JPH09505736A

JPH09505736A - ヌクレオシド類似体法

Info

Publication number: JPH09505736A
Application number: JP7515489A
Authority: JP
Inventors: スミス，クリフォード; フラー，カール
Original assignee: アマーシャム・インターナショナル・ピーエルシー
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 1997-06-10
Also published as: EP0731846B1; US5702925A; DK0731846T3; EP0731846A1; DE69416860T2; WO1995015395A3; WO1995015395A2; DE69416860D1; CA2174942A1; ATE177151T1

Abstract

(57)【要約】反応を触媒するキナーゼまたはリン酸基転移酵素の存在下、相当するジデオキシヌクレオシドを、所望により放射性標識されたヌクレオチドリン酸またはチオリン酸供与体と反応させることを含む、所望により³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓ放射性標識されている、ジデオキシヌクレオシド１−または３−リン酸リン酸をつくる方法。同位体ラベルされた連鎖終結ヌクレオチド類似体を用いることにより酵素的に合成された産物の検出を含む、チェーンターミネーション法による核酸配列の決定方法。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオシド類似体法 [α−³²P]ジデオキシアデノシン３リン酸は商業的に入手可能である。現在の化学合成法は非常に非効率的である。本発明は効率を向上させる、酵素的調整法を提供する。方法はこれの他にも幅広い化合物に応用可能である。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ＰＮＫ）は通常、ＡＴＰからガンマリン酸基を転移することによる、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、または２−デオキシヌクレオシド−３−モノフォスフェート（またはリボ）の５’−ＯＨ基のリン酸化を担う（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２１４，３３８−３４０，１９９３）。一般にＴ４ＰＮＫがヌクレオシドの５’−ＯＨ基をリン酸化するためにはヌクレオシドは５’−ＯＨ基及び３’−リン酸基をもっていなくてはならないと信じられている。３’−リン酸基は２’,３’−ジデオキシヌクレオシド及びその他の既知の連鎖終結因子には明らかに存在しないため、Ｔ４ＰＮＫにこれらのリン酸化を触媒させることは不可能であるとこれまでは考えられてきた。本発明はＴ４ＰＮＫはこの反応を触媒することが可能であるという、われわれの驚くべき発見に由来する。本発明はこの反応及び関係する反応を触媒する、Ｔ４ＰＮＫ及び他の酵素の使用を含む。核酸の配列決定のための既知のキットは４種類全てのヌクレオチドの供給及び４種類全ての２’,３’−ジデオキシヌクレオチドの供給、並びに電気泳動により配列決定をする際反応産物を検出するための標識（一般的には放射性標識）された１種類のヌクレオチドの供給からなる。他の側面において、本発明はジデオキシヌクレオチドの放射性標識により、より向上した結果が得られることの実現に基づいている。蛍光標識された連鎖終結因子（ｄｄＮＴＰ）を含むキットが知られているが、同位元素により標識されたｄｄＮＴＰの方が、ポリメラーゼ反応、ゲル移動度に影響を与えにくい構造をしており、検出に複雑な装置を必要としない。一つの側面として、本発明は５’−リン酸または５’−チオリン酸基を有するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド付加物を生成する方法を提供する。この方法は５’−ＯＨ基をもつが３’−リン酸基をもたない、開始ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体またはヌクレオシド付加物と、ヌクレオチドリン酸またはチオリン酸供与体を、触媒する酵素の存在下で反応させることからなる。ヌクレオシドは未修飾のリボまたはデオキシリボヌクレオシド、例えば２’デオキシアデノシンでもよい。ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体またはヌクレオシド付加物は非標識物であり、リン酸供与体もまた非標識であることも可能である。この方法は、ある環境においては開始物質にダメージを与えるかもしれない化学リン酸化剤を使用する必要なしに、相当するヌクレオシドを生産する。または、ヌクレオシドは検出可能な同位元素、例えば³Ｈまたは¹⁴Ｃのような放射性同位元素によって標識可能であり、非標識リン酸供与体またはチオリン酸供与体により相当する標識ヌクレオチドに変換可能である。好ましくは、ヌクレオチドリン酸またはチオリン酸供与体は検出可能な同位体、例えば³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性同位元素により放射性標識されており、それにより、得られるヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド付加物は³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓを含む、５’−リン酸基または５’−チオリン酸基を有しているために放射性標識される。ヌクレオシド類似体という語はヌクレオシドに類似しており、少なくともヌクレオシドの生化学的機能のいくつかを行うことが可能な化合物を定義しており、単量体及び多量体を含む。以下はヌクレオシド類似体の完全ではない表である。塩基修飾２−アミノアデノシン５−ブロモシトシン５−メチルシトシン５−（１−プロピニル）シトシン５−（１−プロピニル）ウラシル５−アミノアリルウラシル５−アミノアリルウラシル−”標識” チオウラシル/チオチミン/チオグアニンアジリジン誘導体糖修飾２’−Ｏ−アルキル（例えばアリルまたはメチル）２’−フルオロ２’−アミノ２’−デオキシ３’−デオキシ３’−”標識” ３’−フルオロ３’−アミノ３’−アジド２’,３’−非飽和塩基及び糖修飾の組み合わせリン酸修飾リン酸チオ塩リン酸ジチオ塩水素化リン酸塩メチルリン酸塩リン酸トリエステルリン酸アミダイトメチレン架橋派生物修飾骨格５’ヒドロキシルと等価になるように、例えばＨＯ.ＣＨ₂.ＣＨ₂.ＮＣＨ₂.ＣＨ₂.ＮＨ［ＣＯ.ＣＨ₂.ＮＣＨ₂.ＣＨ₂.ＮＨ］ＣＯ.ＣＨ₂.塩基ＣＯ.ＣＨ₂.塩基の構造式をもつように修飾されたポリアミド核酸（ＰＮＡ）（ポリアミド核酸（ＰＮＡ）についてはＰ．Ｅ．Ｎｅｉｌｓｅｎ，ＳｃｉｅｎｃｅＶｏｌｕｍｅ２５４，６Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１９９１，ＲｅｐｏｒｔｓＰａｇｅｓ１４９７−１５００を参照）。アンチセンス及びアンチジーンオリゴヌクレオチドはヌクレオシド類似体の他の例を提供する。本発明が関する、好ましい、そして最も重要なヌクレオシド類似体は４種類の２’,３’−ジデオキシヌクレオシド、ｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧおよびｄｄＴである。ヌクレオシド付加物という語は反応体とＤＮＡまたはＲＮＡとの相互作用の結果得られる化合物を定義する。そのような反応体は発癌性化合物またはその代謝物、及び電磁放射によって生じたフリーラジカルを含んでいる。ヌクレオシド付加物を高感度で検出することは、生物を核酸を修飾するような薬剤への露出を検討する場合において非常に重要である。ヌクレオシド付加物の例として、ポリサイクリック芳香族炭水化物（ＰＡＨ）とグアノシンのＮ２との反応産物、芳香族アミン及び酸素ラジカルとグアノシンのＣ８との反応産物、アルキル化剤とグアノシンのＮ７及びＯ６との反応産物及びマイコトキシンとグアノシンのＮ７との反応産物を含む。この方法に用いられる好ましい酵素はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのようなポリヌクレオチドキナーゼ酵素（ＰＮＫ）である。この酵素は３７℃、ｐＨ８. ５という標準的な反応条件下での、３’−ｄＮＭＰの[ガンマ³²Ｐ]−ＡＴＰ及びＰＮＫによるリン酸化を含む反応による³²Ｐ５’−ｄＮＭＰの調製に広く用いられている。発明者は、この酵素を用いて２’,３’−ジデオキシヌクレオシド（３’−フォスフェートを欠いている）の[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰによるリン酸化を試みたが、成功しなかった。しかしながら驚くべき事に、低い温度及び/あるいは低いｐＨの条件を用いることにより、これに成功した。好ましい温度範囲は４ −３０℃であり、１８℃から３０℃のあいだがより好ましい。好ましいｐＨの範囲は４.０−９.０である。高塩濃度、例えば１５０ｍＭまでのＮａＣｌが目的の反応の促進に有効であると思われる。これらの条件下での１０分から２４時間の範囲での反応物のインキュベーションにおいては、より長い反応時間により、より高い収率が得られる。３’フォスファターゼ活性が実質的に除去されている、フォスファターゼ活性を持たないＴ４ＰＮＫの使用は、ヌクレオシド１リン酸の収率を減少させる副反応を除去するのに有効であるかもしれない。本発明の方法に用いることのできる別の酵素はオオムギの種子から抽出されたリン酸基転移酵素（Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.，２５７，Ｎｏ.９，ｐｐ４９３１− ９，１９８２）である。この酵素は２つの活性を持っている：一つはヌクレオシド−５’−モノフォスフェートから他の全てのヌクレオシド、好ましくはプリンデオキシヌクレオシドリン酸受容体、の５’−ヒドロキシル基へとリン酸を転移するリン酸基転移酵素活性である。この酵素は現在知られている限りにおいては２’,３’−ジデオキシヌクレオシドのリン酸化に用いられた前例はない。この酵素のもう一つの活性は、リン酸−酵素反応中間体はリン酸をヌクレオシド受容体よりも水に転移し、無機リン酸を生成するという活性である。ｐＨを変化させること、供与体と受容体の比、及び酵素が利用することのできる水を取り除くための塩を加えることにより酵素活性を制御することが可能である。好ましい使用条件は５から３０℃、ｐＨ４から９、特に、７から８.５、である。この方法は次にリン酸供与体として利用される５’−ＮＭＰの導入を必要とする。５’−ＵＭＰが好ましい５’−ＮＭＰである。さらに、別のリン酸基転移酵素は子牛胸腺に由来するものである。ヌクレオチド類似体は少なくとも一つの５’−リン酸基又は５’−チオリン酸基をもつヌクレオシド類似体である。ヌクレオチドリン酸基及びチオリン酸基供給体は当該技術分野においてよく知られている。ヌクレオチドリン酸供与体の好ましい例はＡＴＰ、５’−ＵＭＰ、ＡＴＰ−ガンマＳ、５’−ＵＭＰαＳである。これらの供与体は、標識がリン酸基またはチオリン酸基と共にヌクレオシド類似体に転移されるように、³²Ｐ、³³ Ｐ，及び³⁵Ｓにより放射性標識されていてもよい。好ましいヌクレオチドリン酸供与体は[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰである。ＰＮＫを用いた、この供与体と２’,３’ −ジデオキシヌクレオシドとの反応は５’−[α³²Ｐ]ヌクレオシド１リン酸を産出する。これらのヌクレオシド１リン酸は既知の方法により、容易に、そして効率的に相当する３リン酸に変換されうる。³³Ｐまたは³⁵Ｓの使用により、対応する[α³ ³ Ｐ]または[α³⁵Ｓ]ジデオキシヌクレオシド３リン酸をつくることが出来る。ヌクレオシドをリン酸化するために酵素を使用する場合、大過剰量の選択したヌクレオチドリン酸（またはチオリン酸）供与体を提供するのが通常であり、有効であり、そのことは反応を目的の方向に向かわせる効果をもつ。ヌクレオチドフォスフェート（又はチオフォスフェート）供給体が放射標識される場合、大量の供給は実用可能でない。結果として、目的の放射性標識ヌクレオチドを収率よく得るためには、反応条件はより厳密になる。別の側面として、本発明は４種類それぞれの検出可能な同位体で標識された連鎖終結ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体の供給を含む、核酸の配列決定の為のキットを提供する。好ましくはこのキットは、[α³²Ｐ]及び/または[α³³ Ｐ]及び/または[α³⁵Ｓ]連鎖終結ヌクレオチド類似体（例えばジデオキシヌクレオシド）、並びにポリメラーゼ酵素（例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）、４種類それぞれのｄＮＴＰｓの供給、そしてＭｎ²⁺を含むバッファーから成る。標識ｄｄＮＴＰｓの供給は、バックグラウンドの減少とより均一なバンドの強度のため、向上した正確さをもつ有力な配列決定法に使用されるべきである。本発明の別の側面として、連鎖終始因子として検出可能な同位体で標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を用い、酵素的合成産物を検出可能な同位体により検出することからなる、チェーンターミネーション法による塩基配列の決定法を提供する。ゲル電気泳動による分離後の、チェーンターミネーションＤＮＡ塩基配列産物の検出はいくつかの方法によって達成される。原型の方法は新規に合成されたＤＮＡを内部標識するための[α−³²Ｐ]ｄＡＴＰの使用を含む。同様に、放射性標識オリゴヌクレオチド配列決定用プライマーも使用可能である。より最近では、蛍光標識されたプライマー及びヌクレオチドもまた、蛍光産物を検出するための高価な、感度の高い機械と共に用いられている。これらの方法は全てのＤＮＡ鎖が正確、確実にジデオキシヌクレオチドによって終結されている様に注意が払われる場合にのみ有効である。３’端がデオキシヌクレオチドによって終結しているどんな鎖も最終的な電気泳動展開におけるバックグラウンドの要因になる。そのような終結はポリメラーゼが十分に高い伸長活性を持たなかった場合、または鋳型が強固な二次構造を取っている場合に起こり得る。そのような非特異的な停止は一般に配列決定実験中に起こり、通常誤解読となる結果、または影響を受けた塩基を正しく解読するために再配列決定が必要となる結果を引き起こす。連鎖終始ジデオキシヌクレオチドに結合された蛍光色素を用いる、いくつかの好結果を得ている方法もある（Ｐｒｏｂｅｒｅｔａｌ，Ｌｅｅ，ＬＧ，Ｃｏｎｎｅｌｌ，ＣＲ，Ｗｏｏ，ＳＬ，Ｃｈｅｎｇ，ＲＤ，ＭｃＡｒｄｌｅ，ＢＦ，Ｆｕｌｌｅｒ，ＣＷ，Ｈａｌｌｏｒａｎ，ＮＤ＆Ｗｉｌｓｏｎ，ＲＫ，(１９９２)，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，２４７１−２４８３．）。これらの方法は標識が直接連鎖終始を引き起こす分子に結合しているという利点を持つ。偽のあるいはバックグラウンドの終結は、もしそれが起こった場合にも、蛍光検出機によって検出される事はない。これらの方法には二つの欠点がある。一つには色素付加ジデオキシヌクレオシド３リン酸は一般的に、非付加ジデオキシヌクレオチドのようなＤＮＡポリメラーゼの効率の良い基質ではない。これらは比較的高濃度で使用しなくてはならず、これらの反応速度は部分部分の配列の周囲状況によって変化し、非付加ヌクレオチドの場合程、均一のバンド（またはピーク）強度にならない。二つ目に、蛍光付加ＤＮＡを検出する為の装置は、伝統的なオートラジオグラムの検出に必要な装置と比較して、複雑で高価である。本発明は高価な検出装置や、ＤＮＡポリメラーゼの反応性の減少という欠点なしに、検出可能な標識を連鎖終結ヌクレオチドに付加するという利益を特徴とする。これは連鎖終結ヌクレオチドに、特にイオウ、またはリンの放射性同位体を付加することによって行われる。これは４種類全ての標識されたジデオキシヌクレオシド３リン酸の効率的な生産を必要とし、またこれらを使用する、実施しうる方法を必要とする。チェーンターミネーションＤＮＡ塩基配列決定に用いる元来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントまたはＫｌｅｎｏｗ酵素）はジデオキシヌクレオチドを比較的非効率的に利用する。このポリメラーゼを用いた配列決定方法の殆どはジデオキシヌクレオチドを相当するデオキシヌクレオチドの５０または１００倍までの高濃度で使用する必要がある。濃度比で表示する場合、ｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰは１００：１にもなる。実際的な配列決定のためのｄＮＴＰの典型的最小量は３０ｐｍｏｌのオーダーであり、それぞれが平均２４０塩基で０．５ｐｍｏｌのプライマー付き鋳型の伸長を起こす。従って、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによる配列決定には３０００ｐｍｏｌのｄｄＮＴＰが必要となる。０.５ｐｍｏｌの鋳型ＤＮＡからの伸長産物をＸ線フィルムを用い、一晩の露光により検出するための最小の特異的放射活性はおよそ５００Ｃｉ／ｍｏｌである。この値は非標識ｄｄＮＴＰを用いる通常の配列決定法においては実際的であるが、標識ｄｄＮＴＰ及びこのポリメラーゼを用いる配列決定では配列決定１レーン当たり１.５ｍＣｉという多量を必要とするため、法外に高価で、無駄で、危険である。この新規の配列決定法の鍵となる特徴は、それによって濃度比（従って必要量）を実際的なレベルにまで減少させる、ジデオキシヌクレオシド３リン酸を効率的に利用するＤＮＡポリメラーゼの使用である。そのようなポリメラーゼの一つはＭｎ²⁺の存在下で使用する場合の修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼである（ＴａｂｏｒａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，６４４７−６４５８）。このポリメラーゼを用いた場合、ジデオキシヌクレオシド３リン酸はデオキシヌクレオシド３リン酸とほぼ同等の効率で反応するので、濃度比ｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰを１：１００で使用することができる。この比はジデオキシヌクレオチドの使用効率にとってＫｌｅｎｏｗを用いる場合の比に対し、１００００倍好ましい。このポリメラーゼ及び上に概説した量の鋳型を用いる場合、０.３ｐｍｏｌまたは０.１５μＣｉという少量の標識ジデオキシヌクレオシド３リン酸が配列決定実験の各レーン当たり必要になる。この量は経済的に、安全に、容易に使用できる。ジデオキシヌクレオシド３リン酸を効率的に使用する別のＤＮＡポリメラーゼ酵素もこの配列決定法に使用できる。修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びＭｎ²⁺を用いる場合の更なる利点は均一のバンド強度が得られることである。このことは配列決定実験の解釈をさらに正確にする。以下の実施例は本発明を説明する。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ＝５’−デホスホポリヌクレオチド５’−リン酸基転移酵素ＥＣ２.７.１.７８ポリヌクレオチドキナーゼ３’フォスファターゼ活性を持たない＝５’−デホスホポリヌクレオチド５’−リン酸基転移酵素ＥＣ２.７.１.７８−Ｔ４ａｍＮ８１ｐｓｅＴ１ファージ感染Ｅ．ｃｏｌｉＢＢ由来実施例１３.５μモルの各２’,３’−ジデオキシヌクレオシド（４種類全ての塩基）を５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、２.５ｍＭＤＴＴ、及び３０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.１ｍＭスペルミン及び０.５ｍＭＮＨ₄ Ｃｌを含むバッファー中で５０ユニットの３’−フォスファターゼ活性を持たないＰＮＫ及び５ナノモルの[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰと独立に混合した。最終反応体積は１００μｌであり、反応は１８℃でインキュベーションして行った。反応後、ＰＥＣセルロース板上、０.５ＭＬｉＣｌ及び１Ｍ蟻酸中での展開による、ＴＬＣ解析を行った。表１は時間経過による[³²Ｐ]ｄｄＮＭＰへの転換を示す。ＴＬＣシステムを³²ＰＯ₄、[³²Ｐ]ｄｄＡＭＰ（化学的に合成）、及び５’ｄＡＭＰをマーカーとして基準化した。これにより、ＴＬＣ板を解釈し、ベーター −粒子スキャナーを用いて得たピークが何を示すかを同定することができた。実施例２実施例１に記載の[³²Ｐ]ｄｄＡＭＰ産物を大規模に合成した。３５μモルの各２’,３’−ジデオキシヌクレオシド（４種類全ての塩基）を５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、２.５ｍＭＤＴＴ、及び３０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.１ｍＭスペルミン及び０.５ｍＭＮＨ₄Ｃｌを含むバッファー中で、５００ユニットの３’−フォスファターゼ活性を持たないＰＮＫ及び７５ｍＣｉ（２５ナノモル）の[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰと独立に混合した。最終反応体積は２ｍｌであり、反応は１８℃で２時間インキュベーションして行った。反応後、ＰＥＩセルロース板上、０.５ＭＬｉＣｌ及び１Ｍ蟻酸中での展開による、ＴＬＣ解析を行った。２時間後、反応を２ｍｌの純エタノールを加えることにより停止した。濾過後、反応液をＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製した１リン酸のＴＬＣ解析は[³²Ｐ]ｄｄＡＭＰはいくらかの無機³²ＰＯ₄を含んでいることを示した。他の三種の１リン酸は全て９０％以上の純度に精製されていた。反応の収率は表１の小規模解析で得られた値と同じオーダーであった。 [³²Ｐ]ｄｄＮＭＰを標準的な方法により、それぞれ相当する[α³²Ｐ]ｄｄＮＴＰに容易に、効率よく変換した。ＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーによる精製後、[α³²Ｐ]ｄｄＮＴＰを〜４ｍＣｉ／ｍｌの濃度で水性溶液に再懸濁した。[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰからの最終的収率は：ｄｄＡＴＰ４８％ｄｄＣＴＰ４６％ｄｄＴＴＰ１５％ｄｄＧＴＰ２４％標本をそれぞれに対応する比放射性ｄｄＮＴＰマーカーに対するＨＰＬＣ解析による正体の確認及び、ＤＮＡ配列決定に使用するために用いた。結果は、４種類全てのｄｄＮＴＰについて、放射性標識[³²Ｐ]ｄｄＮＴＰ及び非放射性ｄｄＮＴＰはＨＰＬＣカラムからちょうど同じ時間に溶出した。また、上記の合成したもののほかにはどんな終結因子または放射性標識も存在しない場合において、Ｍ１３鋳型の配列を[α³⁵Ｓ]ｄＡＴＰ内部標識及び非放射性ｄｄＮＴＰを用いた場合の配列決定と比較しても、首尾良く決定することができた。このことは[³²Ｐ]ｄｄＮＴＰがつくられ、従って、ＰＮＫはこれらの条件下で、２’,３’−ジデオキシヌクレオシドをリン酸化できることを証明している。実施例３オオムギ種子（ＢａｒｌｅｙＳｅｅｄｌｉｎｇ）リン酸基転移酵素０.５μモルのウリジン−５’−１リン酸（５’−ＵＭＰ）を、０.５μモルの各２’,３’−ジデオキシヌクレオシド（２’,３’−ｄｄＧの可溶性の問題から、０.１５μモルの５’−ＵＭＰ及び２’,３’−ｄｄＧとなっている２’,３’ −ｄｄＧを除く−それでも１：１のモル比となっている事に注目）、並びに５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、１ｍＭＭｇＣｌ₂及び０.００２％Ｔｒｉｔｏｎ −１００中の１０μｌのオオムギ種子リン酸基転移酵素（１.３ユニット／ｍｌ）と独立に混合した。最終反応体積は５０μｌであり、反応は２５℃で４時間インキュベーションして行った。１５μｌの標本をイオン交換クロマトグラフィーによる解析のために取り出し、装填の前に、水で１２０μｌにした。この方法による解析は４種類全ての２’,３’−ジデオキシヌクレオシド−５’−１リン酸が首尾良くつくられたことを示した。第二の実験では、[³²Ｐ]５’−ＵＭＰを加えた５’−ＵＭＰを、５’−ＵＭＰ：２’,３’−ジデオキシアデノシンのモル比を２４：１で使用する事以外は上記と同一の条件下で使用し、ＰＮＫ法によってつくられたものとちょうど合う、２’,３’−ジデオキシアデノシン−５’−１リン酸の放射性標識のピークを、ＨＰＬＣ解析システム上に与えた。ＨＰＬＣシステムは非放射性標識５’−ＵＭＰ及び５’−ｄＡＭＰ（ｄｄＡＭＰは商業的に入手不可能）の混合物をもちいて標準化した。イオン交換システムにおいて予期される様に、このシステムにより、５’−ＡＭＰは３’−ＯＨ基のため[³²Ｐ]２’,３’−ジデオキシアデノシン −５’−１リン酸よりもわずかに遅れて移動し、よく分離されることが示された。この反応を５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中、ｐＨ５.０で繰り返した場合、ＨＰＬＣ解析において放射性標識のピークは非常に速い移動を示し、無機リン酸と認識された。このことは反応がｐＨ依存性であることを示した。高濃度の塩を加えることもまた有益であり、無機リン酸の生産を阻害する事により生産される１リン酸の収率を増加させるかもしれない。実施例４配列決定プロトコール配列決定はＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ.，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯｈｉｏのＳｅｑｕｅｎｃｅＶｅｒｓｉｏｎ２.０キットを用いて行った。１μｌ（０.５ピコモル）のプライマー、２μｌの反応バッファー、５μｌ（１μｇ）のコントロール鋳型及び２μｌの水をきれいな、無菌のバイアル中で混合した。これを６５℃まで２分間加熱し、それからゆっくりと３０℃まで冷却した。ここに１μｌのＤＴＴ（０.１Ｍ）溶液、２μｌの伸長標識混合液（１：５に希釈）、１μｌのＭｎ⁺⁺バッファー、２μｌのシークエンスＤＮＡポリメラーゼ（１：８に希釈）及び０.５μｌの水（これは内部標識コントロールでは０.５ μｌの[α³⁵Ｓ]ｄＡＴＰに置換される、またこの反応には下記に列挙されるものではない、標準終結混合液を用いる。）を加えた。これを室温で５分間放置した。１μｌの４種類全てのｄＮＴＰ（それぞれ３０μＭ又は４８０μＭ溶液）混合液、１μｌの関連した[α³²Ｐ]ｄｄＡＴＰ希釈液（０.３、４.８、または４８ピコモルという、異なる化学含有量を有する範囲の比活性希釈液を含む。ｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰ比は１：１０から１：１００の間で変化する。）及び０.５μｌの水を３.５μｌの上記溶液に加えた。これを３７℃で５分間インキュベートし、４μｌの停止染色液を各反応チューブに加えた。全ての反応チューブを７０−８０℃に、５分間加熱した。４μｌの各反応液を４０分間プレランしておいた標準６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルにのせた。ゲルを４５ｍＡで最初の色素がゲルから流れ出るまで約２時間泳動した。それから、ゲルを乾燥させ、ＡｍｅｒｓｈａｍＨｙｐｅｒｆｉｌｍＭＰというフィルムに一晩感光させた。結果は低いバックグラウンド及び均等のバンド強度をもつ、より向上した配列跡を示した。実施例５２’−デオキシアデノシンのリン酸化０.３ｍｇの２’−デオキシアデノシンを３０ユニットのＴ４ＰＮＫ及び５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、５ｍＭＤＴＴ及び１４ｍＭＭｇＣｌ₂中の８ナノモルの[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰと混合した。最終反応体積は１００μｌであり、反応は２４℃でインキュベーションして行った。反応後、実施例１と同一のＴＬＣシステムで解析した。結果は[³²Ｐ]５’ｄＡＭＰへの取り込みは時間４５分＝４％時間２４０分＝１５％一晩＝４４％実施例６（チオリン酸化）３.５μモルの２’,３’−ジデオキシアデノシン、アデノシン及び２’−デオキシアデノシンをそれぞれ独立に、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、２.５ｍＭＤＴＴ、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、０.１ｍＭスペルミン及び０.５ｍＭＮＨ₄Ｃｌを含むバッファー中で、１５０ユニットの３’−フォスファターゼ活性を持たないＰＮＫ及び８５ピコモルの[ガンマ³⁵Ｓ]ＡＴＰと混合した。最終反応体積は１００μｌであり、反応は１８℃でインキュベーションして行った。反応後、ＰＥＩセルロース板上、０.５ＭＬｉＣｌ及び１Ｍ蟻酸中での展開による、ＴＬＣ解析を行った。２１時間のインキュベーションの後、反応液は８.３％アデノシン−５’−モノチオリン酸[³⁵Ｓ] １１．２％２’−デオキシアデノシン−５’−モノチオリン酸[³⁵Ｓ] ２．８％２’,３’−ジデオキシアデノシン−５’−モノチオリン酸[³⁵Ｓ] を含んでいた。実施例７（修飾糖）３.５μモルの３’−アジドチミジンを５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、２. ５ｍＭＤＴＴ、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、０.１ｍＭスペルミン及び０.５ｍＭＮＨ₄Ｃｌを含むバッファー中で、５０ユニットの３’−フォスファターゼ活性を持たないＰＮＫ及び５ナノモルの[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰと独立に混合した。最終反応体積は１００μｌであり、反応は１８℃でインキュベーションして行った。反応後、ＰＥＩセルロース板上、０.５ＭＬｉＣｌ及び１Ｍ蟻酸中での展開による、ＴＬＣ解析を行った。３時間のインキュベーションの後、反応液は２２％の３’−アジトチミジン− ５’−１リン酸[³²Ｐ]を含んでいた。実施例８（塩基修飾）３.５μモルの７−デアザアデノシン（ツベルシジン）、３−ニトロピロルヌクレオシド及び５−ニトロインドールヌクレオシド（参考文献：ＤＬｏａｋｅｓａｎｄＤＭＢｒｏｗｎ，ＮＡＲ，１９９４，Ｖｏｌ.２２，ＮＯ.２０，ｐｇ４０３９−４０４３）をそれぞれ独立に、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、２.５ｍＭＤＴＴ、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、０.１ｍＭスペルミン及び０ .５ｍＭＮＨ₄Ｃｌを含むバッファー中で、５０ユニットの３’−フォスファターゼ活性を持たないＰＮＫ及び５ナノモルの[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰと混合した。最終反応体積は１００μｌであり、反応は１８℃でインキュベーションして行った。反応後、ＰＥＩセルロース板上、０.５ＭＬｉＣｌ及び１Ｍ蟻酸中での展開による、ＴＬＣ解析を行った。３時間のインキュベーションの後、ＴＬＣスキャン上に追加のピークが観察された。これらは基質の非存在下では見られない事から、おそらくは基質によるものである。６３.０％７−デアザアデノシン−５’−１リン酸[³²Ｐ]＊１６.１％３−ニトロピロルヌクレオシド−５’−１リン酸[³²Ｐ]＊２３.９％５−ニトロインドールヌクレオシド−５’−１リン酸[³²Ｐ]＊＊これらの産物は基質の存在下でのみ見られ、基質なしのコントロール実験では見られなかった。実施例９３.５μモルの各２’,３’−ジデオキシヌクレオシド（４種類全ての塩基）をそれぞれ独立に、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、２.５ｍＭＤＴＴ、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.１ｍＭスペルミン及び０.５ｍＭＮＨ₄Ｃｌを含むバッファー中で、１０００ユニットの３’−フォスファターゼ活性を持たないＰＮＫ及び６０−１００ｍＣｉの[ガンマ³³Ｐ]ＡＴＰ（〜３０００Ｃｉ／ミリモル）と混合した。最終反応体積は２ｍｌであり、反応は１８ ℃で２から６時間インキュベーションして行った。反応後、ＰＥＩセルロース板上、０.５ＭＬｉＣｌ及び１Ｍ蟻酸中での展開による、ＴＬＣ解析を行った。反応を２ｍｌの純エタノールを加えることにより停止した。濾過後、反応液をＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製した１リン酸のＴＬＣ解析は[³³Ｐ]ｄｄＡＭＰはいくらかの無機³³ＰＯ₄を含んでいることを示した。他の三種の１リン酸は全て９０％以上の純度に精製されていた。反応の収率は表１の小規模解析で得られた値と同じオーダーであった。 [³³Ｐ]ｄｄＮＭＰを標準的な方法により、それぞれ対応する[α³³Ｐ]ｄｄＮＴＰに容易に、効率よく変換した。ＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーによる精製後、[α³³Ｐ]ｄｄＮＴＰを〜４ｍＣｉ／ｍｌの濃度で水性溶液に再懸濁した。[ガンマ³³Ｐ]ＡＴＰからの最終的収率は：ｄｄＡＴＰ４０％ｄｄＣＴＰ３０％ｄｄＧＴＰ２０％ｄｄＴＴＰ１６％標本をそれぞれに対応する比放射性ｄｄＮＴＰマーカーに対するＨＰＬＣ解析による同定及び、ＤＮＡ配列決定に使用するために用いた。結果は、４種類全てのｄｄＮＴＰについて、放射性標識[α³³Ｐ]ｄｄＮＴＰ及び非放射性ｄｄＮＴＰはＨＰＬＣカラムからちょうど同じ時間に溶出したことを示した。実施例１０ＤＮＡ塩基配列決定実施例１−３に概略した方法を用い、[α−³²Ｐ]ｄｄＧＴＰ、[α−³²Ｐ] ｄｄＡＴＰ、[α−³²Ｐ]ｄｄＴＴＰ及び[α−³²Ｐ]ｄｄＣＴＰをおよそ２０００Ｃｉ／ミリモルの比活性、及び０.５μＭの濃度で調製した。これらを以下の様式で、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡの塩基配列決定のために用いた。ここに記載の多くの試薬はＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ.，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ．Ｏｈａｉｏで生産しているＳｅｑｕｅｎａｓｅＤＮＡシークエンシングキット中に含まれている。４ヌクレオチド終結混合液は、２μｌの１５μＭｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び１００ｍＭＮａＣｌを０.６μｌ（０.３ピコモルを含む）の各放射性標識ｄｄＮＴＰ溶液と共に混合することにより調製した。鋳型ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８、５μｌ中の１.０μｇ）を０.５ピコモル（１μ ｌ）のＭ１３”−４０”２３−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマー、１μｌのＭＯＰＳバッファー（４００ｍＭモルフォリノプロパン硫酸−ＮａＯＨ、ｐＨ７ .５、５００ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＭｇＣｌ₂、１μｌのＭｎバッファー、５０ｍＭＭｎＣｌ₂、１５０ｍＭイソクエン酸ナトリウム塩）及び２μｌの水と混合し、全体積を１０μｌにした。この混合液プライマーを鋳型にアニールさせるために３７℃に１０分間加熱した。混合液を氷上で急冷し、１μｌの０.１Ｍジチオトレイトール及び２μｌのポリメラーゼ混合液（１.６ユニット/μｌＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２.０Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．）、２.０ユニット/ｍｌ無機ピロリン酸分解酵素２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、２ｍＭＤＴＴ、０.１ｍＭＥＤＴＡ、５０％グリセロール）を加え、よく混合した。それからこのＤＮＡとポリメラーゼの混合溶液のうちの３μｌを（３７℃に）前もって暖めておいた上記の終結混合液（２.６μｌ）と混合した。混合液を３７℃で１０分間インキュベートし、次に４μｌの停止溶液（９５％フォルムアミド２０ｍＭＥＤＴＡ０.０５％ブロモフェノールブルー０.０５％キシレンシアノールＦＦ）を反応を停止させるために加えた。混合液を短時間加熱し、トリス−タウリン−ＥＤＴＡバッファー（ＵＳ５，１３４，５９５，Ｐｉｓａ−Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄ．＆Ｆｕｌｌｅｒ，Ｃ. Ｗ.(１９９２)Ｃｏｍｍｅｎｔｓ１９，２９−３６）により緩衝化された変性ポリアクリルアミド電気泳動ゲルにアプライした。電気泳動後、ゲルを標準的方法により乾燥し、一晩フィルムに感光させた。結果として得られたＤＮＡ塩基配列オートラジオグラムは例外的にバックグラウンドが無く、プライマーの３’端に付加した最初のヌクレオチドも明確に認識でき、均一のバンド強度を有した。実施例１１圧縮アーテイファクトを除去するためのｄＩＴＰを用いた配列決定圧縮アーテイファクト（compression artifact）は配列決定電気泳動ゲル上で分離されたＤＮＡが完全に変性されていない場合に起こる。配列決定反応において、ｄＧＴＰと取り替えたｄＩＴＰ（デオキシイノシン３リン酸）のようなヌクレオチド類似体は圧縮アーテイファクトを除去することができる（Ｔａｂｏｒ. Ｓ. ａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ,Ｃ.Ｃ.（１９８７）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，４７６７−４７７１）。配列決定反応は四ヌクレオチド終結混合液を２μｌの７５μＭのｄＩＴＰ、１５μＭｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及び１００ｍＭＮａＣｌを０.６μｌ（０.３ピコモルを含む）の各放射性標識ｄｄＮＴＰ溶液と共に混合することにより調製した事以外は実施例１０に記載と全く同様に行った。Ｍ１３ｍｐ１８鋳型ＤＮＡの配列決定は、圧縮アーテイファクトをおこしがちな領域の配列を決定できるように選んだ異なるプライマーを用いて行った。ｄＧＴＰ混合液を用いたコントロール配列決定反応では圧縮された、解読不能領域が見られたのに対し、ｄＩＴＰ−含有混合液を用いた場合は圧縮アーテイファクトは見られなかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月２日【補正内容】３４条補正の翻訳文（１）英文明細書第６頁下２行−第８頁第４行の翻訳文（日本語翻訳文第６頁第１１行−第７頁第６行）を以下の通り差し替える。『別の側面として本発明は、放射性同位体で標識された４種類それぞれの連鎖終結ヌクレオチドもしくはヌクレオチト類似体の供給を含む、核酸の配列決定の為のキットを提供する。好ましくはこのキットは、[α³²Ｐ]及び/または[α³³Ｐ] 及び/または[α³⁵Ｓ]連鎖終結ヌクレオチド類似体（例えばジデオキシヌクレオシド）、並びにポリメラーゼ酵素（例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）、４種類それぞれのｄＮＴＰｓの供給、そしてＭｎ²⁺を含むバッファーから成る。標識ｄｄＮＴＰｓの供給は、バックグラウンドの減少とより均一なバンドの強度のため、向上した正確さをもつ有力な配列決定法に使用されるべきである。本発明の別の側面として、連鎖終始因子として放射性同位体で標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を用いた鋳型指向性の酵素的合成を行い、そして、酵素的合成産物を放射性同位体により検出することからなる、チェーンターミネーション法による塩基配列の決定法を提供する。さらに別の側面として、本発明は、³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓによって放射標識されたｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰのいずれかであって、放射標識が好ましくはα−リン酸基に存在するものを提供する。ゲル電気泳動による分離後の、チェーンターミネーションＤＮＡ塩基配列産物の検出はいくつかの方法によって達成される。原型の方法は新規に合成されたＤＮＡを内部標識するための[α−³²Ｐ]ｄＡＴＰの使用を含む。同様に、放射性標識オリゴヌクレオチド配列決定用プライマーも使用可能である。より最近では、蛍光標識されたプライマー及びヌクレオチドもまた、蛍光産物を検出するための高価な、感度の高い機械と共に用いられている。これらの方法は全てのＤＮＡ鎖が正確、確実にジデオキシヌクレオチドによって終結されている様に注意が払われる場合にのみ有効である。３’端がデオキシヌクレオチドによって終結しているどんな鎖も最終的な電気泳動展開におけるバックグラウンドの要因になる。そのような終結はポリメラーゼが十分に高い伸長活性を持たなかった場合、または鋳型が強固な二次構造を取っている場合に起こり得る。そのような非特異的な停止は一般に配列決定実験中に起こり、通常誤解読となる結果、または影響を受けた塩基を正しく解読するために再配列決定が必要となる結果を引き起こす。』（２）請求の範囲の請求項８−１６を以下の通り補正する。（請求項１−７は補正なし）『８．５’−³²Ｐヌクレオシドリン酸をつくるため、２’,３’−ジデオキシヌクレオシドを[ガンマ³²Ｐ]ＡＴＰと反応させる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。９．５’−³²Ｐヌクレオシド１リン酸が、続いて２−又は３−リン酸に変換される、請求項８に記載の方法。１０．酵素がオオムギ種子由来のリン酸基転移酵素である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。１１．検出可能な同位体により標識された四種類それぞれの連鎖終結ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体の供給から成る、またはこれらを含む、核酸配列決定のためのキット。１２．連鎖終結ヌクレオチド類似体がジデオキシヌクレオチドである、請求項１１に記載のキット。１３．四種類のそれぞれの連鎖終結ヌクレオチドが³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓで標識されている、請求項１１または請求項１２に記載のキット。１４．キットが、ポリメラーゼ酵素の供給及び四種類それぞれのｄＮＴＰの供給もさらに含む、請求項１１から１３のいずれか１項に記載のキット。１５．ポリメラーゼ酵素がＴ７ＤＮＡポリメラーゼであり、キットがＭｎ²⁺を含むバッファーをさらに含む、請求項１４に記載のキット。１６．連鎖終始因子として放射性同位体で標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を用いた鋳型指向性の酵素的合成を行い、そして放射性同位体を利用することで酵素的に合成された産物を検出することからなる、チェーンターミネーション法による核酸配列決定法１７．酵素的合成反応がＴ７ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用い、４種類全てのｄＮＴＰ及び標識された連鎖終結ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の存在下、Ｍｎ²⁺を含むバッファーの存在下で行われる、請求項１６に記載の方法。１８．検出可能な行為対が³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓである、請求項１６または請求項１７に記載の方法。１９．³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓによって放射標識された、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ。２０．放射標識がα−リン酸基に存在する、請求項１９に記載されたｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ。』

Claims

【特許請求の範囲】１．５’−ＯＨ基を有するが３’-リン酸基は有さない、開始ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体またはヌクレオシド付加物をヌクレオチドリン酸又はチオリン酸供与体と、この反応を触媒する酵素の存在下で反応させる、ことから成る、５’−リン酸または５’−チオリン酸基を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド付加物を製造する方法。２．ヌクレオチドリン酸またはチオリン酸供与体が³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵ Ｓにより放射性標識され、そして得られるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド付加物は、³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓを含む５’−リン酸または５’−チオリン酸基を有するため放射性標識されている、請求項１に記載の方法。３．開始ヌクレオシド類似体が２’,３’−ジデオキシヌクレオシドである、請求項１または請求項２に記載の方法。４．開始ヌクレオシド類似体が３’−フルオロ、３’−アミノ若しくは３’ −アジドのヌクレオシド、またはＰＮＡ、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１または請求項２に記載の方法。５．酵素がポリヌクレオチドキナーゼである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。６．反応が４−３０℃及びｐＨ４−９で行われる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。７．ヌクレオチドリン酸又はチオリン酸供与体が［ガンマ³²Ｐ］ＡＴＰまたは［ガンマ³⁵Ｓ］ＡＴＰまたは［ガンマ³³Ｐ］ＡＴＰである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。８．５’−³²Ｐヌクレオシドリン酸をつくるため、２’,３’−ジデオキシヌクレオシドを［ガンマ³²Ｐ］ＡＴＰと反応させる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。９．５’−³²Ｐヌクレオシド１リン酸が、続いて２−又は３−リン酸に変換される、請求項８に記載の方法。１０．酵素がオオムギ種子由来のリン酸基転移酵素である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。１１．検出可能な同位体により標識された四種類それぞれの連鎖終結ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体の供給から成る、またはこれらを含む、核酸配列決定のためのキット。１２．連鎖終結ヌクレオチド類似体がジデオキシヌクレオチドである、請求項１１に記載のキット。１３．四種類のそれぞれの連鎖終結ヌクレオチドが³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓで標識されている、請求項１１または請求項１２に記載のキット。１４．キットが、ポリメラーゼ酵素の供給及び四種類それぞれのｄＮＴＰの供給もさらに含む、請求項１１から１３のいずれか１項に記載のキット。１５．ポリメラーゼ酵素がＴ７ＤＮＡポリメラーゼであり、キットがＭｎ²⁺ を含むバッファーをさらに含む、請求項１４に記載のキット。１６．連鎖終結因子として、検出可能な同位体により標識されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を用い、検出可能な同位体を利用することで酵素的に合成された産物を検出することからなる、チェーンターミネーション法による核酸配列決定法１７．酵素的合成反応がＴ７ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用い、４種類全てのｄＮＴＰ及び標識された連鎖終結ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の存在下、Ｍｎ²⁺を含むバッファーの存在下で行われる、請求項１６に記載の方法。１８．検出可能な行為対が³²Ｐまたは³³Ｐまたは³⁵Ｓ出ある、請求項１６または請求項１７に記載の方法。