JP5203381B2 - Ｄｎａの増幅のための二重機能プライマーおよび使用法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

（技術分野）
本発明は、一般にヌクレイン（ｎｕｃｌｅｉｃ）増幅およびプロービングの分野に関し、およびより詳細には、単一の試薬混合物を使用して、ＰＣＲおよびプローブハイブリダイゼーションを実行する方法および組成物に関する。

（背景技術）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニング、遺伝子発現の分析、ＤＮＡ塩基配列決定、および遺伝子地図作成から、薬剤開発、犯罪法医学および同種のものまでにわたる技術の効率的な実行のためにほとんど不可欠なものとなった（Mullis, et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 :263-273 (1986); Saiki, et al., Science 230:1350-1354 (1985); Innis et al.ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）中の、方法および応用への手引き（Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社、サンディエゴ（１９９０）；および米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号）。もとは、ＰＣＲ増幅および増幅産物検出は別々に実行された。最近になって、このプロセスは、ＰＣＲ試薬およびプロービング試薬の両方を含む単一反応混合物の中へこれらの工程を組み合わせることによって改善された。この改善により、反応チューブを決して開かずに産物を生成および検出できるように、すべての試薬を一度に入れることが可能になる。この改善は、サンプル間の交差汚染の機会を減少させ、実験結果を得るために必要な操作数および時間を減少させた。

ＰＣＲ増幅産物が生成されると同時にそれらを検出するための多数の方法が現在存在する（「リアルタイム」ＰＣＲ）。一般にこれらの方法は、増幅反応混合物に追加する場合にオリゴヌクレオチドの蛍光が消光されるように、消光物質基も含むオリゴヌクレオチドに蛍光レポーター色素が連結される蛍光消光プローブを用いる。オリゴヌクレオチドは、増幅される標的ＤＮＡ（すなわち「特異的な標的」オリゴヌクレオチド）に選択的にハイブリダイズするようにデザインされる。蛍光レポーターの消光が様々なメカニズム（それらすべては増幅された標的配列とプローブの相互作用を必要とする）によって減少させられるので、蛍光シグナルが生成される。

１つの「リアルタイム」ＰＣＲ方法では、３’末端で伸長不可能なオリゴヌクレオチドプローブは、消光物質（quencher）がフルオロフォア（fluorophore）の蛍光を消光するように、フルオロフォア（５’末端で）および消光物質で標識される。標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションは、増幅の間に、ＰＣＲポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による切断に適切な基質を生成する。増幅の間に、ポリメラーゼ酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、プローブはより小さなフラグメントへと分解される。消光物質とフルオロフォアとの間の部位が切断される場合、フルオロフォアおよび消光物質はさらに空間的に分離されるようになり、消光効果が失われる。これにより蛍光シグナルが生ずる。この分析はタックマン（Ｔａｑｍａｎ）（登録商標）分析として公知である。この方法は、別々の検出工程を必要とする以前の方法を超える有意な改善を備えているが、この分析にはいくつかの欠点がある。すなわち、この分析は、２つのオリゴヌクレオチドのみが増幅に必要であるという事実にもかかわらず、少なくとも３つの標的特異的オリゴヌクレオチドの合成を必要とする。この増幅反応分析は、フルオロフォア／消光物質標識オリゴヌクレオチドプローブを効率的に消化できる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼもまた必要とする。

直線状の二重標識の蛍光消光オリゴヌクレオチドプローブは、５’末端でのエキソヌクレアーゼ分解がＰＣＲの間の生じないようにも修飾できる。そのようなプローブは、一本鎖ランダムコイルのコンフォーメーションでは消光されるが、より伸びた二本鎖の状態では蛍光を発する。これらのプローブはＰＣＲ反応中に含むことができ、もしそれらの標的配列が増幅されるようになる場合、蛍光シグナルを生成することができる。この方法では５’→３’エキソヌクレアーゼ活性についての必要性はなくなるが、この方法は「リアルタイム」検出による増幅を行なうために３つの標的特異的オリゴヌクレオチドを必要とする。

あるいは、ヘアピンのループ内に標的核酸にハイブリダイズできる配列を有するヘアピン形成可能プローブが開発されている。このプローブは、オリゴヌクレオチドがヘアピンコンフォーメーションをとる場合にフルオロフォアの蛍光が消光物質によって消光されるように、オリゴヌクレオチド上に位置する共有結合で結合するフルオロフォアおよび消光物質分子もまた含む。プローブがその標的配列と共に二重鎖を形成する場合にヘアピンは破壊され、フルオロフォアおよび消光物質は空間的に分離されるようになり、蛍光シグナルが観察される。シグナルを生成するためにプローブを分解する必要はないので、この方法はポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するという以前に記述されたタックマン（登録商標）分析での必要性を克服する。それにもかかわらず、以前に記述された分析と同様に、この方法は３つの標的配列特異的オリゴヌクレオチドを必要とする。さらに、可能なプローブ配列はヘアピン構造を形成できるものに限定される。ヘアピン配列はプローブ−標的結合の動力学および熱力学を妨害するだけでなく、そのような構造は化学的合成が困難である。

１つの「リアルタイム」増幅検出方法では、３つの標的特異的プライマーの必要性はない。この方法において、増幅プライマーの５’末端はオリゴヌクレオチド伸長部分を含む。この伸長部分はフルオロフォアおよび消光物質を含み、遊離されたプライマーでは蛍光が消光されるようにヘアピンコンフォーメーションをとることができる。一旦プライマーが二本鎖アンプリコンの中へ取り込まれ、プライマー−プローブの５’末端上のヘアピンが破壊されれば、フルオロフォアは消光物質から空間的に分離されるようになり、蛍光シグナルが発生する。このシステムの変形では、ヘアピン構造が共有結合のスペーサー／リンカー部分を介してＰＣＲプライマーに連結されることが可能である。

前述の「リアルタイム」ＰＣＲ方法の各々は、プローブのデザインおよび合成の両方における難しさに寄与し、増幅されたＤＮＡ鎖による二重鎖形成により競合するヘアピンループを含む、３つのオリゴヌクレオチドおよび／またはプローブのいずれかを要求するという点で限定されている。増幅および増幅産物の「リアルタイム」検出のために２つの標的特異的オリゴヌクレオチドのみを要求する新方式が必要である。プローブのデザインおよび合成を促進し、ヘアピンと二重鎖形成との間の競合をなくすために、そのような方法はヘアピンループ構造の使用も回避するべきである。

本発明はそのような組成物および方法を提供する。付加的な発明の特色に加えてこれらおよび本発明の他の利点も、本明細書において提供される本発明の記述から明らかになる。

（発明の概要）
本発明は、ＤＮＡ合成産物の検出を可能にする新規ヌクレオチド組成、およびその使用のための方法を提供する。１つの実施形態において、本方法はＰＣＲにおいて使用することができ、反応が生じると同時に反応の進行がモニタリングされることを可能にする。本発明は、ＤＮＡ伸長反応をプライミングすることができる少なくとも１つの蛍光消光オリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドは、伸長反応のプライミングに加えて、さらに連続した伸長反応サイクルの進行の検出ためのプローブとして機能する。

３’標的結合ドメインおよび５’鋳型−プローブ結合ドメインを有する第１のプライマーを使用して、増幅の間のリアルタイム検出のステージを示す図解である。３’標的結合ドメインは標的に特異的であり、ＰＣＲで用いられる標準条件下で標的に結合するのに十分な相補性を含み、ＰＣＲでプライマーとして機能することができる。５’鋳型プローブ結合ドメインは標的に相補的でなく、その代りに合成鋳型−プローブ核酸に相補的である。 標準的なタックマン（登録商標）の反応バッファーおよびサイクルパラメーターによる蛍光／消光プローブ／プライマーを使用する、ＰＣＲ分析のリアルタイムの分光蛍光測定プロットのグラフである。 蛍光シグナルを示した図である。図３ａにおいて、３つの棒セット中の棒は、左側から右側で、一本鎖プライマー／プローブから観察された蛍光、対応する二重鎖プライマー／プローブ、および対応するミクロコッカスヌクレアーゼ消化のプライマー／プローブを表わす。 実施例２において詳述される二重鎖分析のシグナル対ノイズ比を示した図である。図３ｂは、各々の消光物質−フルオロフォアの間隔でのオリゴヌクレオチドについての一組の２本の棒を示す。 観察されたシグナル対ノイズデーターが、プライマー／プローブの機能的性能に相関するかどうかをテストするＰＣＲ分析の「リアルタイム」の分光蛍光測定プロットのグラフである。 ＴＡＭＲＡ含有プローブの機能能力を図示するグラフである。 ＡＭＲＡ含有プローブの機能能力を図示するグラフである。 Ｔｌｉ Ｉ酵素がいつ追加されたかを示す３つのレーンを有するゲルの写真であり、ＰＣＲ前、ＰＣＲ後（７５℃で３０分の追加のインキュベーション）、または追加なしのいずれかである。産物はＰＡＧＥ（１０％ゲル、変性条件）を使用して分離し、ゲルスター（Ｇｅｌｓｔａｒ）を使用して染色し、ＵＶで可視化した。左側から右側で、最初の２つのレーンは、Ｔｌｉ ＩがＰＣＲ前（レーン１）、またはＰＣＲ後（レーン２）の反応に対して追加されたとしても、切断が生じることを示す。第３のレーンは、Ｔｌｉ Ｉを追加しなかったときの全長で未切断の産物を示す。 実施例８中に記載されていたＦＱＴ分析のプローブ、標的および鋳型との間の空間的関係の図解である。 ＰｓｐＧ１を使用する切断の有無、およびフォワードプライマーの有無によるＦＱＴ分析の有効性を実証する増幅プロットである。この分析はフォワードプライマーの存在に依存する。この結果は、この分析ではＰｓｐＧ１酵素による切断によりわずかによいシグナルが得られることを示す。 ＰｓｐＧ１を使用する切断の有無、およびキメラリバースプライマーの有無によるＦＱＴ分析の有効性を実証する増幅プロットである。この分析はキメラリバースプライマーの存在に依存する。 ５’ヌクレアーゼ分析と比較した、ＦＱＴ分析形式の有効性を示す増幅プロットである。５’ヌクレアーゼ分析はわずかに強いシグナルを有するが、両方の分析は同様の感受性を示す。 ＦＱ分析と比較した、ＦＱＴ分析形式の有効性を示す増幅プロットである。ＦＱ分析はわずかに強いシグナルを放出するが、両方の分析は同様の感受性を示す。 ＬＮＡおよび５−メチル−ｄＣ修飾を含むＦＱＴ分析の比較を示す増幅プロットである。ＬＮＡ修飾プローブはより強いシグナルであるが、両方の分析は同様の感受性を示す。 ５−メチル−ｄＣプローブを、酵素の切断の有無で比較する増幅プロットである。切断した型はわずかに強いシグナルを放出する。

（発明を実施するための形態）
オリゴヌクレオチドは、２つの機能ドメイン（プライマードメインおよび蛍光消光レポータードメイン）を含む。プライマードメインは所望の標的配列に対する相補性を有しており、ＰＣＲまたは他のＤＮＡ伸長反応をプライミングするように機能する。このドメインは修飾ＤＮＡまたは非修飾ＤＮＡからなることができ、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。レポータードメインはＤＮＡ塩基も含むが、フルオロフォア（レポーター）基および消光物質基の両方を含むように修飾されており、オリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。このドメインは鋳型に対して相補的または非相補的でありえる。レポータードメインは、レポーターと消光物質を接触するようにするヘアピンまたは他の安定した二次構造の形成を導く任意の核酸配列または構造を含まない。プライマードメインはＤＮＡ合成をプライミングするように機能するが、プライマーおよびレポータードメインの両方は、ＤＮＡ合成のための鋳型として、ＤＮＡ合成の反復サイクルのプロセスの間、オリゴヌクレオチドが一本鎖型から二本鎖型に変換されるように機能することができる。すべての実施形態において、オリゴヌクレオチドの蛍光は一本鎖型で消光される（ＤＮＡ合成のプライミング前に）。これはランダムコイルコンフォーメーションにおけるレポーターと消光物質との間の相互作用によって達成される。

シグナル生成（すなわち、蛍光消光の解放）のメカニズムにおいて異なる様々な実施形態が検討される。好ましくは、各変形はわずかに異なるプローブデザインを用いる。１つの実施形態は、ＤＮＡ合成またはＰＣＲの間の一本鎖ＤＮＡから二重鎖ＤＮＡへの移行により起こる蛍光シグナルの増加を測定する。ＤＮＡ分子上の点の間の末端間距離は、固い二重鎖ＤＮＡよりもランダムコイルコンフォーメーション一本鎖ＤＮＡで短い。一本鎖型がレポーター／消光物質ペアについては

の半径以内にあるように、および二重鎖型がフォースターの半径（フォースターの半径は各レポーター／消光物質の組合せに対して特有である）を上回るように、レポーターと消光物質の間の間隔が選択されるならば、一本鎖型は消光されるが、二重鎖型は消光されないだろう。したがって、消光を解放し、蛍光シグナルを産生するために必要な唯一の事象は二重鎖ＤＮＡの形成である（今後「未切断ＦＱ」と呼ばれる）。シグナルは単純に標的に対するハイブリダイゼーションによって達成されず、むしろ本発明の方法は、プローブがそれ自体で１つのプライマーとして役立つ場合にはＤＮＡ合成によって二重鎖形成を達成する。このように、ＰＣＲにおいて検出可能な蛍光が各反応サイクルにより蓄積し、鎖が蓄積するにつれてモニタリングすることができるために、シグナル生成はＤＮＡ合成に直接関連づけられる。あるいは、蛍光シグナルは、ＰＣＲの完了時に測定することができる。

本方法の他の実施形態は、レポーターおよび消光物質がヌクレアーゼの作用による介在塩基の切断によって分離されるときに起こる蛍光シグナルの増加を測定する。この方法は、好ましくは、プローブ／プライマーがそれ自体でプライマーとして機能するＤＮＡ合成またはＰＣＲの反応の結果として、プローブ／プライマーが二重鎖形態であることをさらに必要とする。レポーターと消光物質の分離をもたらすように二本鎖核酸を切断する任意のヌクレアーゼは、本発明の範囲以内にある（今後「切断ＦＱ」と呼ばれる）。２つの具体的な実施例が記述される。

ヌクレアーゼ作用によりレポーターおよび消光物質を分離する１つの方法は、制限酵素（restriction endonuclease）を使用して、グループの間のＤＮＡを切断することである。一般に、制限酵素は一本鎖ＤＮＡを切断しないが、二本鎖ＤＮＡ基質を要求する。このように制限酵素はもとのプローブ／プライマーオリゴヌクレオチドを切断せず、酵素はＤＮＡ合成またはＰＣＲの間に存在できる。ＤＮＡ合成の後にプローブ／プライマーが二本鎖になるとき、それは制限酵素のための基質になり切断されるだろう。切断によりレポーターは消光物質から分離されて蛍光シグナルを検出でき、シグナル生成はＤＮＡ合成に直接関連づけられてＤＮＡ合成の間にリアルタイムで追跡することができる。用いられた制限酵素が耐熱性であるならば、ＤＮＡ合成およびプローブ切断はＰＣＲの間に同じ反応で同時に進行することができる。例えば、１つの適切な耐熱性ＤＮＡ制限酵素はＴｌｉ Ｉ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社、ベヴァリー、マサチューセッツ）である。Ｔｌｉ Ｉの認識部位は「ＣＴＣＧＡＧ」であり、この配列がレポーターグループと消光物質グループとの間に位置するならば、Ｔｌｉ Ｉはプローブ（二重鎖型において）を切断することができる。様々な耐熱性制限酵素は同定され、それらの多くは使用のために適切かもしれない。ＰＣＲがエンドポイント分析として完了した後は、非耐熱性制限酵素を使用できる。

他の実施形態において、図１における図解によって要約されるように、この分析（以前の「ＦＱ」実施形態との間で区別するために今後「ＦＱＴ」と呼ばれる）は、３’標的結合ドメインおよび５’鋳型−プローブ結合ドメインを有する第１のプライマーを使用する。３’標的結合ドメインは、ＰＣＲにおいて用いられる標準条件下で標的へ結合するために十分な相補性を含む標的に特異的であり、ＰＣＲにおいてプライマーとして機能することができる。５’鋳型プローブ結合ドメインは標的に対して相補的でなく、その代りに、合成鋳型−プローブ核酸に対して相補的である。

第１のプライマー伸長反応において、形成される最初の伸長産物は、その５’末端でプローブ結合ドメインを含み、このドメインのソースはＰＣＲプライマーからである。次のプライマー伸長反応（ＰＣＲのサイクル２）において、その３’末端でプローブ結合ドメインの相補物を含む第１の伸長産物の相補物が合成される。鋳型−プローブ特異的配列の相補的なコピーは、鋳型としてもとのプライマーを使用して、ここで、ＤＮＡ合成を介して他の鎖上の標的配列につながれる。この様式で、標的−鋳型配列は、鋳型−プローブ配列に連結されるようになる。今や鋳型−プローブドメインが新しく合成されたＤＮＡ鎖の３’末端上にあり、それ自体でここで後続するＰＣＲ反応におけるプライマーとして役立つ能力のあることが理解される。

３’末端でプローブ結合ドメインに相補的な配列を含む鋳型−プローブは、第２の伸長産物の３’末端にハイブリダイズされる。フルオロフォア部分および消光物質部分の両方があるプローブは、第２の伸長産物に対してハイブリダイズしない５’領域を含む。フルオロフォア部分および消光物質部分を含むプローブ部が一本鎖のとき、蛍光は消光される。この核酸がプライマーとして役立つことができないように、鋳型−プローブは３’末端でブロックされる。この目的のための１つの適切なブロック基はジデオキシシチジン（ｄｄＣ）である。

第３のプライマー伸長部分反応において、第２の鎖はプローブの５’領域に対する相補物が合成されるように伸長される。プローブはしたがって少なくとも、部分的に二本鎖になる。ＤＮＡ合成による二重鎖ＤＮＡの形成は、フルオロフォアおよび消光物質の間の距離を伸ばし、結果として蛍光の増加を生じる（今後「未切断ＦＱＴ」と呼ばれる）。任意で、プローブは、レポーターと消光物質との間にヌクレアーゼ感受性配列を含むようにデザインされる。この位置に様々な切断可能エレメントを置くことができるかもしれない。１つの具体例として、前記ヌクレアーゼによって切断された場合、レポーターと消光物質の物理的分離をもたらし、それによって蛍光強度のさらなる増加を導く、制限酵素制限部位である（今後「切断ＦＱＴ」と呼ばれる）。１つの適切な制限酵素認識部位は、好熱性制限酵素ＰｓｐＧ１によって切断されるＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧである。このプロセスは増幅の後続ラウンドにより繰り返すことができる。

図１は、鋳型の結合ドメインが十分に高いＴｍを有するならば、図１において示されるすべての反応がリアルタイムで同時に行なうことができることを示す。５−メチル−ｄＣ（５Ｍｅ−ｄＣ）、５−プロピニル−ｄＣ（ｐｄＣ）、またはロックされた核酸（ＬＮＡの）などの残基は、Ｔｍを増加させるために鋳型プローブの結合ドメイン（「Ｂ」）の中に取り込むことができる。「×」は、鋳型がそれ自体でＤＮＡ合成をプライミングすることを阻害する役目をする鋳型−プローブの３’末端上のブロック基を表わす。

本発明のこの実施形態において、蛍光消光鋳型オリゴヌクレオチドは標的に対して相補的な任意の配列ドメインを持たない。したがって、検出反応のＦＱＴ鋳型成分は、多数の異なる核酸標的配列の検出分析において用いることができるユニバーサル検出試薬として役立つことができる。この反応の標的特異的成分は、フルオロフォア基または消光物質基などの費用がかかる修飾の含有なしで合成することができるオリゴヌクレオチドプライマー中に存在する。修飾したＦＱＴプローブは大規模により経済的に生産することができ、特異性が低コストの修飾されないオリゴヌクレオチドプライマーによって測定される複数の反応のための検出試薬として使用できる。

レポーターおよび消光物質をヌクレアーゼ作用により分離する他の方法は、レポーター基および消光物質基との間にＲＮＡ塩基を位置させ、ＲＮａｓｅ Ｈを使用して切断することである。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ部を特異的に切断し、一本鎖ＲＮＡを切断しないエンドリボヌクレアーゼである。切断される核酸は、完全にＲＮＡからなる必要はない。好ましくは、それはＲＮＡ残基およびＤＮＡ残基の両方を含むキメラでありえるが、切断はＲＮＡセグメントの中に起こる。１つの実施形態において、ＲＮＡ含量は少なくとも連続して４つのＲＮＡ残基を含み、それはＲＮａｓｅ Ｈの完全に活性のある基質を構成する。したがって、この方法のためのプライマー／プローブオリゴヌクレオチドは、レポーターと消光物質との間に連続する集団として約４つのＲＮＡ塩基が位置するＤＮＡ／ＲＮＡキメラになるだろう。ＲＮＡは、大部分のポリメラーゼ（逆転写酵素以外の）によるＤＮＡ合成のための鋳型として通常使用することができないが、ＲＮＡの短いストレッチはキメラ中に挿入することができ、多くのＤＮＡポリメラーゼ酵素により機能するだろう。したがって、キメラＲＮＡ／ＲＮＡプローブ／プライマーは、両方とも、プライマー、鋳型およびプローブとして機能することができる。さらに、耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈが利用可能であり、ＤＮＡ合成またはＰＣＲがプローブ切断と同時に起こる場合には均質分析形式を可能にする。

他の実施形態において、ＤＮＡ配列中の単一のリボヌクレオチド塩基で切断が起こるＲＮａｓｅ Ｈ切断の変形が用いられる。以前に略述されたように、ＲＮａｓｅ Ｈのための１つの基質はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のＲＮＡ核酸であり、切断は中心のＲＮＡ残基に続く３’末端で起こり、遊離３’−ＯＨを残す。酵素のＲＮａｓｅ Ｈファミリーの特定のメンバーは、他の基質を切断する能力を有する。例えば、１つのクラスの酵素は、ＤＮＡとの二本鎖コンフォーメーションでアニールした場合、ＤＮＡ配列中に単一のＲＮＡ残基を有する核酸分子を切断することができる。このケースでは、ＲＮＡ残基に対して５’で切断が起こり、同じように遊離３’−ＯＨを残す。ヒトＲＮａｓｅ Ｈ１酵素はそのような基質を切断することが示された（Eder et al., J.Biol.Chem. 266 (1991), 6472-6479）。類似したＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、マウス（マウスＲＮａｓｅ Ｈ１についてはCerritelli et al., Genomics 53 (1998), 300-307を参照）、および原核生物（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）からのＲＮａｓｅ ＨＩＩについてはHaruki et al, FEBS Letters 531 (2002) 204-208を参照）において見出された。提案された分析において、単一のリボヌクレオチドを含むヘテロ二重鎖を切断できる好熱性ＲＮａｓｅ Ｈを使用することができ、切断および検出が増幅と同時にリアルタイムで起こることを可能にすることができた。切断ＦＱまたは切断ＦＱＴの実施形態において、ＲＮａｓｅ Ｈタイプの酵素による切断を利用できるかもしれない。

以下の制限酵素のセットは市販で入手可能であり、酵素が高温で安定しているという要求を満たすと思われる。酵素Ｔｌｉ ＩおよびＰｓｐＧ Ｉは、「極端な」好熱性生物から由来し、ＰＣＲにおいて使用される条件で活性を持つだろう。残りの酵素は、８０℃で２０分間安定しているものとして製造者によって同定された。

注：Ｔｌｉ ＩはＸｈｏ Ｉの耐熱性アイソシゾマーである。

提案された発明の様々な実施形態は、当技術分野で周知の多数の増幅方法において機能することができる。提案された発明は、多項式的増幅（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）において機能することができる（Behlke et al.、米国特許第７，１１２，４０６号を参照）。多項式的増幅（「ポリアンプ（ｐｏｌｙａｍｐ）」）反応（Behlke et al.中に記載されているように）は、内部の位置で、鋳型となるときは機能をブロックするがプライマー活性は保持するような方法で修飾された一方向（「フォワード」プライマー）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる（すなわち「複製欠損」プライマー である）。第２の（「リバース」）プライマーは「複製成分」であり、通常修飾されない。複数の複製欠損プライマーは、反応の増幅力を高めるためにネステッド様式で一緒に使用することができる。通常、単一の複製成分リバースプライマーが使用される。

様々な産物は多項式的増幅の間に生じ、その正確な性質は、用いられたネステッド複製欠損フォワードプライマーの数に依存する。各産物の長さは変化しているが、それらはすべて単一のリバースプライマーによって定義される共通の１つの末端を共有する。反対の末端は、用いられた各々の修飾されたフォワードプライマーについてのブロッキングドメインによって定義される。

多項式的増幅の正確な検出方法は限定されている。５’ヌクレアーゼ分析は様々な産物を検出し、最終ポリアンプ反応生成物について特異的ではない。ＦＱＴ分析はより正確な分析形式を提供する。この方法は、最終増幅産物の３’末端に対してオリゴヌクレオチド（「ポリアンプＦＱＴプローブ」）のアニーリングを必要としている。アニールされたオリゴヌクレオチドは、プライマーとして増幅産物を使用して、ＤＮＡ合成反応のための鋳型として役立つ。プライマー伸長反応は未標識ｄＮＴＰの存在下で実行され、同じチューブ中で増幅と同時に起こることが可能である。ＦＱＴプローブの結合ドメインに相補的な３’末端を有する増幅産物は、この反応が進行するために必要とされる。反応生成物が最も内側の複製欠損プライマーのブロッキングドメインで終結する場合には、この産物は特異的にポリアンプから生じる。この新しい検出スキームは、検出イベントに対して以下の追加の２レベルの特異性を付与する。１）特異的ハイブリダイゼーションが検出鋳型オリゴヌクレオチドとポリアンプ産物との間で起こらなくてはならない。そして２）上述のハイブリダイゼーションイベントにカップルさせた場合、ＤＮＡ合成をプライミングに利用可能な遊離３’末端を有する増幅産物が存在しなくてはならない。

以下の実施例は本発明をさらに説明するが、当然その範囲を限定する任意の方法で解釈されるべきでない。

（実施例１）
この実施例は、標的ＤＮＡを増幅し、増幅された標的ＤＮＡの量に対応する「リアルタイム」蛍光シグナルを生ずるために蛍光消光プライマー／プローブを使用できることを実証する。

以下のオリゴヌクレオチドをこの実施例のために調製した。

配列番号：１は増幅のための標的として供された。配列番号：２、３および４は標的を増幅するために使用された。配列番号：４は配列番号：３と同じプライミング配列を有しており、その５’末端上に付加ヌクレオチド配列もまた含んでいた。配列番号：４において、付加ヌクレオチド配列はフルオロフォアおよび消光物質を含んでいた。しかし、構造にはヘアピンループ形成を導く配列はなかった。フルオレセインで修飾されたｄＴ塩基はｔと表わされた。フルオロフォアはフルオレセインであり、自動シンセサイザーにおいて公知のホスホアミダイトケミストリーを使用して、フルオレセイン−ｄＴとしてオリゴヌクレオチドに付加された。消光物質は、自動シンセサイザーにおいて標準的なホスホアミダイトケミストリーを使用して、５’末端ヒドロキシル基に付加した、米国特許出願第１０／６６６，９９８号中に記載される特許アントラキノン消光物質であった。オリゴヌクレオチドに対するアントラキノン消光物質の結合は、図１中で以下に示される。

式１

すべての配列については、特に断りのない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を表わし、オリゴヌクレオチド配列は、左側に５’末端および右側に３’末端で書かれている。オリゴヌクレオチド基質は、アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーで標準的なホスホアミダイトケミストリーを使用して合成した。

合成に続いて、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し、標準的な方法を使用して脱保護した。次に、オリゴヌクレオチドを、ｐＨ７．２で０．１Ｍトリエチル−酢酸アンモニウム（ＴＥＡＡｃ）中の５〜５０％のアセトニトリルの直線的勾配を使用して、ハミルトンＰＲＰ−Ｉカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ）の逆相ＨＰＬＣで４０分にわたって精製した。モニタリングは２６０ｎｍおよび４９４ｎｍで行い、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド種に対応する画分を採取し、プールし、凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドを２００μｌの滅菌済み水中に溶解し、２％ＬｉＣｌＯ₄を１ｍｌ追加することにより沈殿させ、続いて１０分間１０，０００ｇで遠心分離した。上清をデカントし、沈殿を１０％含水アセトンで洗浄した。

オリゴヌクレオチドを、０．１Ｍトリス緩衝液中の０％〜５０％１Ｍ ＬｉＣｌの４０分の直線的勾配を使用して、イオン交換ＨＰＬＣで４０分にわたってさらに精製した。モニタリングは２６０ｎｍおよび４９４ｎｍで行い、二重標識オリゴヌクレオチド種に対応する画分を２％ＬｉＣｌＯ₄により採取し、プールし、沈殿させ、凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドの識別は ボイジャー−ＤＥ バイオスペクトロメトリー（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）ワークステーションを使用して、質量分析法によって確認された。オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応において使用されることを１回実証した。

ＰＣＲ反応混合物は２５μｌ反応容量中で以下の組成物であった。
２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
２００ｎＭ各ｄＮＴＰ
２００ｎＭＰＣＲプライマー「フォワード」
２００ｎＭＰＣＲプライマー「リバース」または「ＰＣＲプローブプライマー」
１０²、１０⁴、１０⁶および１０⁸コピーの標的ＤＮＡ
２．５ユニットのアンプリタック・ゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）ＤＮＡポリメラーゼ

反応混合物を最初に９５℃で１０分間処理した。次に、標的は９５℃で１５秒間変性し、６０℃で６０秒間アニーリングおよび伸長を続いて行なう、２ステップＰＣＲサイクルを使用した。ＰＣＲ分析のリアルタイム分光蛍光測定のプロットを図２中で示す。

図２において示されるように、二重標識プライマー（配列番号：４）は、効率的に標的配列の増幅をプライミングし、増幅が進行するにつれて蛍光シグナルを増加させた。最も高い標的の濃度（１０⁸コピー）のサンプルでは、蛍光は最も急速に指数関数的に増加（すなわち最低のＣｔ値）し、それは１２サイクルで起こった。１０⁶コピーの標的の反応は１９サイクルのＣｔ値であり、１０⁴コピーの標的の反応は２５サイクルのＣｔ値であり、１０²の標的反応は２９サイクルのＣｔ値であった。すべてのサンプルは４０サイクルの終了時までに類似した最大シグナルを生成した。比較のために、増幅が起こらない反応の蛍光もまた示される。

この実施例は、標的核酸配列を増幅し、同時に増幅の進行のモニタリング用に直接的なシグナルを提供するために、発明の二重標識プライマーを使用できることを実証する。この実施例は、これらのプライマーにより１００コピーという低い標的数を効率的に増幅できることもまた示す。この実施形態において、プローブ切断は起こらなかった。プローブが二本鎖ＤＮＡに変換されるとともに、シグナルは消光が解放されることから生成される。プローブの切断および分解は含まれていない。

（実施例２）
これは、最大のシグナル対ノイズ比がプライマー／プローブにおいて得られるように消光物質とフルオロフォアとの間の距離を最適化する１つの方法を示す。同じ最適化結果はＦＱＴ鋳型プローブに適用されるだろう。

オリゴヌクレオチドプライマー／プローブの蛍光は、３つの別個の物理的状態（すなわち、一本鎖、二本鎖、およびレポーターと消光物質との間の点での切断の後）のオリゴヌクレオチドプライマー／プローブについて測定した。オリゴヌクレオチド切断については、切断を、２つの方法（第１の一本鎖のプライマー／プローブをミクロコッカスヌクレアーゼおよびＤＮａｓｅ Ｉの混合物により消化した）で行なった。蛍光は、テカン（Ｔｅｃａｎ）社プレート蛍光測定器またはＰＴＩキュベット蛍光測定器において製造者の使用説明書に従って測定した。

以下のオリゴヌクレオチドをこの実施例で調査した。

４００ｎＭの各オリゴヌクレオチド溶液を１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂中で調製した。各オリゴヌクレオチドの蛍光はこの一本鎖型で測定した。次に各オリゴヌクレオチドを２倍のモル過剰の相補的なＤＮＡと混合し、二重鎖を形成させ、蛍光を再測定した。一本鎖オリゴヌクレオチドの小分けを、３７℃で１時間５ユニットのミクロコッカスヌクレアーゼおよび５ユニットのＤＮａｓｅ Ｉでも処理し、蛍光を測定した。ミクロコッカスヌクレアーゼ消化物は、プライマー／プローブから期待することができる最大量の蛍光を示すが、オリゴヌクレオチドの一本鎖型は同じプライマー／プローブのバックグラウンド蛍光を示す。

これらの測定からの結果は、図３ａおよび棒グラフの型で３ｂ中に示される。図３ａにおいて、３つの棒セット中の棒は、左側から右側で、一本鎖プライマー／プローブから観察された蛍光、対応する二重鎖プライマー／プローブ、および対応するミクロコッカスヌクレアーゼ消化のプライマー／プローブを表わす。

図３ａにおいて示されるように、消光物質とフルオロフォアとの間のスペースが約１４ヌクレオチドであるまで、プライマー／プローブの一本鎖型は比較的低いバックグラウンド蛍光である。分離が約１４ヌクレオチド以上に増加するにつれて、バックグラウンド蛍光は着実に増加した。これは、一本鎖ランダムコイルコンフォーメーションにおいて、消光物質部分とフルオロフォア部分との間の距離の増加から生じる消光効率の減少を反映するのだろう。

ミクロコッカスヌクレアーゼによって消化されたプライマー／プローブで観察された最大の蛍光シグナルは、すべてのプローブについて比較的一定だった。サンプル間で観察される蛍光の小さな差はオリゴヌクレオチド品質の変動から生じうる。塩基間隔が約１６塩基対に増加するにつれて、プライマー／プローブの二重鎖型間蛍光シグナルは、着実に最大値まで増加した。

シグナル対ノイズ比を計算し、図３ｂにおいて棒グラフ型で示す。図３ｂは、各々の消光物質−フルオロフォア間隔でのオリゴヌクレオチドについての一組の２本の棒を示す。左側の棒は、その二重鎖型で観察された蛍光を一本鎖プライマー／プローブで観察された蛍光で割ることにより計算されるシグナル対ノイズ比を示す。右側の棒は、消化された二重鎖型で観察された蛍光を一本鎖プライマー／プローブで観察された蛍光で割ることによる分解ミクロコッカスヌクレアーゼ分析において、各々のプライマー／プローブごとに測定される理論上最大のシグナル対ノイズ比を示す。

分解分析については、フルオロフォアと消光物質との間の距離が１２ヌクレオチドを超えるまでシグナル対ノイズ比は比較的高く（約１５〜２０）、次に実質的に約５まで減少する。これとは対照的に、消光物質とフルオロフォアが約１２塩基対で分離されるときに二重鎖の非分解分析はピークのシグナル対ノイズ比を示し、間隔が約１４以上のヌクレオチドであるときに最小約５まで急激に減少する。約６〜８ヌクレオチドのより短い分離距離では、かなりの消光が二重鎖型において存在するので、ピークのシグナル強度が損なわれるように思われる。１４以上のヌクレオチドのより長い分離距離では、ピークのシグナル強度は二重鎖型において達成されるが、一本鎖型における消光は不完全である。

観察されたシグナル対ノイズデーターがプライマー／プローブの機能的な性能と相関するかどうかをテストするために、同じプローブシリーズを「リアルタイム」ＰＣＲ分析において使用した。分析デザインは、プライマー／プローブによる実施例１において使用されるものと同一だった。これらのプローブによる「リアルタイム」ＰＣＲ実験からの結果は、図４中で示される。１２以上の塩基の消光物質とフルオロフォアの分離を備えたプローブはすべて、同じようによく動作した。分析における性能は、シグナル対ノイズ比よりもピーク蛍光強度との高い相関関係を示した。

したがって、最大のシグナル対ノイズ比を達成するフルオロフォアと消光物質との間の間隔を最適化するためにこの方法を使用できるように思われる。この実施例において、フルオレセインおよびアントラキノン消光物質では、至適間隔は約１０〜１２ヌクレオチドであるように思われる。さらに、すべてのプローブは「リアルタイム」ＰＣＲ分析においてシグナルを生成したが、アントラキノン消光物質とフルオレセインとの間の間隔が少なくとも１２ヌクレオチドである場合、よりよい結果が得られた。フルオロフォアと消光物質との間の至適間隔が使用されるならば、制限酵素切断を使用する必要はない。１２未満の塩基間隔が所望されるならば、切断はよりよい代替案でありうる。

（実施例３）
この実施例は、フルオロフォアＴＡＭＲＡによりプライマー／プローブを調製できることを示す。以下のオリゴヌクレオチドは、フルオレセイン−ｄＴがフルオロフォア（ＴＡＭＲＡ−ｄＴ）で置き換えられたという例外を除いて実施例２中で記載されているのと同じ方法を使用して調製された。

実施例２におけるように、オリゴヌクレオチドプライマー／プローブの蛍光は、３つの別個の物理的状態（すなわち、一本鎖、二本鎖、およびレポーターと消光物質との間のオリゴヌクレオチドの切断の後）のオリゴヌクレオチドプライマー／プローブについて測定した。オリゴヌクレオチド切断については、ミクロコッカスヌクレアーゼおよびＤＮａｓｅ Ｉの混合物による消化を介して切断を行なった。蛍光は、テカン社プレート蛍光測定器またはＰＴＩキュベット蛍光測定器において製造者の使用説明書に従って測定した。結果を図５ａおよび５ｂ中に示す。

一般に、ＴＡＭＲＡにより得られた結果は、フルオレセインを使用した実験２において以前に得られた結果に著しく類似するように思われた。ＴＡＭＲＡとアントラキノン消光物質との間で１０ヌクレオチド間隔では、一本鎖プライマー／プローブの蛍光ほとんどなく、二重鎖およびミクロコッカスヌクレアーゼ消化サンプルは実質的な蛍光がある。１８ヌクレオチドでは、バックグラウンドは上昇し始めるが、二重鎖およびミクロコッカスヌクレアーゼ消化サンプルは両方とも実質的な蛍光を示す。

プライマー／プローブは、「リアルタイム」ＰＣＲにおいて使用された場合、すべて実施例２からのフルオレセイン含有相当物と同じようによく動作した。

この実施例は、本発明のプライマー／プローブが様々なフルオロフォアを含むことができ、プライマー／プローブのデザインパラメーターが、フルオロフォアの選択によって有意に影響されないことを示す。さらに、この実施例は、ＴＡＭＲＡ（フルオレセインよりも強いシグナルを産生する）が二重標識プローブ発明においてフルオレセインに対する効果的な代替物であることを実証する。

（実施例４）
この実施例は、制限酵素がＰＣＲ環境において機能できることを実証する。

実施例２および３において示されるように、間隔が至適ならば、フルオロフォアと消光物質の分離のために切断を利用する必要はない。間隔が至適範囲未満であるならば、酵素の切断は代替方法であり、実際には好ましいだろう。

二重標識プライマー／プローブ（配列番号：４）は、一本鎖のランダムコイルコンフォーメーションでは、制限酵素のための基質ではない。しかしながら、増幅の間に、プライマー／プローブはオリゴヌクレオチド鎖へ取り込まれ、後続するラウンドの増幅の後に二本鎖になる。一旦プライマー／プローブが二重鎖構造へ取り込まれるようになれば、切断イベントが起こりうる。フルオロフォアと消光物質との間に制限酵素部位を配置することによって、切断イベントは消光物質からレポーターを恒久的に分離させること、および蓄積した増幅産物の量に比例した蛍光を恒久的に増加させることを引き起こす。

この実施例において、プライマー／プローブ配列番号：４中のフルオロフォアと消光物質との間のＴｌｉ Ｉ認識配列（「ＣＴＣＧＡＧ」）を、Ｔｌｉ Ｉ制限酵素で処理した。この酵素は、増幅が同じ反応混合物において起こるにつれて、潜在的にプローブを切断できる極端に耐熱性のある制限酵素である。

以下のプライマーセットをこの実施例において評価した。

オリゴヌクレオチドは実施例１におけるものと同じであった。

ＰＣＲ反応混合物は５０μｌ反応容積中で以下の組成物であった。
１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、
３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
２００ｎＭ各ｄＮＴＰ
２００ｎＭ ＰＣＲプライマー「フォワード」
２００ｎＭ ＰＣＲプローブ−プライマー／リバース
１０⁸コピー標的ＤＮＡ（配列番号：１）
２．５ユニットのアンプリタック・ゴールドＤＮＡポリメラーゼ

ＰＣＲは３０サイクルで行ったが、他の点では温度サイクリング条件は実施例１と同じであった。１つの反応において、ＰＣＲが行なわれる前にＴｌｉ Ｉ酵素を追加した。他の反応において、Ｔｌｉ ＩをＰＣＲ反応の後にも追加した。Ｔｌｉ ＩをＰＣＲの後で追加した場合、７５℃で３０分間ＰＣＲ反応混合物中でインキュベートした。Ｔｌｉ Ｉを追加しない場合、実施例１におけるように分析も行ない、結果を示す。切断が実際に起こったかどうか決定するために、各々の反応からの産物を変性条件下で１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ゲルスター（商標）染色を使用して染色した、適切な光線下で可視化した。

照明されたゲルの写真を図６において提供する。図６は、３つのレーンがあるゲルを示す。左側から右側で、最初の２つのレーンは、Ｔｌｉ Ｉを、ＰＣＲ前（レーン１）、またはＰＣＲ後（レーン２）に反応に追加したとしても切断が起こることを示す。第３のレーンは、Ｔｌｉ１が追加されなかった場合の全長の未切断の産物を示す。

この実施例は、増幅がＴｌｉ Ｉ制限酵素の存在下で起こりうることを実証し、酵素がＰＣＲ増幅条件下で活性を持つことができることを示す。

（実施例５）
この実施例は、本発明のプライマー／プローブのフルオロフォアと消光物質との間の制限酵素認識配列のための適切な位置を決定する方法を示す。この実施例は、プライマー／プローブの５’末端のアントラキノン消光物質とフルオレセインｄＴとの間でのＴｌｉ Ｉによるプローブの切断を可能にするＴｌｉ Ｉ制限酵素認識配列のための適切な位置もまた具体的に実証する。

この方法は、Ｔｌｉ Ｉ認識配列の位置が、消光物質およびフルオロフォアに関して変更された一組のオリゴヌクレオチドプライマー／プローブを作成することを含んでいた。この実施例で作製されたオリゴヌクレオチドを以下にリストする。Ｔｌｉ Ｉ認識配列はボールド体で示され、フルオレセイン−ｄＴ残基はｔで明示される。

実施例１におけるように、オリゴヌクレオチドを調製および精製した。オリゴヌクレオチドを二重鎖分子を形成するために相補的なオリゴヌクレオチドとアニールし、次に制限酵素製造者の使用説明書に従ってＴｌｉ Ｉ消化を行なった。切断混合物は、切断効率を決定する標準的な方法によってポリアクリルアミドゲル上で分離した。

表において示されるように、フルオレセインに標識されたｄＴ残基による切断配列の破壊または消光物質とフルオレセインに標識されたｄＴとの間の７〜９ヌクレオチド間隔以内の認識配列の配置は、Ｔｌｉ Ｉによる切断をブロックする。１２の塩基分離またはそれ以上のすべての配列（配列番号：１５〜２０）は切断された。

（実施例６）
この実施例は、５’末端上でユニバーサル配列により修飾された二重標識プライマーを遺伝子特異的増幅に効果的にカップリングできるかどうかを評価する。ユニバーサル配列により修飾された二重標識プライマーを「リアルタイム」ＰＣＲ反応において使用し、標準的なタックマン（商標）分析および二重標識プライマー分析を使用する「リアルタイム」ＰＣＲ反応と比較した。反応混合物は以下の組成物であった。
１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、
３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
２００ｎＭ各ｄＮＴＰ２００ｎｍ各プライマー
１０⁶クローン化されたＭＰ４８ ＤＮＡ
２．５ユニットのアンプリタック・ゴールドＤＮＡポリメラーゼ
（＋／− ３μｌ、３０ユニットＴｌｉ Ｉ）
５０μｌの最終的な反応容積
以下のプライマーセットを、ＭＰ４８アンプリコン（配列番号：２４）を使用してこの実施例において評価した。

増幅は、４０回の温度サイクルを使用して、実施例１と同じ手順を使用して実行された。各システムは蛍光シグナルを生成した。二重標識システムおよびタックマン（登録商標）システムのＣｔ値は２０であり、ユニバーサルプライマーシステムのＣｔ値は２３であった。ユニバーサルプライマーについての時間の遅れは、二重標識プライマーの使用のための未修飾架橋プライマーからの標的の最初の生成に起因する予想されるシステム固有の特色である。

この実施例は、固有の遅れ期間を例外として、ユニバーサルプライマーシステムがタックマン（登録商標）システムまたは二重標識プライマーシステムと同じくらい効果的であることを実証する。

（実施例７）
この実施例は、架橋プライマーの量の漸増および各濃度の蛍光の評価によって、架橋プライマーの最適濃度を評価する。その手順は、二重標識プライマーシステムがない以外は、実施例６におけるものと同じであり、以下の濃度の複数のユニバーサルプライマーシステムがある。
１００ｎＭ架橋プライマー
１０ｎＭ
８ｎＭ
４ｎＭ
２ｎＭ

１８¹/₂Ｃｔのタックマン（登録商標）システムＣｔ値は、ユニバーサルプライマーシステム値よりもまだ低かった。１００ｎＭ、１０ｎＭおよび８ｎＭの濃度はすべて、２１¹/₂付近の類似したＣｔ値であった。４ｎＭおよび２ｎＭの濃度は、２３¹/₂付近のＣｔ値であった。

この実施例は、ユニバーサルプライマーシステムにおける架橋プライマーの最適濃度が、標準的な１００ｎＭ濃度から広くわたり、８ｎＭ程度まで低くなりえることを実証する。

（実施例８）
この実施例は、図１において示されるＦＱＴ分析の有効性を実証する。以下の配列が調製された。

ＩＱ＝アイオワブラック（Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ）
アゾ消光物質ＲＱ＝アイオワブラックアントラキノン消光物質
Ｆ＝ＦＡＭフルオロフォア
Ｍ＝ＭＡＸフルオロフォア
修飾塩基（下線を引いた）は以下のものを含む。
ＬＮＡ＝ロックされた核酸
５ｍｃ＝５−メチル−ｄＣ
ｐｄＣ＝プロピニル−ｄＣ
制限部位は太字／イタリック体で表わされる。

本発明の方法を使用して、ＦＱおよびＦＱＴのプローブの性能を比較するために、複数の分析を行なった。配列番号：３０〜３２は、５’ヌクレアーゼ（タックマン（登録商標））分析のためにデザインされた。配列番号：３３〜４０は、ＦＱ分析形式での使用のためにデザインされた。配列番号：４１〜４３は、ＦＱＴ分析形式での使用のためにデザインされた。図７は、ＦＱＴ分析の間に起こる生化学的なイベントのための配列アライメントを説明する。配列番号：４４〜４７は、未修飾または修飾されたＦＱＴ鋳型プローブである。ＦＱＴ反応混合物は下記を含む。
ＦＱＴ分析
０．２５Ｕバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社 ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
２００ｎＭフォワードプライマー配列番号：３０
２００ｎＭキメラリバースプライマー配列番号：４３
２００ｎＭＦＱＴ−ＬＮＡ配列番号：４７
＋／−１０ＵＰｓｐＧ１
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂
９５^3:00−（９５^0:15−６３^0:30−７２^0:30）×４５サイクル

ＦＱＴ分析がＰｓｐＧ１酵素の存在下および非存在下でシグナルを生成するかどうかを決定するために、ＦＱＴ分析をＡＢ７９００ ＨＴ（アプライド・バイオシステム社）プラットフォーム上で実行した。図８および９における増幅プロットから、プライマー成分がすべて存在する場合にＬＮＡ修飾ＦＱＴプローブが蛍光シグナルを生成すること、どちらかのプライマーが削除される場合にシグナルは得られないことが示される。ＦＱＴ分析は、切断分析形式および非切断分析形式の両方で機能した。シグナル生成は、プローブ切断で〜３サイクル早く出現した。図１０はＦＱＴ分析（切断有りおよび切断無し）を５’ヌクレアーゼ分析と比較し、図１１はＦＱＴ分析をＦＱ分析形式（切断有りおよび切断無し）と比較する。ＦＱＴ分析は５’−ヌクレアーゼ分析およびＦＱ分析と本質的には同一に実行されたが、シグナル生成は１サイクルの遅延を示し、それは最初のシグナル生成イベントがＰＣＲの第２サイクルから始まる分析デザインに起因して予想される（図１および図７）。

５’−ヌクレアーゼ反応混合物は以下のとおりであった。
０．２５Ｕバイオラッド ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
２００ｎＭリバースプライマー配列番号：３１
２００ｎＭフォワードプライマー配列番号：３０
２００ｎＭ ＦＡＭ−ＦＱプローブ配列番号：３２
３ｍＭ ＭｇＣｌ₂
９５^3:00−（９５^0:15−６３^0:30−７２^0:30）×４５サイクル

実施例８の結果は、ＦＱ分析または５’−ヌクレアーゼ分析のいずれかと比較して、ＦＱＴ分析は類似した検出感度を有しており、定量的核酸検出については機能的に交換可能であることを実証する。

（実施例９）
以下の実施例は、他のＦＱＴプローブ組成物の機能的比較を提供する。ＦＱＴプローブ（配列番号：４４〜４７を参照）は、５−メチリー（ｍｅｔｈｌｙ）−ｄＣ、プロピニル−ｄＣまたはロックされた核酸（ＬＮＡ）塩基により未修飾または修飾された。図１２は、切断酵素（ＰｓｐＧ１）が存在する場合の、５−メチル−ｄＣ修飾ＦＱＴプローブとＬＮＡ修飾ＦＱＴプローブの間の比較の結果を示す。図１３は、同じ反応がプローブ切断なしで機能することを示す。

各参照が参照することにより組み入れられるために個別におよび具体的に示され、参照全体が本明細書において説明されるかのように、出版物、特許出願および特許を含む本明細書において引用される参照はすべて、同程度に参照することにより本明細書に組み入れられる。

用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」および本発明について記述する文脈中の（特に以下の請求項の文脈中の）類似する指示対象の使用は、本明細書において特別の指示の無い限り、または文脈により明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断りのない限り、制限がない用語（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の詳述は、本明細書において特別の指示の無い限り、その範囲以内にある各々の分離した値を個別に指す簡便方法として取り扱うように単に意図され、各々の分離した値は、それが個別に本明細書において詳述されるかのように明細書へ組み入れられる。本明細書において記述される方法はすべて、本明細書において特別の指示の無い限り、または文脈により明らかに否定されない限り、適切な順序で実行することができる。任意のおよびすべての例の使用または本明細書において提供される例示的な言葉（例えば、「などの」）は、単によりよく本発明を例証するように意図され、特別に請求されない限り本発明の範囲に対して制限を提起しない。明細書中の言葉は、本発明の実行にとって必須のものとして任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきでない。

本発明の実行のために、本発明者に既知の最良実施態様を含む本発明の好ましい実施形態が、本明細書において記述される。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の記述を読み取ることで当業者に明らかになるだろう。本発明者は当業者が必要に応じてそのような変形を用いることを予想し、本発明者は、具体的に本明細書において記述される通り以外に本発明を実行することを意図する。したがって本発明は、適用法令によって認められるように、本明細書に添付された請求項において詳述される内容の修飾物および等価物をすべて含む。さらに、そのすべての変形における上述の要素の任意の組合せは、本発明による特別の指示の無い限り、または文脈により明らかに否定されない限り本明細書において包含される。

Claims (15)

1. サンプル中の標的核酸を検出するためのプライマーオリゴヌクレオチドであって、
   ａ）プライマーの３’末端側に位置するプライミングドメインであって、プライミングドメインが標的核酸に対する相補性を有する、プライミングドメインと、
   ｂ）プライマーの５’末端側に位置するレポータードメインであって、レポータードメインが標的核酸に対して非相補的であり、ＤＮＡ合成のための鋳型として機能するように構成され、かつ、蛍光供与基および蛍光受容基を含むように修飾される、レポータードメインと、
   ｃ）供与基と受容基との間に位置するレポータードメイン内のリボヌクレアーゼ酵素認識部位であって、リボヌクレアーゼ酵素認識部位は二本鎖型である場合に耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈにより特異的に切断されることができ、二本鎖はレポータードメインを鋳型として使用するＤＮＡ合成を介して生じる、リボヌクレアーゼ酵素認識部位と、
   を含むプライマー。
2. 前記蛍光受容基がアントラキノンである、請求項１に記載のプライマー。
3. 前記リボヌクレアーゼ酵素認識部位がＲＮＡの連続配列である、請求項１に記載のプライマー。
4. 前記リボヌクレアーゼ酵素認識部位が少なくとも４つのＲＮＡ残基の連続配列である、請求項３に記載のプライマー。
5. 前記耐熱性ＲＮａｓｅ ＨがＩＩ型ＲＮａｓｅ Ｈである、請求項１に記載のプライマー。
6. 前記耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈが、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）からのＲＮａｓｅ Ｈ ＩＩである、請求項１に記載のプライマー。
7. 前記リボヌクレアーゼ酵素認識部位が、単一のリボヌクレオチドを含むヘテロ二重鎖を切断できるリボヌクレアーゼ酵素によって認識される単一のリボヌクレオチドである、請求項１に記載のプライマー。
8. サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、
   ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーであって、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端側にプライマードメインおよび第１のオリゴヌクレオチドの５’末端側にレポータードメインを含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、
   プライマードメインが標的核酸配列に対して相補的であり、
   レポータードメインは、ＤＮＡ合成のための鋳型として機能するように構成され、蛍光供与基および蛍光受容基を含むように修飾され、かつ、供与基と受容基との間に位置するリボヌクレアーゼ酵素認識部位を含み、リボヌクレアーゼ酵素認識部位は二本鎖型である場合に耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈにより特異的に切断されることができ、二本鎖はレポータードメインを鋳型として使用するＤＮＡ合成を介して生じる、前記工程と、
   ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーに対して逆向きである第２のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、第１及び第２のプライマーは、標的核酸上で増幅反応をプライミングするように一緒に機能できる、前記工程と、
   ｃ）標的核酸並びに第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む混合物を調製する工程と、
   ｄ）二本鎖核酸構造を変性させるために混合物を加熱し、相補的核酸のアニーリングを可能にするために混合物を冷却し、ＤＮＡポリメラーゼを使用して新しい核酸鎖を合成する工程と、
   ｅ）工程（ｄ）を繰り返す工程であって、当該工程の後、新しい核酸鎖が、第１のオリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物であって、その５’末端側にリポータードメインを含む伸長生成物と、第２のオリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物であって、その３’末端側にリポータードメインに相補的な核酸配列を含む伸長生成物とを含んでいる工程と、
   ｆ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物を第２のオリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物へアニーリングする工程と、
   ｇ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー伸長生成物を、リポータードメイン内のリボヌクレアーゼ酵素認識部位で、耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈにより切断する工程と、
   ｈ）蛍光シグナルの変化を検出する工程、と
   を含む方法。
9. 前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーのリポータードメインが、標的核酸に対して非相補的である、請求項８に記載の方法。
10. 前記蛍光受容基がアントラキノンである、請求項８に記載の方法。
11. 前記リボヌクレアーゼ酵素認識部位がＲＮＡの連続配列である、請求項８に記載の方法。
12. 前記リボヌクレアーゼ酵素認識部位が少なくとも４つのＲＮＡ残基の連続配列である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記耐熱性ＲＮａｓｅ ＨがＩＩ型ＲＮａｓｅ Ｈである、請求項８に記載の方法。
14. 前記耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈがピロコッカス・コダカラエンシスからのＲＮａｓｅ Ｈ ＩＩである、請求項８に記載の方法。
15. 前記切断が、単一のリボヌクレオチドを含むヘテロ二重鎖を切断できるリボヌクレアーゼ酵素によって認識される単一のリボヌクレオチドで生じる、請求項８に記載の方法。

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