CN117070610A - 一种末端转移酶性能测定方法 - Google Patents
一种末端转移酶性能测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117070610A CN117070610A CN202311086197.0A CN202311086197A CN117070610A CN 117070610 A CN117070610 A CN 117070610A CN 202311086197 A CN202311086197 A CN 202311086197A CN 117070610 A CN117070610 A CN 117070610A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stranded
- stranded template
- template
- dna
- terminal transferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 title claims 9
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 58
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 44
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 40
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 52
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 18
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 16
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 12
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 10
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 abstract description 67
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 abstract description 15
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003904 radioactive pollution Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005287 template synthesis Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供一种末端转移酶性能测定方法，属于分子生物学技术领域。其中，所述末端转移酶性能测定方法包括：针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板；根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板；通过DNA聚合酶补齐所述第一单链模板与所述第二单链模板未互补部分得到双链DNA；对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增确定末端转移酶活性性能。本发明所提供的非放射性、简便、快速的末端转移酶性能测定方法，操作过程不会产生放射性污染；操作简单快速、灵敏度高、稳定性好；可用于不同来源的逆转录酶中的TdT的活性检测；并且，针对RNA测序建库应用筛选最适的逆转录酶原料有更直观的数据比较和依据。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种末端转移酶性能测定方法。
背景技术
逆转录酶是一种在RNA模板合成互补DNA链过程中不可或缺的试剂。它由不同结构和生化活性的酶组成，尽管来源于不同生物体的逆转录酶在功能上存在差异，但其主要功能仍取决于RNA依赖的DNA聚合酶活性。此外，逆转录酶还具有DNA指导的DNA聚合酶活性、RNase H酶活性以及末端核苷酸转移酶TdT活性。
逆转录酶可展现出末端核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyltransferase,TdT)活性。该酶活性会导致向合成的DNA 3’末端非模板特异性的添加核苷酸。TdT活性仅在逆转录酶接触到RNA模板5’末端才会表现出来，此时其会向cDNA末端添加额外的核苷酸，并且对双链核酸底物(如第一链cDNA合成中的DNA：RNA杂交链)展现出特异性。
不同的逆转录酶具有不同的内在TdT活性。对于RNA测序(RNA-Seq)建库，TdT活性可以诱导逆转录酶特异性地向cDNA3’末端加入一系列Cs。由此，逆转录酶中TdT活性的大小对于RNA测序的质量有很大的影响。酶活表征是一种作为酶的功能研究以及酶的生产质检技术，在酶的性能以及酶质检中有着重要的意义。
当前，经典的末端转移酶活性测定采用的为放射性底物掺入法，该方法虽然具有灵敏度高的特点，但受标记物质量所限，在测定的操作过程中，易产生放射性污染；并且，操作步骤多、实验周期长，难以实现高通量和自动化；此外，当前也并没有专门用于检测逆转录酶中的TdT活性的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种末端转移酶性能测定方法，包括：
S1，基于逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板；
S2，根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板；其中，所述第二单链模板的3’末端的脱氧核苷酸G与所述第一单链模板的3’末端的脱氧核苷酸C互补配对，且所述第二单链模板与所述第一单链模板的物种来源不同；
S3，通过DNA聚合酶补齐所述第一单链模板与所述第二单链模板未互补部分得到双链DNA；
S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量，并通过所述产物量确定不同逆转录酶中的末端转移酶活性性能。
优选地，所述步骤S1，基于逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板，包括：
S11，根据所述逆转录酶以RNA为模板合成得到第一单链线性cDNA；
S12，在逆转录酶接触到RNA模板5’末端后，TdT在所述第一单链线性cDNA的3’末端加上非模板化的胞嘧啶残基，得到所述第一单链模板。
优选地，所述第一单链模板和所述第二单链模板均由脱氧核苷酸A、G、C和T组成；
优选地，所述第一单链模板由不同物种真核细胞中mRNA逆转录后获得；其中，逆转录所用引物为Oligo dT或对应基因的特异引物。
优选地，所述步骤S2，根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板包括：
S21，根据所述第一单链模板设计合成单链线性DNA，并将所述单链线性DNA作为所述第二单链模板；
优选地，所述单链线性DNA与所述测序目标的物种来源不同；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列选自大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌中任意一种菌株基因组的核苷酸序列；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列选自根瘤农杆菌；
优选地，所述单链线性DNA由多个脱氧核苷酸N，以及3’末端3-10个鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸组成。
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列长度不小于30bp；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列长度为40-200bp；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述第二单链模板通过3’末端3-10个G与所述第一单链模板的3’末端三个C进行互补配对。
优选地，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，在所使用的定量检测方法为染料法qPCR时，则包括：
设计合成上游引物和下游引物，并在反应体系中添加荧光染料；
其中，所述上游引物和所述下游引物的核苷酸序列分别位于不同的单链模板；
优选地，所述上游引物和下游引物为扩增引物；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上。
优选地，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，基于所述染料法qPCR的荧光定量PCR扩增中，所采用的双链特异性荧光染料定量选自SYBR、Green、PicoGreen和EvaGreen中的任意一种。
优选地，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，在所使用的定量检测方法为探针法qPCR时，则包括：
设计合成上游引物、下游引物和探针；
其中，所述上游引物、下游引物的核苷酸序列分别位于不同的单链模板；
优选地，所述探针引物的核苷酸序列同时在所述第一单链模板与所述第二单链模板上，且覆盖第一单链和第二单链的交汇处；
优选地，所述上游引物与下游引物为扩增引物；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上。
优选地，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，所述探针带有可检测标记。
本发明提供一种末端转移酶性能测定方法，属于分子生物学技术领域，包括：基于逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板；根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板；其中，所述第二单链模板的3’末端的脱氧核苷酸G与所述第一单链模板的3’末端的脱氧核苷酸C互补配对，且所述第二单链模板与所述第一单链模板的物种来源不同；通过DNA聚合酶补齐所述第一单链模板与所述第二单链模板未互补部分得到双链DNA；对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量，并通过所述产物量确定不同逆转录酶中的末端转移酶活性性能。
本发明所提供的末端转移酶性能测定方法，利用逆转录酶通过TdT活性在cDNA末端添加C残基形成第一单链模板，设计合成与第一单链模板互补配对的第二单链模板，通过逆转录酶填补两模板的未互补部分，生成双链DNA，再通过荧光定量PCR检测双链DNA产物量评估不同逆转录酶的末端转移酶活性。本发明所提供的非放射性、简便、快速的末端转移酶性能测定方法，操作过程不会产生放射性污染；操作简单快速、灵敏度高、稳定性好；可用于不同来源的逆转录酶中的TdT的活性检测；并且，针对RNA测序建库应用筛选最适的逆转录酶原料有更直观的数据比较和依据。
附图说明
图1为本发明末端转移酶性能测定方法的流程示意图；
图2为本发明末端转移酶性能测定方法的测定原理示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参考图1，本发明提供一种末端转移酶性能测定方法，包括：
S1，基于逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板；
S2，根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板；其中，所述第二单链模板的3’末端的脱氧核苷酸G与所述第一单链模板的3’末端的脱氧核苷酸C互补配对，且所述第二单链模板与所述第一单链模板的物种来源不同；
S3，通过DNA聚合酶补齐所述第一单链模板与所述第二单链模板未互补部分得到双链DNA；
S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量，并通过所述产物量确定不同逆转录酶中的末端转移酶活性性能。
本实施例中，所进行的末端转移酶性能测定，其特定针对于检测逆转录酶中的TdT活性。
上述，在步骤S2中，第二单链模板的3’末端的脱氧核苷酸G与第一单链模板的3’末端的脱氧核苷酸C进行互补配对。同时，要求第二单链模板与第一单链模板来自不同的物种来源。由此可得到第二单链模板，这是一个DNA分子，其序列与第一单链模板互补配对。这种互补配对确保了第一单链模板和第二单链模板之间的特异性结合。
其中，限定第二单链模板与第一单链模板序列需不同物种来源的原因是为了确保在PCR实验中能够准确地区分两个模板之间的杂交产物和非特异性扩增产物。
当第二单链模板与第一单链模板来自不同物种时，它们的序列差异较大，可以通过PCR引物的设计来选择特异性扩增目标。这样可以避免可能产生的非特异性扩增问题，以提高检测的准确性和可靠性。
如果第二单链模板与第一单链模板序列相似或相同，存在两种主要情况：
(1)杂交产物：如果两个模板的序列相似度较高，可能会在PCR过程中产生杂交产物，即第一单链模板与第二单链模板之间的非特异性结合。这会导致PCR产物的非特异性扩增，使结果解读困难。
(2)纯粹扩增产物：如果两个模板的序列完全相同，PCR实验无法准确区分哪个模板产生的扩增产物，从而无法对逆转录酶中末端转移酶的活性进行准确评估。
因此，通过确保第二单链模板与第一单链模板序列来自不同物种，可以避免上述问题，更精确地评估逆转录酶中末端转移酶活性的性能。
在S3步骤中，利用DNA聚合酶的活性，将第一单链模板与第二单链模板未互补配对的部分进行补齐，形成双链DNA。通过S3步骤，能够得到双链DNA，其中包括第一单链模板与第二单链模板的互补序列。这种双链DNA结构为后续的PCR扩增提供了合适的模板。
通过DNA聚合酶的作用，可以将两个单链模板的非互补部分连接起来，形成双链结构。这样可以为PCR扩增反应提供稳定和特异性的模板。
在S4步骤中，对双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测产物的数量，并通过产物量确定不同逆转录酶中末端转移酶的活性性能。通过S4步骤，利用荧光定量PCR技术对双链DNA进行扩增，并使用荧光信号检测扩增产物的数量。通过比较不同样本中产物的量化结果，可以评估不同逆转录酶中末端转移酶的活性性能。荧光定量PCR技术可以快速、准确地定量扩增产物的数量，从而实现对逆转录酶中末端转移酶性能的定量评估。这种方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点，可以在短时间内获得可靠的实验结果。
参考图2，为末端转移酶性能测定方法的测定原理示意图。
总之，本发明所提供的末端转移酶性能测定方法，利用逆转录酶通过TdT活性在cDNA末端添加C残基形成第一单链模板，设计合成与第一单链模板互补配对的第二单链模板，通过逆转录酶填补两模板的未互补部分，生成双链DNA，再通过荧光定量PCR检测双链DNA产物量评估不同逆转录酶的末端转移酶活性。本发明所提供的非放射性、简便、快速的末端转移酶性能测定方法，操作过程不会产生放射性污染；操作简单快速、灵敏度高、稳定性好；可用于不同来源的逆转录酶中的TdT的活性检测；并且，针对RNA测序建库应用筛选最适的逆转录酶原料有更直观的数据比较和依据。
进一步的，所述步骤S1，基于逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板，包括：
S11，根据所述逆转录酶以RNA为模板合成得到第一单链线性cDNA；
S12，在逆转录酶接触到RNA模板5’末端后，TdT在所述第一单链线性cDNA的3’末端加上非模板化的胞嘧啶残基，得到所述第一单链模板。
上述，TdT(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)活性具有以下特征：
(1)末端特异性：TdT只在接触到RNA模板的5'末端时表现出活性，只在该位置加入核苷酸。
(2)非模板化添加：TdT在RNA模板的5'末端通常加入几个非模板化的胞嘧啶(C)残基。这些添加的核苷酸序列不依赖于RNA模板的序列。
(3)缺乏模板序列依赖性：TdT活性不需要特定的模板序列来引导其添加核苷酸。
(4)模板无关性：TdT能够在DNA和RNA模板上同时活化，并具有高度柔性的底物特异性。
(5)亲合性低：TdT对于不同的核苷酸底物的亲合性较低，使其能够添加各种类型的核苷酸。
综上所述，TdT活性特点包括末端特异性、非模板化添加、模板无关性和低亲合性。这些特征使得TdT成为在实验室中，用于DNA尾标签、基因克隆、DNA测序等多种应用的工具。
在本方法中的步骤S1中，首先，利用逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，逆转录酶以RNA为模板合成cDNA；然后，由于TdT活性仅在逆转录酶接触到RNA模板5′末端才会表现出来，因此，在逆转录酶接触到RNA模板5’末端后，TdT会在第一单链线性cDNA的3’末端加上几个非模板化的胞嘧啶(C)残基得到第一单链模板。
进一步的，所述第一单链模板和所述第二单链模板均由脱氧核苷酸A、G、C和T组成。
上述，第一单链模板和第二单链模板的碱基组成相同，都可以由脱氧核苷酸(A、G、C和T)组成。脱氧核苷酸是DNA的基本组成单位，包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在DNA复制和PCR扩增等过程中，这些脱氧核苷酸会按照特定的配对规则进行互补配对，从而形成双链DNA结构。
进一步的，所述第一单链模板由不同物种真核细胞中mRNA逆转录后获得；其中，逆转录所用引物为Oligo dT或对应基因的特异引物。
进一步的，所述步骤S2，根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板包括：
S21，根据所述第一单链模板设计合成单链线性DNA，并将所述单链线性DNA作为所述第二单链模板；
进一步的，所述单链线性DNA与所述测序目标的物种来源不同；
进一步的，所述单链线性DNA的核苷酸序列选自大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌中任意一种菌株基因组的核苷酸序列；
进一步的，所述单链线性DNA的核苷酸序列选自根瘤农杆菌。
进一步的，所述单链线性DNA由多个脱氧核苷酸N，以及3’末端3-10个鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸组成。
上述，在步骤S21中，设计合成一条单链线性DNA(DNA Oligo)，将第二单链线性DNA(DNA Oligo)作为第二单链模板。
其中，所述第二单链线性DNA由多个脱氧核苷酸N以及3’末端3-10个鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(G)组成，所述第二单链模板通过3’末端3-10个G与所述第一单链模板3’末端三个C进行互补配对。
同时，单链线性DNA与测序目标的物种来源不同，第二单链模板与第一单链模板序列需不同物种来源。
进一步的，所述单链线性DNA的核苷酸序列长度不小于30bp；
进一步的，所述单链线性DNA的核苷酸序列长度为40-200bp。
进一步的，所述单链线性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。进一步的，所述第二单链模板通过3’末端3-10个G与所述第一单链模板的3’末端三个C进行互补配对。
进一步的，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，在所使用的定量检测方法为染料法qPCR时，则包括：
设计合成上游引物和下游引物，并在反应体系中添加荧光染料；
其中，所述上游引物和所述下游引物的核苷酸序列分别位于不同的单链模板；
其中，单链模板包括第一单链模板和第二单链模板。
进一步的，所述上游引物和下游引物为扩增引物；
进一步的，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
进一步的，所述上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上。
上述，在上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上时，则下游引物的核苷酸序列位于所述第一单链模板上。
进一步的，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，基于所述染料法qPCR的荧光定量PCR扩增中，所采用的双链特异性荧光染料定量选自SYBR、Green、PicoGreen和EvaGreen中的任意一种。
在荧光定量PCR中，染料是用来检测PCR扩增产物的荧光信号的关键。这些染料能与DNA结合并发出荧光信号，可用于测量扩增反应的进程和目标序列的数量。SYBR Green、PicoGreen和EvaGreen，这些染料都是双链特异性的，它们可以与PCR扩增产物的双链DNA结合，并在反应过程中发出荧光信号。
选择其中一种染料用于荧光定量PCR的量化是根据实验需求和所研究的目标而定的。每种染料都有其特点和适用范围。其中，SYBR Green可以与所有双链DNA结合，因此适用于PCR应用。PicoGreen和EvaGreen则具有更高的特异性，可以更准确地定量低浓度的DNA样本。
进一步的，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，在所使用的定量检测方法为探针法qPCR时，则包括：
设计合成上游引物、下游引物和探针；
其中，所述上游引物、下游引物的核苷酸序列分别位于不同的单链模板；
上述，单链模板包括第一单链模板和第二单链模板。
进一步的，所述探针引物的核苷酸序列同时在所述第一单链模板与所述第二单链模板上，且覆盖第一单链和第二单链的交汇处；
进一步的，所述上游引物与下游引物为扩增引物；
进一步的，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，所述上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上。
上述，在上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上时，则下游引物的核苷酸序列位于所述第一单链模板上。
上述，在进行荧光定量PCR扩增时，使用了扩增引物来进行反应。基于所采用的方法的不同，则这些扩增引物包括上游引物和下游引物，或者上游引物、下游引物和探针。
(1)上游引物(也称为前向引物)是在PCR反应中与目标序列的上游区域相互配对的短DNA片段。
(2)下游引物(也称为反向引物)则与目标序列的下游区域相互配对。
(3)探针是一种含有荧光信号分子和靶向互补序列的短DNA或RNA片段。
具体的，当定量检测方法为染料法qPCR时，设计合成上游引物和下游引物，并在反应体系中添加荧光染料。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别位于不同的单链模板。
所述上游引物和下游引物的序列，分别位于不同的单链模板。即为如下两种情况：
(1)上游引物位于第一单链模板时，下游引物位于第二单链模板。
(2)下游引物位于第一单链模板时，上游引物位于第二单链模板。
其中，所述上游引物与下游引物为扩增引物，所述第二单链模板上引物序列为5’-ATCCATAGCTGGTCTGAGAG-3’，如SEQ ID NO:1所示；
当定量检测方法为探针法qPCR时，设计合成上游引物、下游引物以及探针引物。所述上游引物和下游引物序列分别位于不同的单链模板，即：
(1)上游引物位于第一单链模板时，下游引物位于第二单链模板。
(2)下游引物位于第一单链模板时，上游引物位于第二单链模板。
上述，所述探针引物序列同时在第一单链模板与第二单链模板上，需覆盖第一单链和第二单链的交汇处。
所述上游引物与下游引物为扩增引物，所述第二单链模板上引物序列为5’-ATCCATAGCTGGTCTGAGAG-3’(SEQ ID NO:1)。
其中，所述探针序列可以为：
(FAM)5’-TCAGCCACATTGGG+(N)x-3’(BHQ-1)，(N)x为一段特异性针对第一单链模板的序列。
例如，在进行染料法荧光定量PCR对于逆转录酶中的末端转移酶活性的测定时，采用的扩增引物，包括上游引物和下游引物；而在探针法荧光定量PCR对于逆转录酶中的末端转移酶活性的测定时，其中采用的扩增引物，就包括上游引物、下游引物和探针。
在荧光定量PCR中，这些引物和探针的设计是根据目标序列的特异性来进行的。它们会与目标序列的特定区域互补配对，并在PCR反应过程中参与DNA的扩增。探针通常含有一个荧光染料和一个辅助荧光物质(通常是一个荧光淬灭剂)，当探针与目标序列结合时，荧光信号被激活并可被检测到。
通过使用包含上游引物、下游引物和探针的荧光定量PCR体系，可以实现对产物数量的准确定量。通过荧光信号的强度，可以反映出PCR扩增过程中目标序列的起始数量，并通过比较样本间的荧光信号强度来确定不同样本中产物的量化结果。这种技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性。
需要说明的是，在荧光定量PCR扩增中，探针的设计是为了特异地与目标序列结合并进行荧光信号的激活。当第一单链模板和第二单链模板相互配对形成双链结构时，探针的序列正好位于两条单链的交汇处。这意味着，在PCR反应中，探针可以与两条单链的互补序列结合，形成一个稳定的结构。
通过这种设计，当PCR反应进行至目标序列的扩增过程中，探针会与目标序列的互补区域结合，激活荧光信号。因此，荧光信号量的增加可以作为反应进行的指标，从而用于确定目标序列的存在和扩增量。
这种设计的优势是使探针能够高度特异地与目标序列结合，增加了荧光信号的特异性和准确性。同时，通过覆盖在两条单链的结合点上，探针可以确保在PCR过程中的每个循环中都有机会与目标序列结合，增强了检测的灵敏度和稳定性。这对于准确测量目标序列的数量以及避免误报和干扰非常重要。
进一步的，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，所述探针带有可检测标记。
在荧光定量PCR中，通常会使用一种被称为探针(probe)的特殊DNA片段。这个探针通过与目标序列的互补区域结合，可以在PCR反应中产生荧光信号。这个探针上附带了一种或多种可检测的标记，例如荧光染料或荧光素等。当探针与目标序列结合后，标记的荧光信号就会被激活并发出。
因此，在荧光定量PCR扩增中，使用的探针具有一种可以检测的标记(如荧光标记)。通过探针的特异性结合，可以在PCR扩增反应中检测到目标序列的存在，并根据荧光信号的强度来定量目标序列的数量。这种方法可用于准确测量PCR扩增产物的量，并进行定量分析和相对表达水平的研究。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：
本实施例中，进行染料法荧光定量PCR对于逆转录酶中的末端转移酶活性的测定。具体步骤如下：
1、双链DNA制备
(1)第二单链模板合成
所述第二单链模板DNA oligo:5’-TACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGG-3’(SEQ ID NO.4)；
本实施例中第二单链模板来源为根癌农杆菌16S rDNA上序列。
(2)反应体系：
表1、反应体系表
| 组分 | 加量 |
| 10X逆转录buffer | 2μL |
| Oligo(dT)(10μM) | 2μL |
| dNTP(10mM) | 1μL |
| RNase Inhibitor(40U/μL) | 1μL |
| 逆转录酶 | 1μL |
| 大鼠RNA(100ng/μL) | 1μL |
| DNA oligo(10μM) | 5μL |
| RNase free ddH2O | To 20μL |
Oligo(dT)：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO.5)。
上述组分均为生工生物(上海)股份有限公司提供。
本实施例中逆转录酶为编号为A、B、C的逆转录酶，包括野生型与不同的突变型逆转录酶。
如上，第一单链模板序列来源为大鼠RNA，与第二单链模板序列不同物种来源。
(3)反应程序：
表2、反应程序表
| 反应温度 | 持续时间 |
| 25℃ | 5min |
| 55℃ | 30min |
| 85℃ | 5 |
| 自然降温 | - |
反应完成的产物为荧光定量PCR的模板。
2、染料法qPCR扩增检测
(1)引物如下：
A-F(上游引物)：5’-ATCCATAGCTGGTCTGAGAG-3’(SEQ ID NO.1)；
A-R(下游引物)：5’-ATCTCACTCTTGTGTGCTTCT-3’(SEQ ID NO.2)；
其中，所述A-F序列位于第二单链模板上，A-R序列位于第一单链模板上。
(2)荧光定量反应体系
表3、荧光定量反应体系表
| 组分 | 加量 |
| 2xSG Fast qPCR Master Mix | 10μL |
| A-F(10μM) | 0.5μL |
| A-R(10μM) | 0.5μL |
| dsDNA模板 | 1μL |
| ddH2O | To 20μL |
上述2xSG Fast qPCR Master Mix为生工生物(上海)股份有限公司提供，引物于生工生物(上海)股份有限公司合成。
(3)荧光定量反应程序
表4、荧光定量反应程序表
3、测试结果
表5、测试结果表
分析：上表为逆转录酶A、B、C号中末端转移酶性能检测定量ct值。
由上述结果可知，其中C号逆转录酶中的末端转移酶活性最高，更有利于用于后续RNA测序建库的进行。活性高低顺序为C＞A＞B。
4、应用测试
将A、B、C三款逆转录酶作为原料用于单细胞转录组RNA测序的应用。测序结果如下表。
表6、测序结果表
分析：
Median Gene per Cell每个细胞相关barcode中检测到得基因中位数，是单细胞转录组RNA测序的重点关注指标，与测序深度有关。
同样的样本类型，数值越大代表测序深度越好。
从上表可以看出，转录组测序效果最好的是编号C。与逆转录酶中的末端转移酶活性的测试结果一致。表示本测试方法，对于高通量RNA测序建库选择逆转录酶原料有很好的指导作用。
实施例2：
本实施例中，进行探针法荧光定量PCR对于逆转录酶中的末端转移酶活性的测定。具体步骤如下：
1、双链DNA制备
(1)第二单链模板合成
所述第二单链模板DNA oligo:5’
-TACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGG-3’(SEQ IDNO.4)。
本实施例中第二单链模板来源为根癌农杆菌16S rDNA上序列。
(2)反应体系
表7、反应体系表
| 组分 | 加量 |
| 10X逆转录buffer | 2μL |
| Oligo(dT)(10μM) | 2μL |
| dNTP(10mM) | 1μL |
| RNase Inhibitor(40U/μL) | 1μL |
| 逆转录酶 | 1μL |
| 大鼠RNA(100ng/μL) | 1μL |
| DNA oligo(10μM) | 5μL |
| RNase free ddH2O | To 20μL |
其中，所述Oligo(dT)：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO.5)。
上述组分均为生工生物(上海)股份有限公司提供。
本实施例中逆转录酶为编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的逆转录酶，包括市售的野生型与不同的突变型逆转录酶。如上，第一单链模板序列来源为大鼠RNA，与第二单链模板序列不同物种来源。
(3)反应程序
表8、反应程序表
| 温度 | 持续时间 |
| 25℃ | 5min |
| 55℃ | 30min |
| 85℃ | 5 |
| 自然降温 | - |
反应完成的产物为荧光定量PCR模板。
2、探针法qPCR扩增检测
(1)引物探针如下：
A-F(上游引物)：5’-ATCCATAGCTGGTCTGAGAG-3’(SEQ ID NO.1)
A-R(下游引物)：5’-ATCTCACTCTTGTGTGCTTCT-3’(SEQ ID NO.2)
A-P(探针)：(FAM)5’-TCAGCCACATTGGGCTAGCCTCTGGCA-3’(BHQ1)(SEQ ID NO.3)
所述A-F序列位于第二单链模板上，A-R序列位于第一单链模板上，A-P覆盖在第一单链和第二单链的交汇处。
(2)荧光定量反应体系
表9、荧光定量反应体系表
| 组分 | 加量 |
| 2xTaqMan Fast qPCR Master Mix | 10μL |
| A-F(10μM) | 0.4μL |
| A-R(10μM) | 0.4μL |
| A-P(10μM) | 0.4μL |
| dsDNA模板 | 1μL |
| ddH2O | To 20μL |
上述2xTaqMan Fast qPCR Master Mix为生工生物(上海)股份有限公司提供，引物探针于生工生物(上海)股份有限公司提供合成。
(3)荧光定量反应程序
表9、荧光定量反应程序表
3、测试结果
表10、测试结果表
分析：
上表为逆转录酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10号中末端转移酶性能检测定量ct值，逆转录酶为包括市售的野生型与不同的突变型逆转录酶。
由上述结果可知，其中8号逆转录酶中末端转移酶活性最高，更有利于用于后续RNA测序建库的进行。
4、应用测试
将3，7，8号三款逆转录酶作为原料用于单细胞转录组RNA测序的应用。逆转录后测得cDNA浓度如下表。可见7号失活了末端转移酶活性的逆转录酶应用于建库所得的cDNA极低，无法用于上机测序。
表11、cDNA浓度测试结果表
上机测序结果如下表。
表12、测序结果表
分析：
Median Gene per Cell每个细胞相关barcode中检测到得基因中位数，是单细胞转录组RNA测序的重点关注指标，与测序深度有关。同样的样本类型，数值越大代表测序深度越好。
从上表可以看出，转录组测序效果最好的是编号8。与逆转录酶中的末端转移酶活性的测试结果一致。表示本测试方法，对于高通量RNA测序建库选择逆转录酶原料有很好的指导作用。
总之，本发明所提供的非放射性、简便、快速的末端转移酶性能测定方法，操作过程不会产生放射性污染；操作简单快速、灵敏度高、稳定性好；可用于不同来源的逆转录酶中的TdT的活性检测；并且，针对RNA测序建库应用筛选最适的逆转录酶原料有更直观的数据比较和依据。
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量和反应容器的调整，例如采用连续流动反应器，这些都属于本发明的保护范围之内。以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种末端转移酶性能测定方法，其特征在于，包括：
S1，基于逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板；
S2，根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板；其中，所述第二单链模板的3’末端的脱氧核苷酸G与所述第一单链模板的3’末端的脱氧核苷酸C互补配对，且所述第二单链模板与所述第一单链模板的物种来源不同；
S3，通过DNA聚合酶补齐所述第一单链模板与所述第二单链模板未互补部分得到双链DNA；
S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量，并通过所述产物量确定不同逆转录酶中的末端转移酶活性性能。
2.如权利要求1所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述步骤S1，基于逆转录酶RNA依赖的DNA聚合酶活性，针对于测序目标通过所述逆转录酶得到第一单链模板，包括：
S11，根据所述逆转录酶以RNA为模板合成得到第一单链线性cDNA；
S12，在逆转录酶接触到RNA模板5’末端后，TdT在所述第一单链线性cDNA的3’末端加上非模板化的胞嘧啶残基，得到所述第一单链模板。
3.如权利要求1所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述第一单链模板和所述第二单链模板均由脱氧核苷酸A、G、C和T组成；
优选地，所述第一单链模板由不同物种真核细胞中mRNA逆转录后获得；其中，逆转录所用引物为Oligo dT或对应基因的特异引物。
4.如权利要求1所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述步骤S2，根据所述第一单链模板，合成得到第二单链模板包括：
S21，根据所述第一单链模板设计合成单链线性DNA，并将所述单链线性DNA作为所述第二单链模板；
优选地，所述单链线性DNA与所述测序目标的物种来源不同；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列选自大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌中任意一种菌株基因组的核苷酸序列；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列选自根瘤农杆菌；
优选地，所述单链线性DNA由多个脱氧核苷酸N，以及3’末端3-10个鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸组成。
5.如权利要求4所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述单链线性DNA的核苷酸序列长度不小于30bp；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列长度为40-200bp；
优选地，所述单链线性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.如权利要求1所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述第二单链模板通过3’末端3-10个G与所述第一单链模板的3’末端三个C进行互补配对。
7.如权利要求1所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，在所使用的定量检测方法为染料法qPCR时，则包括：
设计合成上游引物和下游引物，并在反应体系中添加荧光染料；
其中，所述上游引物和所述下游引物的核苷酸序列分别位于不同的单链模板；
优选地，所述上游引物和下游引物为扩增引物；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上。
8.如权利要求7所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，基于所述染料法qPCR的荧光定量PCR扩增中，所采用的双链特异性荧光染料定量选自SYBR、Green、PicoGreen和EvaGreen中的任意一种。
9.如权利要求1所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，在所使用的定量检测方法为探针法qPCR时，则包括：
设计合成上游引物、下游引物和探针；
其中，所述上游引物、下游引物的核苷酸序列分别位于不同的单链模板；
优选地，所述探针引物的核苷酸序列同时在所述第一单链模板与所述第二单链模板上，且覆盖第一单链和第二单链的交汇处；
优选地，所述上游引物与下游引物为扩增引物；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述上游引物的核苷酸序列位于所述第二单链模板上。
10.如权利要求9所述末端转移酶性能测定方法，其特征在于，所述步骤S4，对所述双链DNA进行荧光定量PCR扩增，检测得到产物量中，所述探针带有可检测标记。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311086197.0A CN117070610A (zh) | 2023-08-25 | 2023-08-25 | 一种末端转移酶性能测定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311086197.0A CN117070610A (zh) | 2023-08-25 | 2023-08-25 | 一种末端转移酶性能测定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117070610A true CN117070610A (zh) | 2023-11-17 |
Family
ID=88703951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311086197.0A Pending CN117070610A (zh) | 2023-08-25 | 2023-08-25 | 一种末端转移酶性能测定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117070610A (zh) |
-
2023
- 2023-08-25 CN CN202311086197.0A patent/CN117070610A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9518302B2 (en) | Method for direct amplification from crude nucleic acid samples | |
| JP5280841B2 (ja) | 分解核酸の分析用組成物及び方法 | |
| CA2877368C (en) | Kit for isothermal dna amplification starting from an rna template | |
| CN109022544A (zh) | 一种检测dna甲基化转移酶活性的试剂盒及其方法 | |
| Zahradnik et al. | Detection of the 35S promoter in transgenic maize via various isothermal amplification techniques: a practical approach | |
| JP6144623B2 (ja) | 核酸測定用の核酸プローブ | |
| WO2014020124A1 (en) | Means and methods for the detection of dna methylation | |
| CN108368557A (zh) | 包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法 | |
| CN113755558A (zh) | 一种基于液态芯片技术的核酸检测方法 | |
| JP7045702B2 (ja) | リアルタイムで核酸を検出するための一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法 | |
| US20140004509A1 (en) | Kit for isothermal dna amplification starting from an rna template | |
| CN109055505B (zh) | 用于测定末端转移酶活性的方法及试剂盒 | |
| US9777319B2 (en) | Method for isothermal DNA amplification starting from an RNA template | |
| CN113195734A (zh) | 通过固相分子成像检测靶核酸 | |
| CN117070610A (zh) | 一种末端转移酶性能测定方法 | |
| US20170159112A1 (en) | Amplified isothermal detection of polynucleotides with atp release | |
| JP2009504173A (ja) | 分析方法及びキット | |
| CN116249783A (zh) | 使用热稳定酶的受控且不依赖于模板的核酸合成 | |
| CN113574180A (zh) | 单一靶基因的遗传变异实时检测用单核酸及利用其的检测方法 | |
| KR100872001B1 (ko) | 이종 핵 리보뉴클레오티드 단백질 Ｂ１(ｈｎＲＮＰ Ｂ１)ｍＲＮＡ의 측정 방법 | |
| KR102599751B1 (ko) | 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 | |
| CN102301003A (zh) | 细胞角蛋白19 mRNA的测定方法 | |
| CN116287260A (zh) | 一种检测dna糖苷酶的发夹探针、生物传感器及检测方法和应用 | |
| CN116790584A (zh) | 一种等温聚合酶链反应分析仪校准试剂盒及其应用 | |
| CN116536400A (zh) | 一种高特异性等温核酸扩增方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |