CN102301003A

CN102301003A - 细胞角蛋白19 mRNA的测定方法

Info

Publication number: CN102301003A
Application number: CN2009801556784A
Authority: CN
Inventors: 尾本大辅; 齐藤寿一; 大仲悟; 林俊典
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2011-12-28
Also published as: JP5481841B2; US20110229893A1; JP2010124770A; WO2010061981A1; EP2351851A4; EP2351851B1; EP2351851A1

Abstract

细胞角蛋白19的mRNA的扩增/检测方法，在RNA扩增步骤中，通过被设计成当其与扩增后的RNA形成互补的双链时信号特性发生变化的寡核苷酸探针，经时地测定扩增后的RNA产物量，其中，所述RNA扩增步骤包括如下步骤：使用由具有与细胞角蛋白19 mRNA中的一部分同源的序列的第一引物、具有与该细胞角蛋白19 mRNA中的一部分互补的序列的第二引物(第一或第二引物中任意一个的5’末端附加有启动子序列)构成的寡核苷酸的组合，通过逆转录酶，生成含有启动子序列的双链DNA，以该双链DNA为模板、利用RNA聚合酶生成RNA转录产物，接着以该RNA转录产物为利用所述逆转录酶合成DNA的模板，生成所述双链DNA。

Description

细胞角蛋白19 mRNA的测定方法

技术领域

本发明涉及利用核酸扩增法的细胞角蛋白19 mRNA的测定方法。更准确地说，本发明提供适合一定温度(40至60℃，优选43℃)下的mRNA的扩增、检测的寡核苷酸，通过本发明，能够简便且快速地测定试样中的细胞角蛋白19 mRNA。另外，本发明还提供用于细胞角蛋白19 mRNA测定的试剂，对于分子生物学、生化学、医学领域等中的研究和诊断治疗有用。

背景技术

细胞角蛋白为形成细胞骨架的中间丝蛋白，且特征性地存在于上皮组织中。到目前为止，已鉴定出20种以上的细胞角蛋白，并且基于该蛋白的电荷而分类为酸性的I型和中性至碱性的II型。已知细胞角蛋白根据种类不同而表达位点不同，细胞角蛋白8、18、19主要在上皮细胞中表达，细胞角蛋白5、14局限于基底细胞，细胞角蛋白2、6、10、11局限于基底上的组织。

细胞角蛋白在医疗等领域中被广泛认识的一个原因在于，使用抗细胞角蛋白抗体的免疫染色经常被使用。大多数情况下，癌症的诊断通过病理学诊断进行，通常使用将怀疑有癌症的组织或细胞进行苏木精/曙红染色(HE染色)后得到的样本。但是，在HE染色中存在难以分清癌细胞和正常细胞的情况，有时癌细胞的发现会被忽略。因此，使用抗细胞角蛋白抗体的免疫组织染色经常被使用。将上皮组织以外的被检物使用抗细胞角蛋白抗体进行免疫组织染色，结果呈阳性反应时，本来应该仅在上皮组织中表达的细胞角蛋白在该组织中表达，在组织学上异常，即病理学上可判断为癌症。

已知细胞角蛋白19(以下记为“CK19”)不仅主要在上皮组织中表达，而且也在其他正常组织中少量表达，但各种癌症中其的表达的亢进是明显的。在使用上述的抗细胞角蛋白抗体的免疫染色中，也大多使用将CK19识别为抗原的抗体。CK19的这种表达特性满足作为肿瘤标记物的条件，实际中作为肿瘤标记物而被广泛使用。CK19由于在各种癌症中表达亢进，因而适用的癌症种类多，使用方法也遍及癌症的早期诊断、转移的诊断、治疗效果的监测等多方面，可以说是非常有用的肿瘤标记物。

如上所述，虽然利用病理诊断的癌症的诊断作为金标准(gold standard)而被广泛使用，但需要病理医生有较高的技术，且指出有时癌细胞的发现被忽略是由于所使用的被检物造成的。近年来，为了减少这种忽略、并且能在各医院等进行均衡的诊断，提出了遗传筛查(核酸扩增法)的使用，或者已一部分实用化。核酸扩增法的灵敏度高是已知的，能够得到用于扩增特定基因的高特异性，并且通过测定方法进行试样中的特定基因的定量也是可能的。即，还能够提供关于特定基因的表达量的大小的信息。

通常，在使用核酸扩增法的肿瘤标记物基因mRNA的检测中，RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆转录-聚合酶链反应)法作为核酸扩增法被广泛使用，且有报道称其对CK19 mRNA也适用(参见Anne-Marie，C.et al.，LaboratoryInvestigation，77，213-220(1997).(非专利文献1)；Tao，L.et al.，BritishJournal of Cancer，94，1164-1169(2006).(非专利文献2)；Wang，H.Y.etal.，International Journal of Gynecological Cancer，16，643-648(2006).(非专利文献3)；Weiggelt，B.et al.，British Journal of Cancer，90，1531-1537(2004).(非专利文献4)；Kamiya，M.et al.，British Journal ofDermatology，149，998-1005(2003).(非专利文献5)；Makino，H.etal.，Hepato-Gastroenterology，50，1407-1410(2003).(非专利文献6)；Bustin，S.A.et al.，British Journal of Cancer，79，1813-1820(1999).(非专利文献7)；Fujita，Y.et al.，Gastric Cancer，9，308-314(2006).(非专利文献8)；日本特表2003-527098号公报(专利文献2)；日本特表2005-522231号公报(专利文献3)；日本特表2008-502330号公报(专利文献4))。该扩增法，例如，在从肿瘤组织提取RNA后，需要如下两阶段的步骤(根据情况有时还需要另外实施检测步骤)：

(a)利用逆转录酶由提取的RNA合成cDNA的步骤；和

(b)通过PCR扩增该cDNA并进行检测的步骤，

因此，暗示着操作的复杂性和二次污染的危险性。另外，实施上述二阶段的步骤通常需要2小时以上，因而在多个步骤的实施所导致的重现性不良、大量被检物处理和检查成本的降低方面存在问题。为了缩短反应时间，也开发了同时进行上述二阶段的步骤的一步RT-PCR法，但被指出与分别进行各步骤的RT-PCR法相比检测灵敏度降低、容易产生非特异的扩增产物等。而且，利用PCR法的扩增由于扩增的是双链DNA，因而混入的染色体DNA也有可能被扩增，因此，为了严密地分析mRNA表达，需要进行利用DNase等的消化而完全地除去染色体DNA。因此，导致操作更加复杂和重现性不良。另外，PCR法需要急剧地使反应温度升降，因此成为自动化时反应装置的省力化和低成本化的障碍。

另外，作为其它核酸扩增法，还报道有使用RT-LAMP(ReverseTranscription-Loop mediated isothermal AMPlification，逆转录环介导等温扩增)法的CK19 mRNA的扩增、检测(参见Tujimoto，M.et al.，ClinicalCancer Research，13，4807-4816(2007).(非专利文献9)；Mike，V.etal.，International Journal of Cancer，122，2562-2567(2008).(非专利文献10)；日本特开2004-89180号公报(专利文献5))。这是通过将2种内引物、2种外引物、逆转录酶、链置换型DNA聚合酶、底物等混合并在一定温度(65℃左右)下保温而扩增目的核酸的方法。但是，上述扩增法的引物设计的数量多、并且各引物设计中存在很多限制，因此设计非常复杂。例如，需要对目的基因在3’末端、5’末端各选择3个区域(此时各区域间的距离等很重要)，并在此基础上将各区域的同源的或互补的序列组合而设计长度不同的引物。当然，由于此时各引物的Tm值和GC含量等与反应性相关联，因此能够设计引物的区域相当有限。另外，为了加快反应速度，可以使用环引物(Loop Primer)(使用环引物时检测时间缩短至30分钟左右)，但还需要设计2个引物。这样设计多个引物除了困难之外，在制造成本方面也不利。而且在LAMP法中，不直接检测扩增产物而检测反应溶液的浊度，由此相对地推测扩增产物的量。检测浊度的方法由于不直接检测扩增核酸，因此在产生非特异的扩增产物时不仅不能进行定量的检测，而且根据测定结果不能得知是否产生了非特异的扩增产物。另外，在多个引物参与反应的LAMP法中，难以完全地控制非特异的扩增产物的产生。因此，可以说该方法不适合PCR法中的一部分已经报道的如多重PCR那样、对多个肿瘤标记物同时进行扩增检测的方法。这是因为浊度检测法中不能判断对哪种肿瘤标记物进行了扩增检测。另外，LAMP法与RT-PCR法一样，也以双链DNA为模板进行扩增，因此存在扩增染色体DNA的可能性。另外，虽然利用LAMP法扩增时的温度为恒定的65℃，但在反应前后通常需要高温处理，这成为反应装置的省力化和低成本化的障碍。

另一方面，作为在一定温度下仅对RNA进行扩增的方法，报道有NASBA法(参照日本专利第2650159号公报(专利文献6)；日本专利第3152927号公报(专利文献7))、以及TMA法(参照日本专利第3241717号公报(专利文献8))等。上述RNA扩增方法，利用含有针对目的RNA的启动子序列的引物、逆转录酶以及根据需要的核糖核酸酶H(RNase H)，合成含有启动子序列的双链DNA，以该双链DNA为模板，利用RNA聚合酶生成含有来源于目的RNA的特定碱基序列的RNA，接着以该RNA为含有启动子序列的双链DNA合成的模板，进行连锁反应。并且，在RNA扩增后，通过电泳或使用结合了可检测的标记的核酸探针的杂交法等检测扩增了的RNA。

上述RNA扩增法由于在一定温度下、以一个阶段仅对RNA进行扩增，因此适合简单的RNA测定，但利用杂交法等的检测需要复杂的操作，因此不仅不适合大量被检物处理和自动化，而且存在容易导致结果重现性不良和扩增核酸的二次污染的问题。而且，通常NASBA法、TMA法得到结果均需要90分钟以上，不能快速地得到结果。另外，虽然扩增步骤在一定温度下进行，但通常在扩增步骤前需要预加热(例如，65℃)，在反应装置的省力化和低成本化方面存在问题。

作为简便地对RNA进行扩增/测定的方法，可以列举Ishiguro等的方法(参见日本特开2000-014400号公报(专利文献9)；Ishiguro，T.et al.，Analytical Biochemistry，314，1247-1252(2003).(非专利文献11))。上述方法在以嵌入性荧光色素标记的、且被设计成当其与目的核酸形成互补的双链时由于嵌入性荧光色素部分嵌入上述双链部分中而荧光特性发生变化的寡核苷酸探针的存在下，实施RNA扩增方法，并测定荧光特性的变化，其可以同时且快速简便地在一定温度、一个阶段且密闭容器内实施RNA扩增和测定。在该方法中，由于使用对扩增后的核酸特异的寡核苷酸探针，因此能够直接检测扩增后的核酸，而且通过使用多种嵌入性荧光色素，能够在对多个核酸进行扩增后检测各扩增产物。作为该方法更具体的方式，对于存在于任意的RNA中且能使该RNA区别于其他RNA的特定碱基序列，

(1)使用与该特定碱基序列的3’末端侧互补的DNA引物和RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)，以RNA为模板生成与特定序列互补的DNA；

(2)使具有核糖核酸酶H活性的酶作用于通过(1)的逆转录反应生成的RNA-DNA双链而分解RNA，从而生成单链DNA；

(3)使用与(2)中生成的单链DNA的3’末端互补的、并且其本身的5’末端具有RNA聚合酶的启动子序列的DNA引物和DNA依赖性DNA聚合酶，合成含有上述启动子序列的双链DNA；

(4)使RNA聚合酶作用于(3)中生成的双链DNA而生成转录产物(特定碱基序列的RNA)。

而且，(4)中生成的RNA转录产物是来源于特定碱基序列的RNA，因此成为上述(1)的反应中的模板，与上述(1)的反应中使用的DNA引物结合，从而发生(1)至(4)的反应，由此，引起RNA扩增的连锁反应。

该核酸扩增法的特征在于如下方面：不需要如PCR法那样升降反应液的温度，而且没有分开实施RNA的逆转录和其后的DNA扩增反应。另外，通过使可特异性地与扩增后的RNA转录产物结合的、嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针共存于反应液中，能够在扩增特定碱基序列或与该碱基序列互补的序列的同时直接检测(监测)该扩增的情况。因此，不需要像通常的RNA扩增法那样另行地进行杂交检测等，能大幅缩短得到结果为止的时间。

但是，关于适合该核酸扩增法的CK19 mRNA扩增用引物序列及其组合、以及检测用的寡核苷酸探针序列，还一无所知。这是因为，其与需要通过在反应开始时使温度暂时高于反应温度、从而使目的RNA的高级结构(superstructure)变性的步骤的PCR法、LAMP法、NASBA法、TMA法等核酸扩增法不同，该核酸扩增法通过扩增反应，在较低的一定温度(40至60℃，优选43℃)条件下进行目的mRNA的扩增检测。即，通常如mRNA那样的单链RNA容易形成高级结构是已知的，在该核酸扩增法那样的反应条件下，目的mRNA形成高级结构，由于认为其阻碍引物和探针的结合，因此最佳的引物和探针需要在无高级结构的区域中设计。作为RNA高级结构的指标，可以利用二级结构分析软件由碱基序列计算和推导二级结构，但由计算上的二级结构推导实际的高级结构极其困难。

另外，在如该核酸扩增法那样在较低温度下实施核酸扩增时，与高温下实施的PCR法相比，容易产生引物二聚体这种非特异产物，为了降低非特异产物的生成，也需要严格选择引物的组合。但是，通常使用的引物的设计法，由于以包括高温下变性的步骤(例如PCR法)为前提，因此在现有的引物设计技术中，设计适合该核酸扩增法的引物是困难的。由此，为了利用上述的在一定温度下的RNA扩增/测定方法实现快速、简便、高灵敏度的CK19 mRNA测定，需要即使在一定温度(40至60℃，优选43℃)条件下结合效率也不降低、并且可扩增、检测CK19mRNA的寡核苷酸及其组合。

发明内容

本发明的目的在于，提供对由人细胞、组织等得到的试样，在一定温度下、以一个阶段的操作快速地测定细胞角蛋白19mRNA的方法。

本发明人为了解决上述问题而反复进行了深入研究，结果构建了特异且快速地测定细胞角蛋白19(以下记为CK19)mRNA的方法。

第一发明为试样中的CK19 mRNA的测定方法，其特征在于，

上述测定方法使用了具有与CK19 mRNA内的特定碱基序列的一部分同源的序列的第一引物、以及具有与特定碱基序列的一部分互补的序列的第二引物，其中第一或第二引物中任意一个的5’末端附加有RNA聚合酶的启动子序列，且所述测定方法包括下述的步骤：

(1)以RNA为模板利用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶合成与特定碱基序列互补的cDNA的步骤；

(2)利用具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶将上述(1)的反应中得到的RNA-DNA双链的RNA分解的步骤(单链DNA的生成)；

(3)以单链DNA为模板利用具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶生成具有可转录上述特定碱基序列或与上述特定碱基序列互补的序列的RNA的启动子序列的双链DNA的步骤；

(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶以上述双链DNA为模板生成RNA转录产物的步骤；

(5)通过使该RNA转录产物成为上述(1)的反应中的cDNA合成的模板而连锁地生成RNA转录产物的步骤；和

(6)测定上述RNA转录产物量的步骤，

并且，上述第一和第二引物为以下的任意一组：

(i)上述第一引物为由以序列号1表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号5表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(ii)上述第一引物为由以序列号2表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号6表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iii)上述第一引物为由以序列号3表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号7表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iv)上述第一引物为由以序列号4表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号8表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

第二发明为第一发明所述的CK19 mRNA的测定方法，其特征在于，上述第一和第二引物为以下的任意一组：

(i)上述第一引物为由以序列号19至22中任意一个表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号29至32中的任意一个表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(ii)上述第一引物为由以序列号23或24表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号33或34表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iii)上述第一引物为由以序列号25或26表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号35或36表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iv)上述第一引物为由以序列号27或28表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，上述第二引物为由以序列号37或38表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

第三发明为第一或第二发明所述的CK19 mRNA的测定方法，其特征在于，上述(6)的步骤(测定RNA转录产物量的步骤)，通过在荧光色素标记寡核苷酸探针存在下测定上述荧光特性的变化而实现，所述荧光色素标记寡核苷酸探针被涉及成当其与目的RNA形成互补的双链时荧光特性发生变化。

第四发明为第三发明所述的测定方法，其特征在于，上述荧光色素标记寡核苷酸探针为通过连接子结合了嵌入性荧光色素的嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针。

第五发明为第四发明所述的测定方法，其特征在于，上述嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针含有由序列号39至46所示的任意一个碱基序列中或者其互补序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

第六发明为第一至第五发明所述的CK19 mRNA的测定方法，其特征在于，在上述(1)的步骤(以RNA为模板利用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶合成与特定碱基序列互补的cDNA的步骤)之前，进行如下步骤：

以CK19 mRNA中的特定碱基序列为模板，使用

(i)切断用寡核苷酸，其具有与上述特定碱基序列中的第一引物的同源区域的5’末端位点重叠的区域、以及与上述特定碱基序列中的从该位点向5’方向的相邻的区域互补的序列；和

(ii)具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶，

在上述特定碱基序列的5’末端位点切断上述RNA。

第七发明为第六发明所述的测定方法，其特征在于，上述切断用寡核苷酸为由以序列号9至18中的任意一个表示的碱基序列形成的寡核苷酸。

第八发明为上述寡核苷酸，其特征在于，其为用于特异性地扩增或检测CK19 mRNA的寡核苷酸，该寡核苷酸含有由序列号1至8或序列号39至46所示的任意一个碱基序列中或者其互补序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

第九发明为一种CK19 mRNA的测定试剂，其特征在于，含有至少一种第八发明所述的寡核苷酸。

附图说明

图1表示CK19 RNA的标准曲线。(a)表1的寡核苷酸组合[8]；(b)组合[10]；(c)组合[30]。纵轴为荧光强度比超过1.2的时间(检测时间，分钟)，横轴为以log表示的测定中使用的初期标准RNA量(拷贝数)。另外，记载有由各点求出的线性一次曲线的方程式和R²的值。

具体实施方式

以下详细地说明本发明。

本发明中的试样是指含有RNA的核酸试样。本发明使用以人细胞、人组织、体液、血液、尿、大便、淋巴液、乳汁管液或者腹腔或胸腔洗液等作为材料、基于例如日本特开平7-59572号等中记载的方法制备的试样，并对该试样直接进行测定，由此进行作为该试样来源的人细胞或组织等中所含的CK19mRNA的测定。

本发明中的特定碱基序列表示CK19 mRNA中的、与从第一引物的同源区域的5’末端到第二引物的互补区域的3’末端的碱基序列同源的RNA或DNA的碱基序列。即，在CK19 mRNA上，第一引物与自特定碱基序列的5’末端向3’方向的至少15个以上连续的碱基同源，第二引物与自特定碱基序列的3’末端向5’方向的至少15个以上连续的碱基互补。由此，在本发明中，来源于上述特定碱基序列的RNA转录产物被扩增。本发明中的第一引物的同源区域的5’末端位点由特定碱基序列内含有该同源区域的5’末端的部分序列形成，该位点是切断用寡核苷酸的互补区域与第一引物的同源区域重叠的位点。

本发明中的启动子是指RNA聚合酶结合并开始转录的位点。已知有对各种RNA聚合酶特异的启动子序列，在本发明的使用中没有特别限定启动子，但优选分子生物学实验等中通常使用的T7启动子、SP6启动子、T3启动子。另外，上述序列中可以含有涉及转录效率的附加序列。

本发明中的互补序列是指在高严谨条件下可与作为对象的碱基序列杂交的序列。作为高严谨条件的一例，可以列举本发明的实施例中记载的核酸扩增反应液组成。另外，本发明中的同源序列是指在高严谨条件下可与作为对象的碱基序列的完全互补序列杂交的序列。因此，本发明中所说的互补或同源序列只要在对高严谨条件下的杂交的特异性和效率没有影响的范围内就可以任意地设定长度等，这一点是毋庸置疑的。另外，在对杂交的特异性和效率没有影响的范围内，可以使用进行了1个至多个碱基的置换/缺失/插入的碱基序列。

本发明中的核苷酸或核酸是指由天然存在的碱基、糖和糖间键形成的核苷酸或核苷(包含RNA和DNA两者)，是包含其寡聚物(寡核苷酸，例如2至100个碱基左右)和聚合物(多核苷酸，例如100个碱基以上)的总称。本发明中的核苷酸或核酸还包含发挥同样功能的非天然存在的单体、用荧光分子以及放射性同位素标记的单体、或者含有它们的寡聚物或聚合物等。

本发明中的引物是指在核酸扩增反应中与模板杂交而开始核酸扩增反应所需的核苷酸，并优选基于核酸扩增反应中所希望扩增的模板，将引物设计为本身含有对该模板特异的序列，以使其与该模板杂交，从而能够通过PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、TMA法、3SR法、TRC法(参见专利文献9和非专利文献11)之类的核酸扩增反应获得链长或序列方面有特异性的生成物。

引物的长度设计为具有通常15至100个碱基、优选15至35个碱基的链长，但并不限于该链长。由此，本发明的第一和第二引物可以在本申请发明所记载的碱基序列的范围内、从至少15个以上连续的碱基的任意序列中选择。即，本发明中的用于CK19 mRNA检测的第一和第二引物如下：

(i)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号1所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分互补的、序列号5所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(ii)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号2所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分互补的、序列号6所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iii)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号3所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分互补的、序列号7所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；或者

(iv)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号4所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分互补的、序列号8所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

本发明中的用于CK19 mRNA检测的第一和第二引物的更优选的方式如下：

(i)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号19至22所记载的任意一个序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19mRNA的一部分互补的、序列号29至32所记载的任意一个序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(ii)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号23或24所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分互补的、序列号33或34所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iii)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号25或26所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19mRNA的一部分互补的、序列号35或36所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；或者

(iv)第一引物为由相对于与CK19 mRNA的一部分同源的、序列号27或28所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，第二引物为由相对于与CK19mRNA的一部分互补的、序列号37或38所记载的序列而言同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

作为本发明中的用于CK19 mRNA检测的第一和第二引物的优选的一个方式，可以列举：

(i)第一引物为选自序列号19至22所记载的序列中的一种寡核苷酸，第二引物为选自序列号29至32所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(ii)第一引物为选自序列号23或24所记载的序列中的一种寡核苷酸，第二引物为选自序列号33或34所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(iii)第一引物为选自序列号25或26所记载的序列中的一种寡核苷酸，第二引物为选自序列号35或36所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(iv)第一引物为选自序列号27或28所记载的序列中的一种寡核苷酸，第二引物为选自序列号37或38所记载的序列中的一种寡核苷酸。

另外，作为本发明的一个方式，CK19 mRNA在成为cDNA合成的模板之前在该RNA内的特定核酸序列的上述5’末端位点被切断。通过在特定核酸序列的5’末端位点切断，在cDNA合成后，能够通过延伸上述cDNA的3’末端而有效地合成与杂交于cDNA的第一引物的启动子序列互补的DNA链，结果形成功能性的双链DNA启动子结构。作为这样的切断方法，可以列举如下方法：通过添加具有与CK19 mRNA内的特定碱基序列的5’末端位点(包含该特定碱基序列内的5’末端位点的部分序列)重叠、并且与向5’方向的相邻的区域互补的序列的寡核苷酸(以下记为切断用寡核苷酸)，形成RNA-DNA双链，利用具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶等切断RNA-DNA双链的RNA部分。该切断用寡核苷酸的3’末端所具有的羟基，为了防止延伸反应而被实施适当的修饰，优选使用例如进行了氨基化等的羟基。

在本发明优选的一个方式中，作为切断用寡核苷酸，可以列举由相对于与CK19 mRNA的一部分互补的、序列号9至18所记载的序列而言同源的序列形成的寡核苷酸。

本发明中的目的RNA表示RNA转录产物上的特定碱基序列中除上述引物的同源或互补区域以外的序列，且具有可与嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针互补地结合的序列。由此，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针成为与本发明中的特定碱基序列的一部分互补或者同源的序列。本发明的一个方式中，作为嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针可以列举：含有由相对于与CK19 mRNA的一部分互补的、序列号39至46所记载的序列而言同源或者互补的序列的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的探针。

作为本发明中的用于CK19 mRNA检测的寡核苷酸的组合的一个方式，可以列举：

(i)切断用寡核苷酸为由与序列号9至12所记载的任意一个序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由与序列号1所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列，并且特定核酸序列中的该引物的同源区域的5’末端位点与序列号9至12所记载的序列的互补区域重叠)，第二引物为由与序列号5所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为含有由与序列号39至41所记载的任意一个序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的探针；

(ii)切断用寡核苷酸为由与序列号13或14所记载的序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由与序列号2所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列，并且特定核酸序列中的该引物的同源区域的5’末端位点与序列号13或14所记载的序列的互补区域重叠)，第二引物为由与序列号6所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为含有由与序列号42或43所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的探针；

(iii)切断用寡核苷酸为由与序列号15或16所记载的序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由与序列号3所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列，并且特定核酸序列中的该引物的同源区域的5’末端位点与序列号15或16的序列的互补区域重叠)，第二引物为由与序列号7所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为含有由与序列号44或45所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的探针；

(iv)切断用寡核苷酸为由与序列号17或18所记载的序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由与序列号4所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列，并且特定核酸序列中的该引物的同源区域的5’末端位点与序列号17或18的序列的互补区域重叠)，第二引物为由与序列号8所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为含有由与序列号46所记载的序列同源的序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的探针。需要说明的是，在(i)中，需要设计为嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针的互补序列与第一引物的同源序列以及第二引物的互补序列不重叠。

作为本发明中的用于CK19 mRNA检测的寡核苷酸的组合的更优选的方式，可以列举：

(i)切断用寡核苷酸为由序列号9所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号19所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号29或30所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号39或40所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(ii)切断用寡核苷酸为由序列号9所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号19所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号31或32所记载的序列的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号39至41所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(iii)切断用寡核苷酸为由序列号10所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号20所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号29或30所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号39或40所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(iv)切断用寡核苷酸为由序列号10所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号20所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号31或32所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号39至41所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(v)切断用寡核苷酸为由序列号11所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号21所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号29或30所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为由序列号40所记载的序列形成的寡核苷酸；

(vi)切断用寡核苷酸为由序列号11所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号21所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号31或32所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号40或41所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(vii)切断用寡核苷酸为由序列号12所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号22所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号29或30所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为由序列号40所记载的序列形成的寡核苷酸；

(viii)切断用寡核苷酸为由序列号12所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号22所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号31或32所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号40或41所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(ix)切断用寡核苷酸为由序列号13所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号23所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号33或34所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号42或43所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(x)切断用寡核苷酸为由序列号14所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号24所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号33或34所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号42或43所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(xi)切断用寡核苷酸为由序列号15所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号25所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号35或36所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号44或45所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(xii)切断用寡核苷酸为由序列号16所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号26所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号35或36所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为选自序列号44或45所记载的序列中的一种寡核苷酸；

(xiii)切断用寡核苷酸为由序列号17所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号27所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号37或38所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为由序列号46所记载的序列形成的寡核苷酸；

(xiv)切断用寡核苷酸为由序列号18所记载的序列形成的寡核苷酸，第一引物为由序列号28所记载的序列形成的寡核苷酸(需要说明的是，第一引物的5’末端具有启动子序列)，第二引物为选自序列号37或38所记载的序列中的一种寡核苷酸，嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针为由序列号46所记载的序列形成的寡核苷酸。

在本发明的CK19 mRNA的测定方法中，需要各种酶(以单链RNA为模板的具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶(逆转录酶)、具有RNase H活性的酶、以单链DNA为模板的具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶、以及具有RNA聚合酶活性的酶)。各酶可以使用兼有几种活性的酶，也可以使用具有单一活性的多种酶。另外，不仅可以在以单链RNA为模板的具有RNA依赖性DNA聚合酶活性、RNase H活性和以单链DNA为模板的DNA依赖性DNA聚合酶活性三种活性的逆转录酶中添加具有RNA聚合酶活性的酶，而且可以根据需要进一步添加具有RNase H活性的酶。上述逆转录酶优选为分子生物学实验等中常用的AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶或者它们的衍生物，最优选AMV逆转录酶及其衍生物。另外，作为上述具有RNA聚合酶活性的酶，可以例示分子生物学实验等中常用的噬菌体来源的T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶以及它们的衍生物。

在本发明的一个方式中，对试样中的CK19 mRNA添加上述切断用寡核苷酸，利用上述逆转录酶的RNase H活性在上述特定碱基序列的5’末端位点切断上述RNA。以切断后的上述RNA为模板、在上述第一和第二引物的存在下利用上述逆转录酶实施逆转录反应时，第二引物与CK19 mRNA内的特定碱基序列结合，并利用上述逆转录酶的RNA依赖性DNA聚合酶活性进行cDNA合成。所得到的RNA-DNA双链，RNA部分由于上述逆转录酶的RNase H活性而被分解、解离，从而第一引物与上述cDNA结合。接着，利用上述逆转录酶的DNA依赖性DNA聚合酶活性，生成来源于特定碱基序列且5’末端具有启动子序列的双链DNA。该双链DNA在启动子序列下游含有特定碱基序列，利用上述RNA聚合酶生产来源于特定碱基序列的RNA转录产物。该RNA转录产物成为利用上述第一和第二引物合成上述双链DNA的模板，一系列的反应连锁地进行，上述RNA转录产物逐渐被扩增。

为了使这样的连锁反应进行，作为上述各种酶所必需的已知要素，至少含有缓冲剂、镁盐、钾盐、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸这一点毋庸置疑。另外，作为用于调节反应效率的添加剂，可以添加二甲亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清清蛋白(BSA)、糖等。

例如，使用AMV逆转录酶和T7 RNA聚合酶时，优选将反应温度设定在35至65℃的范围内，更优选设定在40至60℃的范围内，进一步优选的方式是反应温度为43℃。上述RNA扩增步骤在一定温度下进行，可以将反应温度设定为逆转录酶和RNA聚合酶显示出活性的任意温度。

扩增后的RNA转录产物量可以通过已知的核酸测定方法进行测定。作为上述测定方法，可以列举使用了电泳或液相色谱法的方法、利用以可检测的标记标记后的核酸探针的杂交法等。但是，这些方法的操作均为多个步骤，而且由于将扩增产物取出到体系外进行分析，因此成为二次污染的原因的、扩增产物向环境中飞散的危险性大。为了克服这些问题，优选使用被涉及成当其与目的核酸互补结合时荧光特性发生变化的寡核苷酸探针。作为该寡核苷酸探针，可以使用被称为分子信标(molecular beacon)的、利用了FRET的已知的探针，但从探针设计和探针合成的容易性出发，作为更优选的方法，可以列举如下方法：在以嵌入性荧光色素标记的、且被设计成当其与目的核酸形成互补的双链时由于嵌入性荧光色素部分嵌入上述互补的双链部分而荧光特性发生变化的寡核苷酸探针的存在下，实施上述核酸扩增步骤，并测定荧光特性的变化(参见专利文献9和非专利文献11)。

作为上述嵌入性荧光色素，没有特别的限定，可以使用常用的噁唑黄、噻唑橙、溴化乙锭以及它们的衍生物等。作为上述荧光特性的变化，可以列举荧光强度的变化。例如，已知在噁唑黄的情况下，通过插入双链DNA中，510nm的荧光(激发波长490nm)显著地增加。上述嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针具有如下结构：在与上述RNA转录产物上的目的RNA互补的寡核苷酸中，末端、磷酸二酯部或碱基部分通过适当的连接子结合有嵌入性荧光色素，进而以防止自3’末端的羟基开始的延伸为目的对该3’末端的羟基进行适当的修饰(参见专利文献9和非专利文献11)。

嵌入性荧光色素对寡核苷酸的标记，可以通过已知的方法向寡核苷酸中导入官能团，从而使嵌入性荧光色素结合到寡核苷酸上(参见专利文献9和非专利文献11)。另外，作为上述官能团的导入方法，还可以使用市售的Label-ON Reagents(Clontech公司制)等。

作为本发明的一个方式，提供如下方法：向试样中添加至少含有5’末端具有T7启动子序列(序列号47)的第一引物、第二引物、嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针、切断用寡核苷酸、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶、缓冲剂、镁盐、钾盐、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、二甲亚砜(DMSO)的扩增试剂，在反应温度为40至60℃(优选43℃)的一定温度下使其反应，同时经时地测定反应液的荧光强度。

在上述方式中，由于经时地测定荧光强度，因此可以确认到荧光增加显著的任意时间结束测定，且通常可以使核酸扩增和测定在总计30分钟以内结束。

作为本发明的一个方式，测定上述试样中的CK19 mRNA，通过比较所得到的荧光强度比的信息和测定已知浓度的CK19RNA时荧光强度比的信息，能够算出试样中存在的特定碱基序列的量(对象RNA拷贝数)。特定碱基序列的检测，可以采用例如对进行了一定时间的上述反应的反应液使用可与特定碱基序列互补地结合的固定化和标记化探针的夹心分析法，但如前所述，优选使用与特定碱基序列特异性地结合的嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针的方法。另外，由于该探针不阻碍上述RNA扩增反应，因此特别优选在其存在下实施上述特定碱基序列的扩增、并监测特定碱基序列的扩增情况的方法。而且，在嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针共存下进行特定碱基序列的扩增时，为了不使该探针部分发挥作为延伸反应的引物的功能，例如优选在其3’末端附加羟基乙酸或生物素等。然后，通过荧光检测器测定扩增反应中该嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针与特定碱基序列结合而产生的荧光信号，将由其曲线(profile)得到的信息(例如荧光色素产生的荧光的强度达到一定强度为止所需要的反应时间等)与由已知量的标准RNA的曲线得到的信息进行比较，由此能够确认是否存在特定碱基序列、或者由扩增后的特定碱基序列的量(RNA拷贝数)推测试样中存在的特定核酸序列的量(对象RNA拷贝数)。

另外，上述测定试剂中所含的全部试样可封入一个容器中这一点值得特别说明。即，只要实施将一定量的试样分注到所述一个容器中的操作，则此后可以自动地测定CK19 mRNA。为了例如能从外部测定荧光色素产生的信号，只要该容器的至少一部分由透明的材料构成即可，可在分注试样后可密封的容器在防止污染方面特别优选。

上述方式的RNA扩增/测定方法由于可以一个阶段、在一定温度下实施，因此可以说是比RT-PCR简便且适合自动化的方法。根据本发明，CK19 mRNA的高特异性、高灵敏度、快速、简便、在一定温度下且以一个阶段直接进行扩增/检测成为可能。

在本发明中，基于试样中的目的RNA(CK19基因的mRNA)，合成5’末端具有DNA依赖性RNA聚合酶的启动子区域的双链DNA，以上述DNA为模板生成大量的单链RNA，并且生成的单链RNA量显著地增大，用嵌入性荧光色素标记后的寡核苷酸探针与生成的单链RNA互补结合，由此测定荧光增加，在上述的步骤中，通过分析荧光强度增加的过程，能简便且快速地确定初始RNA量。本发明的CK19 mRNA测定方法中，核酸扩增和测定的时间在30分以内，其与已知的利用RT-PCR法(通常2小时以上)、NASBA法(90分钟以上)、TMA法(90分钟以上)、RT-LAMP法(通常30至60分钟左右)的测定相比，具有同等以上的快速性。

另外，提供用于以一个阶段的操作扩增/检测CK19基因的mRNA的寡核苷酸，即提供用于扩增CK19 mRNA的寡核苷酸、以及用于检测CK19 mRNA的寡核苷酸，由此，能够为生化学/分子生物学/医疗领域等提供利用了上述寡核苷酸的简便、快速且高灵敏度的CK19 mRNA表达细胞的测定方法、以及定量试剂。

实施例

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但这些仅仅是示例，本发明并不限于这些实施例。

实施例1标准RNA的制备

后述的实施例中使用的CK19 RNA(以下记为标准RNA)通过(1)至(2)所示的方法进行制备。

(1)克隆在GenBank中登记的CK19的碱基序列(GenBankAccession No.NM_002276、1490个碱基)中的第160至1353位碱基(1194个碱基)的双链DNA。

(2)以(1)中制备的双链DNA为模板，实施体外转录。接着通过DNase I处理将该双链DNA完全消化，然后提纯并制备RNA。该RNA通过测定260nm下的吸光度而定量。

实施例2嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针的制备

制作用嵌入性荧光色素标记了的寡核苷酸探针。使用Label-ON Reagents(Clontech公司制)将氨基导入序列号39所记载的序列的自5’末端起第9位的T、序列号40所记载的序列的自5’末端起第12位的T、序列号41所记载的序列的自5’末端起第13位的A、序列号42所记载的序列的自5’末端起第13位的C、序列号43所记载的序列的自5’末端起第7位的T、序列号44所记载的序列的自5’末端起第11位的G、序列号45所记载的序列的自5’末端起第10位的C、序列号46所记载的序列的自5’末端起第9位的G的位置，进而用生物素修饰3’末端。对上述氨基标记作为嵌入性荧光色素的噁唑黄，制备噁唑黄标记寡核苷酸探针(序列号39至46)(参见Ishiguro，T.et al.，Nucleic Acids Res.，24，4992-4997(1996).(非专利文献12))。

实施例3 CK19 RNA的测定(之1)

使用表1中示出的组合中[1]至[28]所示的切断用寡核苷酸、第一引物、第二引物、嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针(以下记为INAF探针)，通过(1)至(4)所示的方法，进行标准RNA的测定。需要说明的是，表1中，序列号19至22是序列号1的部分序列，序列号23和24是序列号2的部分序列，序列号25和26是序列号3的部分序列，序列号27和28是序列号4的部分序列，序列号29至32是序列号5的部分序列，序列号33和34是序列号6的部分序列，序列号35和36是序列号7的部分序列，序列号37和38是序列号8的部分序列。

表1

(1)使用RNA稀释液(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.1mM EDTA、0.5U/μL核糖核酸酶抑制剂、5.0mM DTT)，将实施例1中制备的标准RNA稀释至10³拷贝/5μL，将其作为RNA试样使用。

(2)将以下组成的反应液20.0μL分注到容积0.5mL的PCR用管(Individual PCR tube with dome cap、SSI制)中，并向其中添加上述RNA试样5μL。

反应液的组成(浓度为添加酶溶液后(30μL中)的最终浓度)

60.0mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.6)

18.0mM氯化镁

100mM氯化钾

1.0mM DTT

各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP

各3.0mM ATP、CTP、UTP、GTP

3.6mM ITP

1.0μM第一引物(就该引物而言，各序列号记载的碱基序列的5’末端附加有T7启动子序列(序列号47))

1.0μM第二引物

0.16μM切断用寡核苷酸(该寡核苷酸的3’末端的羟基被氨基化)

20.0nM INAF探针

6.0U核糖核酸酶抑制剂(宝生物公司制)

13.0％DMSO

体积调整用蒸馏水

(3)将上述的反应液在43℃下保温5分钟后，添加以下组成且预先在43℃下保温2分钟后的酶液5.0μL。

酶液的组成(反应时(30μL中)的最终浓度)

2.0％山梨糖醇

6.4U AMV逆转录酶(LIFE SCIENCE CO，.LTD.制)

142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen Corporation公司制)

3.6μg牛血清清蛋白(宝生物公司制)

体积调整用蒸馏水

(4)接着，使用可直接对PCR管进行测定的带有温度调节功能的荧光分光光度计，在43℃下进行反应的同时经时地测定反应溶液的荧光强度(激发波长470nm、荧光波长510nm)30分钟。

将添加酶时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(预定时刻的荧光强度值÷背景荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，表2示出了将此时的时间作为检测时间的结果。

表2

寡核苷酸的组合	检测时间[分钟](10³拷贝/test)
		[1]	15.62
[2]	15.40
		[3]	13.49
[4]	15.83
		[5]	12.91
[6]	9.29
		[7]	9.46
[8]	8.01
		[9]	10.68
[10]	9.29
		[11]	11.54
[12]	10.15
		[13]	10.74
[14]	9.68
		[15]	12.01
[16]	10.56
		[17]	10.96
[18]	14.30
		[19]	11.23
[20]	11.84
		[21]	9.12
[22]	9.85
		[23]	9.75
[24]	10.24
		[25]	14.03
[26]	12.39
		[27]	10.03
[28]	10.04

在表1的组合中，

(i)第一引物由序列号1的部分序列形成、第二引物由序列号5的部分序列形成的组合(组合[1]至[8])；

(ii)第一引物由序列号2的部分序列形成、第二引物由序列号6的部分序列形成的组合(组合[9]至[16])；

(iii)第一引物由序列号3的部分序列形成、第二引物由序列号7的部分序列形成的组合(组合[17]至[24])；以及

(iv)第一引物由序列号4的部分序列形成、第二引物由序列号8的部分序列形成的组合(组合[25]至[28])，

均在20分钟以内检测出10³拷贝/5μL的标准RNA。需要说明的是，在对照试验区(代替标准RNA而将RNA稀释液添加到反应液中进行测定)，从反应开始起到30分钟后荧光强度比也没有超过1.2。

该结果表明，通过使用下述组合中的任意一组进行RNA扩增反应，与利用现有技术中最常用的RT-PCR法的CK19 mRNA的检测方法(通常2小时以上)相比，能更快速地检测出CK19RNA，

(i)第一引物为由序列号1所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸、第二引物为由序列号5所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的组合；

(ii)第一引物为由序列号2所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸、第二引物为由序列号6所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的组合；

(iii)第一引物为由序列号3所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸、第二引物为由序列号7所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的组合；或者

(iv)第一引物为由序列号4所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸、第二引物为由序列号8所示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸的组合。

实施例4 CK19 RNA的测定(之2)

使用本发明的寡核苷酸的组合，测定比实施例3的浓度低的标准RNA。

(1)实验方法

除了将寡核苷酸的组合以及RNA试样变更为下述内容之外，通过与实施例3同样的方法实施。

寡核苷酸的组合：

使用表1所示组合中的组合[5]至[8]、[10]、[12]、[14]、[16]、[20]至[22]、[24]、[27]至[30]。

RNA试样：

使用实施例3(1)中使用的RNA稀释液，将实施例1中制备的标准RNA稀释至50拷贝/5μL、10²拷贝/5μL和10³拷贝/5μL，作为RNA试样使用。

(2)实验结果

将添加酶时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(预定时刻的荧光强度值÷背景荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，表3示出了将此时的时间作为检测时间的结果。

表3

此次研究的所有寡核苷酸的组合，均在20分钟以内检测出50拷贝/5μL的标准RNA。以上表明，通过使用本发明的寡核苷酸的组合扩增CK19 RNA，即使是50拷贝/5μL的低浓度CK19RNA也能够快速地检测出来。

实施例5特异性评价

对在使用本发明的寡核苷酸的组合的CK19 RNA的扩增检测体系中、对于其他细胞角蛋白RNA的交叉反应性进行了研究。

(1)细胞角蛋白18(以下记为“CK18”)RNA以及细胞角蛋白20(以下记为“CK20”)RNA的制备

(1-1)克隆在GenBank中登记的CK18的碱基序列(GenBank Accession No.NM_000224、1485个碱基)中的第110至1434位的碱基(1325个碱基)、以及在GenBank中登记的CK20的碱基序列(GenBank Accession No.NM_019010、1817个碱基)中的第40至1710位的碱基(1671个碱基)的双链DNA。

(1-2)以(1-1)中制备的双链DNA为模板，实施体外转录。接着通过DNase I处理将该双链DNA完全消化，然后提纯并制备RNA。该RNA通过测定260nm下的吸光度而定量。

(1-3)使用RNA稀释液(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.1mM EDTA、0.5U/μL核糖核酸酶抑制剂、5.0mM DTT)，将(1-2)中制备的标准RNA稀释至10¹⁰拷贝/5μL。

(2)实验方法

寡核苷酸的组合：

使用表1所示组合中的组合[8]、[10]、[21]、[28]。

需要说明的是，组合[8]相当于第一引物由序列号1的部分序列形成、第二引物由序列号5的部分序列形成的组合；

组合[10]相当于第一引物由序列号2的部分序列形成、第二引物由序列号6的部分序列形成的组合；

组合[21]相当于第一引物由序列号3的部分序列形成、第二引物由序列号7的部分序列形成的组合；

组合[28]相当于第一引物由序列号4的部分序列形成、第二引物由序列号8的部分序列形成的组合。

RNA试样：

RNA试样中，CK19使用实施例3中使用的试样，CK18和CK20使用本实施例的(1)中制备的试样。

(3)实验结果

将添加酶时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(预定时刻的荧光强度值÷背景荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，表4示出了将此时的时间作为检测时间的结果。需要说明的是，表4中的N.D.表示添加酶30分钟后荧光强度比小于1.2(判定为阴性)的试样。

表4

此次研究的寡核苷酸的组合，均只检测出CK19 RNA，另一方面，即使CK18和CK20为10¹⁰拷贝/5μL这样量非常大的RNA试样也没有检测出来。以上的结果表明，使用本发明的寡核苷酸的组合的CK19 RNA的扩增检测体系，能特异性地检测出细胞角蛋白中的CK19。

实施例6 CK19 RNA的测定(之3)

使用本发明的寡核苷酸的组合，测定各种浓度的标准RNA，确认检测时间与初始标准RNA之间的关系。

(1)实验方法

除了将寡核苷酸的组合、RNA试样变更为下述内容之外，通过与实施例3同样的方法进行测定。

寡核苷酸的组合：

使用表1所示组合中的[8]、[10]和[30]。

RNA试样：

使用实施例3(1)中使用的RNA稀释液，将实施例1中制备的标准RNA稀释至10²拷贝/5μL、10³拷贝/5μL、10⁴拷贝/5μL和10⁵拷贝/5μL，作为RNA试样使用。

(2)实验结果

将添加酶时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(预定时刻的荧光强度值÷背景荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，表5中示出了将此时的时间作为检测时间的结果，基于表5的结果制成标准曲线的结果示于图1。另外，测定10²拷贝/5μL的RNA试样时的反应开始后20分钟后的荧光强度比也一起记载于表5。

表5

此次研究的所有寡核苷酸的组合，均在添加酶后15分钟以内检测出所测定的所有浓度的标准RNA。另外，以检测时间为纵轴、初始标准RNA浓度量(将拷贝数以log表示的值)为横轴作图，结果是，此次研究的所有组合中，自10²拷贝的低拷贝区域开始检测时间依赖于初始RNA量，标准曲线可以近似地制成线性一次曲线。即表明，对未知试样进行本发明的CK19 mRNA的测定，将所得的检测时间应用于图1所示的标准曲线，由此可推测出未知试样中所含的CK19 mRNA的量。

实施例7 CK19 RNA的测定(之4)

使用本发明的寡核苷酸的组合，进行人的肺腺癌来源的培养细胞提取物中的CK19 mRNA的定量。

(1)培养细胞的获得

人肺腺癌来源的培养细胞(PC-3)通过人类科学资源研究库(Health Science Research Resources Bank，HSRRB)获得(HSRRB No.JCRB0077)。

(2)培养细胞的培养

PC-3细胞的培养以HSRRB的主页(http://cellbank.nibio.go.jp/celldata/jcrb0077.htm)中记载的培养基、培养条件进行培养。

(3)淋巴细胞的分离

采集健康人的血液(全血)，使用Ficoll-Paque PLUS(GEHEALTHCARE BIO-SCIENCES KK.制)，根据附带的手册进行淋巴细胞的分离。

(4)RNA的提取

对所培养的PC-3细胞测定细胞数而制成5个细胞、50个细胞、5×10²个细胞、5×10³个细胞，制作上述细胞单独、或者将上述细胞与5×10⁶个细胞的淋巴细胞混合的试样，利用RNeasyMini Kit(QIAGEN公司制)，根据试剂盒附带的手册进行RNA的提取。需要说明的是，RNA提取试样的量为50μL。

(5)CK19 RNA的测定

寡核苷酸的组合：

使用表1所示的组合中的组合[10]。

RNA试样：

将本实施例的(4)中记载的RNA提取试样使用实施例3(1)记载的RNA稀释液稀释10倍后，使用其中的5μL。

(6)实验结果

将添加酶时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(预定时刻的荧光强度值÷背景荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，将此时的时间作为检测时间的结果示于表6(来自PC-3细胞的RNA提取试样)和表7(来自PC-3细胞和淋巴细胞的混合物的RNA提取试样)，另外，将基于表6和表7的检测时间与实施例6中得到的标准曲线(图1(b))计算各RNA试样中所含的CK19 RNA量的结果示于表8(来自PC-3细胞的RNA提取试样)和表9(来自PC-3细胞和淋巴细胞的混合物的RNA提取试样)。

表6

表7

表8

表9

来自培养PC-3细胞的RNA提取试样、以及来自上述细胞和淋巴细胞的混合物的RNA提取试样，由标准曲线求出的各RNA试样中的CK19 mRNA量均与所使用的培养PC-3细胞的细胞数大致成比例，表明使用本发明的寡核苷酸的CK19 RNA的扩增检测法依赖于浓度。

实施例8 CK19 RNA扩增产物的碱基序列解析

进行由实施例7得到的核酸扩增反应后的试样中所含的双链DNA的碱基序列分析。碱基序列分析的结果是，在所有的试样中，均通过使用的寡核苷酸的组合确认了相当于CK19 mRNA发生扩增时的碱基序列。

即表明，在本发明中扩增检测出的是CK19 RNA，其他非特异性的RNA没有扩增检测出来。虽然实施例7所示的RNA提取物中除CK19 RNA之外还混入了各种RNA，但本发明的测定方法仅扩增检测出CK19 RNA，可以说特异性非常高。另外，即使在大量夹杂物(CK19 mRNA以外的RNA)存在的情况下，依赖于所使用的培养细胞数、且来自非常少量的培养细胞(5个细胞)的提取物，也可以测定，可以说是灵敏度非常高且准确性优良的测定方法。

以上表明，本发明的CK19 mRNA的测定方法能够特异地、并且快速且高灵敏度地测定未知试样中所含的CK19 mRNA，进而可以通过使用标准曲线进行定量。

产业上的可利用性

根据本发明，能够在较低温度且一定温度(40至60℃、优选43℃)条件下，以一个阶段的操作特异地、并且快速且高灵敏度地扩增细胞角蛋白19(CK19)RNA，并且直接地检测扩增产物。

Claims

1.一种试样中的细胞角蛋白19(以下记为“CK19”)mRNA的测定方法，其特征在于，

所述测定方法使用了具有与CK19 mRNA内的特定碱基序列的一部分同源的序列的第一引物、以及具有与特定碱基序列的一部分互补的序列的第二引物，其中第一或第二引物中任意一个的5’末端附加有RNA聚合酶的启动子序列，且所述测定方法包括下述的步骤：

(2)利用具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶将所述(1)的反应中得到的RNA-DNA双链的RNA分解的步骤(单链DNA的生成)；

(3)以单链DNA为模板利用具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶生成具有可转录所述特定碱基序列或与所述特定碱基序列互补的序列的RNA的启动子序列的双链DNA的步骤；

(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶以所述双链DNA为模板生成RNA转录产物的步骤；

(5)通过使该RNA转录产物成为所述(1)的反应中的cDNA合成的模板而连锁地生成RNA转录产物的步骤；和

(6)测定所述RNA转录产物量的步骤，

并且，所述第一和第二引物为以下的任意一组：

(i)所述第一引物为由以序列号1表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号5表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(ii)所述第一引物为由以序列号2表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号6表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iii)所述第一引物为由以序列号3表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号7表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；和

(iv)所述第一引物为由以序列号4表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号8表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的CK19 mRNA的测定方法，其特征在于，所述第一和第二引物为以下的任意一组：

(i)所述第一引物为由以序列号19至22中任意一个表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号29至32中任意一个表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(ii)所述第一引物为由以序列号23或24表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号33或34表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；

(iii)所述第一引物为由以序列号25或26表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号35或36表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸；和

(iv)所述第一引物为由以序列号27或28表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸，所述第二引物为由以序列号37或38表示的碱基序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的CK19 mRNA的测定方法，其特征在于，所述(6)的步骤(测定RNA转录产物量的步骤)，通过在荧光色素标记寡核苷酸探针存在下测定所述荧光特性的变化而实现，所述荧光色素标记寡核苷酸探针被设计成当其与目的RNA形成互补的双链时荧光特性发生变化。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述荧光色素标记寡核苷酸探针为通过连接子结合了嵌入性荧光色素的嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述嵌入性荧光色素标记寡核苷酸探针含有由序列号39至46所示的任意一个碱基序列中或者其互补序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的CK19 mRNA的测定方法，其特征在于，在所述(1)的步骤(以RNA为模板利用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶合成与特定碱基序列互补的cDNA的步骤)之前，进行如下步骤：

以CK19 mRNA中的特定碱基序列为模板，使用

(i)切断用寡核苷酸，其具有与所述特定碱基序列中的第一引物的同源区域的5’末端位点重叠的区域、以及与所述特定碱基序列中的从该位点向5’方向的相邻的区域互补的序列；和

(ii)具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶，

在所述特定碱基序列的5’末端位点切断所述RNA。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述切断用寡核苷酸为由以序列号9至18中任意一个表示的碱基序列形成的寡核苷酸。

8.一种寡核苷酸，其特征在于，其为用于特异性地扩增或检测CK19 mRNA的寡核苷酸，该寡核苷酸含有由序列号1至8或序列号39至46所示的任意一个碱基序列中或者其互补序列中的至少15个连续的碱基形成的寡核苷酸。

9.一种CK19 mRNA的测定试剂，其特征在于，含有至少一种权利要求8所述的寡核苷酸。