JP3425623B2 - Ｄｎａの蛍光標識プローブ、蛍光標識プラスミド - Google Patents
Ｄｎａの蛍光標識プローブ、蛍光標識プラスミドInfo
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- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
- C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
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- C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
- C07D311/82—Xanthenes
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡを標識する
ための新規な蛍光プローブに関する。
ための新規な蛍光プローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】癌等の疾患の遺伝子治療や遺伝子研究の
現場において、遺伝子が細胞内に導入された量や細胞内
局在を観察する事は重要である。その様な目的を達する
ためには、蛍光標識したプローブを用いてＤＮＡをラベ
ル化することにより、ＤＮＡを可視化することが重要で
ある。その様な目的に用いる蛍光プローブを作製する方
法として、直鎖ＤＮＡの場合には５’末端を標識する方
法が知られていた。一方、環状ＤＮＡの場合には５’末
端が存在しないために、アジド基を有する蛍光プローブ
を導入して、ＵＶ照射下においてリボースのアルデヒド
を開裂する、光反応を利用する方法が知られていた。
現場において、遺伝子が細胞内に導入された量や細胞内
局在を観察する事は重要である。その様な目的を達する
ためには、蛍光標識したプローブを用いてＤＮＡをラベ
ル化することにより、ＤＮＡを可視化することが重要で
ある。その様な目的に用いる蛍光プローブを作製する方
法として、直鎖ＤＮＡの場合には５’末端を標識する方
法が知られていた。一方、環状ＤＮＡの場合には５’末
端が存在しないために、アジド基を有する蛍光プローブ
を導入して、ＵＶ照射下においてリボースのアルデヒド
を開裂する、光反応を利用する方法が知られていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の光反応
を利用する方法は厳しい反応条件を必要とし、目的とす
る遺伝子の活性を損なう可能性がある、という欠点が存
在した。そのために、遺伝子治療で一般的に用いられて
いる環状プラスミドを、穏和な条件下で簡便に標識でき
る蛍光プローブが求められていた。
を利用する方法は厳しい反応条件を必要とし、目的とす
る遺伝子の活性を損なう可能性がある、という欠点が存
在した。そのために、遺伝子治療で一般的に用いられて
いる環状プラスミドを、穏和な条件下で簡便に標識でき
る蛍光プローブが求められていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、フルオロセイン
イソチオシアネート等の、連結基が結合した蛍光物質と
アミノアルキル化フェニルアミンとを共有結合させるこ
とにより、新規のＤＮＡの蛍光標識プローブ前駆体化合
物を作製した。そして、当該前駆体化合物中に含まれる
フェニルアミンのアミノ基をジアゾニウム基に変換する
ことにより、新規のＤＮＡの蛍光標識プローブ化合物を
作製した。そして当該ＤＮＡの蛍光標識プローブ化合物
を、ジアゾニウム基を介してプラスミドＤＮＡにおける
グアニンのプリン環と結合する事により、蛍光標識した
プラスミドを調製した。本発明のＤＮＡの蛍光標識プロ
ーブ化合物を用いることにより、遺伝子の活性を損なう
ことなく、ＤＮＡを蛍光標識することが可能となった。
さらに、細胞への取り込み挙動を、フローサイトメータ
ーや蛍光顕微鏡で観察することが可能となった。
イソチオシアネート等の、連結基が結合した蛍光物質と
アミノアルキル化フェニルアミンとを共有結合させるこ
とにより、新規のＤＮＡの蛍光標識プローブ前駆体化合
物を作製した。そして、当該前駆体化合物中に含まれる
フェニルアミンのアミノ基をジアゾニウム基に変換する
ことにより、新規のＤＮＡの蛍光標識プローブ化合物を
作製した。そして当該ＤＮＡの蛍光標識プローブ化合物
を、ジアゾニウム基を介してプラスミドＤＮＡにおける
グアニンのプリン環と結合する事により、蛍光標識した
プラスミドを調製した。本発明のＤＮＡの蛍光標識プロ
ーブ化合物を用いることにより、遺伝子の活性を損なう
ことなく、ＤＮＡを蛍光標識することが可能となった。
さらに、細胞への取り込み挙動を、フローサイトメータ
ーや蛍光顕微鏡で観察することが可能となった。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、蛍光物質から水素原子
を除いた残基、前記残基と結合した連結基、前記アルキ
ルアミノ基が有するアミノ基により前記連結基と結合し
たアルキルアミノ基、及び当該アルキルアミノ基のアル
キル基とパラ位で結合したフェニルアミンを備える、Ｄ
ＮＡの蛍光標識プローブ前駆体である。ここでアルキル
アミノ基は、炭素数１ないし１６の直鎖または分岐した
アルキルアミノ基であり、好ましくは炭素数２ないし１
０の直鎖または分岐したアミノアルキル基であり、更に
好ましくは炭素数２ないし６の直鎖または分岐したアミ
ノアルキル基である。フルオロセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）にアミノフェニルエチルアミンが結合し
た構造からなる、代表的な本発明のＤＮＡプローブ前駆
体を図１に示す。
を除いた残基、前記残基と結合した連結基、前記アルキ
ルアミノ基が有するアミノ基により前記連結基と結合し
たアルキルアミノ基、及び当該アルキルアミノ基のアル
キル基とパラ位で結合したフェニルアミンを備える、Ｄ
ＮＡの蛍光標識プローブ前駆体である。ここでアルキル
アミノ基は、炭素数１ないし１６の直鎖または分岐した
アルキルアミノ基であり、好ましくは炭素数２ないし１
０の直鎖または分岐したアミノアルキル基であり、更に
好ましくは炭素数２ないし６の直鎖または分岐したアミ
ノアルキル基である。フルオロセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）にアミノフェニルエチルアミンが結合し
た構造からなる、代表的な本発明のＤＮＡプローブ前駆
体を図１に示す。
【０００６】また、本発明における連結基として、アミ
ノ基と反応性を有する限り、任意の官能基を用いること
ができる。ここで好ましい活性基の例としては、チオア
ミド基、スルホニル基、カルボニル基が挙げられる。
ノ基と反応性を有する限り、任意の官能基を用いること
ができる。ここで好ましい活性基の例としては、チオア
ミド基、スルホニル基、カルボニル基が挙げられる。
【０００７】本発明における蛍光物質として、蛍光を有
しかつ活性基と結合する事ができる限り、任意の物質を
用いることが可能できる。好ましい蛍光物質の例として
は、フルオロセイン、スルホローダミン、ローダミン、
ダンシルクロライドおよび７−クロロ−４−ニトロベン
ゾキシアゾールが挙げられる。
しかつ活性基と結合する事ができる限り、任意の物質を
用いることが可能できる。好ましい蛍光物質の例として
は、フルオロセイン、スルホローダミン、ローダミン、
ダンシルクロライドおよび７−クロロ−４−ニトロベン
ゾキシアゾールが挙げられる。
【０００８】更に本発明は、蛍光物質から水素原子を除
いた残基、前記残基と結合した連結基、前記アルキルア
ミノ基が有するアミノ基により前記連結基と結合したア
ルキルアミノ基、及び当該アルキルアミノ基のアルキル
基とパラ位で結合したフェニルジアゾニウム塩を備え
る、ＤＮＡの蛍光標識プローブである。ここでアルキル
アミノ基は、炭素数１ないし１６の直鎖または分岐した
アルキルアミノ基であり、好ましくは炭素数２ないし１
０の直鎖または分岐したアミノアルキル基であり、更に
好ましくは炭素数２ないし６の直鎖または分岐したアミ
ノアルキル基である。フルオロセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）にアミノフェニルエチルジアゾニウム塩
が結合した構造からなる、代表的な本発明のＤＮＡプロ
ーブを図２に示す。
いた残基、前記残基と結合した連結基、前記アルキルア
ミノ基が有するアミノ基により前記連結基と結合したア
ルキルアミノ基、及び当該アルキルアミノ基のアルキル
基とパラ位で結合したフェニルジアゾニウム塩を備え
る、ＤＮＡの蛍光標識プローブである。ここでアルキル
アミノ基は、炭素数１ないし１６の直鎖または分岐した
アルキルアミノ基であり、好ましくは炭素数２ないし１
０の直鎖または分岐したアミノアルキル基であり、更に
好ましくは炭素数２ないし６の直鎖または分岐したアミ
ノアルキル基である。フルオロセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）にアミノフェニルエチルジアゾニウム塩
が結合した構造からなる、代表的な本発明のＤＮＡプロ
ーブを図２に示す。
【０００９】更に、本発明は上記のＤＮＡプローブによ
り蛍光標識したプラスミドである。前記ＤＮＡの蛍光標
識プローブとプラスミドとを、前記プラスミド中のＤＮ
Ａが有するグアニンのプリン環を介して結合することに
より、蛍光標識したプラスミドを作製することができ
る。その様にして蛍光標識したプラスミドを作製する方
法もまた、本発明の範囲内である。
り蛍光標識したプラスミドである。前記ＤＮＡの蛍光標
識プローブとプラスミドとを、前記プラスミド中のＤＮ
Ａが有するグアニンのプリン環を介して結合することに
より、蛍光標識したプラスミドを作製することができ
る。その様にして蛍光標識したプラスミドを作製する方
法もまた、本発明の範囲内である。
【００１０】図３に、本発明の蛍光標識プラスミドを作
製する方法を示す。尚、以下に記載する化合物の番号
は、図３の中における番号である。ＦＩＴＣの様な活性
基が結合した蛍光物質（化合物１）の活性基と、アミノ
フェニルエチルアミンの様なアミノアルキル化フェニル
アミン誘導体（化合物２）のアミノ基とを反応させる事
により、末端にフェニルアミノ基を有する蛍光化合物
（化合物３）を得ることができる。当該末端アミノ基を
ＮａＮＯ2 でジアゾ化することにより、ジアゾ化した蛍
光化合物（化合物４）を得ることができる。化合物４の
末端はジアゾニウム塩となっているために、化合物４と
プラスミドとを反応させると、化合物４はＤＮＡプラス
ミド中に含まれるグアニンのプリン環と結合する。以上
の過程により、ＦＩＴＣ標識したプラスミドを得ること
ができる。本発明の蛍光標識プラスミドの作製方法は、
反応条件が穏和であるという特徴を有する。そのために
本発明の方法により、標識したい遺伝子の機能を損なわ
ずに蛍光標識をすることができる、という効果が得られ
る。以下、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）によりプラスミドを標識した実施例を示すが、本発
明の範囲は以下の実施例により限定されるものではな
い。
製する方法を示す。尚、以下に記載する化合物の番号
は、図３の中における番号である。ＦＩＴＣの様な活性
基が結合した蛍光物質（化合物１）の活性基と、アミノ
フェニルエチルアミンの様なアミノアルキル化フェニル
アミン誘導体（化合物２）のアミノ基とを反応させる事
により、末端にフェニルアミノ基を有する蛍光化合物
（化合物３）を得ることができる。当該末端アミノ基を
ＮａＮＯ2 でジアゾ化することにより、ジアゾ化した蛍
光化合物（化合物４）を得ることができる。化合物４の
末端はジアゾニウム塩となっているために、化合物４と
プラスミドとを反応させると、化合物４はＤＮＡプラス
ミド中に含まれるグアニンのプリン環と結合する。以上
の過程により、ＦＩＴＣ標識したプラスミドを得ること
ができる。本発明の蛍光標識プラスミドの作製方法は、
反応条件が穏和であるという特徴を有する。そのために
本発明の方法により、標識したい遺伝子の機能を損なわ
ずに蛍光標識をすることができる、という効果が得られ
る。以下、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）によりプラスミドを標識した実施例を示すが、本発
明の範囲は以下の実施例により限定されるものではな
い。
【００１１】
【実施例】（ＦＩＴＣ標識プラスミドの調製）２−（４
−アミノフェニル）−エチルアミン）（化合物２）３
５．０ｍｇを（０．２５７ｍｍｏｌ、アルドリッチ）と
ＦＩＴＣ（Ｉ型）（化合物１）１００ｍｇ（０．２５７
ｍｍｏｌ、ドージンドー）を脱水ＤＭＦ１ｍｌ中に等モ
ル溶かし室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：エチ
ルアセテート＝２：８）により反応が完全に進行したの
を確認した。合成物分析にＮＭＲ（バリアン、３００Ｍ
Ｈｚ）、ＴＯＦ−Ｍａｓｓ（Ｖｏｙｇｅｒ−ＤＥ、パー
スペクティブバイオシステムズ）、ＩＲ（ＪＩＲ−７０
００、日本電子）を用いた。次に１Ｎ ＨＣｌ １ｍｌ
に７．７ｍｇ／ｍｌ ＮａＮＯ2 １ｍｌを加えた。これ
に生成したｐ−アミノフェニル化ＦＩＴＣ化合物（化合
物３）を含むＤＭＦ溶液１５０μｌ（２０．２５ｍｇ、
０．０３８６ｍｍｏｌ）を加えジアゾ化した（化合物
４）。
−アミノフェニル）−エチルアミン）（化合物２）３
５．０ｍｇを（０．２５７ｍｍｏｌ、アルドリッチ）と
ＦＩＴＣ（Ｉ型）（化合物１）１００ｍｇ（０．２５７
ｍｍｏｌ、ドージンドー）を脱水ＤＭＦ１ｍｌ中に等モ
ル溶かし室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：エチ
ルアセテート＝２：８）により反応が完全に進行したの
を確認した。合成物分析にＮＭＲ（バリアン、３００Ｍ
Ｈｚ）、ＴＯＦ−Ｍａｓｓ（Ｖｏｙｇｅｒ−ＤＥ、パー
スペクティブバイオシステムズ）、ＩＲ（ＪＩＲ−７０
００、日本電子）を用いた。次に１Ｎ ＨＣｌ １ｍｌ
に７．７ｍｇ／ｍｌ ＮａＮＯ2 １ｍｌを加えた。これ
に生成したｐ−アミノフェニル化ＦＩＴＣ化合物（化合
物３）を含むＤＭＦ溶液１５０μｌ（２０．２５ｍｇ、
０．０３８６ｍｍｏｌ）を加えジアゾ化した（化合物
４）。
【００１２】次にルシフェラーゼプラスミド（５ｍｇ）
を０．１Ｍホウ酸バッファー２０ｍｌ（ｐＨ８．４）に
溶かしこれにジアゾ化した化合物（化合物４）を滴下し
た。このとき反応液は、ｐＨが９．０に保たれるように
ＮａＯＨにより調整した。これにＮａＣｌ １．１８ｇ
を加え塩濃度を１Ｍにして、冷エタノールを５０ｍｌ加
え沈殿させた。この作業を４回行い洗浄した。洗浄物を
０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（塩濃度０．
１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶かし、セファロース４Ｂカラム
（アマシャム、分画分子量０．２〜２ＭＤａ、直径５ｃ
ｍ、カラム長１９ｃｍ）により精製した。分析は、ＵＶ
（ＵＶ−２４００Ｐ、Ｓｈｉｍａｚｕ）、蛍光（ＲＴ−
５４０、Ｓｈｉｍａｚｕ）、ＧＰＣカラム（セファロー
ス４Ｂカラム）、アガロースゲル電気泳動（Ｍｕｐｉ
ｄ、コスモバイオ）を用いた。またコントロール実験と
してジアゾ化していない蛍光試薬（化合物３）とプラス
ミドを同じ条件で混合させたものの溶出曲線を分析し
た。収量 ３．６３ｍｇ、回収率 ７２．６％
を０．１Ｍホウ酸バッファー２０ｍｌ（ｐＨ８．４）に
溶かしこれにジアゾ化した化合物（化合物４）を滴下し
た。このとき反応液は、ｐＨが９．０に保たれるように
ＮａＯＨにより調整した。これにＮａＣｌ １．１８ｇ
を加え塩濃度を１Ｍにして、冷エタノールを５０ｍｌ加
え沈殿させた。この作業を４回行い洗浄した。洗浄物を
０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（塩濃度０．
１Ｍ、ｐＨ７．４）に溶かし、セファロース４Ｂカラム
（アマシャム、分画分子量０．２〜２ＭＤａ、直径５ｃ
ｍ、カラム長１９ｃｍ）により精製した。分析は、ＵＶ
（ＵＶ−２４００Ｐ、Ｓｈｉｍａｚｕ）、蛍光（ＲＴ−
５４０、Ｓｈｉｍａｚｕ）、ＧＰＣカラム（セファロー
ス４Ｂカラム）、アガロースゲル電気泳動（Ｍｕｐｉ
ｄ、コスモバイオ）を用いた。またコントロール実験と
してジアゾ化していない蛍光試薬（化合物３）とプラス
ミドを同じ条件で混合させたものの溶出曲線を分析し
た。収量 ３．６３ｍｇ、回収率 ７２．６％
【００１３】（ＴＬＣ分析）図４に、ＦＩＴＣ−Ｉ型
（化合物１）とｐ−アミノフェニル化ＦＩＴＣ合成物
（化合物３）のＴＬＣの結果を示す。尚、図３において
はレーン１はＦＩＴＣ−Ｉ型を、レーン２はｐ−アミノ
フェニル化ＦＩＴＣを示す。ＦＩＴＣ−Ｉ型（化合物
１）の純度は９０％以上であり、原料において不純物が
確認された。しかしながら等モル反応の後においては合
成物において原料のピークは消失しており、原料は全て
反応したと考えられる。また別の原料であるアミノフェ
ニルエチルアミン（化合物２）（Ｒｆ＝０．１）は、反
応後においては確認されなかった。
（化合物１）とｐ−アミノフェニル化ＦＩＴＣ合成物
（化合物３）のＴＬＣの結果を示す。尚、図３において
はレーン１はＦＩＴＣ−Ｉ型を、レーン２はｐ−アミノ
フェニル化ＦＩＴＣを示す。ＦＩＴＣ−Ｉ型（化合物
１）の純度は９０％以上であり、原料において不純物が
確認された。しかしながら等モル反応の後においては合
成物において原料のピークは消失しており、原料は全て
反応したと考えられる。また別の原料であるアミノフェ
ニルエチルアミン（化合物２）（Ｒｆ＝０．１）は、反
応後においては確認されなかった。
【００１４】（ＩＲ分析）図５に、ｐ−アミノフェニル
化ＦＩＴＣ化合物（化合物２）のキャスト法によるＩＲ
分析の結果を示す。ＦＩＴＣ−Ｉ型（化合物１）では、
２０２１ｃｍ-1にイソチオシアネートのＮＣＳ結合の伸
縮振動が測定された。しかしながら図５のｐ−アミノフ
ェニル化ＦＩＴＣ化合物（化合物３）には、ＮＣＳ伸縮
振動が消失して新たにＣ＝Ｓの伸縮振動が１７９４ｃｍ
-1に測定された。以上のことよりイソチオシアネートの
ＮＣＳが完全に反応したと考えられた。
化ＦＩＴＣ化合物（化合物２）のキャスト法によるＩＲ
分析の結果を示す。ＦＩＴＣ−Ｉ型（化合物１）では、
２０２１ｃｍ-1にイソチオシアネートのＮＣＳ結合の伸
縮振動が測定された。しかしながら図５のｐ−アミノフ
ェニル化ＦＩＴＣ化合物（化合物３）には、ＮＣＳ伸縮
振動が消失して新たにＣ＝Ｓの伸縮振動が１７９４ｃｍ
-1に測定された。以上のことよりイソチオシアネートの
ＮＣＳが完全に反応したと考えられた。
【００１５】（ＴＯＦ−Ｍａｓｓ分析）図６に、ｐ−ア
ミノフェニル化ＦＩＴＣ合成物（化合物３）のＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ−Ｍａｓｓ分析結果を示す。測定にはポシテ
ィブモードを用いマトリックスにはＣＨＣＡを用いた。
測定は、プレート上にマトリックス１００ｎｍｏｌと測
定サンプルを２０ｐｍｏｌ展開した。試料サンプルは、
ＴＨＦ：Ｈ2 Ｏ＝１：１溶液に溶解した。測定結果とし
ては分子量５２６．２０３１にピークを検出した。目的
合成物質の分子量は５２５．２０であり、これにプロト
ンが一つ付加することにより５２６．２０と検出され
た。よって四つの総合的なデーターより目的の合成物は
合成できたと考えられた。
ミノフェニル化ＦＩＴＣ合成物（化合物３）のＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ−Ｍａｓｓ分析結果を示す。測定にはポシテ
ィブモードを用いマトリックスにはＣＨＣＡを用いた。
測定は、プレート上にマトリックス１００ｎｍｏｌと測
定サンプルを２０ｐｍｏｌ展開した。試料サンプルは、
ＴＨＦ：Ｈ2 Ｏ＝１：１溶液に溶解した。測定結果とし
ては分子量５２６．２０３１にピークを検出した。目的
合成物質の分子量は５２５．２０であり、これにプロト
ンが一つ付加することにより５２６．２０と検出され
た。よって四つの総合的なデーターより目的の合成物は
合成できたと考えられた。
【００１６】（ゲルクロマトグラフィーによる分析）Ｆ
ＩＴＣ蛍光修飾したプラスミドをセファロース４Ｂカラ
ム（アマシャム）により精製した時の溶出曲線をＵＶと
蛍光それぞれにより検出した。溶出溶液には、０．０１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（塩濃度０．１Ｍ、ｐ
Ｈ７．４）を用いた。ジアゾ化したＦＩＴＣ（化合物
４）とプラスミドを反応させたものについて測定した結
果を図７に示す。図７において測定条件は、励起波長４
９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍである。図７より、ＦＩ
ＴＣ蛍光標識したプラスミドは、ＵＶと蛍光の溶出曲線
が一致した。ジアゾ化していないＦＩＴＣではプラスミ
ドの分画に蛍光の吸収が観察されなかった。このこと
は、蛍光試薬がプラスミドにインターカレーターしたの
ではなく、共有結合によりプラスミドに結合した事を示
している。これよりプラスミド１分子あたり平均１．２
個のＦＩＴＣが導入されていることが分かった。
ＩＴＣ蛍光修飾したプラスミドをセファロース４Ｂカラ
ム（アマシャム）により精製した時の溶出曲線をＵＶと
蛍光それぞれにより検出した。溶出溶液には、０．０１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（塩濃度０．１Ｍ、ｐ
Ｈ７．４）を用いた。ジアゾ化したＦＩＴＣ（化合物
４）とプラスミドを反応させたものについて測定した結
果を図７に示す。図７において測定条件は、励起波長４
９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍである。図７より、ＦＩ
ＴＣ蛍光標識したプラスミドは、ＵＶと蛍光の溶出曲線
が一致した。ジアゾ化していないＦＩＴＣではプラスミ
ドの分画に蛍光の吸収が観察されなかった。このこと
は、蛍光試薬がプラスミドにインターカレーターしたの
ではなく、共有結合によりプラスミドに結合した事を示
している。これよりプラスミド１分子あたり平均１．２
個のＦＩＴＣが導入されていることが分かった。
【００１７】（アガロースゲル電気泳動分析）ＦＩＴＣ
蛍光標識したプラスミドと未修飾のプラスミドを１％ア
ガロースゲル電気泳動により分析した。結果を図８に示
す。図８においてレーン１はラベルしていないプラスミ
ドを、レーン２はＦＩＴＣラベルしたプラスミドを示
す。結果としてＦＩＴＣラベルしたサンプルにおいて、
コントロールのルシフェラーゼプラスミドと同じ位置に
バンドを検出した。またスーパーヘリッスの構造も保持
されていることが分かった。これはプラスミド一つあた
りに結合しているＦＩＴＣは平均１．２個であることか
ら導入量が少ないために、プラスミドの構造を保持して
いると考えられた。
蛍光標識したプラスミドと未修飾のプラスミドを１％ア
ガロースゲル電気泳動により分析した。結果を図８に示
す。図８においてレーン１はラベルしていないプラスミ
ドを、レーン２はＦＩＴＣラベルしたプラスミドを示
す。結果としてＦＩＴＣラベルしたサンプルにおいて、
コントロールのルシフェラーゼプラスミドと同じ位置に
バンドを検出した。またスーパーヘリッスの構造も保持
されていることが分かった。これはプラスミド一つあた
りに結合しているＦＩＴＣは平均１．２個であることか
ら導入量が少ないために、プラスミドの構造を保持して
いると考えられた。
【００１８】本発明の蛍光標識されたプラスミドによ
り、細胞への取り込みのフローサイトメーターによる分
析や、細胞内での局在解析のための共焦点レーザー顕微
鏡による観察が可能となる。従来では、遺伝子発現のあ
るプラスミドを用いることができなかったので、モデル
化合物として線状のＤＮＡやオリゴ核酸が用いられてい
た。しかしこのような状態では、ＤＮＡの構造による、
取り込みや局在の違いを無視することができず、正確な
議論ができなかった。本発明のプローブはそのような問
題の解決を可能とするものである。
り、細胞への取り込みのフローサイトメーターによる分
析や、細胞内での局在解析のための共焦点レーザー顕微
鏡による観察が可能となる。従来では、遺伝子発現のあ
るプラスミドを用いることができなかったので、モデル
化合物として線状のＤＮＡやオリゴ核酸が用いられてい
た。しかしこのような状態では、ＤＮＡの構造による、
取り込みや局在の違いを無視することができず、正確な
議論ができなかった。本発明のプローブはそのような問
題の解決を可能とするものである。
【００１９】（ＦＩＴＣ蛍光標識プラスミドにおけるル
シフェラーゼ活性の発現）トランスフェクションには市
販の遺伝子導入リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）を用い
た。３７℃、ｐＨ６．５に調整したＡＳＦ−１０４培地
（最終トランスフェクション培地量の１／１０量）に所
定量のプラスミド水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と所定量のリ
ポフェクチン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加え２０分間イン
キュベートして複合体を作成した。
シフェラーゼ活性の発現）トランスフェクションには市
販の遺伝子導入リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）を用い
た。３７℃、ｐＨ６．５に調整したＡＳＦ−１０４培地
（最終トランスフェクション培地量の１／１０量）に所
定量のプラスミド水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と所定量のリ
ポフェクチン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加え２０分間イン
キュベートして複合体を作成した。
【００２０】ルシフェラーゼプラスミドの発現活性は、
常法に従って行った。細胞数を２４穴プレートに１０ま
たは５×１０4 個ずつ蒔き、トランスフェクション前に
１９〜２４時間培養した。培養後所定の濃度の複合体溶
液を９倍量のｐＨ７．０の培養培地に蒔き、４時間のイ
ンキュベーション後に複合体培地を取り除き、血清培地
により１回洗浄後ｐＨ７．０の血清培地に取り替え、さ
らに２４時間培養しトランスフェクションした。培養
後、上清を除きＰＢＳバッファー（Ｍｇ2+、Ｃａ 2+フリ
ー）で３回洗浄後、細胞溶解液（ルシフェラーゼアッセ
イシステム、プロメガ）を１００μｌ加え、ラバーポリ
スマンで細胞をかきとり、エッペンドルフチューブに回
収した。その後遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０秒）
し、上澄みを細胞抽出液として回収した。この細胞抽出
液から４０μｌを採り、測定用のチューブにいれ、これ
に基質（ルシフェリン）溶液１００μｌを加えて軽くピ
ペッティングしてから、すぐにルミノメーター（ＴＤ−
２０／２０ルミノメーター、プロメガ）で測定した。
常法に従って行った。細胞数を２４穴プレートに１０ま
たは５×１０4 個ずつ蒔き、トランスフェクション前に
１９〜２４時間培養した。培養後所定の濃度の複合体溶
液を９倍量のｐＨ７．０の培養培地に蒔き、４時間のイ
ンキュベーション後に複合体培地を取り除き、血清培地
により１回洗浄後ｐＨ７．０の血清培地に取り替え、さ
らに２４時間培養しトランスフェクションした。培養
後、上清を除きＰＢＳバッファー（Ｍｇ2+、Ｃａ 2+フリ
ー）で３回洗浄後、細胞溶解液（ルシフェラーゼアッセ
イシステム、プロメガ）を１００μｌ加え、ラバーポリ
スマンで細胞をかきとり、エッペンドルフチューブに回
収した。その後遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０秒）
し、上澄みを細胞抽出液として回収した。この細胞抽出
液から４０μｌを採り、測定用のチューブにいれ、これ
に基質（ルシフェリン）溶液１００μｌを加えて軽くピ
ペッティングしてから、すぐにルミノメーター（ＴＤ−
２０／２０ルミノメーター、プロメガ）で測定した。
【００２１】Ｈｅｌａ細胞を用いた実験結果を図９に示
す。グラフの縦軸はプラスミドのみの発現活性を１００
とした相対値により表示した。なお、誤差は２〜４回実
験を行った際の標準偏差を示している。また図９におい
て、白抜きのカラムはラベル化していないプラスミド
を、黒抜きのカラムはＦＩＴＣでラベルしたプラスミド
を示す。Ｈｅｌａ細胞を、プラスミド単独またはプラス
ミド／リポフェクチン（重量比は１：２．５、［プラス
ミド］＝１０μｇ／ｍｌ）で、血清フリーの培地（ＡＳ
Ｆ−１０４、味の素）の中でトランスフェクトした。グ
ラフ左側にはプラスミド単独により、右側にはプラスミ
ド／リポフェクチンにより、Ｈｅｌａ細胞をトランスフ
ェクトした結果を示す。その結果、プラスミド／リポフ
ェクチン複合体においてＦＩＴＣ標識による発現活性の
低下は認められなかった。
す。グラフの縦軸はプラスミドのみの発現活性を１００
とした相対値により表示した。なお、誤差は２〜４回実
験を行った際の標準偏差を示している。また図９におい
て、白抜きのカラムはラベル化していないプラスミド
を、黒抜きのカラムはＦＩＴＣでラベルしたプラスミド
を示す。Ｈｅｌａ細胞を、プラスミド単独またはプラス
ミド／リポフェクチン（重量比は１：２．５、［プラス
ミド］＝１０μｇ／ｍｌ）で、血清フリーの培地（ＡＳ
Ｆ−１０４、味の素）の中でトランスフェクトした。グ
ラフ左側にはプラスミド単独により、右側にはプラスミ
ド／リポフェクチンにより、Ｈｅｌａ細胞をトランスフ
ェクトした結果を示す。その結果、プラスミド／リポフ
ェクチン複合体においてＦＩＴＣ標識による発現活性の
低下は認められなかった。
【００２２】（細胞内取り込み量の測定）複合体の作
製、又は複合体のインキュベーションは、先のルシフェ
ラーゼ発現活性測定の実験法と同様な実験系を用いた。
細胞の調製は以下のように行った。複合体をインキュベ
ーション後、上清を除きＰＢＳバッファーで３回洗浄
し、０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ−４Ｎ
ａのＰＢＳ溶液０．５ｍｌで処理することで細胞をはが
し、これを１．０ｍｌのＰＢＳバッファーで希釈し細胞
懸濁液とし、フローサイトメーターで分析した。
製、又は複合体のインキュベーションは、先のルシフェ
ラーゼ発現活性測定の実験法と同様な実験系を用いた。
細胞の調製は以下のように行った。複合体をインキュベ
ーション後、上清を除きＰＢＳバッファーで３回洗浄
し、０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ−４Ｎ
ａのＰＢＳ溶液０．５ｍｌで処理することで細胞をはが
し、これを１．０ｍｌのＰＢＳバッファーで希釈し細胞
懸濁液とし、フローサイトメーターで分析した。
【００２３】Ｈｅｌａ細胞を用いて実験を行い、実験結
果を図１０に示す。１０％ＦＢＳを含むイーグルＭＥＭ
中でプラスミド／リポフェクチン複合体と共に、Ｈｅｌ
ａ細胞を２時間インキュベートした。ここでプラスミド
濃度は１０μｇ／ｍｌであり、プラスミド：リポフェク
チンの比は、重量で１：２．５である。結果としてコン
トロールと比較してリポフェクチン複合体は、細胞群全
体が高い蛍光強度にシフトしていることが確認された。
このことより、この蛍光標識プラスミドがフローサイト
メーターにより測定可能な蛍光感度を保持していること
が示された。
果を図１０に示す。１０％ＦＢＳを含むイーグルＭＥＭ
中でプラスミド／リポフェクチン複合体と共に、Ｈｅｌ
ａ細胞を２時間インキュベートした。ここでプラスミド
濃度は１０μｇ／ｍｌであり、プラスミド：リポフェク
チンの比は、重量で１：２．５である。結果としてコン
トロールと比較してリポフェクチン複合体は、細胞群全
体が高い蛍光強度にシフトしていることが確認された。
このことより、この蛍光標識プラスミドがフローサイト
メーターにより測定可能な蛍光感度を保持していること
が示された。
【００２４】（共焦点レーザー顕微鏡による細胞内局
在）細胞の調製は、３５ｍｍガラスボトムディッシュ
（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏ．，ＵＳＡ）に５×１０4 個細胞
をまき、１９〜２４時間細胞を接着させた。複合体の作
製、又は複合体のインキュベーションは、先のルシフェ
ラーゼ発現活性測定の実験法と同様な実験系を用いた。
複合体を所定時間インキュベーション後に複合体培地を
取り除き、血清培地により１回洗浄し、新たに血清培地
を入れ共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ ＮＴ、ＬＡＩＣ
Ａ）により細胞内の局在を観察した。
在）細胞の調製は、３５ｍｍガラスボトムディッシュ
（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏ．，ＵＳＡ）に５×１０4 個細胞
をまき、１９〜２４時間細胞を接着させた。複合体の作
製、又は複合体のインキュベーションは、先のルシフェ
ラーゼ発現活性測定の実験法と同様な実験系を用いた。
複合体を所定時間インキュベーション後に複合体培地を
取り除き、血清培地により１回洗浄し、新たに血清培地
を入れ共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ ＮＴ、ＬＡＩＣ
Ａ）により細胞内の局在を観察した。
【００２５】実験にはＨｅｌａ細胞を用いた。結果を図
１１に示す。コントロールとして行った蛍光標識プラス
ミドのみのインキュベーションにおいては、細胞内で蛍
光が観察されなかった。しかしながら、リポフェクチン
により導入したプラスミドは細胞質内にドット状の蛍光
として観察された。リポフェクチン複合体においては、
エンドサイトーシスで取り込まれていると考えられてい
る。そのため、ここで観察された蛍光の散在はエンドサ
イトーシスにより取り込まれた複合体の局在であると考
えられた。以上のことより共焦点レーザー顕微鏡によっ
てもこの蛍光標識プラスミドが十分な蛍光感度を保持し
ていることが証明された。
１１に示す。コントロールとして行った蛍光標識プラス
ミドのみのインキュベーションにおいては、細胞内で蛍
光が観察されなかった。しかしながら、リポフェクチン
により導入したプラスミドは細胞質内にドット状の蛍光
として観察された。リポフェクチン複合体においては、
エンドサイトーシスで取り込まれていると考えられてい
る。そのため、ここで観察された蛍光の散在はエンドサ
イトーシスにより取り込まれた複合体の局在であると考
えられた。以上のことより共焦点レーザー顕微鏡によっ
てもこの蛍光標識プラスミドが十分な蛍光感度を保持し
ていることが証明された。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、穏和な条件で環状ＤＮＡ
を標識できる、新規な蛍光標識プローブ及び当該プロー
ブにより蛍光標識されたプラスミドが与えられた。
を標識できる、新規な蛍光標識プローブ及び当該プロー
ブにより蛍光標識されたプラスミドが与えられた。
【図１】 図１は、ＦＩＴＣにアミノフェニルエチルア
ミンを結合した、本発明の蛍光標識プローブ前駆体の化
学構造を示す図である。
ミンを結合した、本発明の蛍光標識プローブ前駆体の化
学構造を示す図である。
【図２】 図２は、ＦＩＴＣにアミノフェニルエチルジ
アゾニウム塩を結合した、本発明の蛍光標識プローブの
化学構造を示す図である。
アゾニウム塩を結合した、本発明の蛍光標識プローブの
化学構造を示す図である。
【図３】 図３は、ＦＩＴＣ標識プラスミドの調製方法
を示す図である。
を示す図である。
【図４】 図４は、ｐ−アミノフェニル化ＦＩＴＣ合成
物をＴＬＣで分析した結果である。
物をＴＬＣで分析した結果である。
【図５】 図５は、ｐ−アミノフェニル化ＦＩＴＣのＩ
Ｒチャートを示す図である。
Ｒチャートを示す図である。
【図６】 図６は、ｐ−アミノフェニル化ＦＩＴＣのＴ
ＯＦ Ｍａｓｓ分析のチャートを示す図である。
ＯＦ Ｍａｓｓ分析のチャートを示す図である。
【図７】 図７は、ＦＩＴＣ蛍光標識プラスミドのセフ
ァロース４Ｂカラムによる溶出曲線を示す図である。
ァロース４Ｂカラムによる溶出曲線を示す図である。
【図８】 図８は、未標識プラスミドとＦＩＴＣ蛍光標
識プラスミドをアガロースゲル電気泳動で解析した結果
を示す写真である。
識プラスミドをアガロースゲル電気泳動で解析した結果
を示す写真である。
【図９】 図９は、未標識プラスミドとＦＩＴＣ蛍光標
識プラスミドのルシフェラーゼ発現活性を示したグラフ
である。
識プラスミドのルシフェラーゼ発現活性を示したグラフ
である。
【図１０】 図１０は、フローサイトメーターを用い
て、ＦＩＴＣ蛍光標識プラスミドの細胞内への取り込み
を分析したチャートである。
て、ＦＩＴＣ蛍光標識プラスミドの細胞内への取り込み
を分析したチャートである。
【図１１】 図１１は、Ｈｅｌａ細胞においてＦＩＴＣ
蛍光標識プラスミドの局在を検出した共焦点像を示した
写真である。
蛍光標識プラスミドの局在を検出した共焦点像を示した
写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開2000−19171（ＪＰ，Ａ)
国際公開00／06771（ＷＯ，Ａ１)
国際公開98／35978（ＷＯ，Ａ１)
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ,
2000年 ４月 ５日，Ｖｏｌ．４，386
−387
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
C12N 15/09
C12Q 1/68
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】 蛍光物質から水素原子を除いた残基、前
記残基と結合した連結基、炭素数１ないし１６の直鎖ま
たは分岐したアルキルアミノ基であり、前記アルキルア
ミノ基が有するアミノ基により前記連結基と結合したア
ルキルアミノ基、及び当該アルキルアミノ基のアルキル
基とパラ位で結合したフェニルアミンを備える、ＤＮＡ
の蛍光標識プローブ前駆体。 - 【請求項２】 前記連結基がチオアミド基、スルホニル
基、カルボニル基からなる群より選択された基である、
請求項１記載のＤＮＡの蛍光標識プローブ前駆体。 - 【請求項３】 前記蛍光物質が、フルオロセイン、スル
ホローダミン、ローダミン、ダンシルクロライドおよび
７−クロロ−４−ニトロベンゾキシアゾール残基からな
る群より選択された蛍光物質である、請求項１記載のＤ
ＮＡの蛍光標識プローブ前駆体。 - 【請求項４】 蛍光物質から水素原子を除いた残基、前
記残基と結合した連結基、炭素数１ないし１６の直鎖ま
たは分岐したアルキルアミノ基であり、前記アルキルア
ミノ基が有するアミノ基により前記連結基と結合したア
ルキルアミノ基、及び当該アルキルアミノ基のアルキル
基とパラ位で結合したフェニルジアゾニウム塩を備え
る、ＤＮＡの蛍光標識プローブ。 - 【請求項５】 前記連結基がチオアミド基、スルホニル
基、カルボニル基からなる群より選択された基である、
請求項４記載のＤＮＡの蛍光標識プローブ。 - 【請求項６】 前記蛍光物質が、フルオロセイン、スル
ホローダミン、ローダミン、ダンシルクロライドおよび
７−クロロ−４−ニトロベンゾキシアゾールからなる群
より選択された蛍光物質である、請求項４記載のＤＮＡ
の蛍光標識プローブ。 - 【請求項７】 蛍光物質から水素原子を除いた残基、前
記残基と結合した連結基、炭素数１ないし１６の直鎖ま
たは分岐したアルキルアミノ基であり、前記アルキルア
ミノ基が有するアミノ基により前記連結基と結合したア
ルキルアミノ基、及び当該アルキルアミノ基のアルキル
基とパラ位で結合したフェニルジアゾニウム基及びプラ
スミドを備え、前記フェニルジアゾニウム基と前記プラ
スミドとが前記プラスミド中のＤＮＡが有するグアニン
のプリン環を介して結合した、蛍光標識プラスミド。 - 【請求項８】 請求項４から６のいずれか一つの項記載
のＤＮＡの蛍光標識プローブとプラスミドとを、前記プ
ラスミド中のＤＮＡが有するグアニンのプリン環を介し
て結合する過程より構成される、蛍光標識プラスミドの
作製方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000100898A JP3425623B2 (ja) | 2000-04-03 | 2000-04-03 | Ｄｎａの蛍光標識プローブ、蛍光標識プラスミド |
| US09/814,218 US6608213B1 (en) | 2000-04-03 | 2001-03-22 | Fluorescence-labeled probe for DNA and a fluorescence-labeled plasmid |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000100898A JP3425623B2 (ja) | 2000-04-03 | 2000-04-03 | Ｄｎａの蛍光標識プローブ、蛍光標識プラスミド |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001289851A JP2001289851A (ja) | 2001-10-19 |
| JP3425623B2 true JP3425623B2 (ja) | 2003-07-14 |
Family
ID=18615041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000100898A Expired - Fee Related JP3425623B2 (ja) | 2000-04-03 | 2000-04-03 | Ｄｎａの蛍光標識プローブ、蛍光標識プラスミド |
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| JP (1) | JP3425623B2 (ja) |
| FR (1) | FR2807432B1 (ja) |
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| WO2009034790A1 (ja) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Riken | 蛍光発生分子 |
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2001
- 2001-03-22 US US09/814,218 patent/US6608213B1/en not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ，２０００年 ４月 ５日，Ｖｏｌ．４，３８６−３８７ |
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|---|---|
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