JP2001258570A - 腸炎ビブリオ菌検出用のオリゴヌクレオチド - Google Patents
腸炎ビブリオ菌検出用のオリゴヌクレオチドInfo
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- JP2001258570A JP2001258570A JP2000081806A JP2000081806A JP2001258570A JP 2001258570 A JP2001258570 A JP 2001258570A JP 2000081806 A JP2000081806 A JP 2000081806A JP 2000081806 A JP2000081806 A JP 2000081806A JP 2001258570 A JP2001258570 A JP 2001258570A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ
２）または該遺伝子に由来するＲＮＡに特異的に結合す
るオリゴヌクレオチドの提供。 【解決手段】腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒遺伝子（ｔ
ｄｈ２）または該遺伝子に由来するＲＮＡを検出または
増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、ｔｄｈ２
または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能で
ある、特定な７種類の塩基配列のいずれかの配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上から成なるオリゴヌクレ
オチド又はそれらのオリゴヌクレオチドと相補的である
オリゴヌクレオチド。
２）または該遺伝子に由来するＲＮＡに特異的に結合す
るオリゴヌクレオチドの提供。 【解決手段】腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒遺伝子（ｔ
ｄｈ２）または該遺伝子に由来するＲＮＡを検出または
増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、ｔｄｈ２
または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能で
ある、特定な７種類の塩基配列のいずれかの配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上から成なるオリゴヌクレ
オチド又はそれらのオリゴヌクレオチドと相補的である
オリゴヌクレオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、公衆衛
生、食品検査または食中毒検査における腸炎ビブリオ菌
の検出用のオリゴヌクレオチドに関するものである。
生、食品検査または食中毒検査における腸炎ビブリオ菌
の検出用のオリゴヌクレオチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒ
ａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、一般に感染性食中毒
の原因菌として知られている。胃腸炎患者から分離され
る腸炎ビブリオ菌の９５％以上が、我妻培地において溶
血活性を示す神奈川現象陽性菌であるのに対し、魚や水
から分離した菌の９９％は神奈川現象陰性菌である。こ
のことから、病原性腸炎ビブリオ菌と神奈川現象は深く
関与しているとされてきたが、その後、この神奈川現象
は腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒（ｔｈｅｒｍｏｓｔａ
ｂｌｅ ｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：ＴＤＨ）
が菌体外へ放出されるために起こる現象であることが判
明し、ＴＤＨが腸炎ビブリオ菌の病原因子として注目さ
れるようになってきた。さらに近年では、神奈川現象陰
性の菌株でありながら病原性を示す菌株から、ＴＤＨに
類似した塩基配列を有し、一部共通抗原性を有する溶血
毒（耐熱性溶血毒類似溶血毒（ＴＤＨ−ｒｅｌａｔｅｄ
ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：ＴＲＨ））も確認された。
ａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、一般に感染性食中毒
の原因菌として知られている。胃腸炎患者から分離され
る腸炎ビブリオ菌の９５％以上が、我妻培地において溶
血活性を示す神奈川現象陽性菌であるのに対し、魚や水
から分離した菌の９９％は神奈川現象陰性菌である。こ
のことから、病原性腸炎ビブリオ菌と神奈川現象は深く
関与しているとされてきたが、その後、この神奈川現象
は腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒（ｔｈｅｒｍｏｓｔａ
ｂｌｅ ｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：ＴＤＨ）
が菌体外へ放出されるために起こる現象であることが判
明し、ＴＤＨが腸炎ビブリオ菌の病原因子として注目さ
れるようになってきた。さらに近年では、神奈川現象陰
性の菌株でありながら病原性を示す菌株から、ＴＤＨに
類似した塩基配列を有し、一部共通抗原性を有する溶血
毒（耐熱性溶血毒類似溶血毒（ＴＤＨ−ｒｅｌａｔｅｄ
ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：ＴＲＨ））も確認された。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これまで腸炎ビブリオ
菌の検出および同定を行うためには、増菌培養、分離培
養の後に神奈川現象を判定するといった非常に煩雑で長
時間を要するものだった。最近の腸炎ビブリオ菌の検出
および同定には、前記ＴＤＨやＴＲＨ遺伝子中の配列に
特異的な遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーショ
ン法も試みられているが、食品検査等において十分な検
出感度を得ることは困難であった。
菌の検出および同定を行うためには、増菌培養、分離培
養の後に神奈川現象を判定するといった非常に煩雑で長
時間を要するものだった。最近の腸炎ビブリオ菌の検出
および同定には、前記ＴＤＨやＴＲＨ遺伝子中の配列に
特異的な遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーショ
ン法も試みられているが、食品検査等において十分な検
出感度を得ることは困難であった。
【０００４】このように、腸炎ビブリオ菌の検出および
同定には、複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試
料中に存在する極微量の腸炎ビブリオ菌を検出すること
は困難であったため、食品検査等の分野では迅速かつ高
感度な検出法の出現が望まれている。さらには、検査を
より簡便にするために、自動検査装置の開発も望まれて
いる。
同定には、複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試
料中に存在する極微量の腸炎ビブリオ菌を検出すること
は困難であったため、食品検査等の分野では迅速かつ高
感度な検出法の出現が望まれている。さらには、検査を
より簡便にするために、自動検査装置の開発も望まれて
いる。
【０００５】検出を高感度で行うためには、検出および
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ
（以下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅
したうえで検出等することが好適である。
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ
（以下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅
したうえで検出等することが好適である。
【０００６】標的核酸がＤＮＡである場合の増幅法とし
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマーと
熱耐性DNAポリメレース存在下で、熱変性、プライマー
・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行う
ことによって前記特定の配列を増幅する方法である。し
かし、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温を繰り返すという複
雑操作が必要であり、そのことが自動化への障害とな
る。また前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記
特定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
であり、更にその検出および同定を高感度で行うために
は、標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが
必要である。
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマーと
熱耐性DNAポリメレース存在下で、熱変性、プライマー
・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行う
ことによって前記特定の配列を増幅する方法である。し
かし、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温を繰り返すという複
雑操作が必要であり、そのことが自動化への障害とな
る。また前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記
特定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
であり、更にその検出および同定を高感度で行うために
は、標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが
必要である。
【０００７】標的核酸がＲＮＡである場合の増幅法とし
ては、逆転写酵素およびRNAポリメレースの協奏的作用
によって前記特定配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ
法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡ中の特定
の配列に対し、プロモーター配列を含むプライマーと逆
転写酵素、およびリボヌクレエースＨにより、プロモー
ター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡ
を鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、前記特定配列
を含むＲＮＡを合成するとともに、該ＲＮＡが引き続き
プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる
連鎖反応を行うものである。ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は
一定温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適してい
る方法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較
的低温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮ
Ａが分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、
反応効率を低下させる可能性が考えられる。したがっ
て、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、
標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率
を向上させるための操作が必要であった。また前記特定
の配列をＮＡＳＢＡ法等で増幅するには前記特定の配列
との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要であり、更
にその検出および同定を高感度で行うためには、標的Ｒ
ＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要であっ
た。また更には、低温でＲＮＡの検出等を行う場合に
も、前記のような分子内構造を形成したＲＮＡに対して
結合し得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
ては、逆転写酵素およびRNAポリメレースの協奏的作用
によって前記特定配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ
法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡ中の特定
の配列に対し、プロモーター配列を含むプライマーと逆
転写酵素、およびリボヌクレエースＨにより、プロモー
ター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡ
を鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、前記特定配列
を含むＲＮＡを合成するとともに、該ＲＮＡが引き続き
プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる
連鎖反応を行うものである。ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は
一定温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適してい
る方法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較
的低温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮ
Ａが分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、
反応効率を低下させる可能性が考えられる。したがっ
て、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、
標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率
を向上させるための操作が必要であった。また前記特定
の配列をＮＡＳＢＡ法等で増幅するには前記特定の配列
との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要であり、更
にその検出および同定を高感度で行うためには、標的Ｒ
ＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要であっ
た。また更には、低温でＲＮＡの検出等を行う場合に
も、前記のような分子内構造を形成したＲＮＡに対して
結合し得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
【０００８】そこで本願発明は、腸炎ビブリオ菌の耐熱
性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ２）、又は該遺伝子に由来する
ＲＮＡを特異的に増幅したり、これらの検出および同定
を高感度で行うために有用なオリゴヌクレオチドの提供
を目的とするものである。
性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ２）、又は該遺伝子に由来する
ＲＮＡを特異的に増幅したり、これらの検出および同定
を高感度で行うために有用なオリゴヌクレオチドの提供
を目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、腸炎ビブリオ菌の耐
熱性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ２）、または該遺伝子に由来
するＲＮＡを検出または増幅するためのオリゴヌクレオ
チドであって、ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮ
Ａと特異的に結合可能である、配列番号１から７に示し
たいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなるオリゴヌクレオチド又はそれらのオリゴヌクレ
オチドと相補的であるオリゴヌクレオチドである。
になされた本願請求項１の発明は、腸炎ビブリオ菌の耐
熱性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ２）、または該遺伝子に由来
するＲＮＡを検出または増幅するためのオリゴヌクレオ
チドであって、ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮ
Ａと特異的に結合可能である、配列番号１から７に示し
たいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなるオリゴヌクレオチド又はそれらのオリゴヌクレ
オチドと相補的であるオリゴヌクレオチドである。
【００１０】そして本願請求項２の発明は、請求項１項
のオリゴヌクレオチドからなる、ＤＮＡ伸長反応のため
のオリゴヌクレオチドプライマーであり、本願請求項３
の発明は請求項１に記載されたオリゴヌクレオチドの一
部が修飾され、または検出可能な標識物質により標識さ
れてなるオリゴヌクレオチドプローブである。以下、本
発明を詳細に説明する。
のオリゴヌクレオチドからなる、ＤＮＡ伸長反応のため
のオリゴヌクレオチドプライマーであり、本願請求項３
の発明は請求項１に記載されたオリゴヌクレオチドの一
部が修飾され、または検出可能な標識物質により標識さ
れてなるオリゴヌクレオチドプローブである。以下、本
発明を詳細に説明する。
【００１１】本願発明のオリゴヌクレオチドは、前記し
たＲＮＡの増幅に際して、標的ＲＮＡの分子内構造フリ
ーな領域に対して特異的に相補結合を形成するオリゴヌ
クレオチドであり、前記したような熱変性を行うことな
しに標的ＲＮＡと特異的に結合可能である。このように
本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０
℃、好ましくは４１℃）で、腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ２
に由来するＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合
するオリゴヌクレオチドを提供することで、ｔｄｈ２を
特異的に増幅し又は検出等するためのオリゴヌクレオチ
ドを提供するものである。より具体的には、本願発明に
はＰＣＲ法によって前記標的ＤＮＡを増幅するためのオ
リゴヌクレオチドプライマー、ＮＡＳＢＡ法等によって
前記標的ＲＮＡ等を増幅するためのオリゴヌクレオチド
プライマー、そしてかかる増幅なしに、或いはかかる増
幅の後に標的核酸を検出等するためのオリゴヌクレオチ
ドプローブが含まれる。そして本願発明のオリゴヌクレ
オチドを利用することで、簡便、迅速かつ高感度な検出
方法を食品検査、食中毒検査等が提供される。
たＲＮＡの増幅に際して、標的ＲＮＡの分子内構造フリ
ーな領域に対して特異的に相補結合を形成するオリゴヌ
クレオチドであり、前記したような熱変性を行うことな
しに標的ＲＮＡと特異的に結合可能である。このように
本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０
℃、好ましくは４１℃）で、腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ２
に由来するＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合
するオリゴヌクレオチドを提供することで、ｔｄｈ２を
特異的に増幅し又は検出等するためのオリゴヌクレオチ
ドを提供するものである。より具体的には、本願発明に
はＰＣＲ法によって前記標的ＤＮＡを増幅するためのオ
リゴヌクレオチドプライマー、ＮＡＳＢＡ法等によって
前記標的ＲＮＡ等を増幅するためのオリゴヌクレオチド
プライマー、そしてかかる増幅なしに、或いはかかる増
幅の後に標的核酸を検出等するためのオリゴヌクレオチ
ドプローブが含まれる。そして本願発明のオリゴヌクレ
オチドを利用することで、簡便、迅速かつ高感度な検出
方法を食品検査、食中毒検査等が提供される。
【００１２】配列番号１から７は、ｔｄｈ２、または該
遺伝子に由来するＲＮＡを増幅しまたは検出等するため
のオリゴヌクレオチドを示すものである。ここで、ｔｄ
ｈ２に由来するＲＮＡとは、これら遺伝子を鋳型として
製造されるＲＮＡをも含む。これらオリゴヌクレオチド
は、それぞれ記載した塩基配列のうち少なくとも連続し
た１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであれば良
く、また更にその相補的なオリゴヌクレオチドであって
も良い。
遺伝子に由来するＲＮＡを増幅しまたは検出等するため
のオリゴヌクレオチドを示すものである。ここで、ｔｄ
ｈ２に由来するＲＮＡとは、これら遺伝子を鋳型として
製造されるＲＮＡをも含む。これらオリゴヌクレオチド
は、それぞれ記載した塩基配列のうち少なくとも連続し
た１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであれば良
く、また更にその相補的なオリゴヌクレオチドであって
も良い。
【００１３】本願発明の一態様は、上記のオリゴヌクレ
オチドからなる増幅用のプライマーである。上記のオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を実施
すれば、標的核酸、即ちｔｄｈ２のみを増幅可能であ
る。増幅方法としてはＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ
法等が例示できるが、中でもＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等
の一定温度核酸増幅法が好ましい。この増幅産物を種々
の方法により検出等することで、腸炎ビブリオ菌の検出
が可能となる。この場合、増幅で使用したオリゴヌクレ
オチド以外の上記オリゴヌクレオチをプローブとして使
用しても良いし、増幅された特定配列の断片を電気泳動
等により確認しても良い。
オチドからなる増幅用のプライマーである。上記のオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を実施
すれば、標的核酸、即ちｔｄｈ２のみを増幅可能であ
る。増幅方法としてはＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ
法等が例示できるが、中でもＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等
の一定温度核酸増幅法が好ましい。この増幅産物を種々
の方法により検出等することで、腸炎ビブリオ菌の検出
が可能となる。この場合、増幅で使用したオリゴヌクレ
オチド以外の上記オリゴヌクレオチをプローブとして使
用しても良いし、増幅された特定配列の断片を電気泳動
等により確認しても良い。
【００１４】本願発明の別の態様は、上記のオリゴヌク
レオチドの一部が修飾され、または検出可能な標識物質
により標識されてなるプローブである。標的核酸を検出
等しようとする場合、検出可能な標識物質により標識さ
れた前記オリゴヌクレオチドを一本鎖の標的核酸とハイ
ブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブについて
前記標識を検出等すれば良い。標識の検出等は、標識物
質に適した方法を採用すれば良く、例えば、オリゴヌク
レオチドの標識にインターカレーター性蛍光色素を用い
た場合は、標的核酸とオリゴヌクレオチドプローブから
なる２本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光
強度が増加する性質の色素等を用いれば、標的核酸とハ
イブリダイズしていないプローブを除去等することな
く、ハイブリダイズしたプローブのみを検出することが
容易に実施できる。通常の蛍光色素等を標識として使用
した場合には、標的核酸とハイブリダイズしていないプ
ローブを除去等した後に標識を検出すれば良い。なお検
出に当たっては、試料中の標的核酸をＰＣＲ法、ＮＡＳ
ＢＡ法、３ＳＲ法などといった種々の核酸増幅法により
検出可能な量まで増幅させることが好ましく、中でもＮ
ＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が最も好
ましい。ここで、上記ヌクレオチドを標識したプローブ
を増幅の際に反応液中に共存させる場合は、プローブが
ヌクレオチドプライマーとして機能しないように、例え
ばその３’末端にグリコール酸を付加する等の修飾を行
うことが特に好ましい。
レオチドの一部が修飾され、または検出可能な標識物質
により標識されてなるプローブである。標的核酸を検出
等しようとする場合、検出可能な標識物質により標識さ
れた前記オリゴヌクレオチドを一本鎖の標的核酸とハイ
ブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブについて
前記標識を検出等すれば良い。標識の検出等は、標識物
質に適した方法を採用すれば良く、例えば、オリゴヌク
レオチドの標識にインターカレーター性蛍光色素を用い
た場合は、標的核酸とオリゴヌクレオチドプローブから
なる２本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光
強度が増加する性質の色素等を用いれば、標的核酸とハ
イブリダイズしていないプローブを除去等することな
く、ハイブリダイズしたプローブのみを検出することが
容易に実施できる。通常の蛍光色素等を標識として使用
した場合には、標的核酸とハイブリダイズしていないプ
ローブを除去等した後に標識を検出すれば良い。なお検
出に当たっては、試料中の標的核酸をＰＣＲ法、ＮＡＳ
ＢＡ法、３ＳＲ法などといった種々の核酸増幅法により
検出可能な量まで増幅させることが好ましく、中でもＮ
ＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が最も好
ましい。ここで、上記ヌクレオチドを標識したプローブ
を増幅の際に反応液中に共存させる場合は、プローブが
ヌクレオチドプライマーとして機能しないように、例え
ばその３’末端にグリコール酸を付加する等の修飾を行
うことが特に好ましい。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本願発明を実施例により更
に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
【００１６】実施例 １ ｔｄｈ２−ＲＮＡに対して、本願発明のオリゴヌクレオ
チドが４１℃で特異的に結合するかを確認した。なおｔ
ｄｈ２−ＲＮＡは、ｔｄｈ２の塩基配列を含む二本鎖Ｄ
ＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製され
たＲＮＡである。
チドが４１℃で特異的に結合するかを確認した。なおｔ
ｄｈ２−ＲＮＡは、ｔｄｈ２の塩基配列を含む二本鎖Ｄ
ＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製され
たＲＮＡである。
【００１７】まず、腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ２−ＲＮＡ
の塩基番号１から６１０（ＲＮＡの塩基番号は西渕ら
「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
１９９２年、５８、２４４９から２４５７頁」に従っ
た）を含む標準ＲＮＡ（６１６ｍｅｒ）を試料とし、２
６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ）を用いて３．０×１０-12ｍｏｌ／μｌとな
るよう希釈した。
の塩基番号１から６１０（ＲＮＡの塩基番号は西渕ら
「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
１９９２年、５８、２４４９から２４５７頁」に従っ
た）を含む標準ＲＮＡ（６１６ｍｅｒ）を試料とし、２
６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ）を用いて３．０×１０-12ｍｏｌ／μｌとな
るよう希釈した。
【００１８】次に、以下の組成の反応液１４．０μｌを
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａ
ｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔ
ｕｂｅｓ、パーキンエルマー（株）製）に分注した。
０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａ
ｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔ
ｕｂｅｓ、パーキンエルマー（株）製）に分注した。
【００１９】反応液の組成 ２０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH７．５） ２０．０ｍＭ 塩化カリウム １０．０ｍＭ 塩化マグネシウム ０．１ｍＭ ＤＴＴ ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ １．３μＭのオリゴヌクレオチドプライマー溶液 １．０×１０-12ｍｏｌ標準ｔｄｈ２−ＲＮＡ試料 容量調製用蒸留水 なお、オリゴヌクレオチドプライマー溶液としては、そ
れぞれ配列番号１から７のオリゴヌクレオチド溶液を用
いた。なお、配列番号１のオリゴヌクレオチドは、ｔｄ
ｈ２−ＲＮＡの６６から８５番目の２０ｍｅｒの配列に
対して相補的であり、配列番号２のオリゴヌクレオチド
は、ｔｄｈ２−ＲＮＡの１６２から１８１番目の２０ｍ
ｅｒの配列に対して相補的であり、配列番号３のオリゴ
ヌクレオチドは、ｔｄｈ２−ＲＮＡの２４１から２６０
番目の２０ｍｅｒの配列に対して相補的であり、配列番
号４のオリゴヌクレオチドは、ｔｄｈ２−ＲＮＡの２７
５から２９４番目の２０ｍｅｒの配列に対して相補的で
あり、配列番号５のオリゴヌクレオチドは、ｔｄｈ２−
ＲＮＡの３９９から４１８番目の２０ｍｅｒの配列に対
して相補的であり、配列番号６のオリゴヌクレオチド
は、ｔｄｈ２−ＲＮＡの４５３から４７２番目の２０ｍ
ｅｒの配列に対して相補的であり、配列番号７のオリゴ
ヌクレオチドは、ｔｄｈ２−ＲＮＡの５４０から５５９
番目の２０ｍｅｒの配列に対して相補的である。
れぞれ配列番号１から７のオリゴヌクレオチド溶液を用
いた。なお、配列番号１のオリゴヌクレオチドは、ｔｄ
ｈ２−ＲＮＡの６６から８５番目の２０ｍｅｒの配列に
対して相補的であり、配列番号２のオリゴヌクレオチド
は、ｔｄｈ２−ＲＮＡの１６２から１８１番目の２０ｍ
ｅｒの配列に対して相補的であり、配列番号３のオリゴ
ヌクレオチドは、ｔｄｈ２−ＲＮＡの２４１から２６０
番目の２０ｍｅｒの配列に対して相補的であり、配列番
号４のオリゴヌクレオチドは、ｔｄｈ２−ＲＮＡの２７
５から２９４番目の２０ｍｅｒの配列に対して相補的で
あり、配列番号５のオリゴヌクレオチドは、ｔｄｈ２−
ＲＮＡの３９９から４１８番目の２０ｍｅｒの配列に対
して相補的であり、配列番号６のオリゴヌクレオチド
は、ｔｄｈ２−ＲＮＡの４５３から４７２番目の２０ｍ
ｅｒの配列に対して相補的であり、配列番号７のオリゴ
ヌクレオチドは、ｔｄｈ２−ＲＮＡの５４０から５５９
番目の２０ｍｅｒの配列に対して相補的である。
【００２０】次に、上記の反応液を、４１℃で５分間保
温後、ＲＮａｓｅ Ｈ（宝酒造（株）製）を０．１Ｕ添
加し（ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮ
Ａを切断する酵素である）、引き続きＰＣＲチューブを
４１℃に１５分間保温した。
温後、ＲＮａｓｅ Ｈ（宝酒造（株）製）を０．１Ｕ添
加し（ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮ
Ａを切断する酵素である）、引き続きＰＣＲチューブを
４１℃に１５分間保温した。
【００２１】反応後の切断断片を確認するため、ポリア
クリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６％、尿素７
Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色はＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ(宝酒造（株）製)により行った。標
的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と、ＲＮａｓｅ Ｈにより、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲ
ＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
クリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６％、尿素７
Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色はＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ(宝酒造（株）製)により行った。標
的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と、ＲＮａｓｅ Ｈにより、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲ
ＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
【００２２】電気泳動結果を図１（図１はオリゴヌクレ
オチドの状態を示すための写真（白黒反転）である）に
示した。新たに出現した特定バンドの大きさは図１中に
示した通りである。例えば、配列番号１のオリゴヌクレ
オチドを用いた実験では、ｔｄｈ２−ＲＮＡの５’末端
から６６番目で切断された場合のバンドの大きさ、つま
り６６ｍｅｒおよび５５０ｍｅｒを表示してある。これ
より、上記各オリゴヌクレオチドを用いた実験におい
て、いずれも特定バンドが確認できたため、これらのオ
リゴヌクレオチドはいずれも腸炎ビブリオのｔｄｈ２−
ＲＮＡに４１℃で強く結合している事が示された。
オチドの状態を示すための写真（白黒反転）である）に
示した。新たに出現した特定バンドの大きさは図１中に
示した通りである。例えば、配列番号１のオリゴヌクレ
オチドを用いた実験では、ｔｄｈ２−ＲＮＡの５’末端
から６６番目で切断された場合のバンドの大きさ、つま
り６６ｍｅｒおよび５５０ｍｅｒを表示してある。これ
より、上記各オリゴヌクレオチドを用いた実験におい
て、いずれも特定バンドが確認できたため、これらのオ
リゴヌクレオチドはいずれも腸炎ビブリオのｔｄｈ２−
ＲＮＡに４１℃で強く結合している事が示された。
【００２３】
【発明の効果】以上の説明のように、本願発明のオリゴ
ヌクレオチドは、ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライ
マーやプローブの結合を阻害しかねない、比較的低温か
つ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）条件
下でも、腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ２に由来するＲＮＡと
相補的に結合するオリゴヌクレオチドである。従って、
標的ＲＮＡを熱変性することなく、オリゴヌクレオチド
を特異的に結合させることが可能となる。このように本
願発明のオリゴヌクレオチドは、腸炎ビブリオの耐熱性
溶血毒遺伝子（ｔｄｈ２）に由来するＲＮＡを増幅しま
たは検出等するためのオリゴヌクレオチド、すなわちＲ
ＮＡの増幅方法で使用するオリゴヌクレオチドプライマ
ーやオリゴヌクレオチドプローブとして有用である。
ヌクレオチドは、ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライ
マーやプローブの結合を阻害しかねない、比較的低温か
つ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）条件
下でも、腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ２に由来するＲＮＡと
相補的に結合するオリゴヌクレオチドである。従って、
標的ＲＮＡを熱変性することなく、オリゴヌクレオチド
を特異的に結合させることが可能となる。このように本
願発明のオリゴヌクレオチドは、腸炎ビブリオの耐熱性
溶血毒遺伝子（ｔｄｈ２）に由来するＲＮＡを増幅しま
たは検出等するためのオリゴヌクレオチド、すなわちＲ
ＮＡの増幅方法で使用するオリゴヌクレオチドプライマ
ーやオリゴヌクレオチドプローブとして有用である。
【００２４】上記以外にも、本願発明のオリゴヌクレオ
チドは、ｔｄｈ２を増幅しまたは検出等するために有用
であることは明らかである。また更には二本鎖ＤＮＡを
ＰＣＲ法で増幅したり、ＲＮＡを逆転写して得られるｃ
ＤＮＡを検出等するためには、上記した具体的なオリゴ
ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドも有用
である。
チドは、ｔｄｈ２を増幅しまたは検出等するために有用
であることは明らかである。また更には二本鎖ＤＮＡを
ＰＣＲ法で増幅したり、ＲＮＡを逆転写して得られるｃ
ＤＮＡを検出等するためには、上記した具体的なオリゴ
ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドも有用
である。
【００２５】本願発明のオリゴヌクレオチドは、具体的
に記載した２０ｍｅｒのものに限られず、これら配列中
の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌク
レオチドを含む。これは、プライマーまたはプローブの
標的核酸への十分な特異性を確保するためには１０ｍｅ
ｒ程度の塩基配列があれば十分であることから、明らか
である。
に記載した２０ｍｅｒのものに限られず、これら配列中
の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌク
レオチドを含む。これは、プライマーまたはプローブの
標的核酸への十分な特異性を確保するためには１０ｍｅ
ｒ程度の塩基配列があれば十分であることから、明らか
である。
【００２６】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> 腸炎ビブリオ菌検出のためのオリゴヌクレオチド <130> PA211-0105 <160> 7 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 1 atggatataa ataaaaatga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 2 gttgtatctc gaacaacaaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 3 tttgtacggt tttcttttta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 4 ctgacgttgt gaatactgat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 5 agctgtactt gatctgattt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 6 atagaatctt catcttcacc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 7 attaccaata tattaccact 20
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 1 atggatataa ataaaaatga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 2 gttgtatctc gaacaacaaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 3 tttgtacggt tttcttttta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 4 ctgacgttgt gaatactgat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 5 agctgtactt gatctgattt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 6 atagaatctt catcttcacc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｔｄｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異
的に結合可能であるオリゴヌクレオチド <400> 7 attaccaata tattaccact 20
【図１】図１は、ｔｄｈ２−ＲＮＡの分子内構造フリー
領域に対し設計したオリゴヌクレオチドを用いて、４１
℃でのｔｄｈ２−ＲＮＡへの結合実験を行った後のサン
プルの６％ＰＡＧＥの電気泳動写真である。図中、レー
ン１はＲＮＡマーカー（０．１から１．０Ｋ）、レーン
２からレーン８は、順に、配列番号１から７のオリゴヌ
クレオチド溶液に関するものであり、レーン９はｔｄｈ
２−ＲＮＡ（６１６mer）の標品である。
領域に対し設計したオリゴヌクレオチドを用いて、４１
℃でのｔｄｈ２−ＲＮＡへの結合実験を行った後のサン
プルの６％ＰＡＧＥの電気泳動写真である。図中、レー
ン１はＲＮＡマーカー（０．１から１．０Ｋ）、レーン
２からレーン８は、順に、配列番号１から７のオリゴヌ
クレオチド溶液に関するものであり、レーン９はｔｄｈ
２−ＲＮＡ（６１６mer）の標品である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｑ 1/04 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/04 (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA14 CA01 CA09 GA19 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ06 QQ16 QQ17 QQ18 QQ42 QQ52 QR14 QR32 QR39 QR56 QR62 QS03 QS25 QS34
Claims (3)
- 【請求項１】腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒遺伝子２型
（ｔｄｈ２）、又は該遺伝子に由来するＲＮＡを検出ま
たは増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、ｔｄ
ｈ２または該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可
能である、配列番号１から７に示したいずれかの配列中
の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌク
レオチド又はそれらのオリゴヌクレオチドと相補的であ
るオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項１に記載されたオリゴヌクレオチド
からなる、ＤＮＡの伸長反応のためのオリゴヌクレオチ
ドプライマー。 - 【請求項３】請求項１に記載されたオリゴヌクレオチド
の一部が修飾され、または検出可能な標識物質により標
識されてなるオリゴヌクレオチドプローブ。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000081806A JP2001258570A (ja) | 2000-03-17 | 2000-03-17 | 腸炎ビブリオ菌検出用のオリゴヌクレオチド |
| US09/808,358 US6562955B2 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Oligonucleotides for detection of Vibrio parahaemolyticus and detection method for Vibrio parahaemolyticus using the same oligonucleotides |
| DE60122043T DE60122043T2 (de) | 2000-03-17 | 2001-03-16 | Oligonukleotide zur Detektion von 'Vibrio parahaemolyticus' und Detektionsverfahren für 'Vibrio parahaemolyticus' unter Verwendung der gleichen Oligonukleotide |
| EP01106364A EP1134292B1 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-16 | Oligonucleotides for detection of 'Vibrio parahaemolyticus' and detection method for 'Vibrio parahaemolyticus' using the same oligonucleotides |
| US10/407,461 US20030176687A1 (en) | 2000-03-17 | 2003-04-07 | Oligonucleotides for detection of Vibrio parahaemolyticus and detection method for Vibrio parahaemolyticus using the same oligonucleotides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000081806A JP2001258570A (ja) | 2000-03-17 | 2000-03-17 | 腸炎ビブリオ菌検出用のオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001258570A true JP2001258570A (ja) | 2001-09-25 |
Family
ID=18598691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000081806A Pending JP2001258570A (ja) | 2000-03-17 | 2000-03-17 | 腸炎ビブリオ菌検出用のオリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001258570A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110836975A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-25 | 扬州大学 | 一种检测副溶血性弧菌td毒素的胶体金塑封检测卡及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10503382A (ja) * | 1995-01-19 | 1998-03-31 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ |
-
2000
- 2000-03-17 JP JP2000081806A patent/JP2001258570A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10503382A (ja) * | 1995-01-19 | 1998-03-31 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110836975A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-25 | 扬州大学 | 一种检测副溶血性弧菌td毒素的胶体金塑封检测卡及其制备方法和应用 |
| CN110836975B (zh) * | 2019-11-29 | 2023-05-02 | 扬州大学 | 一种检测副溶血性弧菌td毒素的胶体金塑封检测卡及其制备方法和应用 |
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