JP2003289869A - 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 - Google Patents
非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａ
ｖｉｕｍ Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡの特
異的な切断・増幅・検出及び同定を高感度で行なうため
に有用なオリゴヌクレオチド及びそれらを用いたＭｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｐｓｔ Ｓ−３遺
伝子に由来するＲＮＡの検出法を提供する。 【解決手段】非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子または当該遺伝子
に由来するＲＮＡと特異的に結合可能である、特定の配
列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴ
ヌクレオチド、そして、ＲＮＡ増幅行程を利用した検出
法において、第一のプライマーとして少なくとも連続し
た１０塩基以上からなる特定のオリゴヌクレオチド、第
二のプライマーとして少なくとも連続した１０塩基以上
からなり、第一のプライマーとは異なる特定のオリゴヌ
クレオチドを用いることを特徴とする検出法。
ｖｉｕｍ Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡの特
異的な切断・増幅・検出及び同定を高感度で行なうため
に有用なオリゴヌクレオチド及びそれらを用いたＭｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｐｓｔ Ｓ−３遺
伝子に由来するＲＮＡの検出法を提供する。 【解決手段】非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子または当該遺伝子
に由来するＲＮＡと特異的に結合可能である、特定の配
列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴ
ヌクレオチド、そして、ＲＮＡ増幅行程を利用した検出
法において、第一のプライマーとして少なくとも連続し
た１０塩基以上からなる特定のオリゴヌクレオチド、第
二のプライマーとして少なくとも連続した１０塩基以上
からなり、第一のプライマーとは異なる特定のオリゴヌ
クレオチドを用いることを特徴とする検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は臨床検査における非
定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ検
出用のオリゴヌクレオチドおよび検出法に関するもので
ある。本発明で提供されるオリゴヌクレオチドはＲＮＡ
やＤＮＡの切断、増幅そして検出といった操作を行なう
遺伝子診断用の試薬として、またＲＮＡの逆転写や翻訳
を阻害するための試薬として有効である。
定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ検
出用のオリゴヌクレオチドおよび検出法に関するもので
ある。本発明で提供されるオリゴヌクレオチドはＲＮＡ
やＤＮＡの切断、増幅そして検出といった操作を行なう
遺伝子診断用の試薬として、またＲＮＡの逆転写や翻訳
を阻害するための試薬として有効である。
【０００２】
【従来の技術】非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｖｉｕｍ（Ｍ．ａｖｉｕｍ）は同じく非定型抗酸
菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒｅとともにＭＡＣ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる菌種
に属している。ＭＡＣは肺に基礎疾患を持つ患者に肺結
核類似症を引き起こし、日本では非結核性抗酸菌感染症
の約７０％を占めている。また、ＭＡＣは一般に各種抗
菌剤に対して耐性を持っている。
ｍ ａｖｉｕｍ（Ｍ．ａｖｉｕｍ）は同じく非定型抗酸
菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒｅとともにＭＡＣ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる菌種
に属している。ＭＡＣは肺に基礎疾患を持つ患者に肺結
核類似症を引き起こし、日本では非結核性抗酸菌感染症
の約７０％を占めている。また、ＭＡＣは一般に各種抗
菌剤に対して耐性を持っている。
【０００３】従来、Ｍ．ａｖｉｕｍをはじめとする非定
型抗酸菌の同定は主として培養検査を基本としていた
が、検査が煩雑で同定に３〜４週間という日時を要し、
また同一菌種の中でも定型的な性状を示さない菌株もあ
り、非定型抗酸菌の同定にはある程度の熟練を必要とし
ていた。
型抗酸菌の同定は主として培養検査を基本としていた
が、検査が煩雑で同定に３〜４週間という日時を要し、
また同一菌種の中でも定型的な性状を示さない菌株もあ
り、非定型抗酸菌の同定にはある程度の熟練を必要とし
ていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、現在利
用されている検査法は実際の医療現場で必要とされてい
る迅速な検出や治療効果確認のための用途に必ずしも答
えるものではなく、生菌のみを検出するとともに、さら
なる高感度、迅速な検出法の出現が望まれている。ま
た、検査をより簡便にするためには自動化された検査装
置の開発が要求されている。
用されている検査法は実際の医療現場で必要とされてい
る迅速な検出や治療効果確認のための用途に必ずしも答
えるものではなく、生菌のみを検出するとともに、さら
なる高感度、迅速な検出法の出現が望まれている。ま
た、検査をより簡便にするためには自動化された検査装
置の開発が要求されている。
【０００５】高感度な検出法としては標的核酸を増幅す
る方法の利用が可能である。特定ＲＮＡ配列の増幅法と
しては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的
作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や
３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを
鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写
酵素、およびリボヌクレアーゼＨにより、プロモーター
配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳
型としてＲＮＡポリメラーゼにより、標的ＲＮＡの特定
塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプ
ロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連
鎖反応を行なうものである。
る方法の利用が可能である。特定ＲＮＡ配列の増幅法と
しては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的
作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や
３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを
鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写
酵素、およびリボヌクレアーゼＨにより、プロモーター
配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳
型としてＲＮＡポリメラーゼにより、標的ＲＮＡの特定
塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプ
ロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連
鎖反応を行なうものである。
【０００６】このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的低
温（例えば４１℃）で反応を行なうために、標的ＲＮＡ
が分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反
応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、
増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行なうことで、標
的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を
向上させるための操作が必要であった。またさらには、
低温でＲＮＡの検出を行なう場合にも前記のような分子
構造を形成したＲＮＡに対して結合し得るオリゴヌクレ
オチドが必要であった。
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的低
温（例えば４１℃）で反応を行なうために、標的ＲＮＡ
が分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反
応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、
増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行なうことで、標
的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を
向上させるための操作が必要であった。またさらには、
低温でＲＮＡの検出を行なう場合にも前記のような分子
構造を形成したＲＮＡに対して結合し得るオリゴヌクレ
オチドが必要であった。
【０００７】そこで本願発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来する
ＲＮＡを比較的低温かつ一定温度（３５℃から５０℃、
好ましくは４１℃）で特異的に切断したり、増幅した
り、これらの検出および同定を高感度で行なうために有
用なオリゴヌクレオチドおよび好適な組み合わせの提供
を目的とするものである。
ｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来する
ＲＮＡを比較的低温かつ一定温度（３５℃から５０℃、
好ましくは４１℃）で特異的に切断したり、増幅した
り、これらの検出および同定を高感度で行なうために有
用なオリゴヌクレオチドおよび好適な組み合わせの提供
を目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来す
るＲＮＡを切断、検出または増幅するために必要なオリ
ゴヌクレオチドであり、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−
３遺伝子ＤＮＡまたは当該遺伝子に由来するＲＮＡと特
異的に結合可能な、配列番号１から１２に示したいずれ
かの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドである。
になされた本願請求項１の発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来す
るＲＮＡを切断、検出または増幅するために必要なオリ
ゴヌクレオチドであり、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−
３遺伝子ＤＮＡまたは当該遺伝子に由来するＲＮＡと特
異的に結合可能な、配列番号１から１２に示したいずれ
かの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドである。
【０００９】本願請求項２の発明は、前記請求項１の発
明に係わり、前記オリゴヌクレオチドの一部が当該ＲＮ
Ａの特定の部位に結合することにより当該特定部位にお
いて当該ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチドプ
ローブであることを特徴とする。本願請求項３の発明
は、前記請求項１の発明に係わり、前記オリゴヌクレオ
チドがＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーであることを特徴とする。本願請求項４の発明
は、前記請求項１の発明に係わり、前記オリゴヌクレオ
チドの一部が修飾され、または検出可能な標識物質によ
り標識されたオリゴヌクレオチドプローブであることを
特徴とする。そして本願請求項５の発明は、前記オリゴ
ヌクレオチドの塩基の一部がオリゴヌクレオチドプロー
ブとしての機能を損なわない範囲で変換された合成オリ
ゴヌクレオチドであることを特徴とする。
明に係わり、前記オリゴヌクレオチドの一部が当該ＲＮ
Ａの特定の部位に結合することにより当該特定部位にお
いて当該ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチドプ
ローブであることを特徴とする。本願請求項３の発明
は、前記請求項１の発明に係わり、前記オリゴヌクレオ
チドがＤＮＡ伸長反応のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーであることを特徴とする。本願請求項４の発明
は、前記請求項１の発明に係わり、前記オリゴヌクレオ
チドの一部が修飾され、または検出可能な標識物質によ
り標識されたオリゴヌクレオチドプローブであることを
特徴とする。そして本願請求項５の発明は、前記オリゴ
ヌクレオチドの塩基の一部がオリゴヌクレオチドプロー
ブとしての機能を損なわない範囲で変換された合成オリ
ゴヌクレオチドであることを特徴とする。
【００１０】本願請求項６の発明は、Ｍ．ａｖｉｕｍの
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡの増幅行程であ
り、試料中に存在するＭ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３
遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、
リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲ
ＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖のＤＮ
Ａを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによ
り、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列か
らなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポ
リメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ
転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅行
程において、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に
由来するＲＮＡに相同的な配列を有する配列番号１３に
示した配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からな
る第一のプライマーと、配列番号４に示した配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上からなる、増幅される
Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮ
Ａ配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー
（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方
は、その５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列を含む）を用いることを特徴とする。
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡの増幅行程であ
り、試料中に存在するＭ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３
遺伝子に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、
リボヌクレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲ
ＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖のＤＮ
Ａを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによ
り、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列か
らなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポ
リメラーゼ存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ
転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅行
程において、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に
由来するＲＮＡに相同的な配列を有する配列番号１３に
示した配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からな
る第一のプライマーと、配列番号４に示した配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上からなる、増幅される
Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮ
Ａ配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー
（ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方
は、その５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列を含む）を用いることを特徴とする。
【００１１】本願請求項７の発明は、前記請求項６の発
明に係わり、前記ＲＮＡ増幅行程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、か
つ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することからなる（ただし該標識されたオリゴヌ
クレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異
なる配列である）。本願請求項８の発明は、前記請求項
７の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ
転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように
設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光
特性が変化するものであることを特徴とする。そして本
願請求項９の発明は、前記請求項８の発明に係わり、前
記オリゴヌクレオチドが、配列番号１４に示したいずれ
かの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からな
る、またはその相補配列であることを特徴とする。以
下、本発明を詳細に説明する。
明に係わり、前記ＲＮＡ増幅行程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、か
つ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することからなる（ただし該標識されたオリゴヌ
クレオチドは、前記第一および第二のプライマーとは異
なる配列である）。本願請求項８の発明は、前記請求項
７の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ
転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように
設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光
特性が変化するものであることを特徴とする。そして本
願請求項９の発明は、前記請求項８の発明に係わり、前
記オリゴヌクレオチドが、配列番号１４に示したいずれ
かの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からな
る、またはその相補配列であることを特徴とする。以
下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】本願発明のオリゴヌクレオチドは、前記し
たＲＮＡの増幅に際して、標的ＲＮＡの分子内構造フリ
ーな領域に対して特異的に相補結合を形成するオリゴヌ
クレオチドであり、前記したような熱変性を行なうこと
なしに標的ＲＮＡと特異的に結合する。このように本願
発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃から５０℃、
好ましくは４１℃）で、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−
３遺伝子に由来するＲＮＡの分子内構造フリー領域に対
して結合するオリゴヌクレオチドであり、Ｍ．ａｖｉｕ
ｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを特異的に
切断、増幅、または検出等するために有用なオリゴヌク
レオチドである。より具体的には、本願発明は前記標的
ＲＮＡを特定の位置で切断するためのオリゴヌクレオチ
ドプローブ、ＰＣＲ法によって前記標的ＤＮＡを増幅す
るためのオリゴヌクレオチドプライマー、ＮＡＳＢＡ法
等によって前記標的ＲＮＡを増幅するためのオリゴヌク
レオチドプライマー、そしてかかる増幅なしに、あるい
はかかる増幅の後に標的核酸を検出等するためのオリゴ
ヌクレオチドプローブとして利用することで、迅速かつ
高感度な検出を達成するためのオリゴヌクレオチドであ
る。
たＲＮＡの増幅に際して、標的ＲＮＡの分子内構造フリ
ーな領域に対して特異的に相補結合を形成するオリゴヌ
クレオチドであり、前記したような熱変性を行なうこと
なしに標的ＲＮＡと特異的に結合する。このように本願
発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃から５０℃、
好ましくは４１℃）で、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−
３遺伝子に由来するＲＮＡの分子内構造フリー領域に対
して結合するオリゴヌクレオチドであり、Ｍ．ａｖｉｕ
ｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを特異的に
切断、増幅、または検出等するために有用なオリゴヌク
レオチドである。より具体的には、本願発明は前記標的
ＲＮＡを特定の位置で切断するためのオリゴヌクレオチ
ドプローブ、ＰＣＲ法によって前記標的ＤＮＡを増幅す
るためのオリゴヌクレオチドプライマー、ＮＡＳＢＡ法
等によって前記標的ＲＮＡを増幅するためのオリゴヌク
レオチドプライマー、そしてかかる増幅なしに、あるい
はかかる増幅の後に標的核酸を検出等するためのオリゴ
ヌクレオチドプローブとして利用することで、迅速かつ
高感度な検出を達成するためのオリゴヌクレオチドであ
る。
【００１３】配列番号１から１２はＭ．ａｖｉｕｍのＰ
ｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを切断、増幅また
は検出等するために有用な本願発明のオリゴヌクレオチ
ドの一例を示すものである。ここで、Ｍ．ａｖｉｕｍの
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡとは、これら遺
伝子を鋳型として製造されるＲＮＡをも含む。本願発明
のオリゴヌクレオチドは、配列番号１から１２としてそ
れぞれ記載した全塩基配列を含むものであっても良い
が、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来する
ＲＮＡとの特異的な結合には１０塩基程度あれば十分で
あることから、それぞれ記載した塩基配列のうち少なく
とも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド
であれば良い。
ｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを切断、増幅また
は検出等するために有用な本願発明のオリゴヌクレオチ
ドの一例を示すものである。ここで、Ｍ．ａｖｉｕｍの
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡとは、これら遺
伝子を鋳型として製造されるＲＮＡをも含む。本願発明
のオリゴヌクレオチドは、配列番号１から１２としてそ
れぞれ記載した全塩基配列を含むものであっても良い
が、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来する
ＲＮＡとの特異的な結合には１０塩基程度あれば十分で
あることから、それぞれ記載した塩基配列のうち少なく
とも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド
であれば良い。
【００１４】本願発明のオリゴヌクレオチドは、例えば
ＲＮＡ切断用のプローブとして使用できる。標的ＲＮＡ
を特定の位置で切断しようとする場合、本願発明のオリ
ゴヌクレオチドを一本鎖の標的ＲＮＡとハイブリダイズ
させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ異核二重鎖部分のＲＮＡのみを切
断する酵素を作用させれば良い。当該酵素としては、通
常リボヌクレアーゼＨ活性を有するとして知られている
酵素を用いれば良い。
ＲＮＡ切断用のプローブとして使用できる。標的ＲＮＡ
を特定の位置で切断しようとする場合、本願発明のオリ
ゴヌクレオチドを一本鎖の標的ＲＮＡとハイブリダイズ
させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ異核二重鎖部分のＲＮＡのみを切
断する酵素を作用させれば良い。当該酵素としては、通
常リボヌクレアーゼＨ活性を有するとして知られている
酵素を用いれば良い。
【００１５】本願発明のオリゴヌクレオチドは、例えば
核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用
できる。本願発明のオリゴヌクレオチドをプライマーと
して核酸増幅法を実施すれば、標的核酸すなわちＭ．ａ
ｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子の核酸のみを増幅可能
である。増幅法としてはＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢ
Ａ法、３ＳＲ法等が例示できるが、中でもＬＣＲ法、Ｎ
ＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度で実施できる核酸増
幅法が好ましい。この増幅産物を様々な方法により検出
等することで、Ｍ．ａｖｉｕｍの検出が可能となる。こ
の場合、増幅で使用したオリゴヌクレオチド以外の上記
オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して良いし、
増幅された特定配列の断片を電気泳動により確認しても
良い。
核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用
できる。本願発明のオリゴヌクレオチドをプライマーと
して核酸増幅法を実施すれば、標的核酸すなわちＭ．ａ
ｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子の核酸のみを増幅可能
である。増幅法としてはＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢ
Ａ法、３ＳＲ法等が例示できるが、中でもＬＣＲ法、Ｎ
ＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度で実施できる核酸増
幅法が好ましい。この増幅産物を様々な方法により検出
等することで、Ｍ．ａｖｉｕｍの検出が可能となる。こ
の場合、増幅で使用したオリゴヌクレオチド以外の上記
オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して良いし、
増幅された特定配列の断片を電気泳動により確認しても
良い。
【００１６】本願発明のオリゴヌクレオチドは、例えば
その一部を修飾しまたは検出可能な標識物質により標識
することにより、プローブとして使用することができ
る。標的核酸を検出しようとする場合、検出可能な標識
物質により標識された本願発明のオリゴヌクレオチドを
一本鎖の標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ズしたプローブについて前記標識を検出等すれば良い。
標識の検出等は、標識物質に適した方法を採用すればよ
く、例えば、オリゴヌクレオチドの標識にインターカレ
ーター性蛍光色素を用いた場合には、標的核酸とオリゴ
ヌクレオチドプローブからなる二本鎖核酸にインターカ
レーションすることで蛍光強度が増加する性質の色素等
を用いれば、標的核酸とハイブリダイズしていないプロ
ーブを除去等することなく、ハイブリダイズしたプロー
ブのみを検出することが容易に実施できる。通常の蛍光
色素等を標識として使用した場合には、標的核酸とハイ
ブリダイズしていないプローブを除去等した後に検出す
れば良い。なお、検出にあたっては、試料中の標的核酸
をＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法といった様々な核
酸増幅法により検出可能な量まで増幅させることが望ま
しく、中でもＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸
増幅法が最も望ましい。他方で、上記オリゴヌクレオチ
ドを標識したプローブを増幅の際に反応液中に共存させ
る場合は、プローブがヌクレオチドプライマーとして機
能しないように、例えば３’末端にグリコール酸を付加
する等の修飾を行なうことが特に望ましい。
その一部を修飾しまたは検出可能な標識物質により標識
することにより、プローブとして使用することができ
る。標的核酸を検出しようとする場合、検出可能な標識
物質により標識された本願発明のオリゴヌクレオチドを
一本鎖の標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ズしたプローブについて前記標識を検出等すれば良い。
標識の検出等は、標識物質に適した方法を採用すればよ
く、例えば、オリゴヌクレオチドの標識にインターカレ
ーター性蛍光色素を用いた場合には、標的核酸とオリゴ
ヌクレオチドプローブからなる二本鎖核酸にインターカ
レーションすることで蛍光強度が増加する性質の色素等
を用いれば、標的核酸とハイブリダイズしていないプロ
ーブを除去等することなく、ハイブリダイズしたプロー
ブのみを検出することが容易に実施できる。通常の蛍光
色素等を標識として使用した場合には、標的核酸とハイ
ブリダイズしていないプローブを除去等した後に検出す
れば良い。なお、検出にあたっては、試料中の標的核酸
をＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法といった様々な核
酸増幅法により検出可能な量まで増幅させることが望ま
しく、中でもＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸
増幅法が最も望ましい。他方で、上記オリゴヌクレオチ
ドを標識したプローブを増幅の際に反応液中に共存させ
る場合は、プローブがヌクレオチドプライマーとして機
能しないように、例えば３’末端にグリコール酸を付加
する等の修飾を行なうことが特に望ましい。
【００１７】また本発明は、試料中のＭ．ａｖｉｕｍの
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを増幅するため
の核酸増幅行程や、核酸増幅行程によって生成したＲＮ
Ａ転写産物の検出法を提供する。本発明の増幅行程は、
ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法を含むが、中でも逆
転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によっ
て（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作
用するような条件下で反応させ）Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓ
ｔ Ｓ−３遺伝子に由来する特定ＲＮＡ配列を増幅する
ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ま
しい。
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを増幅するため
の核酸増幅行程や、核酸増幅行程によって生成したＲＮ
Ａ転写産物の検出法を提供する。本発明の増幅行程は、
ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法を含むが、中でも逆
転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用によっ
て（逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作
用するような条件下で反応させ）Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓ
ｔ Ｓ−３遺伝子に由来する特定ＲＮＡ配列を増幅する
ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ま
しい。
【００１８】例えばＮＡＳＢＡ法は、試料中に存在する
Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮ
Ａの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレアーゼＨに
よってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖
ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特定配列または前
記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な
プロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そし
て該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ
転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳
型となるようなＲＮＡ増幅行程であるが、本発明はＭ．
ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡに
相同的な配列を有する配列番号１３に示した配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上からなる第一のプライマ
ーと、配列番号４に示した配列中の少なくとも連続した
１０塩基以上からなる、増幅されるＭ．ａｖｉｕｍのＰ
ｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡ配列の一部と相補
的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または
第二のプライマーのいずれか一方は、その５’末端側に
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮ
Ａの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレアーゼＨに
よってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖
ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特定配列または前
記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な
プロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そし
て該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡ
転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ合成の鋳
型となるようなＲＮＡ増幅行程であるが、本発明はＭ．
ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡに
相同的な配列を有する配列番号１３に示した配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上からなる第一のプライマ
ーと、配列番号４に示した配列中の少なくとも連続した
１０塩基以上からなる、増幅されるＭ．ａｖｉｕｍのＰ
ｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡ配列の一部と相補
的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一または
第二のプライマーのいずれか一方は、その５’末端側に
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
【００１９】なお、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ
は特に限定しないが、これらの活性のすべてを有してい
るＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファ
ージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメ
ラーゼが好ましい。
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ
は特に限定しないが、これらの活性のすべてを有してい
るＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファ
ージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメ
ラーゼが好ましい。
【００２０】上記増幅行程では、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓ
ｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡ配列の中で特定配列
とする領域の５’末領域と重複（１〜１０塩基）して隣
接する領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドを添加
し、前記Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来
するＲＮＡを特定配列の５’末領域で切断（リボヌクレ
アーゼＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることに
より、特定配列が５’末端に位置していないＭ．ａｖｉ
ｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡをも増幅
することができる。この切断のためには、たとえば、配
列番号１から１２のオリゴヌクレオチド（ただし、前記
増幅行程において第二のプライマーとして使用したもの
以外のオリゴヌクレオチド）を使用することができる。
なお、前記切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端から
の伸長反応をおさえるために３’末水酸基が化学的に修
飾（たとえばアミノ化）されたものであることが望まし
い。
ｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡ配列の中で特定配列
とする領域の５’末領域と重複（１〜１０塩基）して隣
接する領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドを添加
し、前記Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来
するＲＮＡを特定配列の５’末領域で切断（リボヌクレ
アーゼＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることに
より、特定配列が５’末端に位置していないＭ．ａｖｉ
ｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡをも増幅
することができる。この切断のためには、たとえば、配
列番号１から１２のオリゴヌクレオチド（ただし、前記
増幅行程において第二のプライマーとして使用したもの
以外のオリゴヌクレオチド）を使用することができる。
なお、前記切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端から
の伸長反応をおさえるために３’末水酸基が化学的に修
飾（たとえばアミノ化）されたものであることが望まし
い。
【００２１】以上の核酸増幅方法で得られた増幅産物は
既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な
態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリン
カーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させ
たもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１
９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７）。
既知の核酸検出方法で検出することができるが、好適な
態様では前記核酸増幅をインターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチド存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが望ましい。該オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のリンにリン
カーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させ
たもので、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないことを特徴とする（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１
９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７）。
【００２２】該オリゴヌクレオチドの配列は、増幅産物
の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に
限定しないが、配列番号１４に示した配列中の少なくと
も連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配
列であることが好ましい。また、該オリゴヌクレオチド
をプライマーとした伸長反応を抑えるために該オリゴヌ
クレオチドの３’末の水酸基は化学的に修飾（たとえば
グリコール酸付加）することが望ましい。
の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に
限定しないが、配列番号１４に示した配列中の少なくと
も連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配
列であることが好ましい。また、該オリゴヌクレオチド
をプライマーとした伸長反応を抑えるために該オリゴヌ
クレオチドの３’末の水酸基は化学的に修飾（たとえば
グリコール酸付加）することが望ましい。
【００２３】これにより、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ
−３遺伝子に由来するＲＮＡの中の特定配列と同じ配列
からなるＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で
増幅し、検出することが可能となり、自動化への適用も
容易となる。
−３遺伝子に由来するＲＮＡの中の特定配列と同じ配列
からなるＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で
増幅し、検出することが可能となり、自動化への適用も
容易となる。
【００２４】
【発明の実施の形態】以下、本願発明を実施例により詳
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。 実施例 １ 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ
のＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡに対して４１
℃で特異的に結合するオリゴヌクレオチドを選択した。
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。 実施例 １ 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ
のＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡに対して４１
℃で特異的に結合するオリゴヌクレオチドを選択した。
【００２５】（１）Ｍ．ａｖｉｕｍの塩基配列のうち、
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来する領域を含む標準ＲＮＡ
（１２６４塩基、配列番号１５）を２６０ｎｍの紫外部
吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））を用い０．８４４ｐｍｏ
ｌ／μＬとなるよう希釈した。
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来する領域を含む標準ＲＮＡ
（１２６４塩基、配列番号１５）を２６０ｎｍの紫外部
吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））を用い０．８４４ｐｍｏ
ｌ／μＬとなるよう希釈した。
【００２６】（２）以下の組成の反応液１４μＬをＰＣ
Ｒ用チューブ（容量０．５ｍＬ；ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ、パ
ーキンエルマー製）に分注した。
Ｒ用チューブ（容量０．５ｍＬ；ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ、パ
ーキンエルマー製）に分注した。
【００２７】反応液の組成（各濃度は最終反応液量１５
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ６Ｕ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）
製） １ｍＭ ＤＴＴ ０．０６６μＭ 標準ＲＮＡ ０．２μＭ オリゴヌクレオチド（以下のオリゴヌクレ
オチドのうち、いずれか１つを使用した。なお塩基番号
はＭ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３領域遺伝子の開始位
置（配列番号１５の１０１番目の塩基）を１としてい
る。） ＭＡＰ−１Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号５４か
ら７３に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１） ＭＡＰ−２Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１２９
から１４８に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
６） ＭＡＰ−３Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１７６
から１９５に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２） ＭＡＰ−４Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１９０
から２１２に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
３） ＭＡＰ−５Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号２３０
から２４９に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
７） ＭＡＰ−６Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号２９２
から３１１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
４） ＭＡＰ−７Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号３５５
から３７４に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
５） ＭＡＰ−８Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号３９２
から４１１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
８） ＭＡＰ−９Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号４９３
から５１２に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
９） ＭＡＰ−１０Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号５４
０から５５９に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
６） ＭＡＰ−１１Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号５７
７から５９６に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
７） ＭＡＰ−１２Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号６１
０から６２９に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２０） ＭＡＰ−１３Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号６６
６から６８５に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２１） ＭＡＰ−１４Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号７１
２から７３１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２２） ＭＡＰ−１５Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号７４
７から７６６に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
８） ＭＡＰ−１６Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号７９
３から８１２に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
９） ＭＡＰ−１７Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号８６
２から８８１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
１０） ＭＡＰ−１８Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号８８
９から９０８に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２３） ＭＡＰ−１９Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号９５
５から９７４に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
１１） ＭＡＰ−２０Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１０
５２から１０７３に相補的なオリゴヌクレオチド、配列
番号１２） 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後８Ｕ／μＬ
のＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製、本酵素はＤＮＡ
／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡを切断する酵素である）を含む
溶液を１μＬ添加した。
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ６Ｕ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）
製） １ｍＭ ＤＴＴ ０．０６６μＭ 標準ＲＮＡ ０．２μＭ オリゴヌクレオチド（以下のオリゴヌクレ
オチドのうち、いずれか１つを使用した。なお塩基番号
はＭ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３領域遺伝子の開始位
置（配列番号１５の１０１番目の塩基）を１としてい
る。） ＭＡＰ−１Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号５４か
ら７３に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１） ＭＡＰ−２Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１２９
から１４８に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
６） ＭＡＰ−３Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１７６
から１９５に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２） ＭＡＰ−４Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１９０
から２１２に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
３） ＭＡＰ−５Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号２３０
から２４９に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
７） ＭＡＰ−６Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号２９２
から３１１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
４） ＭＡＰ−７Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号３５５
から３７４に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
５） ＭＡＰ−８Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号３９２
から４１１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
８） ＭＡＰ−９Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号４９３
から５１２に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号１
９） ＭＡＰ−１０Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号５４
０から５５９に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
６） ＭＡＰ−１１Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号５７
７から５９６に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
７） ＭＡＰ−１２Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号６１
０から６２９に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２０） ＭＡＰ−１３Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号６６
６から６８５に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２１） ＭＡＰ−１４Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号７１
２から７３１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２２） ＭＡＰ−１５Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号７４
７から７６６に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
８） ＭＡＰ−１６Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号７９
３から８１２に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
９） ＭＡＰ−１７Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号８６
２から８８１に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
１０） ＭＡＰ−１８Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号８８
９から９０８に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
２３） ＭＡＰ−１９Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号９５
５から９７４に相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号
１１） ＭＡＰ−２０Ｒ（Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子の塩基番号１０
５２から１０７３に相補的なオリゴヌクレオチド、配列
番号１２） 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後８Ｕ／μＬ
のＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製、本酵素はＤＮＡ
／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡを切断する酵素である）を含む
溶液を１μＬ添加した。
【００２８】（４）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で
１０分間保温した。
１０分間保温した。
【００２９】（５）反応後の切断断片を確認するため、
尿素変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度
６％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染
色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）に
より行なった。標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオ
チドが結合すると、ＡＭＶ逆転写酵素のリボヌクレアー
ゼＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡが切断
され、特定バンドが検出される。
尿素変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度
６％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染
色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）に
より行なった。標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオ
チドが結合すると、ＡＭＶ逆転写酵素のリボヌクレアー
ゼＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡが切断
され、特定バンドが検出される。
【００３０】電気泳動結果を（白黒反転）を図１に示し
た。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合し
た場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖長
の分解産物を生じる。表１にはオリゴヌクレオチドが標
準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待されるバ
ンドの鎖長を示した。ＭＡＰ−１Ｒ、ＭＡＰ−３Ｒ、Ｍ
ＡＰ−４Ｒ、ＭＡＰ−６Ｒ、ＭＡＰ−７Ｒ、ＭＡＰ−１
０Ｒ、ＭＡＰ−１１Ｒ、ＭＡＰ−１５Ｒ、ＭＡＰ−１６
Ｒ、ＭＡＰ−１７Ｒ、ＭＡＰ−１９Ｒ、ＭＡＰ−２０Ｒ
の場合に特定のバンドが確認された。これから、これら
のオリゴヌクレオチドは４１℃一定の状態でＭ．ａｖｉ
ｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡに強く結
合していることが示された。なお、表１中の塩基番号は
配列番号１５に示した塩基配列のうち、Ｐｓｔ Ｓ−３
遺伝子の開始位置（配列番号１５の１０１番目の塩基）
を１とした時の番号である。また表中の丸は特異バンド
のみが認められること、三角は特異バンドが見られるが
非特異バンドも認められること、バツは特異バンドが認
められなかったことをそれぞれ示す。
た。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合し
た場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖長
の分解産物を生じる。表１にはオリゴヌクレオチドが標
準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待されるバ
ンドの鎖長を示した。ＭＡＰ−１Ｒ、ＭＡＰ−３Ｒ、Ｍ
ＡＰ−４Ｒ、ＭＡＰ−６Ｒ、ＭＡＰ−７Ｒ、ＭＡＰ−１
０Ｒ、ＭＡＰ−１１Ｒ、ＭＡＰ−１５Ｒ、ＭＡＰ−１６
Ｒ、ＭＡＰ−１７Ｒ、ＭＡＰ−１９Ｒ、ＭＡＰ−２０Ｒ
の場合に特定のバンドが確認された。これから、これら
のオリゴヌクレオチドは４１℃一定の状態でＭ．ａｖｉ
ｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡに強く結
合していることが示された。なお、表１中の塩基番号は
配列番号１５に示した塩基配列のうち、Ｐｓｔ Ｓ−３
遺伝子の開始位置（配列番号１５の１０１番目の塩基）
を１とした時の番号である。また表中の丸は特異バンド
のみが認められること、三角は特異バンドが見られるが
非特異バンドも認められること、バツは特異バンドが認
められなかったことをそれぞれ示す。
【００３１】
【表１】
実施例 ２
Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮ
Ａに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。
Ａに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。
【００３２】（１）実施例１と同様のＭ．ａｖｉｕｍの
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子標準ＲＮＡ（配列番号１５）を２
６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａ
ｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））を用
い、１０3コピー／５μＬとなるよう希釈した。コント
ロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子標準ＲＮＡ（配列番号１５）を２
６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａ
ｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））を用
い、１０3コピー／５μＬとなるよう希釈した。コント
ロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。
【００３３】（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．
５ｍＬ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−
Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキ
ンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬ
を添加した。
５ｍＬ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−
Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキ
ンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬ
を添加した。
【００３４】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
１の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表２に示す組み合わせにな
るよう溶液を調製した。
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
１の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表２に示す組み合わせにな
るよう溶液を調製した。
【００３５】（４）上記の反応液を４１℃で５分間保温
後、以下の組成の酵素液５μＬを添加した。
後、以下の組成の酵素液５μＬを添加した。
【００３６】酵素液の組成（各数値は最終反応液量３０
μＬにおける値） ２．０％ ソルビトール ３．６μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。
μＬにおける値） ２．０％ ソルビトール ３．６μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。
【００３７】（６）反応後のＲＮＡ増幅部分を確認する
ため、アガロースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動
を実施した。電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
ＩＩ（宝酒造製）により行なった。標的ＲＮＡの特定
部位にオリゴヌクレオチドプローブが結合すると第２オ
リゴヌクレオチドと第３オリゴヌクレオチドに挟まれた
部分のＲＮＡが増幅され、特定バンドが観察される。
ため、アガロースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動
を実施した。電気泳動後の染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
ＩＩ（宝酒造製）により行なった。標的ＲＮＡの特定
部位にオリゴヌクレオチドプローブが結合すると第２オ
リゴヌクレオチドと第３オリゴヌクレオチドに挟まれた
部分のＲＮＡが増幅され、特定バンドが観察される。
【００３８】電気泳動結果の写真（白黒反転）を図２に
示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖長は表２
に示した通りである。これより表２に示したオリゴヌク
レオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応におい
て、組み合わせ（ａ）にて特定バンドが確認できたた
め、この組み合わせで使用したオリゴヌクレオチドは
Ｍ．ａｖｉｕｍの検出に有効であることが示された。
示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖長は表２
に示した通りである。これより表２に示したオリゴヌク
レオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応におい
て、組み合わせ（ａ）にて特定バンドが確認できたた
め、この組み合わせで使用したオリゴヌクレオチドは
Ｍ．ａｖｉｕｍの検出に有効であることが示された。
【００３９】
【表２】
表２は本実験系で用いた第１、第２、第３オリゴヌクレ
オチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いてＲ
ＮＡ増幅反応させたときに増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３'末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち、５'末端第１番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモー
ター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。ま
た塩基番号は配列番号１５のうち、Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝
子の開始位置を１としたときの番号である。
オチドの組み合わせ、およびその組み合わせを用いてＲ
ＮＡ増幅反応させたときに増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３'末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち、５'末端第１番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの領域はＴ７プロモー
ター領域であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの領域はエンハンサー配列である。ま
た塩基番号は配列番号１５のうち、Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝
子の開始位置を１としたときの番号である。
【００４０】第１オリゴヌクレオチド
ＭＡＰ−３Ｓ（配列番号２４、塩基番号１７２から１９
５） ＭＡＰ−４Ｓ（配列番号２５、塩基番号１８９から２１
２） ＭＡＰ−１０Ｓ（配列番号２６、塩基番号５３７から５
５９） ＭＡＰ−１１Ｓ（配列番号２７、塩基番号５７３から５
９６） ＭＡＰ−１５Ｓ（配列番号２８、塩基番号７４３から７
６６） 第２オリゴヌクレオチド ＭＡＰ−３Ｆ（配列番号２９、塩基番号１９０から２０
７） ＭＡＰ−４Ｆ（配列番号３０、塩基番号２０７から２２
９） ＭＡＰ−１０Ｆ（配列番号３１、塩基番号５５４から５
７６） ＭＡＰ−１１Ｆ（配列番号３２、塩基番号５９１から６
１３） ＭＡＰ−１５Ｆ（配列番号３３、塩基番号７６１から７
８３） 第３オリゴヌクレオチド ＭＡＰ−６Ｒ（配列番号４、塩基番号２９２から３１
１） ＭＡＰ−７Ｒ（配列番号５、塩基番号３５５から３７
４） ＭＡＰ−１５Ｒ（配列番号８、塩基番号７４７から７６
６） ＭＡＰ−１７Ｒ（配列番号１０、塩基番号８６２から８
８１） 実施例 ３ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、標的Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来
するＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行なっ
た。
５） ＭＡＰ−４Ｓ（配列番号２５、塩基番号１８９から２１
２） ＭＡＰ−１０Ｓ（配列番号２６、塩基番号５３７から５
５９） ＭＡＰ−１１Ｓ（配列番号２７、塩基番号５７３から５
９６） ＭＡＰ−１５Ｓ（配列番号２８、塩基番号７４３から７
６６） 第２オリゴヌクレオチド ＭＡＰ−３Ｆ（配列番号２９、塩基番号１９０から２０
７） ＭＡＰ−４Ｆ（配列番号３０、塩基番号２０７から２２
９） ＭＡＰ−１０Ｆ（配列番号３１、塩基番号５５４から５
７６） ＭＡＰ−１１Ｆ（配列番号３２、塩基番号５９１から６
１３） ＭＡＰ−１５Ｆ（配列番号３３、塩基番号７６１から７
８３） 第３オリゴヌクレオチド ＭＡＰ−６Ｒ（配列番号４、塩基番号２９２から３１
１） ＭＡＰ−７Ｒ（配列番号５、塩基番号３５５から３７
４） ＭＡＰ−１５Ｒ（配列番号８、塩基番号７４７から７６
６） ＭＡＰ−１７Ｒ（配列番号１０、塩基番号８６２から８
８１） 実施例 ３ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、標的Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来
するＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行なっ
た。
【００４１】（１）実施例１と同様のＭ．ａｖｉｕｍの
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子標準ＲＮＡ（配列番号１５）をＲ
ＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造製）、５ｍＭ ＤＴＴ）
を用い、１０6コピー／５μＬから１０2コピー／５μＬ
までとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）
には希釈液のみを用いた。
Ｐｓｔ Ｓ−３遺伝子標準ＲＮＡ（配列番号１５）をＲ
ＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造製）、５ｍＭ ＤＴＴ）
を用い、１０6コピー／５μＬから１０2コピー／５μＬ
までとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）
には希釈液のみを用いた。
【００４２】（２）以下の組成の反応液２０μＬをＰＣ
Ｒ用チューブ（容量０．５ｍＬ；ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、
パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
５μＬを添加した。
Ｒ用チューブ（容量０．５ｍＬ；ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、
パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
５μＬを添加した。
【００４３】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １２０ｍＭ 塩化カリウム ６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＡＰ−３
Ｓ、配列番号２４、３'末端の水酸基はアミノ化されて
いる。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＡＰ−３Ｆ、
配列番号２９） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＡＰ−６Ｒ、
配列番号４） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−ａｖｉｕｍ−Ｓ−Ｇ、配列
番号１４、５’末端から７番目の「Ｔ」と８番目の
「Ｔ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が
標識されている。また３'末端の水酸基はグリコール基
で修飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
５μＬを添加した。
μＬにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １２０ｍＭ 塩化カリウム ６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（ＭＡＰ−３
Ｓ、配列番号２４、３'末端の水酸基はアミノ化されて
いる。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（ＭＡＰ−３Ｆ、
配列番号２９） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（ＭＡＰ−６Ｒ、
配列番号４） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−ａｖｉｕｍ−Ｓ−Ｇ、配列
番号１４、５’末端から７番目の「Ｔ」と８番目の
「Ｔ」との間のリンにインターカレーター性蛍光色素が
標識されている。また３'末端の水酸基はグリコール基
で修飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
５μＬを添加した。
【００４４】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μＬにおける濃度） ２．０％ ソルビトール ３．６μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水（４）引き続きＰＣＲチューブを直接
測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光 度計を用い、４１℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、
蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
μＬにおける濃度） ２．０％ ソルビトール ３．６μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製） 容量調整用蒸留水（４）引き続きＰＣＲチューブを直接
測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光 度計を用い、４１℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、
蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
【００４５】酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍
光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図３（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図３（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０2コピー／試験から１０6コピ
ー／試験である。
光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図３（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図３（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０2コピー／試験から１０6コピ
ー／試験である。
【００４６】図３より、１０3コピーが３０分以内に検
出された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロフ
ァイルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＭ．ａ
ｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３領域ＲＮＡの定量が可能であ
ることが示された。以上より、本法により、Ｍ．ａｖｉ
ｕｍの迅速・高感度な検出が可能であることが示され
た。
出された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロフ
ァイルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＭ．ａ
ｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３領域ＲＮＡの定量が可能であ
ることが示された。以上より、本法により、Ｍ．ａｖｉ
ｕｍの迅速・高感度な検出が可能であることが示され
た。
【００４７】
【発明の効果】以上の説明のように、本願発明のオリゴ
ヌクレオチドは、ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライ
マーやプローブの結合を阻害しかねない、比較的低温か
つ一定温度（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）条
件下でも、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由
来するＲＮＡと相補的に結合するオリゴヌクレオチドで
ある。よって、標的ＲＮＡを熱変性することなく、オリ
ゴヌクレオチドを特異的に結合させることが可能とな
る。このように本願発明のオリゴヌクレオチドは、Ｍ．
ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを
切断、増幅または検出等するため、すなわちＲＮＡの増
幅で使用するオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌ
クレオチドプローブとして有用である。
ヌクレオチドは、ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライ
マーやプローブの結合を阻害しかねない、比較的低温か
つ一定温度（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）条
件下でも、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由
来するＲＮＡと相補的に結合するオリゴヌクレオチドで
ある。よって、標的ＲＮＡを熱変性することなく、オリ
ゴヌクレオチドを特異的に結合させることが可能とな
る。このように本願発明のオリゴヌクレオチドは、Ｍ．
ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡを
切断、増幅または検出等するため、すなわちＲＮＡの増
幅で使用するオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌ
クレオチドプローブとして有用である。
【００４８】上記以外にも、本願発明のオリゴヌクレオ
チドは、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔＳ−３遺伝子を増幅
し、または検出等するためにも有用である。
チドは、Ｍ．ａｖｉｕｍのＰｓｔＳ−３遺伝子を増幅
し、または検出等するためにも有用である。
【００４９】本願発明のオリゴヌクレオチドは、配列表
に記載した塩基配列（２０塩基から２３塩基）の物に限
られず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以
上からなるオリゴヌクレオチドであれば良い。これら
は、比較的低温（好ましくは４１℃）条件下で、プライ
マーまたはプローブの標的核酸への特異性を確保するた
めには１０塩基程度の塩基配列があれば十分であること
から明らかである。
に記載した塩基配列（２０塩基から２３塩基）の物に限
られず、これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以
上からなるオリゴヌクレオチドであれば良い。これら
は、比較的低温（好ましくは４１℃）条件下で、プライ
マーまたはプローブの標的核酸への特異性を確保するた
めには１０塩基程度の塩基配列があれば十分であること
から明らかである。
【００５０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> TOSOH corporation
<120> 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ検出のためのオリ
ゴヌクレオチドおよび検出法
<130> PA211-0741
<160> 33
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１Ｒ
<400> 1
ttccgcatcc cgacaacacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−３Ｒ
<400> 2
gaatcgggtc atcgcgttgg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−４Ｒ
<400> 3
tgttcgaagg cgttgacgaa tcg 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−６Ｒ
<400> 4
gagtcggaac caccgaaatc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−７Ｒ
<400> 5
agattccagg ccggcgagcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１０Ｒ
<400> 6
tgcggaagac gacgtgaatc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１１Ｒ
<400> 7
tatttctgga aattgtcggt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１５Ｒ
<400> 8
tgttcagctt ctgcgcctga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１６Ｒ
<400> 9
ctgatcgcca ccgcgtccgg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１７Ｒ
<400> 10
tcgagcacca gatcgttgcc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１９Ｒ
<400> 11
tgggggtcgg ggtacttcga 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−２０Ｒ
<400> 12
ttgaaggcgt cggggatcgg ga 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 23
<223> ＭＡＰ−３
<400> 13
cgcttcgtca acgccttcga aca 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＹＯ−ａｖｉｕｍ−Ｓ−Ｇ
<400> 14
ttgccgttga attcgctgat 20
<210> 15
<211> 1264
<212> RNA
<213> Mycobacterium avium
<220>
<223> 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３
遺伝子に由来する標準ＲＮＡ
<400> 15
gggagaacug uuagcuucgu ggugcgagac gggcuggucg gcacgcgguu gccgguggac 60
cggcggcgaa cauguuucau cccuaccgug aggaagcgaa uugaaacuca accgauuugg 120
ugccgugcug agcgucuuga gcgccggcgc gcugguguug ucgggaugcg gaagcgauaa 180
caacggggcc ggcgccggcg ccggcggcuc gucgucgagc aaggugagcu gcgguggcaa 240
gaaggcccuc aaggccagcg gcucgaccgc ccaggccaac gcgaugaccc gcuucgucaa 300
cgccuucgaa caggccuguc ccggccagac acugaacuac acggccaacg guuccggugc 360
cgggaucagc gaauucaacg gcaagcaaac cgauuucggu gguuccgacu cgccgcuggc 420
gcccagugaa uacgccgcgg cgcagcagcg uugcggcucg ccggccugga aucugccggu 490
gguuuucggc ccgaucgcca ucaccuacaa cgucgccggg cugaacucgc ugaaccugga 540
cggcgcgacc gccgccaaaa ucuucaacgg cgccaucacg acguggaaug acccggggau 600
ccaggcgcuc aaccccggcg uugcccugcc cgccgagccg auucacgucg ucuuccgcaa 660
cgacgaaucc ggcaccaccg acaauuucca gaaauaucuc gaugccgccg ccgacggcgc 720
cuggggcaag ggcgccggca agaccuucaa ggguggcguc ggcgagggag ccaagggcaa 780
cgacggcacc ucagcggcga ucaaggccac cgaagggucc aucaccuaca acgagugguc 840
guucgcucag gcgcagaagc ugaacauggc caagaucauc acgucggccg guccggacgc 900
gguggcgauc agcgccgacu cggugggcaa gacgaucgcg ggagccaaga ucuccggcca 960
gggcaacgau cuggugcucg acacccuguc guucuacaag cccacccagg ccggcucgua 1020
cccgaucgug cuggccaccu acgagaucgu cugcucgaag uaccccgacc cccaggucgg 1080
cacggcgguc aaggcguucc ugcagagcac cgucggcgcc ggccagaacg gucuggccga 1140
caacggcuau aucccgaucc ccgacgccuu caagucgaga cugucugcug ccaucaacgc 1200
gaucaccuaa ccugaggugg ucgugacacg aggaacagca accgcgggua ccgagcucga 1260
auuc 1264
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−２Ｒ
<400> 16
gggccttctt gccaccgcag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−５Ｒ
<400> 17
gttggccgtg tagttcagtg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−８Ｒ
<400> 18
gttgtaggtg atggcgatcg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−９Ｒ
<400> 19
ttgagcgcct ggatccccgg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１２Ｒ
<400> 20
ttgccccagg cgccgtcggc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１３Ｒ
<400> 21
cgtcgttgcc cttggctccc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１４Ｒ
<400> 22
ttgtaggtga tggacccttc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１８Ｒ
<400> 23
tgggtgggct tgtagaacga 20
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−３Ｓ
<400> 24
gaagcgggtc atcgcgttgg cctg 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−４Ｓ
<400> 25
tgttcgaagg cgttgacgaa gcgg 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１０Ｓ
<400> 26
tgcggaagac gacgtgaatc ggct 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１１Ｓ
<400> 27
tatttctgga aattgtcggt ggtg 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１５Ｓ
<400> 28
tgttcagctt ctgcgcctga gcga 24
<210> 29
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−３Ｆ
<400> 29
aattctaata cgactcacta tagggagacg cttcgtcaac gccttcgaac a 51
<210> 30
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−４Ｆ
<400> 30
aattctaata cgactcacta tagggagacg aacaggcctg tcccggccag a 51
<210> 31
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１０Ｆ
<400> 31
aattctaata cgactcacta tagggagatc cgcaacgacg aatccggcac c 51
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１１Ｆ
<400> 32
aattctaata cgactcacta tagggagaga aatatctcga tgccgccgcc g 51
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ＭＡＰ−１５Ｆ
<400> 33
aattctaata cgactcacta tagggagatg aacatggcca agatcatcac g 51
【図１】図１はＭＡＰ−１ＲからＭＡＰ−２０Ｒのオリ
ゴヌクレオチドを用いて、４１℃でＭｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来す
る標準ＲＮＡへの結合試験を行なった後の試料の尿素変
性６％ポリアクリルアミド電気泳動写真である（白黒反
転）。矢印で示したものが特異バンドの位置である。レ
ーン１から２０がそれぞれＭＡＰ−１ＲからＭＡＰ−２
０Ｒを用いて結合試験を行なった時の結果であり、レー
ンＮはＮｅｇａ（オリゴヌクレオチドの代わりに希釈液
を用いたもの）である。また分子量マーカーはＲＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ（０．１〜１ｋｂと０．２〜１０ｋｂ）を
使用した（レーンＭ１、Ｍ２）。
ゴヌクレオチドを用いて、４１℃でＭｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来す
る標準ＲＮＡへの結合試験を行なった後の試料の尿素変
性６％ポリアクリルアミド電気泳動写真である（白黒反
転）。矢印で示したものが特異バンドの位置である。レ
ーン１から２０がそれぞれＭＡＰ−１ＲからＭＡＰ−２
０Ｒを用いて結合試験を行なった時の結果であり、レー
ンＮはＮｅｇａ（オリゴヌクレオチドの代わりに希釈液
を用いたもの）である。また分子量マーカーはＲＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ（０．１〜１ｋｂと０．２〜１０ｋｂ）を
使用した（レーンＭ１、Ｍ２）。
【図２】図２は実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０3
コピー／試験において、表２の組み合わせ（ａ）〜
（ｊ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の電気泳動写真（白黒反転）である。レーン１・
２が組み合わせ（ａ）、レーン４・５が組み合わせ
（ｂ）、レーン７・８が組み合わせ（ｃ）、レーン１０
・１１が組み合わせ（ｄ）、レーン１３・１４が組み合
わせ（ｅ）、レーン１６・１７が組み合わせ（ｆ）、レ
ーン１９・２０が組みあわせ（ｇ）、レーン２２・２３
が組み合わせ（ｈ）、レーン２５・２６が組み合わせ
（ｉ）、レーン２８・２９が組み合わせ（ｊ）のそれぞ
れの結果であり、レーン３・６・９・１２・１８・２１
・２４・２７・３０が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の
代わりに希釈液のみを用いたもの）である。また分子量
マーカーはφＸ１７４／ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（Ｍ
ａｒｋｅｒ４）を使用した（レーンＭ）。このうち組み
合わせ（ａ）を用いたときに特定バンドが確認できた。
コピー／試験において、表２の組み合わせ（ａ）〜
（ｊ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の電気泳動写真（白黒反転）である。レーン１・
２が組み合わせ（ａ）、レーン４・５が組み合わせ
（ｂ）、レーン７・８が組み合わせ（ｃ）、レーン１０
・１１が組み合わせ（ｄ）、レーン１３・１４が組み合
わせ（ｅ）、レーン１６・１７が組み合わせ（ｆ）、レ
ーン１９・２０が組みあわせ（ｇ）、レーン２２・２３
が組み合わせ（ｈ）、レーン２５・２６が組み合わせ
（ｉ）、レーン２８・２９が組み合わせ（ｊ）のそれぞ
れの結果であり、レーン３・６・９・１２・１８・２１
・２４・２７・３０が陰性コントロール（ＲＮＡ試料の
代わりに希釈液のみを用いたもの）である。また分子量
マーカーはφＸ１７４／ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（Ｍ
ａｒｋｅｒ４）を使用した（レーンＭ）。このうち組み
合わせ（ａ）を用いたときに特定バンドが確認できた。
【図３】図３は実施例３で行なった初期ＲＮＡ量１０2
コピー／試験から１０6コピー／試験において、反応時
間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフ
（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間と
の間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コピー数１０
3 コピー／試験のＲＮＡが反応３０分以内で検出でき、
初期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のある
ことが示された。
コピー／試験から１０6コピー／試験において、反応時
間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光強度比のグラフ
（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間と
の間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コピー数１０
3 コピー／試験のＲＮＡが反応３０分以内で検出でき、
初期ＲＮＡ量と立ち上がり時間との間に相関関係のある
ことが示された。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA04 CA11 HA12
4B063 QA18 QA19 QQ06 QQ42 QQ52
QR08 QR13 QR32 QR42 QR56
QR62 QR66 QS03 QS25 QS34
Claims (9)
- 【請求項１】非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子または該遺伝子に
由来するＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドで
あって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍの特
定の部位に結合する、配列番号１から１２に示したいず
れかの配列の少なくとも１０塩基以上を含む配列を特徴
とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】前記オリゴヌクレオチドは、当該ＲＮＡの
特定の部位に結合することにより、当該特定部位におい
て当該ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチドプロ
ーブである、請求項１のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ伸長反
応のためのオリゴヌクレオチドプライマーである、請求
項１のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】前記オリゴヌクレオチドは、その一部が修
飾されまたは検出可能な標識物質により標識されたオリ
ゴヌクレオチドプローブである、請求項１のオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項５】前記オリゴヌクレオチドは、その塩基の一
部がオリゴヌクレオチドプローブとしての機能を損なわ
ない範囲で変換された合成オリゴヌクレオチドである、
請求項１のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】試料中に存在する非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子
に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存
性ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡを合成し、リボヌ
クレアーゼＨによってＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを
分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型
としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、前記特
定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮ
Ａを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ
を生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ
存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が
引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｃ
ＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程を利用し
た検出法において、配列番号１３に示した配列中の少な
くとも連続した１０塩基以上からなる、増幅されるＭｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３
遺伝子に由来するＲＮＡ配列の一部と相同的な配列を有
する第一のプライマーと、配列番号４に示した配列中の
少なくとも連続した１０塩基以上からなるＭｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に
由来するＲＮＡの配列の一部と相補的な配列を有する第
二のプライマー（ここで第一または第二のプライマーの
いずれか一方は、５’側にＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーター配列を付加した配列を有するプライマーである）
を用いることを特徴とするＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍのＰｓｔ Ｓ−３遺伝子に由来するＲＮＡ
の増幅行程。 - 【請求項７】前記ＲＮＡ増幅工程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつ
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌク
レオチド存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測
定することからなる請求項６に記載の工程（ただし該標
識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一および第二の
プライマーとは異なる配列である）。 - 【請求項８】前記プローブが、ＲＮＡ転写産物の少なく
とも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体
を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するも
のであることを特徴とする請求項７に記載の検出方法。 - 【請求項９】前記プローブが、配列番号１４に示した配
列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、ある
いはその相補配列であることを特徴とする請求項８に記
載の検出方法。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP2002099840A JP2003289869A (ja) | 2002-04-02 | 2002-04-02 | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
| US10/403,090 US20030219811A1 (en) | 2002-04-02 | 2003-04-01 | Oligonucleotide for detection of atypical mycobacteria mycobacterium avium and detection method |
| EP03007393A EP1352974A1 (en) | 2002-04-02 | 2003-04-02 | Oligonucleotide for detection of atypical mycobacteria mycobacterium avium and detection method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002099840A JP2003289869A (ja) | 2002-04-02 | 2002-04-02 | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003289869A true JP2003289869A (ja) | 2003-10-14 |
Family
ID=28449857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002099840A Pending JP2003289869A (ja) | 2002-04-02 | 2002-04-02 | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030219811A1 (ja) |
| EP (1) | EP1352974A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003289869A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010061981A1 (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-03 | 東ソー株式会社 | サイトケラチン１９ ｍＲＮＡの測定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010053213A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-05-14 | Fujirebio Inc. | Optical sensing via cavity mode excitations in the stimulated emission regime |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5591582A (en) * | 1985-07-23 | 1997-01-07 | The Board Of Rijks Universiteit Leiden | Methods for detecting activated RAS oncogenes |
| US5717058A (en) * | 1993-02-23 | 1998-02-10 | Somatogen, Inc. | Peptide inhibitors of tax-dependent transcription |
| US5698446A (en) * | 1994-09-07 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Methods and compositions for inhibiting production of replication competent virus |
| FR2729392B1 (fr) * | 1995-01-16 | 1997-03-28 | Pasteur Institut | Oligonucleotides pour la detection de salmonella |
| US5962271A (en) * | 1996-01-03 | 1999-10-05 | Cloutech Laboratories, Inc. | Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end |
| US20030198953A1 (en) * | 2000-03-30 | 2003-10-23 | Spytek Kimberly A. | Novel proteins and nucleic acids encoding same |
| US20040241651A1 (en) * | 2000-04-07 | 2004-12-02 | Alexander Olek | Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations |
| EP1280924A2 (en) * | 2000-04-14 | 2003-02-05 | University of South Carolina Research Foundation | Cloning of corynebacteriaceae histidine ammonia lyase and therapeutic uses |
| AU2001288393A1 (en) * | 2000-08-25 | 2002-03-04 | Illumina, Inc. | Probes and decoder oligonucleotides |
| GB0106949D0 (en) * | 2001-03-20 | 2001-05-09 | Norchip As | Detection of mycobacteria |
-
2002
- 2002-04-02 JP JP2002099840A patent/JP2003289869A/ja active Pending
-
2003
- 2003-04-01 US US10/403,090 patent/US20030219811A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-02 EP EP03007393A patent/EP1352974A1/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010061981A1 (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-03 | 東ソー株式会社 | サイトケラチン１９ ｍＲＮＡの測定方法 |
| JP2010124770A (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Tosoh Corp | サイトケラチン１９ｍＲＮＡの測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030219811A1 (en) | 2003-11-27 |
| EP1352974A1 (en) | 2003-10-15 |
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