献44)与化合物15或16的钠盐反应，然后，通过BBr3处理进行苄基的脱保护。这样，通过2个步骤分别得到了化合物17(收率15％)及化合物18(收率7％)的核糖核苷。
根据NMR(参照图25中化合物17及18的NMR谱)及高分辨核磁共振波谱学确认了化合物17及18的结构。化合物17及18的HMBC及HSQC谱在C1’碳方面显示：在糖与吡咯碱基部分之间形成有N-糖苷键。通过NOE实验(差别NOE及NOESY谱)确认了化合物17及18的异头物结构。
差别NOESY谱实验的主要结果如下。H1’质子的照射带来了H4’信号的3-4％增强。当照射H2’(及/或H3’)质子时，得到了H5信号的9-10％增强。化合物17及18的NOESY谱在H1’与H4’间、H1’与CHO质子间、以及H5与H2’(及/或H3’)间显示交叉峰。因此，基于NOE NMR将化合物17及18的异头物结构确定为β结构。采用常规方法(非专利文献45)将化合物17及18的核糖核苷转化为核糖核苷5’-三磷酸。
按现有技术文献(非专利文献43及45)中公开的方法合成了核苷5’-三磷酸。5’-γ-三磷酸酰胺的合成按改进的常规方法(非专利文献43)进行。对于化合物9及21的保护核苷，用2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮进行了亚磷酸化。通过偏磷酸处理，将保护的核苷亚磷酸衍生物转化为P2，P3-二氧代-P1-5’-核苷环三磷酸(ヌクレオシジルシクロ三磷酸)。用碘/水处理后，将所得的5’-三甲基磷酸用浓氨水处理，得到核苷5’-γ-三磷酸酰胺。
5’-γ-三磷酸酰胺的纯化通过阴离子交换DEAESephadex色谱柱及RP-HPLC进行。脱氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺的DEAE柱洗脱模式及电喷雾离子化质谱如图(图26及27)所示。
在5’-γ-三磷酸酰胺的合成中，也形成了脱氧腺苷的5’-三磷酸，而且，由级分吸光度的计算值可知：5’-γ-三磷酸酰胺与5’-三磷酸的比例为4.8∶1。与脱氧腺苷的5’-磷酸(dATP)相比，化合物22先被洗脱，通过DEAE柱纯化将其分离。通过ESI-MS谱确认了5’-γ-三磷酸酰胺的分子量。化合物22与dATP的差异为1m/z。通过HPLC进行最终纯化，以三乙铵盐的形式得到了核苷5’-γ-三磷酸酰胺。而且，通过NMR谱学(1H及31P NMR)确认了其结构。脱氧腺苷5’-γ-三磷酸酰胺及化合物6的γ-磷酸信号与化合物6，11、17及18的5’-磷酸的γ-磷酸信号相比，发生了低场位移(低磁場シフト)(-0.50及-0.52p.p.m)。使用鸟苷的5’-γ-三磷酸酰胺，同样观察到了该现象。
3.合成的具体说明
(1)2-氨基-3-硝基-4-(2-噻吩基)吡啶(化合物2)
在氩气氛围下，向DMF(50ml)中的2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶(化合物1)(非专利文献41)(1.74g、10mmol)及二氯双(三苯基膦)合钯(II)(350mg、0.50mmol)的溶液中添加2-(三丁基甲锡烷基)噻吩(3.82ml、12mmol)。将所得混合物于100℃搅拌4小时。将混合物加到水中(250ml)，并且用乙酸乙酯(250ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥，然后减压下蒸去溶剂。将残渣填充至使用二氯甲烷∶乙酸乙酯(100∶1至49∶1)作为洗脱剂的快速硅胶色谱柱(フラツシユシリカゲルクロマトダラフイ一)中。得到了2.07g的化合物2(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝19∶1的Rf为0.30)，收率93％。
1H NMR(270MHz，CDCl3)δ
8.17(d，1H，J＝5.1Hz)，
7.4(dd，1H，J＝5.0及1.1Hz)，
7.12(dd，1H，J＝3.6及1.1Hz)，
7.07(dd，1H，J＝5.0及3.6Hz)，
6.77(d，1H，J＝5.1Hz)，5.66(bs，2H)。
HRMS(FAB，3-NBA、MATRIX)
C9H8N3O2S(M+1)：计算值222.0337；观测值222.0337。
(2)2，3-二氨基-4-(2-噻吩基)吡啶(化合物3)
于0℃，向130ml乙醇与65ml乙酸乙酯中的、化合物2(2.06g、9.3mmol)与466mg碳化钯(10重量％)的混合物中，加入28ml的1M硼氢化钠水溶液。将所得混合物在0℃下搅拌1小时。向混合物中加入43ml的5％氯化铵水溶液。将混合物用硅藻土(セライト)进行过滤。向滤过物中添加500ml的水。蒸发掉乙醇及乙酸乙酯后，用乙酸乙酯抽提混合物(250ml×3)。在Na2SO4上进行干燥，然后蒸去溶剂。对于残渣，使用二氯甲烷∶乙酸乙酯(19∶1至93∶7)作为洗脱溶剂，用快速硅胶色谱柱进行了纯化。得到了1.46g的化合物3(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝9∶1的Rf为0.24)，收率82％。
1H NMR  (270MHz，CDCl3)δ
7.64(d，1H，J＝5.1Hz)，
7.40(dd，1H，J＝5.1及1.1Hz)，
7.23(dd，1H，J＝3.5及1.1Hz)，
7.14(dd，1H，J＝5.1及3.5Hz)，
6.74(d，1H，J＝5.1Hz)，
4.26(bs，2H)，3.72(bs，2H)。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C9H10N3S(M+1)：计算值192.0595；观测值192.0588。
(3)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物4)
对化合物3(956mg、5.0mmol)的甲酸溶液(15ml)进行12小时回流。于冰浴上，向反应混合物中加入24ml的28％NH4OH。对所得沉淀物进行过滤，用H2O及乙醚清洗，并且于60℃干燥12小时，得到了7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(970mg、96％)。
1H NMR  (300MHz，DMSO-d6)δ
13.20(s，lH)，8.48(s，1H)，8.30(m，2H)，
7.78(dd，1H，J＝1.0及5.1Hz)，
7.54(d，1H，J＝5.1Hz)，
7.25(dd，1H，J＝3.8及4.9Hz)。
13C NMR  (75MHz，DMSO-d6)δ
113.12，128.00，128.71，129.24，
130.00，131.16，137.60，143.44，
144.09，148.66。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C10H8N3S(M+1)：计算值202.0439；观测值202.0444。
(4)7-(2-噻吩基)-3-[2-脱氧-3，5-二-O-(甲苯酰)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物5)
向化合物4(403mg、2.0mmol)的CH3CN溶液(32ml)中加入NaH(96mg、2.4mmol、矿物油中60％分散液)。将所得混合物于室温搅拌1小时。向混合物中加入2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(933mg、2.4mmol)(非专利文献42)。室温下搅拌2.5小时，然后用乙酸乙酯和水分离反应混合物。将有机层用饱和食盐水清洗3次，在Na2SO4上干燥，减压下进行蒸馏除去。用硅胶色谱柱(CH2Cl2中、0.5％甲醇)纯化产物，得到了化合物5(714mg、65％)。
1H NMR  (270MHz，CDCl3)δ
8.32(d，1H，J＝5.3Hz)，8.26(s，1H)，
8.16(dd，1H，J＝3.8及1.2Hz)，
7.93(m，4H)，7.50(dd，1H，J＝5.1及1.2Hz)，
7.47(d，1H，J＝5.3Hz)，7.22(m，5H)，
6.68(dd，1H，J＝8.6及5.8Hz)，
5.82(m，1H)，4.69(m，3H)，
3.18(ddd，1H，J＝14.2，8.6及6.4Hz)，
2.86(ddd，1H，J＝14.2，5.8及2.0Hz)，
2.43(s，3H)，2.37(s，3H)。
HRMS(FAB，3-NB AMATRIX)
C31H28N3O5S(M+1)：计算值554.1750；观测值554.1748。
(5)7-(2-噻吩基)-3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物6)
于0℃，向1.33g(2.40mmol)的化合物5加入氨饱和甲醇(120ml)。将溶液在室温搅拌2小时。反应后，蒸馏除去溶剂，以二氯甲烷∶乙醇(97∶3至93∶7)作为洗脱溶剂，用快速硅胶色谱柱对残渣进行纯化。得到了717mg的化合物6，收率94％。
1H NMR  (300MHz，DMSO-d6)δ
8.75(s，1H)，8.35(d，1H，J＝5.1Hz)，
8.30(d，1H，J＝3.7Hz)，7.83(d，1H，J＝5.1Hz)，
7.65(d，1H，J＝5.1Hz)，7.28(t，1H，J＝4.2Hz)，
6.54(t，1H，J＝6.9Hz)，5.34(d，1H，J＝4.1Hz)，
5.11(t，1H，J＝5.7Hz)，4.46(m，1H)，
3.91(m，1H)，3.60(m，2H)，
2.80(m，1H)，2.37(m，1H)。
13C NMR  (75MHz，DMSO-d6)δ
147.10，144.04，143.62，137.06，
132.00，131.00，129.78，129.06，
128.07，113.93，87.88，83.72，
70.80，61.74，39.40。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C15H16N3O3S(M+1)：计算值318.0912；观测值318.0905。
UV：λmax，311nm；
ε＝2.04×104，25mM磷酸钠缓冲液pH 6.8中。
(6)7-(2-噻吩基)-3-[2-脱氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物7)
用无水吡啶使317mg(1.0mmol)的化合物6共沸3次。向其中加入5.0ml的无水吡啶，再加入二甲氧基三苯基氯甲烷(356mg、1.1mmol)。将混合物于室温搅拌一晚，然后加水(50ml)，用二氯甲烷(50ml×3)进行抽提。在Na2SO4上干燥，然后减压下蒸馏除去溶剂。以二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1至13∶7)作为洗脱溶剂，用快速硅胶色谱柱对残渣进行纯化。得到了550mg的化合物7，收率89％。
1H NMR  (270MHz，CDCl3)δ
8.29(d，1H，J＝5.1Hz)，8.22(s，1H)，
8.17(dd，1H，J＝3.8及1.1Hz)，
7.49(dd，1H，J＝5.1及1.1Hz)，
7.44(d，1H，J＝5.1Hz)，7.37(m，2H)，
7.27(m，5H)，7.20(m，3H)，6.78(m，4H)，
6.57(dd，1H，J＝6.5及6.2Hz)，
4.66(m，1H)，4.12(m，1H)，3.75(s，3H)，
3.75(s，3H)，
3.42(dd，1H，J＝10.1及4.6Hz)，
3.38(dd，1H，J＝10.1及5.4Hz)，
2.86(m，1H)，
2.56(ddd，1H，J＝13.8，6.5及4.6Hz)，
2.06(d，1H，J＝3.5Hz)。
HRMS(FAB，3-NBAMATRIX)
C36H34N3O5S(M+1)：计算值620.2219；观测值620.2230。
(7)7-(2-噻吩基)-3-[2-脱氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(化合物8)
用无水吡啶使化合物7(425mg、0.69mmol)共沸3次，接着，用无水乙腈使其共沸3次。将其溶于无水乙腈(4.6ml)中，加入262μl(0.82mmol)的2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺、及0.45M四唑的乙腈溶液(1.68ml)。将该混合物于室温搅拌1小时。向混合物中加入90μl的无水甲醇，然后，将混合物加到水中(50ml)，用含1％三乙胺(v/v)的二氯甲烷(50ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。以含2％三乙胺(v/v)的己烷∶乙酸乙酯(4∶1至3∶2)作为洗脱溶剂，用快速硅胶色谱柱对残渣进行纯化。得到了490mg的化合物8，收率87％。
1H NMR(270MHz，DMSO-d6)δ
8.65(m，1H)，8.27(m，1H)，8.23(m，1H)，
7.81(m，1H)，7.62(m，1H)，7.26(m，3H)，
7.18(m，7H)，6.75(m，4H)，6.54(m，1H)，
4.81(m，1H)，4.13(m，1H)，
3.84-3.45(m，10H)，3.21(m，3H)，
2.82-2.48(m，3H)1.13(m，12H)。
31P NMR(109MHz，DMSO-d6)δ
148.76ppm及148.14ppm。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C45H51N5O6SP(M+1)：计算值820.3298；观测值820.3325。
(8)7-(2-噻吩基)-3-(2-脱氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物9)
用无水吡啶使化合物7(124mg、0.20mmol)共沸3次。将其用无水吡啶(2.0ml)溶解，再添加38μl(0.40mmol)的乙酸酐。将所得混合物于室温搅拌2日。将混合物加到水(50ml)中，用二氯甲烷(50ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥，然后，减压下蒸馏除去溶剂。将残渣溶于20ml的无水二氯甲烷，于0℃向其中添加200μl的二氯醋酸。将混合物于2℃搅拌15分钟，然后，将其添加到8ml的饱和碳酸氢钠水溶液中，再向其中加入42ml的水，用二氯甲烷(50ml×3)抽提。在Na2SO4上干燥，然后、减压下蒸馏除去溶剂。以二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1至3∶2)为洗脱溶剂，用快速硅胶色谱柱对残渣进行纯化。得到了65mg的化合物9，收率88％。
1H NMR(270MHz，CDCl3)δ
8.29(d，1H，J＝5.4Hz)，
8.18(dd，1H，J＝3.8及1.1Hz)，
8.13(s，1H)，7.53(dd，1H，J＝5.0及1.1Hz)，
7.50(d，1H，J＝5.4Hz)，
7.20(dd，1H，J＝5.0及3.8Hz)，
6.69(m，1H)，6.37(dd，1H，J＝10.1及5.4Hz)，
5.58(m，1H)，4.28(m，1H)，3.96(m，2H)，
3.32(ddd，1H，J＝15.9，10.1及5.9Hz)，
2.41(m，1H)，2.12(s，3H)。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C17H18N3O4S(M+1)：计算值360.1018；观测值360.0993。
(9)7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物11)
将化合物4(80mg、0.4mmol)、四-O-乙酰-β-D-呋喃核糖(130mg、0.4mmol)及氯醋酸(2mg)的混合液于200℃加热5分钟。向所得暗色浆液中加入甲醇氨(40ml)，于室温处理18小时。减压下蒸馏除去溶剂，向残渣中加入30％CH3CN水溶液，然后，利用反相HPLC纯化产物，得到了化合物11(39mg、29％、2步骤)。
1H NMR  (300MHz，DMSO-d6)δ
8.78(s，1H)，8.36(d，1H，J＝5.2Hz)，
8.31(dd，1H，J＝1.0及3.7Hz)，
7.84(dd，1H，J＝0.9及5.1Hz)，
7.66(d，1H，J＝5.2Hz)，
7.28(dd，1H，J＝3.7及5.0Hz)，
6.08(d，1H，J＝5.8Hz)，5.49(d，1H，J＝6.0Hz)，
5.26(t，1H，J＝6.5Hz)，5.20(d，1H，J＝4.9Hz)，
4.67(q，1H，J＝5.8Hz)，4.20(q，1H，J＝4.9Hz)，
4.00(m，1H)，3.71(m，1H)，3.59(m，1H)。
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ
147.29，144.07，143.91，137.00，
132.13，131.08，129.86，129.14，
128.10，114.02，87.76，85.57，
73.48，70.43，61.43。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C15H16N3O4S(M+1)：计算值334.0862；观测值334.0871。
(10)7-(2-噻吩基)-3-[5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物12)
用无水吡啶使化合物11(99mg、0.29mmol)共沸3次，然后将其溶解在吡啶(3.0ml)中。向该溶液中加入4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(106mg、0.31mmol)，将混合物于室温搅拌2小时。将反应混合物添加到5％NaHCO3水溶液中，然后用乙酸乙酯抽提。将有机层用饱和食盐水清洗3次，用Na2SO4干燥，然后减压下蒸馏除去溶剂。用硅胶色谱柱纯化产物(1％甲醇-CH2Cl2)，得到了化合物12(131mg、71％)。
1H NMR  (600MHz，CDCl3)δ
8.39(s，1H)，8.28(d，1H，J＝5.2Hz)，
8.25(d，1H，J＝3.4Hz)，7.52(t，2H，H＝5.7Hz)，
7.22(m，2H)，7.14(m，7H)，6.69(m，5H)，
6.04(d，1H，J＝6.2Hz)，4.77(m，1H)，
4.48(m，1H)，4.34(d，1H，J＝4.6Hz)，
3.70(s，6H)，3.46(dd，1H，J＝3.4及10.5Hz)，
3.23(dd，1H，J＝2.9及10.5Hz)。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C36H34N3O6S(M+1)：计算值636.2168；观测值636.2173。
(11)7-(2-噻吩基)-3-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物13)
用无水吡啶使化合物12(120mg、0.19mmol)共沸3次。将其溶于无水吡啶(1.9ml)，再加入72μl(0.76mmol)的乙酸酐。将该混合物在室温搅拌7小时。将混合物添加到5％NaHCO3(50ml)及乙酸乙酯(50ml)中。将有机层用饱和食盐水清洗1次。用Na2SO4干燥有机层后，减压下蒸馏除去溶剂。残渣用甲苯共沸2次，然后，将其溶于CH2Cl2(19ml)，于0℃加入190μl的二氯醋酸。将该反应混合物于0℃搅拌15分钟。将混合物添加到5％NaHCO3中，用CH2Cl2抽提。将有机层用饱和食盐水清洗1次，并且用Na2SO4干燥有机层，然后，减压下蒸馏除去溶剂。以2％甲醇-二氯甲烷溶液为溶剂，用快速硅胶色谱柱对产物进行纯化。得到了77mg的化合物13，收率93％。
1H NMR  (300MHz，DMSO-d6)δ
8.79(s，1H)，8.37(d，1H，J＝5.2Hz)，
8.29(dd，1H，J＝1.2及3.7Hz)，
7.84(dd，1H，J＝1.1及5.1Hz)，
7.68(d，1H，J＝5.2Hz)，
7.27(dd，1H，J＝3.7及5.1Hz)，
6.38(d，1H，J＝6.8Hz)，
6.02(dd，1H，J＝5.6及6.6Hz)，
5.54(m，2H)，4.26(m，1H)，3.71(m，2H)，
2.14(s，3H)，1.98(s，3H)。
13C NMR  (75MHz，DMSO-d6)δ
169.55，169.22，146.98，144.39，
143.85，136.74，132.50，131.02，
130.11，129.32，128.14，114.36，
85.20，83.63，72.34，71.23，61.05，
20.44，20.13。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C19H20N3O6S(M+1)：计算值418.1073；观测值418.1049。
(12)1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物17)
向吡咯-2-甲醛(330mg、3.5mmol)的CH3CN溶液(18ml)中加入NaH(60％油分散液、152mg、3.8mmol)，于室温搅拌45分钟。接着，向其中加入2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基氯化物(3.1mmol)(非专利文献44)的CH3CN溶液(18ml)。将反应混合物于室温搅拌4小时。用乙酸乙酯及水分离产物，并且，将有机层用饱和食盐水清洗3次，用Na2SO4干燥，然后，减压下蒸馏除去溶剂。用硅胶色谱柱(用己烷中的20％乙酸乙酯洗脱)对残渣进行纯化，得到了粗品1-(2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(カルボキシアルデヒド)(506mg)。粗品1-(2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(506mg、1.0mmol)用甲苯共沸后，向残渣中加入CH2Cl2(17ml)。向该溶液中于-78℃加入BBr3(1M溶液、3.0ml)，搅拌2.5小时，然后加入50％甲醇-CH2Cl2溶液(25ml)。将溶液于-78℃搅拌10分钟后，添加28％的NH4OH(0.5ml)。接着，搅拌反应混合物直至其升至室温。用CH2Cl2及H2O分离产物，并且将水层用CH2Cl2清洗3次，减压下蒸馏除去溶剂。产物用反相C18HPLC纯化，得到了1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(108mg、15％、2步骤)。
1H NMR  (270MHz，DMSO-d6)δ
9.54(s，1H)，7.74(s，1H)，
7.06(dd，1H，J＝1.6及4.0Hz)，
6.39(d，1H，J＝4.3Hz)，
6.30(dd，1H，J＝3.0及4.0Hz)，
5.27(d，1H，J＝5.6Hz)，
5.05(d，1H，J＝4.9Hz)，
5.00(t，1H，J＝5.3Hz)，4.02(m，2H)，
3.85(m，1H)，3.52(m，2H)。
13C NMR  (75MHz，DMSO-d6)δ
179.41，131.68，128.24，124.94，
110.23，89.34，84.33，75.64，
69.50，60.82。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C10H14NO5(M+1)：计算值228.0872；观测值228.0863。
(13)4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物18)
4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(化合物18)是采用与化合物17的合成方法一样的方法，由4-丙炔基-2-吡咯甲醛(化合物16)(非专利文献40)(266mg、2.0mmol)合成的。用RP-HPLC进行纯化，得到了化合物18(39mg、7％、2步骤)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ
9.50(s，1H)，7.91(s，1H)，
7.09(d，1H，J＝1.8Hz)，6.32(d，1H，J＝3.6Hz)，
5.32(d，1H，J＝5.5Hz)，5.07(t，1H，J＝5.2Hz)，
5.05(d，1H，J＝4.2Hz)，4.01(m，1H)，
3.86(m，1H)，
3.66(ddd，1H，J＝3.4、5.3及11.9Hz)，
3.55(ddd，1H，J＝3.6、4.9及12.1Hz)，
1.97(s，3H)。
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ
179.60，131.15，130.43，126.13，
106.22，89.62，85.26，84.49，
75.86，73.17，69.30，60.53，3.79。
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C13H16NO5(M+1)：计算值266.1028；观测值266.1023。
(14)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶的核苷5’-三磷酸的合成
用吡啶使保护的核苷(0.1mmol、化合物9或13)共沸，干燥之。将残渣溶解在吡啶(100μl)-二噁烷(300μl)混合溶剂中。向其中加入1M 2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮-二噁烷溶液(110μl、0.11mmol)。10分钟后，快速地将0.5M双(三丁基铵)焦磷酸盐-三乙胺(10μl)：DMF(300μl、0.15mmol)混合溶液添加到反应混合物中。将混合液于室温搅拌10分钟。接着，向其中加入1％碘-吡啶：水(98/2、v/v)(2.0ml)混合溶液。15分钟后，加入150μl的5％NaHSO3水性溶液，再向其中加入5.0ml的水。将溶液于室温搅拌30分钟，然后，加入20ml的浓氨水，于室温氨解2小时。减压下蒸馏除去溶剂，将产物用DEAESephadex(A-25)色谱柱(利用50mM至1M TEAB的线性梯度洗脱)纯化，然后用C18-HPLC柱(利用0％至30％的CH3CN-100mM醋酸三乙铵溶液的线性浓度梯度洗脱)纯化，得到了核苷5’-三磷酸。
7-(2-噻吩基)-3-(2-脱氧-β-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物10)
1H NMR(270MHz，D2O)δ
8.51(s，1H)，8.09(d，1H，J＝5.3Hz)，
7.78(d，1H，J＝3.6Hz)，7.56(d，1H，J＝4.9Hz)，
7.36(d，1H，J＝5.3Hz)，7.12(t，1H，J＝4.9Hz)，
6.41(t，1H，J＝7.3Hz)，4.16(m，1H)，
4.04(m，2H)，3.01(q，18H，J＝7.3Hz)，
2.72(m，1H)，2.46(m，1H)，
1.09(t，27H，J＝7.3Hz)。
31P NMR (109MHz，D2O)δ
-9.94(d，1P，J＝20.1Hz)，
-10.72(d，1P，J＝20.1Hz)，
-22.58(t，1P，J＝20.1Hz)。
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C15H18N3O12P3S；计算值555.97(M-H)-；观测值555.69(M-H)-。
7-(2-噻吩基)-3-(β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-三磷酸(化合物14)
1H NMR  (300MHz，D2O)δ
8.74(s，1H)，8.32(d，1H，J＝5.4Hz)，
8.01(d，1H，J＝3.5Hz)，
7.68(dd，1H，J＝1.1及5.1Hz)，
7.64(d，1H，J＝5.1Hz)，
7.25(dd，1H，J＝3.5及5.1Hz)，
6.25(d，1H，J＝6.0Hz)，
4.82(m，1H)，4.57(m，1H)，4.36(m，1H)，
4.20(m，2H)，3.11(q，18H，J＝7.3Hz)，
1.19(t，27H，J＝7.3Hz)。
31P NMR  (109MHz，D2O)δ
-9.80(d，1P，J＝20.1Hz)，
-11.03(d，1P，J＝18.9Hz)，
-22.78(t，1P，J＝20.1及18.9Hz)。
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C15H18N3O13P3S；计算值571.97(M-H)-；测定值571.74(M-H)-。
(15)腺嘌呤或7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(非专利文献43、47、48)的核苷5’-γ-三磷酸酰胺的合成
用吡啶使保护的核苷(0.1mmol、化合物21(非专利文献46)或化合物9)共沸，干燥之。将残渣溶解在吡啶(100μl)-二噁烷(300μl)混合溶液中。向其中加入1M2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱4-酮的二噁烷溶液(110μl、0.11mmol)。10分钟后、将0.5M双(三丁基铵)焦磷酸盐(300μl、0.15mmol)-三乙胺(10μl)的DMF溶液快速地加入到反应混合物中，于室温搅拌10分钟。接着，添加1％碘-吡啶/水(98/2、v/v)混合溶液(2.0ml)。15分钟后，添加150μl的5％NaHSO3水性溶液。减压下蒸馏除去溶剂，然后，向残渣中加入20ml的28％氨水。于60℃氨解5小时(对于脱氧腺苷的5’-γ-三磷酸酰胺)、或于室温氨解2小时(对于化合物6的5'-γ-三磷酸酰胺)。减压下蒸馏除去溶剂，然后，将产物用DEAESephadex(A-25)色谱柱(利用50mM至1M TEAB的线性浓度梯度洗脱)纯化，再用C18-HPLC柱(利用0％至30％的CH3CN-100mM醋酸三乙铵溶液的线性浓度梯度洗脱)纯化，得到了核苷5’-γ-三磷酸酰胺。
6-氨基-9-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)嘌呤5’-γ-三磷酸酰胺(化合物22)
1H NMR  (270MHz，D2O)δ
8.35(s，1H)，8.11(s，1H)，
6.37(t，1H，J＝6.9Hz)，4.16(m，1H)，
4.03(m，2H)，3.05(q，18H，J＝7.3Hz)，
2.70(m，1H)，2.48(m，1H)，
1.13(t，27H，J＝7.3Hz)。
31P NMR  (109MHz，D2O)δ
-0.50(d，1P，J＝19.5Hz)，
-10.77(d，1P，J＝19.5Hz)，
-22.14(t，1P，20.1Hz)。
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C10H17N6O11P3；计算值489.01(M-H)-；观测值488.98(M-H)-。
7-(2-噻吩基)-3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶5’-γ-三磷酸酰胺(化合物10的γ-三磷酸酰胺)
1H NMR  (270MHz，D2O)δ
8.57(s，1H)，8.16(d，1H，J＝5.3Hz)，
7.85(d，1H，J＝3.6Hz)，7.58(d，1H，J＝4.9Hz)，
7.45(d，1H，J＝5.3Hz)，7.15(t，1H，J＝4.6Hz)，
6.48(t，1H，J＝6.9Hz)，4.18(m，1H)，
4.05(m，2H)，3.03(q，18H，J＝7.3Hz)，
2.75(m，1H)，2.50(m，1H)，
1.11(t，27H，J＝7.3Hz)。
31P NMR  (109MHz，D2O)δ
-0.52(d，1P，J＝20.1Hz)，
-10.75(d，1P，J＝19.5Hz)，
-22.14(t，1P，J＝20.8Hz)。
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C15H19N4O11P3S；计算值554.99(M-H)-；观测值555.01(M-H)-。
(16)吡咯-2-甲醛及4-丙炔基吡咯-2-甲醛(非专利文献45)的核苷5’-三磷酸
向含1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(0.1mmol)(化合物17)或4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛(0.1mmol)(化合物18)和1，8-双二甲氨基萘(33mg、0.15mmol)的磷酸三甲酯溶液(500μl)中，于0℃添加POCl3(12μl、0.13mmol)，0℃下搅拌2小时。向反应混合物中添加三-正丁基胺(120μl、0.5mmol)，接着，向其中添加0.5M双(三丁基铵)焦磷酸盐(1.0ml、0.5mmol)的DMF溶液。5分钟后，添加0.5M碳酸氢三乙铵水溶液(TEAB、500μl)，终止反应。所得粗产物用DEAE Sephadex(A-25)色谱柱(1.5cm×30cm、利用50mM至1M TEAB的线性梯度洗脱)纯化，再用C18-HPLC柱(SynchropakRPP、Eichrom Technologies、利用0％至30％的CH3CN-100mM醋酸三乙铵溶液的梯度洗脱)纯化。
1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物19)
1H NMR(270MHz，D2O)δ
9.28(s，1H)，7.64(s，1H)，
7.08(d，1H，J＝3.9Hz)，
6.45(d，1H，J＝4.1Hz)，6.32(m，1H)，
4.32(m，2H)，4.10(m，3H)，
3.03(q，18H，J＝7.3Hz)，
1.11(t，27H，J＝7.3Hz)。
31P NMR(109MHz，D2O)δ
-10.51(d，1P，J＝19.5Hz)，
-11.3(d，1P，J＝20.1Hz)，
-22.91(t，1H，J＝20.1Hz)。
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C10H16NO14P3：计算值465.97(M-H)-；测定值465.85(M-H)-。
4-丙炔基-1-(β-D-呋喃核糖基)吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(化合物20)
1H NMR(270MHz，D2O)δ
9.28(s，1H)，7.70(s，1H)，7.08(s，1H)，
6.40(d，1H，J＝4.0Hz)，4.30(m，2H)，
4.13(m，3H)，3.06(q，18H，J＝7.3Hz)，
1.86(s，3H)，1.14(t，27H，J＝7.3Hz)。
31P NMR(109MHz，D2O)δ
-10.10(d，1P，J＝19.5Hz)，
-11.02(d，1P，J＝19.5Hz)，
-22.82(t，1P，J＝20.1Hz)。
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C13H18NO14P3：计算值503.99(M-H)-；观测值503.94(M-H)-。
实施例II化学合成-2
1.7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(化合物4)(Dv)的核苷衍生物的合成(图33)
按图22所示的7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶(实施例I的化合物4)(Ds)的核苷衍生物的合成方法进行，不同的是：在噻唑基的导入反应(a)中使用了2-(三丁基甲锡烷基)噻唑。
关于亚磷酰胺合成(g)，在实施例I-3(7)的7-(2-噻吩基)-3-[2-脱氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(化合物8)的合成中使用的是2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺、及0.45M四唑的乙腈溶液，而在本实施例中使用的是2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺、二异丙基乙基胺、THF。虽然试剂不同，但生成的亚磷酰胺相同。
2.2-硝基吡咯(化合物1)(Pn)的核苷衍生物的合成(图34)
(1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(化合物3)的合成
将2-硝基吡咯(化合物1)(非专利文献49)(224mg，2.0mmol)溶解在乙腈(20ml)中，添加NaH(80mg，60％油分散液，2.0mmol)。室温下搅拌30分钟，然后，添加2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(855mg，2.2mmol)，室温下搅拌2小时。用乙酸乙酯和水清洗反应溶液，用水和饱和食盐水清洗有机层。将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，用硅胶柱纯化，得到了722mg(78％)的化合物2。向化合物2(722mg)中添加甲醇氨(メタノリツクアンモニウム)(50ml)，室温下进行甲苯酰基的脱保护12小时，用硅胶柱纯化后，再用HPLC进行最终纯化，得到了291mg(82％)的化合物3。
化合物3：1H NMR(270MHz，DMSO-d6)δ
7.76(bs，1H)，7.26(dd，1H，J＝1.6及3.6Hz)，
6.59(t，1H，J＝5.9Hz)，6.30(t，1H，J＝3.6Hz)，
5.27(d，1H，J＝4.3Hz)，5.03(t，1H，J＝5.3Hz)
4.23(m，1H)，3.85(m，1H)，3.59(m，2H)，
2.42(m，1H)，2.19(m，1H)。
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C9H11O5N2；计算值227.07(M-H)-；测定值227.03(M-H)-，
C9H13O5N2；计算值229.08(M+H)+；测定值229.06(M+H)+。
(2)1-[2-脱氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-2-硝基吡咯2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(化合物5)的合成
用吡啶使化合物3(228mg，1.0mmol)共沸后，添加吡啶(10ml)，添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(373mg，1.1mmol)，室温下搅拌1小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3水溶液清洗，将有机层用饱和食盐水清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，用硅胶柱纯化，得到了493mg(93％)的化合物4。
用吡啶使化合物4(265mg，0.5mmol)共沸后，添加THF(2.5ml)和二异丙基乙基胺(131μl，0.75mmol)，再向溶液中添加2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺(123μl，0.55mmol)，室温下搅拌1小时。向反应溶液中添加甲醇(50μl)，用乙酸乙酯∶水(20∶1，v/v)稀释，添加5％NaHCO3水溶液，清洗。将有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用硅胶柱纯化，得到了315mg(86％)的化合物5。
(3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5’-三磷酸(化合物7)的合成用吡啶使化合物4(159mg，0.3mmol)共沸后，添加吡啶(3ml)，在添加乙酸酐(57μl，0.6mmol)，将反应溶液在室温下搅拌12小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3清洗，再用5％NaHCO3水溶液清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，用甲苯共沸，然后将其溶解于二氯甲烷30ml。于0℃向该反应溶液中添加二氯醋酸(300μl)，0℃下搅拌15分钟。向反应溶液中添加5％NaHCO3水溶液，清洗，将有机层用5％NaHCO3清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用硅胶柱纯化，得到了73mg(91％)的化合物6。
用吡啶使化合物6(41mg，0.15mmol)共沸后，添加吡啶(150μl)和二噁烷(450μl)，然后添加2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮(180μl，1M二噁烷溶液)，室温下搅拌10分钟。向反应溶液中添加三-正丁基胺(150μl)和双(三丁基铵)焦磷酸盐(450μl，0.5M DMF溶液)，搅拌10分钟。添加I2/吡啶(3.0ml，吡啶中1％碘：H2O，98∶2，v/v)，搅拌15分钟，然后添加5％NaHSO3水溶液(225μl)，浓缩反应溶液。添加H2O(7.5ml)，室温下搅拌30分钟，然后添加28％氨水30ml，室温下搅拌2小时。浓缩反应溶液，冷冻干燥，然后用DEAE Sephadex A-25纯化(50mM至1.0mM TEAB线性梯度)，用HPLC进行最终纯化，得到了作为目标的化合物7。
化合物7：
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C9H14O14N2P3；计算值，466.97(M-H)-；测定值，466.70(M-H)-。
3.4-(噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDs)及4-(噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(DDv)的核苷衍生物的合成(图35)
(1)4-碘-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物3)的合成
将1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物1)(5.3g，45mmol)溶解在乙酸乙酯(45ml)中，在0℃下、用1小时的时间，一边搅拌一边滴加溶解于乙酸乙酯(30ml)中的间氯过氧苯甲酸(14g，54mmol)溶液。滴加后，室温下搅拌3小时，然后0℃下静置。过滤结晶，用乙酸乙酯清洗，然后减压下干燥。将其溶解于水(30ml)中，然后添加30％K2CO3直至pH为10，室温下静置1小时，0℃下静置1小时，然后过滤沉淀，用醚清洗，得到了3.5g(58％)的N-氧化物(N-オキシド)。将N-氧化物(3.0g，22mmol)溶解在DMF(16ml)中，于50℃加热。于70℃滴加甲磺酰氯(メタンスルホニルクロリド)(4.7ml，60mmol)的DMF(6.4ml)溶液，将反应溶液在75℃下搅拌2小时。将反应溶液置于冰上，然后于0℃下用10N的NaOH中和。室温下搅拌1小时，过滤生成的沉淀，用水清洗，然后于60℃减压干燥，得到了2.7g(80％)的作为目标的化合物2。
将化合物2(2.7g，18mmol)、NaI(13g，88mmol)溶解在乙腈(28ml)中，室温下边搅拌边添加CH3COCl(3.5ml，50mmol)。将反应溶液于85℃加热12小时。反应溶液恢复室温后、依次添加10％Na2CO3水溶液(28ml)和10％NaHSO3水溶液(28ml)，室温下搅拌15分钟。添加乙酸乙酯，清洗，将有机层用饱和食盐水进一步清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用硅胶柱纯化，得到了4-碘-1-N-乙酰-吡咯并[2，3-b]吡啶(2.0g)以及4-碘-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物3)(2.3g)。4-碘-1-N-乙酰-吡咯并[2，3-b]吡啶(2.0g，7.0mmol)溶于乙醇(70ml)中，添加甲醇中的28％甲醇钠(1.4ml，7.0mmol)，加热回流1小时。浓缩反应溶液，然后用乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液进行分液，将有机层用饱和氯化铵水溶液清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后与先前得到的化合物3(2.3g)混合，用乙醇重结晶，得到了化合物3(4.0g，92％)。
(2)1-[2-脱氧-3，5-二-O-(甲苯酰)-β-D-呋喃核糖基]-4-碘-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物4)的合成
向化合物3(950mg，3.9mmol)的乙腈(39ml)溶液中添加NaH(156mg，60％油分散液，3.9mmol)。室温下搅拌1小时后，添加2-脱氧-3，5-二-O-p-甲苯酰-α-D-赤式-戊呋喃糖基氯化物(1.8g，1.2当量)，室温下搅拌1.5小时。将反应溶液用乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液清洗，将有机层用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水分液。将有机层用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用硅胶柱纯化，得到了1.8g(77％)的化合物4。
(3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻吩基)-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物7)和1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻唑基)-吡咯并[2，3-b]吡啶(化合物8)的合成
向化合物4(715mg，1.2mmol)和二氯双(三苯基膦)合钯(42mg，0.06mmol)的DMF(12ml)溶液中添加2-(三丁基甲锡烷基)噻吩(601μl，1.8mmol)，100℃下搅拌1小时。将反应溶液用乙酸乙酯和水分液，将有机层用水清洗，再用饱和食盐水清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用硅胶柱纯化，得到了586mg(88％)的化合物5。
向化合物5(580mg)中添加氨饱和甲醇(50ml)，室温下进行12小时的甲苯酰基的脱保护，用硅胶柱纯化，然后用HPLC进行最终纯化，得到了304mg(91％)的化合物7。
化合物6和化合物8的合成按同一方式进行，不同的是：使用了2-(三丁基甲锡烷基)噻唑。合成从化合物4(600mg，1.0mmol)开始，得到了化合物6(449mg，81％)、化合物8(245mg，97％)。
化合物7：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ
8.27(d，1H，J＝5.1Hz)，7.87(d，1H，J＝3.8Hz)，
7.83(d，1H，J＝3.6Hz)，7.79(d，1H，J＝5.1Hz)，
7.41(d，1H，J＝5.0Hz)，
7.28(dd，1H，J＝3.7及5.0Hz)，
6.93(d，1H，J＝3.8Hz)，
6.76(dd，1H，J＝6.0及8.2Hz)，
5.28(d，1H，J＝4.1Hz)，
5.02(t，1H，J＝5.6Hz)，4.39(m，1H)，
3.85(m，1H)，3.56(m，2H)，2.57(m，1H)，
2.26(m，1H)。
化合物8：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ
8.38(d，1H，J＝5.1Hz)，8.13(d，1H，J＝3.2Hz)，
8.01(d，1H，J＝3.2Hz)，7.96(d，1H，J＝3.7Hz)，
7.72(d，1H，J＝5.1Hz)，7.15(d，1H，J＝3.7Hz)，
6.79(dd，1H，J＝6.1及8.0Hz)，
5.29(d，1H，J＝4.0Hz)，4.50(t，1H，J＝5.5Hz)，
4.40(m，1H)，3.86(m，1H)，3.57(m，2H)，
2.58(m，1H)，2.26(m，1H)。
(4)1-[2-脱氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-(2-噻吩基)-吡咯并[2，3-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(化合物11)及1-[2-脱氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-(2-噻唑基)-吡咯并[2，3-b]吡啶2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(化合物12)的合成
用吡啶使化合物7(300mg，0.9mmol)共沸后，添加吡啶(9ml)，再添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(386mg，1.1mmol)，室温下搅拌1小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3水溶液分液，将有机层用饱和食盐水清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用硅胶柱纯化，得到了570mg(97％)的化合物9。
用吡啶使化合物9(290mg，0.47mmol)共沸后，添加THF(2.4ml)和二异丙基乙基胺(123μl，0.7mmol)，向该溶液中添加2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺(115μl，0.52mmol)，室温下搅拌1小时。向反应溶液中添加甲醇(50μl)，用乙酸乙酯∶水(20∶1，v/v)稀释，添加5％NaHCO3水溶液，分液。将有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用硅胶柱纯化，得到了345mg(90％)的化合物11。
同样地，化合物10和化合物12的合成是从化合物8(220mg，0.7mmol)开始，得到了化合物10(424mg，99％)、化合物12(227mg，86％)。
(5)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻吩基)-吡咯并[2，3-b]吡啶5’-三磷酸(化合物15)和1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(2-噻唑基)-吡咯并[2，3-b]吡啶5’-三磷酸(化合物16)的合成
用吡啶使化合物9(247mg，0.4mmol)共沸后，添加吡啶(4ml)，再添加乙酸酐(75μl，0.8mmol)，将反应溶液在室温下搅拌12小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3水溶液分液，将有机层用5％NaHCO3水溶液清洗。将该有机层用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用甲苯共沸，然后将残渣溶解在二氯甲烷40ml中。于0℃向该反应溶液中添加二氯醋酸，0℃搅拌15分钟。向反应溶液中添加5％NaHCO3水溶液，分液，将有机层用5％NaHCO3水溶液清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用硅胶柱纯化，得到了125mg(87％)的化合物13。
用吡啶使化合物13(36mg，0.1mmol)共沸，然后添加吡啶(100μl)和二噁烷(300μl)，再添加2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮(110μl，1M二噁烷溶液)，室温下搅拌10分钟。向反应溶液中添加三-正丁基胺(100μl)和双(三丁基铵)焦磷酸盐(300μl，0.5M DMF溶液)，搅拌10分钟。添加I2/吡啶(3.0ml，吡啶中1％碘：H2O，98∶2，v/v)搅拌15分钟，然后添加5％NaHSO3水溶液(150μl)，浓缩反应溶液。添加H2O(5ml)，室温下搅拌30分钟，然后添加28％氨水20ml，室温下搅拌2小时。将反应溶液浓缩、冻干，然后用DEAE Sephadex A-25纯化(50mM至1.0mM TEAB线性梯度)，用HPLC进行最终纯化，得到了作为目标的化合物15。
同样地，化合物14和化合物16的合成是从化合物10(210mg，0.34mmol)开始的，得到了化合物14(108mg，89％)、化合物16(0.1mmol合成级)。
化合物15：
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C16H18O12N2P3S；计算值，554.98(M-H)-；测定值，554.73(M-H)-。
化合物16：
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C15H17O12N3P3S；计算值，555.97(M-H)-；测定值，555.82(M-H)-。
实施例III生物学实验
1.方法
本实施例中，如无另行说明，采用以下方法。
使用了KF exo - 的单核苷酸插入实验
单核苷酸插入实验根据文献进行(非专利文献30-32)。将5’-末端用6-羧基荧光素标记的引物(20-mer)与模板DNA(35-mer)在含20mM MgCl2、2mM DTT和0.1mg/ml牛血清白蛋白的100mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中通过下述方式退火：升温至95℃再缓慢冷却至4℃。将引物-模板双链溶液(10μM、5μl)与缺失外切核酸酶活性的克列诺片段(KF exo-、Amersham USB)的酶溶液(2μl)混合。将混合物温育2分钟，接着，将各dNTP溶液(3μl)添加到该溶液中，于37℃开始反应。调节所使用的酶量(5-50nM)、反应时间(1-35分)和dNTP的梯度浓度(0.3-1500μM)，在产生25％以下的生成物的条件下进行测定。将反应用10μl的终止溶液(95％甲酰胺和20mM EDTA)终止，并将混合物立即在75℃加热3分钟。使用装备有GeneScan软件(版本3.0)的自动ABI377DNA测序仪对稀释产物进行分析(非专利文献32)。用反应范围(反応の範囲)除以反应时间计算出比速度(比速度)(v0)，并对所使用的各酶浓度进行酶浓度的标准化(20nM)。由相对于[dNTP]的[dNTP]/v0的Hanes-Woolf作图得到了动力学参数(KM和Vmax)。各参数是3～8组数据的平均值。
使用KF的引物延伸反应
将5’-32P-标记引物(23-mer)和模板DNA(35-mer)的双链在含14mMMgCl2和0.2mM DTT的20mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中退火。将双链溶液(400nM，5μl)在冰上与5xdNTP溶液(2μl)混合，接着，向其中添加含KF exo-(1单位)或KF exo+(1单位)(TAKARA)的酶溶液(3μl)，从而开始反应。将反应溶液在37℃下温育3或5分钟，然后添加含89mM Tris-硼酸盐、2mM EDTA、10M尿素和0.05％BPB的染料溶液(10μl)终止反应。将该溶液立即在75℃加热3分钟，然后在15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上电泳。使用生物影像分析仪(型号BAS2500、Fuji)对凝胶上的产物进行了分析。
DNA测序
双脱氧-循环测序反应(20μl)在存在或不存在1nmol dPa’TP的条件下、使用含有0.3pmol模板和4pmol引物1或引物2的8μl的Ready ReactionMix(BigDye1.1，Applied Biosystems)在PTC-100Program ThermalController(MJ Reseach)上进行。25循环的PCR(96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分)之后，用Centri-SeqTM离心旋转柱(スピンカラム)(AppliedBiosystems)从反应溶液中除去残存的染料终止剂，然后，于55℃在减压下对该溶液进行干燥。将残留物用甲酰胺溶液(4μl)重悬，然后用装备有6％聚丙烯酰胺-6M尿素凝胶的ABI 377DNA测序仪进行分析。序列数据用Applied Biosystems PRISM测序分析v3.2软件进行了分析。
PCR扩增
使用PTC-100Controller，在10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mMMgSO4、0.1％Triton X-100、0.3mM各dNTP(N＝Pa，G，C，和T)与dNTPN(N＝Ds和A)、1μM各引物1和引物2、2.3nM双链DNA片段、以及0.04单位/μl Vent DNA聚合酶(New England BioLabs)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.8)中进行反应。PCR循环如下进行：94℃、0.5分；45℃、0.5分；65℃、4分。在对照PCR中使用的是0.2mM各天然型dNTP和0.01单位/μl的Vent DNA聚合酶，并且延伸反应步骤为72℃、1分钟。在4％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行溴化乙啶染色，使用Molecular Imager FX Pro system和Quantity One软件(Bio-Rad)对染色条带的强度进行了定量。为了进行测序分析，将PCR产物预先用凝胶电泳(7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶)或过滤(Microcon YM-30和Micropure-EZ)的方法进行了纯化。
T7转录
转录(20μl)在含24mM MgCl2、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％TritonX-100、1-3mM各天然型NTP、0-3mM Pa’TP、0-3mM DsTP、10mM GMP、2μM模板DNA(用于17-mer转录物的合成)或0.5μM模板DNA(用于tRNA转录物合成)、和2.5单位/μl T7RNA聚合酶(TAKARA)的40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中进行。为了考察转录效率，在17-mer转录物的合成中，添加了2μCi[γ-32P]GTP(PerkinElmer、代替GMP)，而在tRNA转录物的合成中添加了[α-32P]GTP(Amersham)，进行了转录。于37℃温育3小时(17-mer合成时)或6小时(tRNA合成时)后，添加含尿素的染料溶液终止反应。将该溶液于75℃加热3分钟，然后进行15或20％(17-mer)或10％(tRNA)聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳，用生物影像分析仪对产物进行了分析。在分析转录产物中的核苷酸组成时(非专利文献17，33)，将转录物用2μCi[α-32P]UTP或[α-32P]ATP(Amersham)进行了内部标记。转录后、将产物在10μl的15mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)中用0.75单位的RNase T2于37℃消化2小时。在17-mer的分析中，在消化反应溶液中添加了0.05A260单位的大肠杆菌tRNA(Sigma)。用2D-TLC(HPTLC板、100×100mm、Merck)对消化产物进行了分析。第一维展开溶剂为异丁酸-氨-水(66∶1∶33v/v/v)，第二维展开溶剂为异丙醇-HCl-水(70∶15∶15v/v/v或用于Pa’转录物的75∶15∶10v/v/v)。使用生物影像分析仪对TLC板上的标记核苷酸的点进行了分析。
DNA2-9的PCR扩增产物的双脱氧-循环测序
各DNA的PCR是使用PTC-100Controller在含10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、0.3mM的各dNTP(N＝Pa、G、C及T)及dNTPN(N)＝Ds及A)、1μM的各引物1及引物2、2.3M的双链DNA片段(DNA2-9)、及0.04单位/μl的Vent DNA聚合酶(New England BioLabs)的Tris-HCl缓冲液(pH8.8)中进行的。PCR的循环如下进行：94℃、0.5分钟；45℃、0.5分钟；65℃、4分钟。为了测序，将PCR产物预先通过凝胶电泳(7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶)或过滤(Microcon YM-30及Micropure-EZ)进行了纯化。在存在或者不存在dPa’TP的条件下进行测序，使用装备有6％聚丙烯酰胺-6M尿素凝胶的ABI377DNA测序仪测定了序列。
通过比较在存在或不存在dPa’TP的条件下的测序中所获得的两者的峰模式，能够确认DNA片段中的非天然型碱基的位置。
大肠杆菌无细胞翻译系统中含有非天然型反密码子的tRNA的氨酰化
按修改过的生产商的规程在快速翻译系统(RTS-100、Roche)中考察了tRNA转录产物的氨酰化。将用[α-32P]进行了分子内标记的tRNA转录产物(0.4μM)于30℃在系统(25μl)中温育30分钟。用醋酸钠(pH4.5)饱和的苯酚抽提tRNA，然后在含0.2M Tris-醋酸及3mM EDTA的酸性缓冲液(pH4.75)中于4℃用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了分析(图5d、图21)。
2.含有Ds的DNA片段的测序
采用利用了双脱氧核苷酸链终止的测序方法(非专利文献33)确认了DNA片段中的Ds-Pa碱基对的位置，所述双脱氧核苷酸链终止中添加了修饰Pa即4-丙炔基吡咯-2-甲醛(Pa’)核苷的三磷酸衍生物(dPa’TP)(非专利文献34)。使用KF exo-时，与针对模板中的Ds的dPaTP的导入效率(Vmax/KM＝5.7×104)相比，针对模板中的Ds的dPa’TP的导入效率(Vmax/KM＝2.2×105)高，为其3.9倍(表1及2)。因此，含Ds链的测序是添加dPa’TP、并使用Taq DNA聚合酶的测序试剂盒即BigDye1.1(appliedBiosystems)进行的。为了测序和其后的实验，通过对化学合成的DNA片段进行引物延伸或连接制备了含有Ds-Pa碱基对的双链DNA片段(150-mer和174-mer、DNA1-14)(图6)。
在含有5’-CDsA/3’-GPaT的DNA1的测序中，通过添加0.05mM dPa’TP使得不针对模板中的Ds导入天然型碱基的染料终止剂，因此，仅在对应于模板中的Ds的部位，A，G，C，T的峰均消失(图3c)。即，在该测序中，不出现峰而被认定为空位(ギヤツプ)的位置表示非天然型碱基的位置。
除DNA1以外，在其它含有非天然型碱基周围不同的序列的DNA中，也有一些在dPa’TP存在下的测序中未显示出明显的空位模式(图13-20)。但是，在不存在dPa’TP的条件下的测序中，模板Ds的位置以后的峰基本上消失(图3g)，因此，通过比较存在或不存在dPa’TP的条件下各自的测序的峰模式，能够确认DNA中的非天然型碱基的位置(例如，图3c和3g)。
3.含有Ds-Pa碱基对的DNA片段的PCR扩增
含有Ds-Pa碱基对的DNA1-14(图6)(150-mer或174-mer、2.3nM)的PCR扩增是使用具有3’→5’外切核酸酶活性的耐热性DNA聚合酶(0.04单位/μl、VENT DNA聚合酶，New England BioLabs)与dDsTPN、dPaTP、dATPN、dGTP、dCTP和dTTP的底物混合物(各0.3mM)进行的。PCR循环如下进行：94℃、30秒，45℃、30秒，和65℃、4分。
本发明人等首先测试了DNA1的扩增的选择性和效率(图3a)。10循环的PCR后(图3b)、通过共存或者不共存dPa’TP条件下的测序，对产物进行了分析(图3d和3h)。而且，进一步的10循环PCR(共10+10循环)是使用10循环PCR产物的一部分进行的(图3e和3i)。10循环和10+10循环的PCR产物的dPa’TP存在下的测序显示出与最初的DNA1的测序相类似的峰模式。在dPa’TP非共存下的测序中(图3g-3i)，DNA1中非天然型碱基位置之后的通读(read-through)的峰随PCR循环数的增加稍微增大。因此，通读峰的高度可以用来确定PCR扩增中Ds-Pa碱基对变为天然型碱基对的变异率。变异率是通过比较以下两个通读峰的高度而确定的：含有1-10％的A-T来代替Ds-Pa碱基对的对照DNA片段的dPa’TP非共存下测序中所得的通读峰的高度(图8)，与PCR产物的通读峰的高度(图3g-3i)。10循环和10+10循环后的DNA1中Ds-Pa碱基对的变异率分别为约1％和3-4％。通过该方法可知：A的γ-三磷酸酰胺的使用增加了PCR中Ds-Pa碱基对的选择性。不使用dATPN、而使用dDsTPN、dPaTP和天然型dNTP的DNA1的PCR扩增的变异率上升。10和10+10循环后，Ds-Pa碱基对的变异率分别为约5％和约10％(图9)。此外，在不存在dDsTPN和dPaTP的条件下的10循环PCR中，DNA1中的Ds-Pa碱基对被完全替换成了A-T碱基对(图3f)。
DNA1的扩增效率如下进行评价：通过用染料对凝胶上的PCR产物染色、或者、使用了各标记引物的产物的放射自显影，由条带的强度来评价。其结果(图3b)为：DNA1在10循环的PCR中扩增了15倍，天然型DNA片段(DNAcontl)在10循环的PCR中扩增了37倍。更为准确的效率是使用5’-或3’-32P标记引物、通过PCR产物的放射自显影获得的(图10)。使用式Nf＝N0(1+Y)n，确定各循环的延伸效率(Y)。此处，Nf为产物的最终拷贝数，N0为最初拷贝数，n为PCR循环数(非专利文献35)。使用DNA1的1至10循环的PCR的效率(Y)对于从5’引物开始的延伸为0.38，对于从3’引物开始的延伸为0.29。而在常规条件下PCR扩增DNAcontl时，Y值分别为0.43和0.35。因此，非天然型碱基对系统中PCR的每循环的效率为传统天然型碱基对系统中的76-88％。从以上获得的PCR产物的扩增效率和由DNA测序确定的Ds-Pa碱基对的变异率，可以计算出DNA1中的Ds-Pa碱基对在PCR中的保真度(DNA1被二倍扩增时)为99.8％以上。然而，可知：PCR扩增中Ds-Pa碱基对的选择性相比，该保真度更依赖于化学合成的最初的DNA片段的纯度(图11)。因此，可以认为：非天然型碱基对系统的选择性相当高，甚至为99.8％以上。
本发明人等还研究了含Ds-Pa碱基对周围不同的序列的其它DNA片段(DNA2-14)的扩增。10循环PCR后，各DNA片段被扩增了16至30倍(图12)，各DNA的Ds-Pa碱基对的变异率为1-3％(图13-图20)。其中例外的是含有5’-X(A)n-3’序列的DNA10-14的扩增。此处，X＝Ds或Pa，而且n＝2。这些DNA片段的10循环PCR后的扩增效率不到5倍。这样的低效率在继A的γ-三磷酸酰胺的掺入后，Ds或Pa底物被连续地掺入时中会有发生。因此，除5’-DsAA-3’和5’PaAA-3’序列外，含有非天然型碱基的所有序列能够用于DNA扩增。
4.Ds-Pa碱基对介导的T7转录
Ds-Pa和Ds-Pa’碱基对以互补的方式介导利用T7RNA聚合酶将DsTP、PaTP和Pa’TP部位特异性地导入RNA。使用含Ds、Pa或Pa’的模板DNA(35-mer)，研究了转录(图4a和4b)。添加非天然型碱基的核糖核苷三磷酸进行3个小时的转录后，在凝胶上对32P标记的转录物进行了分析(图4c)。与使用天然型碱基构成的模板DNA的仅使用天然型碱基的转录物(图4c泳道9)的收率相比，各含有Pa、Pa’和Ds的全长转录物(17-mer)的收率为28-91％(图4c泳道1，2，5，和7)。在含非天然型碱基的模板DNA的转录中，不添加非天然型碱基底物时的转录物的收率显著减少(图4c泳道3，6和8)。
通过分析内部32P标记转录物的核苷酸组成(非专利文献17，33)确认了：T7转录中Ds-Pa和Ds-Pa’碱基对的高选择性(图4d和4e、以及表3)。
表3.T7转录物的核苷酸组成分析
表3a
Figure GSB00000653789400731
表3b
Figure GSB00000653789400741
a：如图4及5所示的、被掺入到A(条目1-13及24-31)或U(条目14-23及32-39)的5’末端侧的核苷酸的组合物
b：Np＝Pap、Pa’p、或Dsp
c：该值通过下式确定
化学式27
(各核苷酸的放射活性)/[全部核苷酸(3’-磷酸)的总放射活性]×([α-P32]NTP的5’近旁的核苷酸的总数)
d：各核苷酸的理论值标在方括号内。
e：标准偏差标在圆括号内。
f：未检出。
将内部32P标记的转录物用RNaseT2消化，用2D薄层色谱(2D-TLC)对生成的标记核苷3’-一磷酸进行了分析。在使用含非天然型碱基的模板的转录物中，与Ds和Pa对应的各点出现在2D-TLC上，而且没观察到任何对应于与非天然型碱基形状类似的天然型底物的错误导入(例如，CTP和UTP相对于PaTP、以及ATP和GTP相对于DsTP)的点(图4d、N＝Ds和图4e、N＝Pa)。在使用完全由天然型碱基构成的模板的转录物中，未观察到与Pa或Ds对应的点(图4d、N＝A和G、以及图4e、N＝T和C)。2D-TLC上各核苷酸的点的定量值极其接近根据产物序列预测的理论值(表3、条目1-23)，由这些结果可以认为：转录中Ds-Pa或Ds-Pa’碱基对的选择性为95％以上。
作为应用例，本发明人等通过T7转录制备了含有非天然型反密码子即CUPa’、CPa’A、CUDs、和CDsA的tRNA分子(85-mer)。这里采用了大肠杆菌抑制tRNATyr的序列。
向PaTP或Pa’TP的17-mer转录物转录的转录效率比较低，但含有Pa’的更长tRNA(85-mer)的转录显示出高效率；85-mer的收率与具有CUA反密码子的tRNA转录物的收率相比，为88-93％(图5a)。为了核苷酸组成分析，将转录物用[α-32P]ATP或[α-32P]UTP进行了内部标记。因为非天然型核苷酸位于A的5’末端侧，所以各非天然型核苷酸的3’-一磷酸仅用[α-32P]ATP标记。因此，仅当转录物用[α-32P]ATP标记时，通过2D-TLC检测到了对应于非天然型核苷酸的点(图5b和5c)。针对模板中的Ds导入Pa’、以及针对模板中的Pa导入Ds的选择性为96％以上(表3、条目24-39)。
使用所得的tRNA转录物，本发明人等研究了大肠杆菌抽提液中的氨酰化(RTS 100E.coli HY kit、Roche Diagnostics)。具有CPa’A和CDsA反密码子的tRNA完全未氨酰化，可知其不被大肠杆菌来源的氨酰tRNA合成酶识别(图5d泳道7-10)。此外，具有CUPa’和CUDs反密码子的tRNA被氨酰化(图5d泳道1-4)。具有这些非天然型反密码子的tRNA的氨酰化选择性，与大肠杆菌tRNATyr与其酪氨酰tRNA合成酶间的识别选择性(非专利文献36，37)相当一致。由以上结果可以确认非天然型碱基部位特异性地导入tRNA。
实施例IV生物素化PaTP的合成
根据图36所示的方案合成了生物素化PaTP(1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯：化合物28、Bio-PaTP)。
(1)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物24)的合成(图36的方案中的反应(a)-(c))：
于-78℃向含2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖(1.0g、2.3mmol)和CCl4(344μl、3.6mmol)的THF溶液(4.6ml)中添加六甲基亚磷酰三胺(ヘキサメチルホスホロストリアミド)(562μl、3.0mmol)。将该溶液在-78℃搅拌2小时，然后在室温搅拌30分钟(溶液A)。在CH3CN(25mL)中，向4-碘-吡咯-2-甲醛(化合物23)(830mg、3.7mmol)添加NaH(60％油分散液、150mg、3.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。接着，添加THF中的2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基氯化物(溶液A)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将生成物用乙酸乙酯和水进行分液。有机层用饱和NH4Cl清洗3次，用Na2SO4干燥，然后减压下浓缩。生成物用硅胶色谱柱(用二氯甲烷中的1％甲醇洗脱)纯化，得到了1-(2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛。
于-78℃，向1-(2，3，5-三-O-苄基-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛的二氯甲烷(15ml)溶液中添加BBr3(1M溶液、8.5ml)。将反应混合物搅拌2小时，然后添加CH2Cl2中的50％甲醇(30ml)。将该溶液于-78℃搅拌10分钟后，添加28％NH4OH(4ml)，然后搅拌反应混合物，直至其至室温。将该溶液添加到CH2Cl2和H2O中。水层用CH2Cl2分液并清洗3次，然后减压下浓缩残渣。将生成物用反相C18HPLC纯化，得到了1-(β-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛(330mg)。
用吡啶及甲苯使1-(β-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛(176mg、0.5mmol、含α异头物)共沸。向1-(β-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛(176mg)、四(三苯基膦)钯(29mg、0.025mmol)、CuI(15mg、0.08mmol)和三乙胺(105μl、0.75mmol)的DMF(1.8ml)溶液中添加3-(二氯乙酰胺)-1-丙炔(0.75mmol)的1M DMF溶液(750μl)。将反应物在室温下搅拌12小时。生成物用EtOAc/H2O进行分液，有机层用Na2SO4干燥，减压下浓缩。生成物用硅胶色谱柱(二氯甲烷中10％甲醇)和RP-HPLC纯化，以β异构体的形式得到了化合物24(123mg、26％、3步的总收率)。通过NMR(图38)和高分辨率质谱分析确认了化合物24的结构。化合物24的HMQC谱(图38e)和HMBC谱(图38f和图38g)显示：在C1’碳上，糖和吡咯碱基部位之间形成有N-糖苷键。此外，化合物24的NOESY谱(图38d)的交叉峰与化合物18(图25j)类似，而且显示出H1’和H4’质子间的交叉峰，因此，将化合物24的芳香族立体构型鉴定为β。
化合物24：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ
9.54(d，1H，J＝0.8Hz)，9.10(t，1H，J＝5.2Hz)，
8.01(s，1H)，7.18(d，1H，J＝1.8Hz)，
6.49(s，1H)，6.34(d，1H，J＝3.5Hz)，
5.35(d，1H，J＝5.6Hz)，5.10(m，2H)，
4.17(d，2H，J＝5.4Hz)，4.02(m，2H)，
3.88(m，1H)，
3.68(ddd，1H，J＝3.4，5.3，12.1Hz)，
3.57(ddd，1H，J＝3.5，5.0，12.1Hz).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ
180.28，163.78，131.88，131.49，
126.85，105.23，90.23，85.26，
85.04，76.83，76.41，69.75，
67.01，60.96，30.20.
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C15H17N2O6Cl2(M+1)：计算值，391.0464；实测值，391.0462.
(2)1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-二氯乙酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(化合物26)的合成(图36方案中的反应(d)-(e))。
用吡啶使化合物24(118mg，0.3mmol)共沸3次。向吡啶(3.0ml)中的残渣中添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(113mg、0.33mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时，然后将其添加到EtOAc和5％NaHCO3中。将有机层用饱和NaCl清洗，在Na2SO4上干燥，然后在减压下浓缩。生成物用硅胶色谱柱(二氯甲烷中、1％甲醇)纯化，得到了197mg的化合物25，收率95％。
用吡啶使化合物25(188mg、0.27mmol)共沸3次。向吡啶(2.7ml)中的残渣添加乙酸酐(103μl、1.1mmol)。将混合物在室温下搅拌，然后将其添加到EtOAc和5％NaHCO3中。有机层用饱和NaCl清洗，在Na2SO4上干燥，然后减压下浓缩。于0℃，向二氯甲烷(27ml)中的残渣添加二氯醋酸(270μl)。将混合物在0℃下搅拌15分钟，添加到5％水性碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷抽提。在Na2SO4上干燥后，减压下浓缩溶液。生成物用硅胶色谱柱(二氯甲烷中、1％甲醇)纯化，得到了118mg的化合物26，收率92％。
化合物25：
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ
9.56(s，1H)，9.05(t，1H，J＝5.0Hz)，
7.72(s，1H)，7.38-7.20(m，10H)，
6.87(d，4H，J＝7.1Hz)，6.47(s，1H)，
6.34(d，1H，J＝3.3Hz)，
5.47(d，1H，J＝5.3Hz)，
5.13(d，1H，J＝5.7Hz)，
4.12-4.00(m，5H)，3.73(s，6H)，
3.22(m，2H).
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C36H35N2O8Cl2(M+1)：计算值，693.1770；实测值，693.1721.
化合物26：
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ
9.50(s，1H)，9.10(bs，1H)，8.06(s，1H)，
7.24(d，1H，J＝1.3Hz)，6.64(d，1H，J＝5.0Hz)，
6.48(s，1H)，5.43(t，1H，J＝5.0Hz)，
5.35(t，1H，J＝5.2Hz)，5.32(t，1H，J＝4.8Hz)，
4.17(m，3H)，3.73(m，1H)，3.62(m，1H)，
2.07(s，3H)，2.01(s，3H).
HRMS(FAB，3-NBA MATRIX)
C19H21N2O8Cl2(M+1)：计算值，475.0675；实测值，475.0687.
(3)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-生物素酰胺-1-丙炔基)]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸酯(化合物28)的合成(图36方案中的反应(f)-(g))。
将保护的核苷26(47mg、0.1mmol)溶解于吡啶中，减压下浓缩。将残渣溶解在吡啶(100μl)和二噁烷(300μl)中。添加二噁烷中的2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮的1M溶液(110μl、0.11mmol)。10分钟后，将三-正丁基胺(100μl)和DMF中的0.5M双(三丁基铵)焦磷酸盐(300μl、0.15mmol)迅速地添加到反应混合物中。将混合物在室温下搅拌10分钟。接着，添加吡啶/水(98/2，v/v)中的1％碘溶液(2.0ml)。15分钟后，添加NaHSO3的5％水性溶液(150μl)。蒸馏除去挥发性成分，然后向残渣加水(5.0ml)。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后用浓氨水(20ml)在室温下处理12小时。减压下浓缩溶液，然后将生成物用DEAE Sephadex(A-25)色谱柱(用50mM至1M TEAB的线性梯度洗脱)纯化，再用C18-HPLC(通过100mM醋酸三乙铵中0％至30％CH3CN的梯度洗脱)纯化，得到了核苷5’-三磷酸酯27。
冻干后，使0.1M NaHCO3-Na2CO3缓冲液(5ml、pH8.6)中的化合物27与生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(900μl、DMF溶液中0.14M)在室温下反应3小时。将混合物用28％NH4OH(2ml)处理1小时。将生成物用DEAE
Sephadex(A-25)色谱柱(通过50mM至1M TEAB的线性梯度洗脱)纯化，再用C18-HPLC(通过100mM醋酸三乙铵中、0％至30％CH3CN的梯度洗脱)纯化，由化合物26得到了核苷5’-三磷酸酯28，收率14％。通过1H NMR(图43a和b)、31P NMR(图43c)和质量分析(图42)确认了化合物28的结构。化合物28生物素部分的质子信号与以前合成的生物素化yTP的质子信号相同，D2O中的31P NMR谱显示与核苷酸5’-三磷酸酯对应的典型的磷的信号。
化合物27：
电喷雾离子化-质谱学(ESI-MS)
C13H19O14N2P3：计算值，519.00(M-H)-；实测值，518.98(M-H)-.
化合物28：
1H NMR(300MHz，D2O)δ
9.36(d，1H，J＝0.9Hz)，7.86(s，1H)，
7.20(d，1H，J＝1.7Hz)，6.44(d，1H，J＝4.1Hz)，
4.39-4.33(m，3H)，4.23-4.15(m，4H)，
4.06(d，2H，J＝3.7Hz)，3.18(m，1H)，
3.12(q，24H，J＝7.3Hz)，
2.82(dd，1H，J＝4.9和13.1Hz)，
2.60(d，1H，J＝13.0Hz)，
2.23(t，2H，J＝7.0Hz)，1.60(m，4H)，
1.32(m，2H)，1.20(t，36H，J＝7.3Hz).
31P NMR(107MHz，D2O)δ
-8.96(d，1P，J＝16.5Hz)，
-10.67(d，1H，J＝20.1Hz)，
-22.36(t，1P，J＝20.1Hz).
电喷雾离子化-质谱学(ESI-MS)
C23H33O16N4P3S：计算值，745.07(M-H)-；实测值，745.07(M-H)-.
UV-可见光谱(10mM磷酸钠缓冲液中，pH7.0)，
λmax＝258nm(ε＝1.1×104)，308nm(ε＝9.5×103).
实施例V利用介导Ds-Pa人工碱基对的T7转录的RNA的部位特异性 生物素化
为了对转录和PCR扩增中的Ds-Pa人工碱基对的选择性和可能性进行更详细的测试，进行了152-mer RNA分子的部位特异性生物素化。
RNA的部位特异性生物素化(152-mer)
转录(20μl)是使用3μCi[γ-32P]GTP、2mM各天然型NTP、0-4mMBio-PaTP(生物素化Pa底物：按实施例IV的记载化学合成)和30nM模板(对于DNA6和DNAcont2(图6参照)分别使用连接获得的模板和PCR扩增的模板)，于37℃进行6小时。
在使用通过连接获得的DNAcont5和DNAcont6(图6参照)的对照反应中，转录是在存在下或不存在2mM Bio-UTP(生物素-16-尿苷-5’-三磷酸酯、Roche·Applied·Science)的条件下，仅与2mM ATP、GTP和CTP一起进行的。将生成物在7～10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上进行分析及纯化。
生物素化RNA转录物通过使用链霉菌抗生物素蛋白的凝胶电泳迁移测定进行了检测。将2pmol32P-标记转录物和100pmol链霉菌抗生物素蛋白(Promega)的混合物(10μl)在含50mM NaCl和10mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)中20℃温育1小时。将生物素化RNA-链霉菌抗生物素蛋白复合体通过7％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上的电泳进行了分析。为了确定Bio-Pa的导入位置，将各RNA(152-mer)用小牛肠来源的碱性磷酸酶(Takara)进行5’-末端脱磷酸化后，再用[γ-32P]ATP(PerkinElmer)标记。将标记的RNA用RNase T1在含4.7M尿素、0.7mM EDTA和0.17mg/ml大肠杆菌tRNA的13.3mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)中，于55℃部分消化12分钟，并且用碱在含0.6mM EDTA的32mM碳酸钠缓冲液(pH9.1)中，于90℃部分消化15分钟。将碱消化的RNA溶液(9μl)与含150mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)(11μl)混合，然后将混合物(10μl)与链霉菌抗生物素蛋白磁珠(0.4mg)(New England BioLabs)一起在室温下温育5分钟，捕捉了生物素化的RNA。将一部分上清(5μl)与其它消化的样品一起在10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上进行了分析。
结果
使用连接得到的模板和PCR扩增的模板，通过介导Ds-Pa碱基对的T7转录，将生物素偶联的Pa(Bio-Pa)导入了RNA。为了分析针对RNA分子(152-mer)的Bio-Pa导入，使用DNA6和DNAcont2模板(图6参照)，在天然型底物NTP(2mM)和Bio-PaTP(2或4mM)存在下进行了T7转录。与使用仅含天然型碱基的DNA片段即DNAcont2时(图44c、泳道3、7和11)相比，有Ds-Pa碱基对时的转录效率为47-85％(图44c、泳道2、6和10)。在使用连接得到的DNA6模板和PCR扩增的DNA6模板的转录中，在不存在Bio-PaTP的条件下，全长产物的量显著低下(图44c、泳道1、5和9)。这些结果显示：在PCR扩增DNA6时，基本上未引起Ds-Pa碱基对替换为天然型碱基对。
使用链霉菌抗生物素蛋白，通过生物素化转录物的凝胶电泳迁移测定评价了对RNA的Bio-Pa导入选择性。链霉菌抗生物素蛋白与生物素之间的结合非常强且特异性，因而可以认为：凝胶电泳迁移的转录物的比例与转录中的生物素导入率(即，生物素化转录物的收率)基本相同。在使用与天然型底物等量的2mM Bio-PaTP、和通过连接得到的DNA6模板的转录中，90％的转录物被生物素化(图44d、泳道2)，而且增加Bio-PaTP浓度(4mM)，导入率提高到96％(图44d、泳道4)。关于针对天然型碱基的Bio-PaTP的错误导入，在采用2或4mM Bio-PaTP存在下的使用DNAcont2为模板的转录实验进行评价时，生物素化转录物的收率分别为9和16％(图44d、泳道6和7)。相对于152-mer转录物的1个碱基的位置，这些错误导入大致仅为0.06％(总计9％)和0.12％(总计16％)。在使用PCR扩增(20循环)的模板的转录中，Bio-Pa的导入率减少至3-4％(图44d、泳道9和11)。该值与通过序列分析图3i)得到的Ds-Pa碱基对部位的变异率(3-4％)一致。有趣的是，针对天然型碱基的Bio-Pa错误导入，在天然型和人工碱基底物存在下的使用PCR扩增(20循环)的DNAcont2模板的转录中，并未增加(图44d、泳道13和14)。因此，可以认为：针对天然型碱基的Ds和Pa的错误导入在PCR扩增中是非常低的。
此外，比较了Ds-Pa碱基对在T7转录中的选择性与天然型的A-T(U)碱基对的选择性。为了评价针对模板链中的碱基G、C和T的Bio-UTP的错误导入，合成了在模板链的编码区中仅含1个A的对照DNA(DNAcont5)和不含A的对照DNA(DNAcont6)(图6参照)。在使用DNAcont5和DNAcont6作为模板的转录中，按与Ds-Pa碱基对相同的系统和条件进行，不同的是：使用了0或2mM Bio-UTP和其它天然型底物(2mM ATP，GTP和CTP)。在DNAcont5的转录中，通过针对A导入Bio-U，转录物被完全生物素化(图44d、泳道16)。然而，在DNAcont6的转录中，由于针对模板链中的碱基G、C和T的Bio-U的错误导入，有21％的转录物被生物素化(图44d、泳道18)。因此，可知：针对天然型碱基的Bio-PaTP错误导入的比例(9％和16％、分别为图44d、泳道6和7)，比针对天然型碱基的生物素偶联UTP(Bio-UTP)的错误导入比例(21％)更低。值得一提的是：该Bio-U错误导入比例(21％)即使在相对于天然型底物存在2mol当量的Bio-PaTP的条件下，仍然比Bio-Pa相对于天然型碱基的错误导入比例(16％)要高。因而，针对Ds的Bio-Pa导入比针对A的Bio-U导入的效率稍差，而在T7转录中，排除针对模板链中的天然型碱基部位的Bio-Pa错误导入的选择性比排除针对模板链中的碱基G、T和C部位的Bio-U错误导入的选择性高。
为了确定转录物中Bio-Pa的导入部位，分析了生物素化转录物的序列。如果针对模板中的Ds、Bio-Pa被正确地导入到转录物中，则转录物的第59位被生物素化。用碱或RNase T1部分消化5’末端经32P标记的转录物，用电泳对其产物进行了分析。在含Bio-Pa的转录物的序列梯(ラダ一)中，对应于大于59-mer的片段的条带发生了移动(图44e、泳道2和8)。此外，用链霉菌抗生物素蛋白处理碱消化的片段，捕捉生物素化片段，其余的进行电泳，这种情况下，大于59-mer的片段基本上消失(图44e、泳道2和9)。这些结果显示：转录物第59位的部位特异性Bio-Pa导入。进一步，使用PCR扩增(20循环)的模板的转录物(图44e、泳道7-12)与使用连接获得的模板获得的转录物(图44e、泳道1-6)产生相同的模式。
因此，利用该方法的RNA部位特异性生物素化可以用于RNA分子的固定，而不破坏RNA的活性。用生物素这样的大基团修饰的人工碱基Pa能够有效地掺入RNA中，因此，荧光团偶联的Pa等一系列功能性4-修饰Pa碱基同样能够掺入RNA中。
实施例VI  2-硝基吡咯的4位修饰核苷衍生物的合成
2-硝基吡咯的4位修饰核苷衍生物按图45所示方案合成。
(1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(图45的化合物1)的合成
将1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(700mg、3.1mmol)溶解于CH3CN(12ml)中，添加N-碘琥珀酰亚胺(1.38g、6.1mmol)，室温下搅拌12小时。反应溶液用乙酸乙酯和水进行分液，将有机层用水清洗2次。将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，用硅胶柱(CH2Cl2∶MeOH＝50∶1、v/v)和HPLC(25％-40％CH3CN、10分钟、40％-50％CH3CN、5分钟)纯化，得到了607mg(56％)的化合物1。未反应回收原料219mg(31％)。
化合物1
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ
7.90(d，1H，J＝2.1Hz)，7.40(d，1H，J＝2.1Hz)，
6.54(t，1H，J＝5.6Hz)，5.27(d，1H，J＝4.5Hz)，
5.10(t，1H，J＝5.2Hz)，4.23(m，1H)，
3.83(m，1H)，3.65(m，1H)，3.56(m，1H)，
2.40(m，1H)，2.23(m，1H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C9H12IN2O5(M+1)：计算值354.9791；测定值354.9784.
(2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯(化合物2)的合成
将1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(化合物1)(280mg、0.79mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(56mg、0.08mmol)溶解在DMF(7.9ml)中，添加三丁基(1-丙炔基)锡(481μl、1.6mmol)。将反应溶液于100℃加热1.5小时，将溶液浓缩后，用硅胶柱(CH2Cl2∶MeOH、50∶1、v/v)和HPLC(34％-35％CH3CN、13分钟)纯化，得到了125mg(60％)的化合物2。
化合物2：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ
7.92(d，1H，J＝2.2Hz)，7.27(d，1H，J＝2.2Hz)，
6.55(t，1H，J＝5.7Hz)，5.28(d，1H，J＝4.5Hz)，
5.11(t，1H，J＝5.2Hz)，4.24(m，1H)，
3.85(m，1H)，
3.67(ddd，1H，J＝3.6，5.3，12.1Hz)，
3.57(m，1H)，2.43(m，1H)，2.23(m，1H)，
1.99(s，3H).
13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ
136.21，129.17，117.08，105.29，
88.74，88.30，86.75，72.91，69.21，
60.83，42.58，4.29.
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C12H15N2O5(M+1)：计算值267.0981；测定值267.0991.
(3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(二氯乙酰胺1-丙炔基)-2-硝基吡咯(化合物3)的合成
将1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(化合物1)(354mg、1.0mmol)、Pd(PPh3)4(58mg、0.05mmol)、CuI(30mg、0.16mmol)、三乙胺(209μl、1.5mmol)溶解在DMF(3.5ml)中，添加N-(2-丙炔基)-二氯乙酰胺的1M DMF溶液(1.5ml、1.5mmol)，室温下搅拌12小时。将反应溶液用乙酸乙酯和水进行分液，将有机层用水清洗3次。将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，用硅胶柱(CH2Cl2∶MeOH、20∶1、v/v)和HPLC(34％-35％CH3CN、12分)纯化，得到了317mg(81％)的化合物3。
化合物3：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ
9.01(t，1H，J＝5.3Hz)，7.98(d，1H，J＝2.1Hz)，
7.33(d，1H，J＝2.1Hz)，6.54(t，1H，J＝5.8Hz)，
6.47(s，1H)，5.27(d，1H，J＝4.5Hz)，
5.10(t，1H，J＝5.2Hz)，4.23(m，1H)，
4.17(d，2H，J＝5.4Hz)，3.84(m，1H)，
3.66(ddd，1H，J＝3.5，5.2，12.1Hz)，
3.56(dt，1H，J＝4.6，12.2Hz)，2.43(m，1H)，
2.23(m，1H).
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C14H15O6N3Cl2；计算值390.03(M-H)-；测定值389.85(M-H)-.
(4)1-[2-脱氧-5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-呋喃核糖基]-4-丙炔基-2-硝基吡咯2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(化合物6)的合成
用吡啶使化合物2(200mg，0.75mmol)共沸后，添加吡啶(7.5ml)，再添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(280mg，0.83mmol)，室温下搅拌1小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3进行分液，将有机层用饱和食盐水清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，用硅胶柱纯化(CH2Cl2∶MeOH，200∶1，v/v)，得到了365mg(86％)的化合物4。用吡啶使化合物4(190mg，0.33mmol)共沸后，添加THF(1.7ml)和二异丙基乙基胺(87μl，1.5当量)，向溶液中添加2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基氯代亚磷酰胺(82μl，0.37mmol)，室温下搅拌1小时。向反应溶液中添加甲醇(50μl)，用乙酸乙酯∶水(20∶1，v/v)进行稀释，添加5％NaHCO3，分液。将有机层用饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用硅胶柱(CH2Cl2∶己烷，1∶4，v/v，2％三乙胺)纯化，得到了223mg(87％)的化合物6。
化合物4：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ
7.65(d，1H，J＝2.2Hz)，7.41-7.23(m，10H)，
6.89(d，4H，J＝8.8Hz)，6.59(t，1H，J＝5.3Hz)，
5.37(d，1H，J＝5.0Hz)，4.30(m，1H)，
3.97(m，1H)，3.75(s，6H)，
3.21(d，2H，J＝4.1Hz)，2.48-2.32(m，2H)，
1.92(s，3H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C33H33N2O7(M+1)：计算值569.2288；测定值569.2246.
化合物6.
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ
7.62及7.55(d及d，1H，J＝2.2Hz)，
7.48-7.44(m，2H)，7.39-7.22(m，8H)，
6.87(m，4H)，6.68(m，1H)，4.56(m，1H)，
4.25(m，1H)，3.88-3.35(m，6H)，
3.82(s及s，6H)，2.85-2.72(m，1H)，
2.63(t，1H，J＝6.4Hz)，2.46(t，1H，J＝6.4Hz)，
2.36-2.25(m，1H)，1.95及1.93(s及s，3H)，
1.20-1.08(m，12H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C42H50N4O8P(M+1)：计算值769.3366；测定值769.3166.
(5)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯5’-三磷酸(化合物9)的合成
用吡啶使化合物4(160mg，0.28mmol)共沸后，添加吡啶(2.8ml)，再添加乙酸酐(53μl，0.56mmol)，将反应溶液在室温下搅拌12小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3分液，用5％NaHCO3清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩，用甲苯共沸后，溶解在二氯甲烷28ml中。0℃下向该反应溶液中添加二氯醋酸(280μl)，0℃搅拌15分钟。向反应溶液中添加5％NaHCO3，分液，将有机层用5％NaHCO3清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用硅胶柱纯化，得到了78mg(90％、2步骤)的化合物7。将化合物7(31mg，0.1mmol)用吡啶共沸后，添加吡啶(100μl和二噁烷(300μl)，然后添加2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮(110μl，二噁烷的1M溶液)，室温下搅拌10分钟。向反应溶液中添加三-正丁基胺(100μl)和双(三丁基铵)焦磷酸盐(300μl，DMF中的0.5M溶液)，搅拌10分钟。添加I2/吡啶(3.0ml，吡啶中1％碘：H2O，98∶2，v/v)，搅拌15分钟，然后添加5％NaHSO3(150μl)，浓缩反应溶液。添加H2O(5.0ml)，室温下搅拌30分钟，然后添加28％氨水20ml，室温下搅拌2小时。将反应溶液浓缩、冻干，然后用DEAE Sephadex A-25纯化(50mM-1.0mM TEAB线性梯度)，得到了作为目标的化合物9。
化合物7：
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ
7.90(d，1H，J＝2.1Hz)，7.30(d，1H，J＝2.1Hz)，
6.60(t，1H，J＝6.4Hz)，5.22(m，2H)，
4.13(m，1H)，3.65(m，2H)，
2.62(ddd，1H，J＝3.0，6.0，14.3Hz)，
2.43(m，1H)，2.08(s，3H)，2.00(s，3H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C14H17N2O6(M+1)：计算值309.1087；测定值309.1066.
化合物9：
电喷雾离子化质谱学(ESI-MS)
C12H17O14N2P3；计算值504.98(M-H)-；测定值505.95(M-H)-.
(6)1-(2-脱氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-(二氯乙酰胺1-丙炔基)-2-硝基吡咯(化合物8)的合成
将化合物3(305mg，0.78mmol)用吡啶共沸后，添加吡啶(7.8ml)，再添加4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(291mg，0.86mmol)，室温下搅拌1小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3分液，将有机层用饱和食盐水清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用硅胶柱(CH2Cl2∶EtOAc，9∶1，v/v)纯化，得到了526mg(97％)的化合物5。将化合物5(515mg，0.74mmol)用吡啶共沸后，添加吡啶(7.4ml)，再添加乙酸酐(280μl，3.0mmol)，将反应溶液在室温下搅拌12小时。将反应溶液用乙酸乙酯和5％NaHCO3进行分液，用5％NaHCO3清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，然后浓缩，用甲苯共沸后，溶解在二氯甲烷74ml中。0℃下向该反应溶液添加二氯醋酸(740μl)，0℃下搅拌15分钟。向反应溶液添加5％NaHCO3，分液，将有机层用5％NaHCO3清洗。将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，然后用硅胶柱(CH2Cl2∶MeOH，50∶1，v/v)纯化，得到了289mg(90％，2步骤)的化合物8。
化合物5：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ
9.07(t，1H，J＝5.3Hz)，7.67(d，1H，J＝2.2Hz)，
7.41-7.21(m，10H)，
6.89(dd，4H，J＝1.7，8.9Hz)，
6.59(t，1H，J＝5.4Hz)，6.48(s，1H)，
5.38(d，1H，J＝4.9Hz)，4.29(m，1H)，
4.12(d，2H，J＝4.4Hz)，3.99(m，1H)，
3.74(s，6H)，3.17(m，2H)，
2.46-2.33(m，2H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C35H34N3O8Cl2(M+1)：计算值，694.1723；测定值694.1729.
化合物8：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ
9.12(t，1H，J＝5.3Hz)，7.96(d，1H，J＝2.2Hz)，
7.36(d，1H，J＝2.2Hz)，6.61(t，1H，J＝6.3Hz)，
6.49(s，1H)，5.23(m，2H)，
4.18(d，2H，J＝5.4Hz)，4.13(m，1H)，
3.68(m，2H)，
2.63(ddd，1H，J＝3.0，6.0，14.3Hz)，
2.44(m，1H)，2.07(s，3H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C16H18N3O7Cl2(M+1)：计算值434.0522；测定值434.0549.
实施例VII NH2-hx-dPnTP、ROX-hx-dPnTP、FAM-hx-dPnTP的合成
本实施例中，作为dPnTP相关的衍生物，按图46所示的合成方案合成了NH2-hx-dPnTP、ROX-hx-dPnTP、FAM-hx-dPnTP。这些衍生物能够在例如复制(PCR、引物延伸)中导入DNA中。氨基衍生物可以用于导入后DNA的修饰，氨基以外的荧光基团偶联的各衍生物可以用于DNA的荧光标记以及FRET等。
(1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(图46的步骤(a))
在50mL茄形烧瓶中，用无水乙腈使1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg、1mmol、含α异头物)共沸2次。添加碘化铜(31mg、160μmol))、四三苯基膦钯(0)(58mg、50μmol)，将其溶解在无水DMF(5mL)中，室温下一边搅拌一边添加三乙胺(210μL，1.5mmol)，避光条件下室温下搅拌。向其中滴加N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺(396mg、1.5mmol)的DMF(4mL)溶液，室温下搅拌一晚。减压下浓缩反应溶液，将所得粗生成物用硅胶色谱柱(5-10％CH3OH、CH2Cl2中)和C18-HPLC(39-41％CH3CN、H2O中、15分钟)纯化，以无定形状物质的形式得到了目的物(408mg，收率83％)。
1H NMR(270MHz，DMSO-d6)δ
9.38(brs，1H)，8.28(t，1H，J＝5.3Hz)，
7.95(d，1H，J＝2.0Hz)，7.30(d，1H，J＝2.0Hz)，
6.54(t，1H，J＝5.6Hz)，5.29(d，1H，J＝4.0Hz)，
5.20-5.05(m，1H)，4.30-4.20(m，1H)，
4.05(d，2H，J＝5.3Hz)，3.83(q，1H，J＝4.0Hz)，
3.70-3.50(m，2H)，3.14(t，2H，J＝7.3Hz)，
2.50-2.36(m，1H)，2.30-2.17(m，1H)，
2.08(t，2H，J＝7.3Hz)，1.58-1.40(m，4H)，
1.28-1.16(m，2H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C20H26F3N4O7(M+1)：计算值491.1754；测定值491.1761.
(2)1-(2-脱氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(步骤(b)、(c))
在50mL茄形烧瓶中，将1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(394mg、803μmol)用无水吡啶共沸3次。将其溶解在无水吡啶(4mL)中，添加二甲氧基三苯基氯甲烷(286mg、844μmol)，室温下搅拌1.5小时。将反应溶液加到乙酸乙酯/水中，除去水层。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液清洗，用硫酸镁干燥，然后蒸馏除去溶剂。将所得粗生成物用硅胶色谱柱(0-0.5％CH3OH、CH2Cl2中)纯化，以无定形状物质的形式得到了三苯甲基化物。在30mL茄形烧瓶中，用无水吡啶使1-(2-脱氧-5-O-二甲氧基三苯甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(542mg、684μmol)共沸3次。将其溶解在无水吡啶(7mL)中，添加醋酸酐(169μL，1.79mmol)，室温下搅拌一晚。将反应溶液用乙酸乙酯稀释，将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，在硫酸镁上干燥，然后蒸馏除去溶剂。将所得粗生成物溶解在无水二氯甲烷(68mL)中，0℃下一边搅拌一边添加二氯醋酸(680μL)，搅拌15分钟。将反应溶液添加到饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷抽提水层，将合并的有机层在硫酸镁上干燥，然后蒸馏除去溶剂。将所得油状物质用硅胶色谱柱(2％CH3OH、CH2Cl2中)纯化，以无定形状物质的形式得到了目的物(328mg、77％，2步骤收率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ
9.39(brs，1H)，8.30(t，1H，J＝5.4Hz)，
7.94(d，1H，J＝2.2Hz)，7.33(d，1H，J＝2.2Hz)，
6.61(t，1H，J＝6.3Hz)，5.30-5.18(m，2H)，
4.20-4.10(m，1H)，4.06(d，2H，J＝5.4Hz)，
3.75-3.55(m，2H)，3.16(t，2H，J＝7.0Hz)，
2.62(ddd，1H，J＝3.0，6.0，14.2Hz)，
2.50-2.35(m，1H)，2.15-2.05(m，2H)，
2.07(s，3H)，1.60-1.40(m，4H)，
1.30-1.20(m，2H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C22H28F3N4O8(M+1)：计算值533.1859；测定值533.1907.
(3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5’-三磷酸(NH2-hx-dPnTP)(步骤(d))
在10mL茄形烧瓶中，用无水吡啶使1-(2-脱氧-3-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(53mg、100μmol)共沸3次，然后用氩气充满反应容器。向其中添加无水吡啶(100μL)和无水二噁烷(300μL)使之溶解，添加2-氯-4H-1，2，3-二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱(ジオキサホスホリン)-4-酮的1M二噁烷溶液(110μL、110μmol)，室温下搅拌10分钟，然后添加三-正丁基胺(100μL)和双(三正丁铵)焦磷酸的0.5M DMF溶液(300μL)，搅拌10分钟。添加1％碘/水/吡啶溶液(2mL)，室温下搅拌15分钟，添加5％亚硫酸氢钠水溶液(150μL)，然后减压浓缩反应溶液。向所得油状物质加水(5mL)，室温下搅拌30分钟，然后添加浓氨水(20mL)搅拌8小时。将其用DEAE Sephadex A-25色谱柱(1.5×30cm，浓度线性梯度；TEAB的50mM-1M溶液)和C18-HPLC(浓度梯度；x％-xx％乙腈的0.1M醋酸三乙铵缓冲液，pH7.0)进行纯化，得到了目的物。
1H NMR(300MHz，D2O)δ
7.79(s，1H)，7.31(s，1H)，
6.68(t，1H，J＝5.6Hz)，4.60-4.50(m，1H)，
4.30-4.00(m，5H)，3.13(q，18H，J＝7.3Hz)，
2.90(t，2H，J＝7.5Hz)，2.62-2.52(m，1H)，
2.46-2.30(m，1H)，2.24(t，2H，J＝7.0Hz)，
1.63-1.55(m，4H)，1.38-1.16(m，29H).
31P NMR(121MHz，D2O)δ
-8.26，-10.51，-22.05.
MS(ESI)
C18H28N4O15P3，[M-H]-：计算值633.08；测定值633.00.
(4)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-[6-(荧光素-5-羧酰胺基(カルボキサミド))己酰胺]-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5’-三磷酸(FAM-hx-dPnTP)(步骤(e))
将NH2-hx-dPnTP(6μmol)溶解在0.1M碳酸氢钠水溶液(pH8.5，0.72mL)中，添加5-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯(FAM-SE)(3.7mg，7.8μmol)的DMF溶液(500μL)，一边不时地振荡一边在避光条件下于室温反应8小时。向其中添加浓氨水(0.5mL)，不时振荡下反应5分钟。将其冻干后，用DEAE
Sephadex A-25色谱柱(1.5×30cm，浓度线性梯度；TEAB的50mM-1M溶液)和C18-HPLC(浓度梯度；0％-50％乙腈的0.1M醋酸三乙铵缓冲液，pH7.0)进行纯化，得到了目的物。
1H NMR(300MHz，D2O)δ
8.29(s，1H)，8.04(d，1H，J＝7.5Hz)，
7.58(brs，1H)，7.26(d，1H，7.5Hz)，
7.00-6.60(m，7H)，6.39(brs，1H)，
4.50-4.35(m，1H)，4.40-3.90(m，5H)，
3.50-3.30(m，2H)，3.12(q，18H，J＝7.3Hz)，
2.41-2.10(m，4H)，1.75-1.50(m，4H)，
1.45-1.10(m，29H).
31P NMR(121MHz，D2O)δ
-10.86，-10.86，-23.13.
MS(ESI)
C39H38N4O21P3[M-H]-：计算值991.12；测定值990.56
(5)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-[6-(罗丹明-X-5-羧酰胺)己酰胺]-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5’-三磷酸(ROX-hx-dPnTP)(步骤(e))
将NH2-hx-dPnTP(6μmol)溶解在0.1M碳酸氢钠水溶液(pH8.5，0.85mL)溶解中，添加5-羧基-X-罗丹明N-羟基琥珀酰亚胺酯(ROX-SE)(5mg、7.92μmol)的DMF溶液(1mL)，不时振荡下在避光条件下于室温反应18小时。向其中添加浓氨水(0.5mL)，不时振荡下反应5分钟。将其冻干后，用DEAE
Sephadex A-25色谱柱(1.5×30cm、浓度线性梯度；TEAB的50mM-1M溶液)和C18-HPLC(浓度梯度；12.5％-50％乙腈的0.1M醋酸三乙铵缓冲液，pH7.0)进行纯化，得到了目的物。
1H NMR(300MHz，D2O)δ
8.28(s，1H)，8.03(d，1H，J＝8.9Hz)，
7.47(s，1H)，7.19(d，1H，J＝7.7Hz)，
6.68(brs，1H)，6.55(brs，1H)，
6.43(brs，1H)，6.09(brs，1H)，
4.40-4.25(m，1H)，4.15-3.70(m，5H)，
3.60-3.27(m，10H)，3.12(q，18H，J＝7.3Hz)，
2.95-2.70(m，4H)，2.65-2.40(m，4H)，
2.40-2.15(m，3H)，2.05-1.70(m，9H)，
1.60-1.50(m，4H)，1.50-1.15(m，29H).
31P NMR(121MHz，D2O)δ
-10.90，-11.59，-23.27.
MS(ESI)
C51H56N6O19P3[M-H]-：计算值1149.28；测定值1148.77
实施例VIII NH2-hx-PaTP、FAM-hx-PaTP、TAMRA-hx-PaTP的合成
本实施例中，作为rPaTP相关的衍生物，按图47所示的合成方案合成了NH2-hx-PaTP、FAM-hx-PaTP、TAMRA-hx-PaTP。这些衍生物可以在例如转录中导入到RNA中。氨基衍生物可以用于导入后的RNA的修饰，其以外的荧光基团偶联的各衍生物可以用于RNA的荧光标记以及FRET等。
(1)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(图47的步骤(a))
在10mL茄形烧瓶中，用无水乙腈使1-(β-D-呋喃核糖基)-4-碘吡咯-2-甲醛(177mg、500μmol，含α异头物)共沸2次。添加碘化铜(15mg、80μmol))、四三苯基膦钯(0)(29mg，25μmol)，将其溶解在无水DMF(2.5mL)中，室温下一边搅拌一边添加三乙胺(105μL，750μmol)，避光条件下室温下搅拌。向其中滴加N-(2-丙炔基)-6-三氟乙酰胺基己酰胺(198mg、750μmol)的DMF(2mL)溶液，室温下搅拌一晚。减压下浓缩反应溶液，将所得粗生成物用硅胶色谱柱(10％CH3OH、CH2Cl2中)和C18-HPLC(22-24％CH3CN、H2O中、15分钟)纯化，以无定形状物质的形式得到了目的物(126mg、收率51％)。
1H NMR(270MHz，DMSO-d6)δ
9.52(d，1H，J＝0.66Hz)，9.38(brs，1H)，
8.27(t，1H，J＝5.3Hz)，7.96(s，1H)，
7.13(d，1H，J＝1.6Hz)，6.32(d，1H，J＝3.6Hz)，
5.42-5.32(brs，1H)，5.18-5.05(m，2H)，
4.08-3.95(m，4H)，3.90-3.84(m，1H)，
3.70-3.50(m，2H)，3.20-3.10(m，2H)，
2.08(t，2H，J＝7.3Hz)，1.55-1.40(m，4H)，
1.30-1.15(m，2H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C21H27F3N3O7(M+1)：计算值490.1801；测定值490.1815.
(2)1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(步骤(b)、(c))
在10mL茄形烧瓶中，用无水吡啶使1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(122mg，250μmol)共沸3次。将其溶解在无水吡啶(4mL)中，添加二甲氧基三苯基氯甲烷(89mg、263μmol)，室温下搅拌2.5小时。将反应溶液加到乙酸乙酯/水中，除去水层。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液清洗，用硫酸镁干燥后，蒸馏除去溶剂。将所得粗生成物用硅胶色谱柱(0-0.5％CH3OH、CH2Cl2中)纯化，以无定形状物质的形式得到了三苯甲基化物(150mg)。在10mL茄形烧瓶中，用无水吡啶使1-(5-O-二甲氧基三苯甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(149mg、188μmol)共沸3次。将其溶解在无水吡啶(2mL)中，添加醋酸酐(53μL，565μmol)，室温下搅拌一晚。将反应溶液用乙酸乙酯稀释，将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗，在硫酸镁上干燥，然后蒸馏除去溶剂。将所得粗生成物溶解在无水二氯甲烷(19mL)中，0℃下一边搅拌一边添加二氯醋酸(280μL)，搅拌15分钟。将反应溶液加到饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷抽提水层，将合并的有机层在硫酸镁上干燥，然后蒸馏除去溶剂。将所得油状物质用硅胶色谱柱(1-2.5％CH3OH、CH2Cl2中)纯化，以无定形状物质的形式得到了目的物(90mg、63％，2步骤收率)。
1H NMR(270MHz，DMSO-d6)δ
9.49(s，1H)，9.39(brs，1H)，
8.28(t，1H，J＝5.3Hz)，8.03(s，1H)，
7.21(d，1H，J＝1.6Hz)，6.63(d，1H，J＝5.3Hz)，
5.44(brs，1H)，5.40-5.28(m，3H)，
4.20-4.15(m，1H)，4.05(d，2H，J＝5.3Hz)，
3.80-3.56(m，2H)，3.20-3.10(m，2H)，
2.14-1.98(m，8H)，1.55-1.40(m，4H)，
1.30-1.15(m，2H).
HRMS(FAB，3-NBA matrix)
C25H31F3N3O9(M+1)：计算值574.2012；测定值574.2061.
(3)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(NH2-hx-PaTP)(步骤(d))
在10mL茄形烧瓶中，用无水吡啶使1-(2，3-二-O-乙酰-β-D-呋喃核糖基)-4-[(3-(6-三氟乙酰胺基己酰胺)-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛(57mg、100μmol)共沸3次，然后用氩气充满反应容器。向其中添加无水吡啶(100μL)和无水二噁烷(300μ)，使之溶解，添加2-氯-4H-1，2，3-二氧杂二乙氧磷酰硫胆碱-4-酮的1M二噁烷溶液(110μL、110μmol)，室温下搅拌10分钟，然后添加三-正丁基胺(100μL)和双(三正丁铵)焦磷酸的0.5M DMF溶液(300μL)，搅拌10分钟。添加1％碘/水/吡啶溶液(2mL)，室温下搅拌15分钟，添加5％亚硫酸氢钠水溶液(150μL)，然后减压浓缩反应溶液。向所得油状物质加水(5mL)，室温下搅拌30分钟，然后添加浓氨水(20mL)，搅拌8小时。将其用DEAE Sephadex A-25色谱柱(1.5×30cm，浓度线性梯度；TEAB的50mM-1M溶液)和C18-HPLC(浓度梯度；0％-50％乙腈的0.1M醋酸三乙铵缓冲液，pH7.0)纯化，得到了目的物。
MS(ESI)
C19H29N3O15P3[M-H]-：计算值632.08；测定值632.00
(4)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-(荧光素-5-羧酰胺)己酰胺]-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(FAM-hx-PaTP)(步骤(e))
将1/3量的上述合成的NH2-hx-PaTP溶解在0.1M碳酸氢钠水溶液(pH8.5、2.5mL)中，添加5-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯(9mg、19μmol)的DMF溶液(200μL)，不时振荡下避光条件下于室温反应9小时。向其中添加浓氨水(1mL)，不时振荡下反应1小时。将其冻干后，用DEAE Sephadex
A-25色谱柱(1.5×30cm，浓度线性梯度；TEAB的50mM-1M溶液)和C18-HPLC(浓度梯度；0％-50％乙腈的0.1M醋酸三乙铵缓冲液，pH7.0)纯化，得到了目的物。
1H NMR(300M[Hz，D2O)δ
9.07(s，1H)，8.20(s，1H)，
7.93(d，1H，J＝7.9Hz)，7.62(brs，1H)，
7.13(d，1H，J＝7.9Hz)，7.00-6.60(m，7H)，
6.10(d，1H，J＝3.2Hz)，4.25-3.80(m，7H)，
3.40-3.20(m，2H)，3.04(q，18H，J＝7.3Hz)，
2.16(t，2H，J＝6.4Hz)，1.65-1.45(m，4H)，
1.40-1.00(m，29H).
31P NMR(121MHz，D2O)δ
-10.90，-11.38，-23.25.
MS(ESI)
C40H39N3O21P3[M-H]-：计算值990.13；测定值989.78.
(5)1-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-(四甲基罗丹明-5-羧酰胺)己酰胺]-1-丙炔基]吡咯-2-甲醛5’-三磷酸(TAMRA-hx-PaTP)(步骤(e))
将1/3量的上述合成的NH2-hx-PaTP溶解在0.1M碳酸氢钠水溶液(pH8.5，2.5mL)中，添加5-羧基四甲基罗丹明N-羟基琥珀酰亚胺酯(TAMRA-SE)(10mg、19μmol)的DMF溶液(1mL)，不时振荡下避光条件下于室温反应9小时。向其中添加浓氨水(1mL)，不时振荡下反应8小时。将其冻干后，用DEAE Sephadex A-25色谱柱(1.5×30cm，浓度线性梯度；TEAB的50mM-1M溶液)和C18-HPLC(浓度梯度；12.5％-50％乙腈的0.1M醋酸三乙铵缓冲液，pH7.0)纯化，得到了目的物。
1H NMR(300MHz，D2O)δ
9.07(s，1H)，8.26(s，1H)，
8.02(d，1H，J＝7.9Hz)，7.69(s，1H)，
7.35(d，1H，J＝7.9Hz)，7.10(d，1H，J＝9.4Hz)，
7.01(d，1H，J＝9.4Hz)，6.88-6.70(m，3H)，
6.39(d，2H，J＝9.2Hz)，6.06(d，1H，J＝3.5Hz)，
4.20(t，1H，J＝4.9Hz)，4.10-3.80(m，6H)，
3.55-3.30(m，2H)，3.25-3.00(m，30H)，
2.25(t，2H，J＝6.3Hz)，1.75-1.55(m，4H)，
1.40-1.10(m，29H).
31P NMR(121MHz，D2O)δ-10.84，-11.56，-23.22.
MS(ESI)
C44H49N5O19P3[M-H]-：计算值1044.22；测定值1044.09.
实施例IX通过使用克列诺片段的复制将氨基、荧光染料偶联的底物 Pn导入DNA(55-mer)中
在本实施例中，使用通过接头结合了氨基、荧光染料(FAM)的底物Pn(NH2-hx-dPnTP、FAM-hx-dPnTP)(实施例VII中制备的)，考察了复制中这些底物向DNA中的掺入。
具体地，采用了以下实验方法。在包含下述双链的溶液(10μl)中混合灭菌水稀释的脱氧核苷三磷酸溶液(5μl)和缺失3’-5’外切核酸酶活性的克列诺片段(2U、5μl)，进行引物延伸反应(20μl规模)，其中，所述双链由在各种位置在含有Ds的模板链DNA(Template，55-mer；1Ds，2Ds，3Ds，4Ds，5Ds(序列番号33-37)或对照(序列番号38))与用荧光素荧光标记的引物(Primer，20-mer)构成。反应是在50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、0.05mg/ml BSA中，使用200nM模板-引物、100μM或200μM dNTPs(N＝A，G，C，T)、10μM NH2-hx-dPnTP或FAM-hx-dPnTP、0.1μU/μl克列诺片段(GE Healthcare)进行的。37℃反应5分钟后，向该溶液中添加10M尿素(20μl)，终止反应。将该溶液于75℃加热3分钟，然后，将反应产物用10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳进行了分析。利用荧光影像分析仪(MolecularImager、BioRad、FAM检测型)检测了反应产物的条带。
结果如图48B及C所示。与不存在Pn的修饰底物时相比，当存在NH2-hx-dPnTP(图48B及C)或FAM-hx-dPnTP(图48C)时，全长产物的量增加，因此可知：这些修饰dPnTP与模板链DNA中的Ds互补，从而掺入到DNA中。
实施例X T7通过使用RNA聚合酶的转录将荧光染料偶联的底物Pa 导入RNA(17-mer)中
本实施例中，使用通过接头与荧光染料(FAM或者TAMRA)结合的底物Pa(FAM-hx-PaTP，TAMRA-hx-PaTP)(实施例VIII制备的)，考察了转录中这些底物向RNA中的掺入。
具体地，采用了以下实验方法。在含10mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)中，进行模板DNA(35-mer，10μM)与其启动子部分的互补链DNA(21-mer、10μM)的退火。转录反应是在40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、24mM MgCl2、2mM亚精胺、5mM DTT、0.01％TritonX-100中，使用2μCi[γ-32P]GTP、1mM NTPs、1mM FAM-，或TAMRA-hx-PaTP、2μM模板DNA、和50单位T7RNA聚合酶(Takara)进行的。37℃反应3小时后，向该溶液中添加10M尿素(20μL)终止反应。将该溶液于75℃加热3分钟，然后，用20％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析了转录物。
结果如图49。只在使用含Ds的模板DNA时，电泳上、转录物(17-mer)条带的移动速度变慢，因此可知：这些修饰PaTP与模板中的Ds互补，从而被导入到RNA中。在转录效率方面，与仅有天然型的对照实验(图49中右侧的None泳道)相比，FAM-hx-PaTP为14％、TAMRA-hx-PaTP为10％。
工业实用性
本发明人等开发了在复制和转录中具有实用水平的高选择性的非天然型碱基对系统，这使得创造一种新的生物技术来扩展遗传字母表成为可能。疏水性Ds-Pa碱基对能够PCR扩增含有它的DNA片段。进一步，利用Ds-Pa碱基对，能够在通常的T7转录中将Ds和Pa部位特异性地导入到RNA中。因此，该系统提供了制造新功能性人工DNA和RNA的新型技术。而且，在科学上，修饰底物和疏水性碱基对对于复制和转录机制的进一步阐明同样是重要的。
在复制中，为了防止形成Ds-Ds、天然型-非天然型碱基对等不希望的碱基配对，本发明人等通过5’-γ-三磷酸酰胺和常规5’-三磷酸的组合实现了非天然型碱基配对的高选择性。5’-γ-三磷酸酰胺作为识别配对碱基间的正确互补性的DNA聚合酶的底物是有用的。最近，有报道称：另一种5’-γ-修饰三磷酸即5’-γ-P-氨基萘-5-磺化(スルフオネ一ト)三磷酸改善了逆转录的保真度(非专利文献38)。这些发现提示：对于DNA聚合酶识别γ-修饰三磷酸来说，与通常的三磷酸底物的几何学匹配相比，配对碱基间的正确几何学匹配更为必要。5’-γ-三磷酸酰胺和3’→5’具有外切核酸酶活性的聚合酶的组合对其它非天然型碱基对同样适用。
Ds-Pa碱基对提供了疏水性碱基对在转录中发挥功能的第一个例子，这提示：正如已经在复制中显示的那样，疏水性碱基对在转录中，配对碱基间的形状互补性也是重要的。
Ds-Pa碱基对系统对于创造新型功能性RNA分子是非常有用的。4-丙炔基吡咯-2-甲醛(Pa’)同样可以与模板中的Ds互补性地、部位特异性地导入到RNA中，因此，4位修饰的一系列Pa碱基衍生物同样可以导入到RNA中。此时，模板DNA可以通过含Ds-Pa碱基对的DNA片段的PCR扩增获得。因此，Ds-Pa碱基对系统是制造在任意位置导入了功能性人工元件的核酸的强有力工具。
序列表
<110>独立行政法人理化学研究所(RIKEN)
<120>核酸的复制方法及新型人工碱基对
<130>PC/R-6-10
<150>JP2005-356883
<151>2005-12-09
<160>41
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于复制的合成引物
<400>1
actcactata gggagcttct  20
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>7
<223>n表示下面中的任意一个：
2-甲酰-1H-吡咯-1-基，
2-甲酰-4-(1-丙烯基)-1H-吡咯-1-基，
腺嘌呤，
鸟嘌呤，
胸腺嘧啶
胞嘧啶
<220>
<223>用于复制的合成模板链
<400>2
tcgaganaga agctccctat agtgagtcgt attat    35
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于复制的合成引物
<400>1
actcactata gggaggaaga    20
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>7
<223>n表示下面中的任意一个：
7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基，
腺嘌呤，
鸟嘌呤，
胸腺嘧啶
胞嘧啶
<220>
<223>用于复制的合成模板链
<400>4
agctctntct tcctccctat agtgagtcgt attat    35
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于复制的合成引物
<400>5
actataggga gcttct    16
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于复制的合成引物
<400>6
actataggga ggaaga    16
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于复制的合成引物
<400>7
ataatacgac tcactatagg gag    23
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于转录的合成非模板链
<400>8
ataatacgac tcactatagg g    21
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>5
<223>n表示下面中的任意一个：
7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基，
腺嘌呤，
鸟嘌呤
<220>
<223>用于转录的合成模板链
<400>9
cactnctcgg gattccctat agtgagtcgta ttat    35
<210>10
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>5
<223>n表示下面中的任意一个：
2-甲酰-1H-吡咯-1-基，
2-甲酰-4-(1-丙烯基)-1H-吡咯-1-基，
胸腺嘧啶
胞嘧啶
<220>
<223>用于转录的合成模板链
<400>10
ctcanaggga agctccctat agtgagtcgt attat    35
<210>11
<211>17
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>13
<223>n表示下面中的任意一个：
2-甲酰-1H-吡咯-1-基，
2-甲酰-4-(1-丙烯基)-1H-吡咯-1-基，
尿嘧啶
胞嘧啶
<220>
<223>RNA转录物
<400>11
gggaaucccg agnagug    17
<210>12
<211>17
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>13
<223>n表示下面中的任意一个：
7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基，
腺嘌呤，
鸟嘌呤
<220>
<223>RNA转录物
<400>12
gggagcuucc cunugag    17
<210>13
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>79...83
<223>nnnnn表示下面中的任意一个：
胞嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>13
gaaattaata cgactcacta tagggttaac tttaagaagg agatatacca tgggctccaa    60
ga agccggtc cccatcatnn nnngcaaccg c  91
<210>14
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>68...72
<223>nnnnn表示下面中的任意一个：
腺嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-鸟嘌呤
腺嘌呤-胞嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤-鸟嘌呤
腺嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>14
tttcacacag gaaacagcta tgacccgggt tattacatgc gctggcactt gcccgtacgg    60
cggttgcnnn nnatgatggg g  81
<210>15
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>15
gaaattaata cgactcacta tagggttaac tttaagaagg agatatacca tgggctccaa    60
gaagcc  66
<210>16
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>13...17
<223>nnnnn表示下面中的任意一个：
胞嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-腺嘌呤-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-胞嘧啶-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-鸟嘌呤-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-鸟嘌呤-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-胸腺嘧啶-胞嘧啶，
胸腺嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤-胸腺嘧啶，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>16
ggtccccatc atnnnnngca accgccgtac gggcaagacg cagcgcg  47
<210>17
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>17
ggggttctca tcatcatcat catcattaat aacccgggtc atagctgttt cctgtgtgaa    60
a    61
<210>18
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>18
tttcacacag gaaacagcta tgacccgggt tattaatgat gat gatgatg atgagaaccc    60
ccgcgctgcg t  71
<210>19
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>21...25
<223>nnnnn表示下面中的任意一个：
腺嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-鸟嘌呤，
腺嘌呤-胞嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤-鸟嘌呤，
腺嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-鸟嘌呤，
腺嘌呤-胞嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤-鸟嘌呤，
腺嘌呤-鸟嘌呤-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-胸腺嘧啶-鸟嘌呤，
腺嘌呤-腺嘌呤-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-胞嘧啶-鸟嘌呤，
鸟嘌呤-腺嘌呤-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-胞嘧啶-鸟嘌呤，
腺嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤，
腺嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤，
腺嘌呤-鸟嘌呤-胸腺嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>19
cttgcccgta cggcggttgc nnnnnatgat ggggaccggc ttcttggagc    50
<210>20
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>20
ccatggtata tctccttctt aaagttaacc ctatagtgag tcgtattaat tt c    53
<210>21
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>54...58
<223>nnnnn表示下面中的任意一个：
胞嘧啶-胸腺嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤-腺嘌呤，
胞嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤-腺嘌呤，
胞嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤，
胞嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>21
gataatacga ctcactatag gtggggttcc cgagcggcca aagggagcag ac tnnnnntc    60
tgccgtc    67
<210>22
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>1
<223>n表示tm
<220>
<221>misc_feature
<222>2
<223>n表示gm
<220>
<221>misc_feature
<222>47...51
<223>nnnnn表示下面中的任意一个：
胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤-鸟嘌呤，
胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-鸟嘌呤，
胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤-鸟嘌呤，
胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-2-甲酰-1H-吡咯-1-基-鸟嘌呤，
胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>22
nngtggtggg ggaaggattc gaaccttcga agtctgtgac ggcagannnn nagtctgctc    60
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR和测序的合成引物
<400>23
gaaattaata cgactcacta taggg    25
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR和测序的合成引物
<400>24
tttcacacag gaaacagcta tgac    24
<210>25
<211>86
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>35...37
<223>nnn表示下面中的任意一个：
胞嘧啶-尿嘧啶-2-甲酰-4-(1-丙烯基)-1H-吡咯-1-基，
胞嘧啶-2-甲酰-4-(1-丙烯基)-1H-吡咯-1-基-腺嘌呤，
胞嘧啶-尿嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基，
胞嘧啶-7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基-腺嘌呤，
胞嘧啶-尿嘧啶-腺嘌呤
<220>
<223>RNA转录物
<400>25
ggugggguuc ccgagcggcc aaagggagca gacunnnaau cugccguca ucgacuucga    60
agguucgaau ccuuccccca ccacca    86
<210>26
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>26
gaaattaata cgactcacta tagggccaac cagaagaagg agacagacca agggcaccaa    60
gaagcc    66
<210>27
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>27
ggaccccaac aacaygagca accgccgaac gggcaagacg cagcgcg    47
<210>28
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>28
ggggaacaca acagcaccaa cagcaccaac aacccgggac aaagcagcaa ccagggagaa    60
a    61
<210>29
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>29
ccttggtctg tctcc ttctt ctggttggcc ctatagtgag tcgtattaat ttc    53
<210>30
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>30
cttgcccgtt cggcggttgc tcrtgttgtt ggggtccggc ttcttggtgc    50
<210>31
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的合成DNA片段，测序和转录
<400>31
tttctccctg gttgctgctt tgtcccgggt tgttggtgct gttggtgctg ttgtgttccc    60
ccgcgctgcg t    71
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于复制的合成DNA片段
<400>32
gataatacga ctcactatag
<210>33
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>28
<223>n表示7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基
<220>
<223>用于复制的合成DNA片段
<400>33
gcagtgaaga attcgcttag atgtggancc attccctata gtgagtcgta ttatc  55
<210>34
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_featurc
<222>25
<223>n表示7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基
<220>
<223>用于复制的合成DNA片段
<400>34
gcagtgaaga attcgcttag atgtngatcc attccctata gtgagtcgta ttatc  55
<210>35
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>21
<223>n表示7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基
<220>
<223>用于复制的合成DNA片段
<400>35
gcagtgaaga attcgcttag angtggatcc attccctata gtgagtcgta ttatc    55
<210>36
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>31
<223>n表示7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基
<220>
<223>用于复制的合成DNA片段
<400>36
gcagtgaaga attcgcttag atgtggatcc nttccctata gtgagtcgta ttatc  55
<210>37
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>34
<223>n表示7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基
<220>
<223>用于复制的合成DNA片段
<400>37
gcagtgaaga attcgcttag atgtggatcc attncctata gtgagtcgta ttatc  55
<210>38
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于复制的合成DNA片段
<400>38
gcagtgaaga attcgcttag atg tggatcc attccctata gtgagtcgta ttatc  55
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于转录的合成DNA片段
<400>39
ataatacgac tcactatagg g    21
<210>40
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>5
<223>n表示7-(2-噻嗯基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基或腺嘌呤
<220>
<223>用于转录的合成DNA片段
<400>40
cactnctcgg gattccctat agtgagtcgt attat    35
<210>41
<211>17
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>13
<223>n表示下面中的任意一个：
2-甲酰-4-[3-[6-(荧光素-5-羧酰胺基)己酰胺]-1-丙烯基]-1H-吡咯-1-基，
2-甲酰-4-[3-[6-(四甲基罗丹明-5-羧酰胺基)己酰胺]-1-丙烯基]-1H-吡咯-1-基，
<400>41
gggaaucccg agnagug    17

Claims (15)

1.一种核酸，其中具有用式1表示的碱基的核苷酸与具有用式2表示的碱基的核苷酸形成碱基对：
式1
化学式3.
Figure FSB00000653789300011
此处，R1为氢或氨基，R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A为N或CH；
式2
化学式4.
Figure FSB00000653789300012
此处，R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且，R4为甲酰基或硝基。
2.权利要求1的核酸，其中，式1的碱基选自下组：
A1)7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A2)7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A3)7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A4)5-氨基-7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A5)5-氨基-7-(2-噻唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A6)5-氨基-7-(1H-2-咪唑基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基；
A7)4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；
A8)4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；
A-9)4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基：
A-10)6-氨基-4-(2-噻吩基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；
A-11)6-氨基-4-(2-噻唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基；及
A-12)6-氨基-4-(1H-2-咪唑基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-1-基。
3.权利要求1的核酸，其中式2的碱基选自下组：
B1)2-甲酰基-1H-吡咯-1-基；
B2)2-甲酰基-4-碘-1H-吡咯-1-基；
B3)2-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；
B4)2-甲酰基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B5)2-甲酰基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；
B6)2-甲酰基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B7)2-硝基-1H-吡咯-1-基；
B8)2-硝基-4-碘-1H-吡咯-1-基；
B9)2-硝基-4-甲基-1H-吡咯-1-基；
B10)2-硝基-4-(1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基；
B11)2-硝基-4-(2-取代氨基乙烯基)-1H-吡咯-1-基；及
B12)2-硝基-4-(3-取代氨基-1-丙炔-1-基)-1H-吡咯-1-基。
4.权利要求1～3任一项的核酸，其中在转录、逆转录、复制或翻译步骤中形成碱基对。
5.包含具有用式1表示的碱基的核苷酸的核酸的制备方法，其中，以包含具有用式2表示的碱基的核苷酸的核酸作为模板，进行转录、逆转录或复制，在所述具有式2的碱基的核苷酸的互补位置掺入所述具有式1的碱基的核苷酸：
式1
化学式5.
Figure FSB00000653789300021
此处，R1为氢或氨基，R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A为N或CH；
式2
化学式6.
Figure FSB00000653789300031
此处，R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且，R4为甲酰基或硝基。
6.包含具有式2表示的碱基的核苷酸的核酸的制备方法，其中，以包含具有式1表示的碱基的核苷酸的核酸作为模板，进行转录、逆转录或复制，在所述具有式1的碱基的核苷酸的互补位置掺入所述具有式2的碱基的核苷酸：
式2
化学式7.
此处，R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且，R4为甲酰基或硝基；
式1
化学式8.
Figure FSB00000653789300033
此处，R1为氢或氨基，R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A为N或CH。
7.包含具有式1及/或式2的碱基的核苷酸的核酸，其是采用权利要求5或6的方法制备的。
8.权利要求7的核酸，其为tRNA、mRNA、反义DNA或RNA、核酶、适体或siRNA。
9.具有式1表示的碱基的核糖核苷5’-三磷酸：
式1
化学式9.
Figure FSB00000653789300041
此处，R1为氢或氨基，R2为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A为N或CH。
10.具有式2表示的碱基的核糖核苷5’-三磷酸：
式2
化学式10.
Figure FSB00000653789300042
此处，R3为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且，R4为甲酰基或硝基。
11.具有式3表示的碱基的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷：
式3
化学式11.
Figure FSB00000653789300043
此处，R5为氢或取代的氨基，R6为取代的或非取代的2-噻吩基、取代的或非取代的2-噻唑基、或者取代的或非取代的1H-2-咪唑基，而且，A为N或CH。
12.具有式4表示的碱基的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷：
式4
化学式12
Figure FSB00000653789300051
此处，R7为选自氢、碘基、取代的或非取代的C1-C3烷基、取代的或非取代的C2-C3烯基、或者取代的或非取代的C2-C3炔基的基团，而且，R8为甲酰基或硝基，
但不包括R7为氢或1-丙炔基且R8为甲酰基的情况。
13.采用权利要求6的方法制备的、包含具有式2表示的碱基的核苷酸的核酸，其中，式2的取代基R3为用生物素或荧光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
14.权利要求10的核糖核苷5’-三磷酸，其中，R3为用生物素或荧光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
15.权利要求12的5’-O-(4、4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-(2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)脱氧核糖核苷，其中，R7为用生物素或荧光分子取代的C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
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