CN104513850A - 一种脱氧核糖核酸酶催化合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱氧核糖核酸酶催化合成方法，组合物和试剂盒。核酸检测系统利用加上pyrophosphorylation磷酸核糖焦磷酸合成酶催化产生无论是三磷酸脱氧核糖核苷或核糖核苷三磷酸的各种聚合酶或核酸酶消化催化焦磷酸解反应。dNTPs浓度转化为ATP的核苷二磷酸激酶的作用。这些反应产生的ATP可被检测到的荧光素酶或NADH的检测系统。如果需要更灵敏的检测，NTPs和dNTPs浓度的扩增方案中所提供的。样品中的细胞或细胞物质的检测系统，其特征在于，AMP和磷酸供体的高能量被转换为内源酶的作用，随后检测的ATP的ATP加入到样品。

Description

一种脱氧核糖核酸酶催化合成方法

发明领域  

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种脱氧核糖核酸酶催化合成方法。

发明背景

目前的准则规定，存在于重组治疗性蛋白质的核酸量小于10 pg的每日剂量的重组蛋白的DNA。因此，用于检测核酸的量极低的方法是必要的。这种方法也将得到广泛的使用，法医样品中的DNA的定量。 已经描述的核酸检测的低水平的几种方法。第一种方法是基于经典的杂交技术。此方法利用放射性标记的核酸探针结合到感兴趣的DNA。然而，这种方法有几个缺点，包括再现性差，产生大量废试剂，引起的非特异性结合的高背景水平。此外，这种技术用于确定低量的未知序列的DNA的存在通常是不适当的 检测核酸的第二种方法利用能够插入到核酸的荧光染料。然而，如清洁剂，蛋白质和脂质的许多干扰物质影响通过该方法产生的信号的再现性， 利用生物素化的检测的DNA的水平低的第三种方法的单链DNA结合蛋白（SSB），链霉抗生物素蛋白，抗稠合到脲酶DNA抗体，以及作为试剂的生物素化的硝化纤维素。此法是市售Kung等分子器件和描述，皮克总DNA定量使用SNA-结合蛋白在硅基于传感器的系统，肛交。生物化学。187：220-27（1990）。该试剂盒的操作，允许将要形成一个复杂的的链霉抗生物素蛋白，生物素，SSB，抗DNA抗体一起孵育。然后将复合体上的生物素化的过滤器捕获，洗涤，读取捕获的脲酶的量。此方法是高度敏感的，但是有几个缺点。这些缺点包括昂贵的试剂和广泛的控制的需要。 第四种方法包括解聚或降解核酸和检测由荧光素酶的ATP。多核苷酸聚合酶的核酸在细胞中的合成负责。这些酶也能够德意志和Kornberg，脱氧核糖核酸酶催化合成，生物化学杂志中所描述的催化其它反应。化学 244（11）:3019-28（1969）。很多，但不是全部，聚合酶能够解聚磷酸盐或焦磷酸盐存在下，无论是在核酸 的美国专利。第4735897号描述了一种方法，检测的多聚腺苷酸化，信使RNA（聚（A）-mRNA的）。解聚的聚（A）-mRNA的磷酸盐的存在已被证实会导致在形成ADP，它可以被转换为ATP由丙酮酸激酶或肌酸磷酸激酶。RNA也可通过核糖核酸酶消化AMP，腺苷酸激酶转化为ADP，然后转换为ATP的丙酮酸激酶 的ATP这样生产的荧光素酶检测系统检测。在ATP和O2的存在下，荧光素酶催化荧光素的氧化作用，产生光，然后可以使用光度计定量。其他反应的副产物是AMP的磷酸盐，焦磷酸盐和氧合虫荧光素， ATP的产生在所有的生物体中的酶的存在下，也允许使用荧光素酶系统的，用于检测污染细胞的存在或量的样品中，如描述在美国专利。第5648232号。例如，可能会增加ADP怀疑含有污染细胞的样品。转换的ADP转化为ATP酶的细胞的荧光素酶测定法检测，如上所述。这种方法的缺点是相对不稳定的ADP衬底， 这是本领域需要的是可靠的，成本效益的方法，核酸，细胞，细胞物质在多种类型的样品的检测非常低的水平。本发明公开了新颖的方法，用于检测的DNA，RNA和细胞数量低。这些方法利用焦磷酸或核酸酶降解的新颖的组合，转换为ATP的dNTPs，直接向ATP，AMP的转化，扩增的ATP敏感性增加，寡核苷酸探针的解聚，和优化的反应条件。 

发明内容

核酸和多孔材料与ATP的检测系统检测的极低量的方法和组合物进行了描述。 背景 生产大量的重组蛋白质的方法是众所周知的。重组蛋白行业的发展，出现了各种质量控制检测的需要。一个例子是需要重组蛋白抽提物中存在的核酸的定量分析。

 甲需要由重组方法产生的蛋白质的质量控制检测。目前的指引建议，重组蛋白制剂应含有小于10微微克的核酸。也有必要可以定量取证样品中核酸的非常低的水平。因此，它是本发明的一个目的是提供用于检测低量的核酸和低数量的细胞或细胞物质的方法。这也是本发明的一个目的是提供用于检测核酸和检测核酸的试剂盒组合物， 在本发明的一个实施例中，提供一种方法，用于检测和/或在一个反应体系中磷酸盐测定脱氧核糖核酸腺苷5'-二磷酸，或它们的组合。该方法包括的核酸酶裂解的终端internucleoside的磷酸二酯键和重整与焦磷酸盐分子相同，根据下列反应，以形成脱氧核糖核苷三磷酸分子在末端核苷酸：选自下组的DNA聚合酶或逆转录酶催化的解聚 T4聚合酶，Taq DNA聚合酶，AMV反转录酶，MMLV逆转录酶组成的。解聚工序中的定量测定核酸，重复基本上完成或均衡，取得至少两个从最小3个核苷酸的链的核苷三磷酸分子。检测DNA，无需重复解聚步骤，如果有足够的核酸分子，本以产生一个信号。下一步涉及酶促脱氧核糖核苷三磷酸分子5'端的磷酸基团转移形成腺苷-5'-三磷酸腺苷-5'-二磷酸分子根据下面的反应： 核苷二磷酸激酶的催化式中，P *是终端5 '磷酸转移。最后的步骤是检测的ATP，通过荧光素酶检测系统或NADH的检测系统。的解聚步骤和磷酸转移步骤可任选地在一个单一的一锅反应进行。如果需要更高的灵敏度，所产生的磷酸转移步骤或解聚步骤中生产的国家结核病ATP分子可能被放大，以形成多个ATP分子。 在本发明的另一个实施例中，提供了一种方法，用于检测多聚腺苷酸化的mRNA含有焦磷酸的反应。第一解聚在一个末端核苷酸的多聚腺苷酸化的mRNA的酶裂解终端internucleoside的磷酸二酯键和重整与焦磷酸盐分子相同，根据下列反应，形成游离的ATP分子： 聚（A）聚合酶催化。解聚工序中的RNA的定量测定，重复基本上完成或均衡，取得至少两个从最小3个核苷酸的链的核苷三磷酸分子。检测DNA，无需重复解聚步骤，如果有足够的核酸分子，本以产生一个信号。然后，如此形成的ATP分子的荧光素酶检测系统或NADH检测系统检测。反应的灵敏度可以增加在本发明的另一个实施例中，提供一种方法，用于有选择地检测和/或测定聚（A）mRNA在一个反应体系中，焦磷酸，腺苷5'-二磷酸任选放大ATP分子。 或它们的组合。在该方法中，互补的寡聚（dT）探针的poly（A）mRNA的杂交，形成RNA-DNA杂合体。然后解聚酶裂解终端internucleotide的磷酸二酯键和重整与焦磷酸分子以形成脱氧胸苷-5'-三磷酸的末端核苷酸的寡聚（dT）链的RNA-DNA杂合体。根据下面的反应： TT.sub.n + PP.sub.i.fwdarw.TT.sub.n-1 + dTTP的 利用逆转录酶催化。解聚工序中的定量测定核酸，重复基本上完成或均衡，取得至少两个从最小3个核苷酸的链的核苷三磷酸分子。检测DNA，无需重复解聚步骤，如果有足够的核酸分子，本以产生一个信号。接着，从脱氧胸苷-5'-三磷酸酶的磷酸基团转移到腺苷5'-二磷酸分子形成ATP分子，根据下面的反应： ，其中P * 5'端磷酸转移催化NDPK。最后，如此形成的ATP的荧光素酶检测系统或NADH检测系统的检测。如果所需的敏感性增加，的末端磷酸dTTP的可能被转移到ADP形成ATP上述后跟的扩增所产生的ATP。

具体实施方法：

在本发明的实施中，提供一种方法，在一个反应体系中，检测DNA磷酸核糖焦磷酸，腺苷5'-二磷酸，或它们的组合。在该方法中，免费的脱氧核糖核苷单磷酸分子的核酸通过核酸酶消化产生。然后，焦磷酸基酶从磷酸核糖焦磷酸分子转移到脱氧腺苷单磷酸分子以形成脱氧腺苷三磷酸分子根据下面的反应： 磷酸核糖焦磷酸合成酶催化的。接着，从脱氧腺苷三磷酸分子的5'端的磷酸基团转移酶，腺苷5'-二磷酸分子，根据下面的反应形成ATP分子 的dATP * + ADP.fwdarw.dADP + ATP 催化由NDPK其中P *终端5'磷酸转移。如此产生的ATP可被检测到的荧光素酶检测系统或NADH检测系统。如果需要，也可以进行焦磷酸转移步骤和磷酸转移步骤在一个单一的反应锅内。如果增加的敏感性是必要的，ATP分子可能被放大， 本发明的另一个实施例提供了一种方法，检测的RNA，在反应体系中，磷酸核糖焦磷酸。免核糖核苷单磷酸分子是由具有核酸酶消化的RNA。接着，从磷酸核糖焦磷酸分子的焦磷酸分子酶转移磷酸腺苷分子，根据下面的反应形成三磷酸腺苷分子： 磷酸核糖焦磷酸合成酶催化的。如此产生的ATP，然后检测由荧光素酶检测系统或NADH检测系统。如果增加的敏感性是必要的，这样生产的ATP可以被放大， 本发明的另一个实施例提供了一种方法，用于确定细胞和细胞物质存在于样品中的存在和/或量。在该方法中，单元格的内容被释放以形成细胞裂解物。磷酸供体分子和腺苷-5'-单磷酸分子，然后加入细胞裂解物中，根据下列反应，使腺苷5'-二磷酸分子是由来自供体的腺苷-5'-单磷酸酶的磷酸基转移： 存在于细胞裂解物中的内源酶催化的。然后，所产生的酶的磷酸盐转移从供体分子，按照下列反应：本细胞裂解物样品中的内源酶催化腺苷5'-二磷酸分子ATP 。如此产生的腺苷5'-三磷酸，然后由一个荧光素酶检测系统或NADH检测系统检测。在此实施例中的磷酸供体，可以是任一脱氧胞苷-5'-三磷酸，5'-三deoxyguanidine，或脱氧胸苷-5'-三磷酸， 本发明还提供一种组合物的制造从DNA，焦磷酸腺苷-5'-三磷酸的物质，并腺苷5'-二磷酸。此组合物包括核苷二磷酸激酶，在足够的浓度，催化产生ATP从DNA在约皮克微克量的DNA中所提供的核酸聚合酶的混合物，本发明，还提供了一种用于制备组合物的物质。 从DNA，磷酸核糖焦磷酸，5'-二磷酸腺苷三磷酸腺苷。此组合物含有足够的浓度，催化产生三磷酸腺苷，从约皮克微克量的DNA中的磷酸核糖焦磷酸合成酶和核苷二磷酸激酶的混合物，本发明提供了各种用于核酸检测的试剂盒。首先，提供了药盒，其中包含用于检测DNA的焦磷酸的试剂。该试剂盒包含一个容器中的核酸聚合酶和容器中的核苷二磷酸激酶。也可以设置在相同的容器中的核酸聚合酶和核苷二磷酸激酶。第二，提供了药盒，其中包含的核酸检测的试剂，通过核酸酶消化。该套件包含一个容器，含磷酸核糖焦磷酸合成酶和核酸酶的容器中。第三，提供了药盒，其中包含通过焦磷酸水解RNA的检测试剂。该套件包含的容器中的poly（A）聚合酶。第四，提供的试剂盒，包含用于检测DNA的核酸酶消化的试剂。此套件包含磷酸核糖焦磷酸合成酶的容器中核苷二磷酸果糖激酶的容器中。的磷酸核糖焦磷酸合成酶和二磷酸核苷激酶可任选地被设置在同一个容器中， 本发明的一个实施例还提供了一种试剂盒中含有的试剂的细胞和/或细胞样品中的材料的检测。该试剂盒包含一个容器中腺苷5'-单磷酸和一个容器中的高能量可能不被利用荧光素酶的磷酸供体， 本发明还提供了一种在一个反应体系中，腺苷-5'-单磷酸核苷三磷酸分子扩增分子，高能量的磷酸供体分子，或它们的组合。在该方法中，5'端磷酸基团从三磷酸核苷存在于样品中的分子（XTP）酶腺苷-5'-单磷酸分子加入到样品中，以形成腺苷5'-二磷酸分子和核苷二磷酸分子转移到（ XTP，无论是核糖核苷或脱氧核糖核苷三磷酸），按照下列反应： 由第一酶可以是单磷酸核苷激酶或腺苷酸激酶催化。接着，从高能磷酸供体分子可能不被利用的第一个酶，磷酸酶转移到腺苷5'-二磷酸分子，根据到以下反应：ADP + DP.fwdarw“的形成腺苷-5'-三磷酸分子 ATP + D 核苷二磷酸激酶和丙酮酸激酶催化。然后，这两个步骤重复进行，直到达到理想水平的扩增。高能量磷酸供体可以是dCTP或AMP-CPP NDPK，和PEP丙酮酸激酶， 本发明还提供了一种方法，用于检测在一个反应体系中，焦磷酸，腺苷5'-单磷酸脱氧核糖核酸或核糖核酸，和高能量磷酸供体，或它们的组合，在一个单一的反应锅内。首先，核酸酶裂解终端internucleotide的磷酸二酯键与焦磷酸分子形成游离核糖核苷或脱氧核苷三磷酸分子（XTP）（XTP）根据反应1：聚合酶催化的解聚在一个末端核苷酸 。解聚步骤重复取得的至少两个核苷三磷酸分子。核糖核苷三磷酸分子或脱氧核糖核苷三磷酸分子，然后扩增酶，腺苷-5'-单磷酸腺苷5'-二磷酸分子和核苷5反应1中形成的核苷三磷酸分子5'端的磷酸基团转移-二磷酸分子（XDP）根据第一酶：下，高能量磷酸供体分子，这是不是第一种酶的底物的磷酸基团从2催化反应 ，酶腺苷-5'-二磷酸的分子转移到中产生的反应，根据反应3第二种酶催化的两个放大的步骤被重复直到达到理想水平的扩增产生腺苷-5'-三磷酸分子 。在该方法中的酶1可能是腺苷酸激酶或核苷单磷酸激酶酶2，而可以是丙酮酸激酶或二磷酸nuceloside激酶 优选实施例的描述 本发明提供了一种方法，用于检测非常低的水平，包括各种核酸脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的生物样品中，特别是重组蛋白的样品。的极端敏感性，重现性，易于进行的反应，进行反应的速度表示当前正在使用的低电平检测核酸的方法。

Claims (7)

1.一种脱氧核糖核酸酶催化合成方法，该方法包括：释放单元格的内容，以形成细胞裂解物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐供体是选自脱氧胞苷-5'-三磷酸，deoxyguanidine 5'三磷酸脱氧胸苷5'三磷酸组成的组中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，一种组合物，用于生产腺苷-5'-三磷酸的DNA磷酸盐，焦磷酸盐，腺苷5'-二磷酸的混合物的组合物，该组合物包括：核苷二磷酸激酶;提供足够浓度的核酸聚合酶，核苷二磷酸激酶，核酸聚合酶催化从DNA的三磷酸腺苷的生产在大约皮克微克量的DNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸核糖焦磷酸和腺苷5'-二磷酸的混合物的组合物，该组合物包括：用于产生三磷酸腺苷一个磷酸核糖焦磷酸合成酶。

5.核苷二磷酸激酶，磷酸核糖焦磷酸合成酶，在足够的浓度，催化产生的三磷酸腺苷，从约皮克微克量的DNA的核苷二磷酸激酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，产生三磷酸腺苷分子的多个由核苷三磷酸分子中的反应体系中，腺苷-5'-单磷酸分子，高能量的磷酸供体分子，或它们的组合方法。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一酶是选自选自核苷单磷酸激酶，腺苷酸激酶。