JP7462972B2 - 生物磁気ミクロスフェア並びにその調製方法および使用方法 - Google Patents

Description

本出願は、２０１９年６月２１日に出願された中華人民共和国特許出願ＣＮ２０１９１０５４０１３２６号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１．技術分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、生物磁気ミクロスフェアおよびその調製方法、並びに当該生物磁気ミクロスフェアを使用したタンパク質の分離および精製の方法に関するものである。
２，関連技術の説明
タンパク質の分離および精製は、生物起源由来医薬品の製造、生物タンパク質分子の検出および診断、タンパク質の構造の分析・解析等を含む、複数の分野で幅広く応用されている。現有の技術では、タンパク質の分離および精製のための複数の一般的に用いられる技術は、ニッケルカラム、プロテインＡカラム、ビオチンカラム等を含む。ニッケルカラムの技術では、担体に固定化されたニッケルイオンにより、ヒスチジンタグタンパク質を混合系から分離することができる。この段階では、よく使用される担体はアガロースゲルである。ゲル類材料の３次元多孔質構造が、ゲル類材料の比表面積の増加を促進し、ニッケルイオンを固定化するための部位が増加し、標的タンパク質への結合量が上昇する。

材料の三次元多孔質構造より、複数の標的タンパク質結合部位の数を大幅に増加することができるが、材料内部の多孔質構造は、また、タンパク質溶出の際にタンパク質の滞留時間を長くし得るものであり、材料内部の複数の不連続空間および死角が、タンパク質が材料内部から溶出されることを防止し、滞留率を増加させる。標的タンパク質結合部位が材料の外表面のみに固定化されれば、標的タンパク質が材料内部への進入は防止でき、標的タンパク質の滞留時間および滞留率を溶出中に大幅に減少させることができる。しかし、材料の外表面のみを使用した場合、材料の比表面積が大幅に減少し、標的タンパク質結合部位の数が大幅に減少する。

ポリマーは、複数のモノマー分子が重合されることによって得られる高分子化合物である。重合後は活性部位を持つモノマー分子は、得られたポリマーに多数の活性部位を持たせることができ、それにより活性部位の数を増加させる。それらの活性部位を通じ、複数の対応する結合部位をさらに結合させることができる。分子鎖が相互架橋されてネットワーク構造が形成されるポリマー、単一線状分子鎖を有するポリマー、多数の分岐鎖を有するポリマー等を含む多種類のポリマーがある。異なる種類のポリマーは、それぞれ異なる分野で異なる幅広い用途を有する。

本発明は、生物磁気ミクロスフェアおよびその調製方法、並びに生物磁気ミクロスフェアを使用したタンパク質の分離および精製方法を提供する。生物磁気ミクロスフェアは、機能化された磁気ミクロスフェアであり、標的タンパク質の分離および精製は、生物磁気ミクロスフェアの外表面のみを利用し行われ、生物磁気ミクロスフェアの外表面は、分岐鎖を有する線状ポリマーで修飾されるため、標的タンパク質を高効率・ハイスループットに結合することができ、溶出プロセス中の標的タンパク質の滞留時間および滞留率を効果的に減少させる。

本発明の第一方面では、生物磁気ミクロスフェアが提供され、前記生物磁気ミクロスフェアは、磁気ミクロスフェア本体を有し、前記磁気ミクロスフェア本体の外表面は、少なくとも1種類の分岐鎖を有する線状ポリマーを有し、この分岐鎖を有する線状ポリマーの一端は、磁気ミクロスフェア本体の外表面に共有結合し、前記線状ポリマーのバックボーンは、ポリオレフィンバックボーンであり、前記線状ポリマーの分岐鎖は、官能基を含み、前記官能基は、標的物に結合することができる。
好ましい実施形態の一つでは、前記線状ポリマーは、アクリル酸、アクリレート、アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリレート、メタクリル酸エステル、他のアクリルモノマー、およびそれらの組合せを含む群から選択される１種の重合により得られたものであり、好ましくは、前記線状ポリマーのバックボーン形成プロセスにおいて、架橋剤は必要としない。
前記線状ポリマーの分岐鎖は官能基を含んでおり、前記官能基は標的物に結合することができる。好ましくは、前記線状ポリマーの分岐鎖は、特異的結合部位を含み（すなわち、官能基は、特異的結合部位である）、特異的結合部位は、標的物に特異的に結合することができる。
より好ましくは、特異的結合部位はニッケルイオンであり、このニッケルイオンはＨｉｓタグの標識に特異的に結合することができる。
好ましい実施形態の一つでは、前記線状ポリマーの官能基は、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、およびそれらの組合せを含む群から選択される1種である。

好ましい実施形態の一つでは、前記線状ポリマーが、前記磁気ミクロスフェア本体の外表面に直接的に固定されるか、または連結基を介して磁気ミクロスフェア本体の外表面に間接的に固定されている。
好ましい実施形態の一つでは、磁気ミクロスフェア本体は、ＳｉＯ_２にて被覆した磁気粒子である。
好ましい実施形態の一つでは、磁気粒子は、鉄化合物、鉄合金、酸化亜鉛、酸化マンガン混合物、酸化ガドリニウム混合物、コバルト化合物、ニッケル化合物、ニッケル合金、酸化マンガン、マンガン合金、酸化亜鉛、酸化ガドリニウム、酸化クロム、およびそれらの組合せを含む群から選択される1種を含む化学成分を有する。
好ましい実施形態の一つでは、磁気粒子は、酸化鉄、酸化亜鉛、酸化マンガン混合物、酸化ガドリニウム混合物、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化マンガン、酸化亜鉛、酸化ガドリニウム、酸化クロム、およびそれらの組合せを含む群から選択される１種を含む化学成分を有する。
好ましい実施形態の一つでは、磁気粒子は、酸化鉄、鉄、コバルト、Ｃｏ^２＋、窒化鉄、Ｍｎ_３Ｏ_４、ＧｄＯ、ニッケル、Ｎｉ^２＋、およびそれらの組合せを含む群から選択された１種を含む化学成分を有し、ここで、酸化鉄は、好ましくは、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３、またはこれらの組合せである。
好ましい実施形態の別の一つでは、磁気粒子は、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３、窒化鉄、Ｍｎ_３Ｏ_４、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＭｏ、ＦｅＡｌＣ、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＣｏ、ＲｅＣｏ、ＲｅＦｅ、ＰｔＣｏ、ＭｎＡｌＣ、ＣｕＮｉＦｅ、ＡｌＭｎＡｇ、ＭｎＢｉ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉ、ＦｅＡｌ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉＡｌ、ＢａＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＳｒＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＰｂＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＧｄＯ、およびこれらの組合せを含む群から選択される１種を含む化学成分を有し、ここで、Ｒｅは希土類元素であるレニウムである。

本発明の第二方面では、下記の手続きを含む、本発明の第一方面で述べた生物磁気ミクロスフェアの調製方法が提供される：
（１）磁気ミクロスフェアＡを形成するため、磁気ミクロスフェア本体の外表面にアミノ基を導入することにより、磁気ミクロスフェア本体に化学修飾を行う；
好ましい実施形態の一つでは、磁気ミクロスフェア本体に対する化学修飾は、シランカップリング剤を用いて行う。
（２）カルボキシル基とアミノ基との共有反応を用いることにより、前記磁気ミクロスフェアＡの外表面にアクリル酸分子を共有結合させ、炭素―炭素二重結合を導入し、磁気ミクロスフェアＢを形成する；
（３）架橋剤がないという条件で、前記アクリルモノマー分子を炭素－炭素二重結合間の重合反応により重合させ、得られた線状ポリマーを磁気ミクロスフェアＢの外表面に共有結合させた後、固液分離を行い、液相を除去し、磁気ミクロスフェアＣを得る；
前記官能基が特異的結合部位を含む場合、下記の手続きを含む：（４）磁気ミクロスフェアＣの線状ポリマーの分岐鎖に特異的結合部位を結合させる；
好ましい実施形態の一つでは、前記アクリルモノマー分子は、アクリル酸ナトリウムモノマー分子である。
上述したステップ（１）および（２）は、下記のステップ（Ｉ）に合併できる：磁気ミクロスフェアＢを形成するため、トリメトキシシラン化されたアクリル分子を用いて、磁気ミクロスフェア本体に化学修飾を行い、磁気ミクロスフェア本体の外表面に炭素－炭素二重結合を導入する。

前記トリメトキシシラン化されたアクリル分子は、例えば、γ―メタクリロキシプロピルトリメトキシルシラン（ＫＨ５７０アシルオキシシラン、ＣＡＳ：２５３０－８５－０）である。

好ましい実施形態の一つでは、磁気ミクロスフェアＣの線状ポリマーの分岐鎖は、ニッケルイオンを含む。ここでは、さらに下記の手続きを含むことができる：（４）トリカルボキシルアミンの残基における３つのカルボキシル基にＮｉを複合化させる前に、トリカルボキシルアミンを磁気ミクロスフェアＣに結合させ、磁気ミクロスフェアＤ、すなわち、目的生物磁気ミクロスフェアを得る、ここでの目的生物磁気ミクロスフェアは、Ｈｉｓタグの標識に特異的に結合することができる。
好ましい実施形態の一つでは、トリカルボキシルアミンは、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンであり、このＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンの量は、好ましくは０．５ｇ／Ｌから５５０ｇ／Ｌまでの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、ステップ（２）で磁気ミクロスフェアＡの調製のためのアクリル酸の量は、０．００２ｍｏｌ／Ｌから２０ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、前記ステップ（３）における磁気ミクロスフェアＢの調製のためのアクリル酸ナトリウムの量が、０．５３ｍｏｌ／Ｌから１２．７６ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内にある。

本発明の第三方面では、下記の手続きを含む、本発明の第一方面で述べた生物磁気ミクロスフェアを用いてタンパク質を分離する方法が提供される：
（１）生物磁気ミクロスフェアに結合緩衝液を加えてよく混合し、前記生物磁気ミクロスフェアを磁気的に分離し、分離した生物磁気ミクロスフェアを分離するタンパク質を含む溶液に加えてよく混合しインキュベートさせ、標的タンパク質が結合した生物磁気ミクロスフェアＥを得る。
（２）固液分離を行ってから上澄みを除去し、生物磁気ミクロスフェアＥを洗浄液で洗浄し、生物磁気性ミクロスフェアＥを溶出液で溶出させ、上澄みを回収する；
（３）上澄みから標的タンパク質を分離および精製する。

本発明の第四方面では、タンパク質の分離および精製、免疫学的検定、標的抗体薬の濃縮、標的ドラッグデリバリー、核酸の分離および抽出、細胞の選び分け、酵素の固定化、遺伝子ベクター構築などを含む、本発明の第一方面で述べた生物磁気ミクロスフェアの複数の用途が提供される。

本発明の複数の主な利点および有益な効果は以下の通りである。
（１）調製された生物磁気ミクロスフェアは、混合系から大量の標的タンパク質を効率的に生物磁気ミクロスフェアに捕捉することができ、標的タンパク質をハイスループットに結合させる。
（２）調製された生物磁気ミクロスフェアは、標的タンパク質の効率的な溶出を遂行し、溶出のステップでの標的タンパク質の滞留時間および滞留率を効果的に減少させることができる。
（３）調製した生物磁気ミクロスフェアを操作および使用することが容易である。特に、単に小片の磁石を使用することにより、生物磁気ミクロスフェアの位置および凝集状態を効率的に制御することができ、そして溶液中での生物磁気ミクロスフェアの迅速な分散および凝集を達成することができ、高価な大型実験設備例えば高速遠心機を必要とせず、タンパク質の分離および精製をより容易かつより迅速にさせる。
（４）調製した生物磁気ミクロスフェアは、免疫学的検定、Ｈｉｓタグタンパク質のような標的タンパク質の迅速な分離および精製、標的抗体薬物の濃縮、標的ドラッグデリバリー、核酸の分離および抽出、細胞選定、酵素の固定化、遺伝子ベクターの構築を含んで、幅広く使用することができる。
（５）本発明によれば、磁気ミクロスフェア本体の寸法を制御し、異なる水溶性を有する複数のポリマーを磁気ミクロスフェアの表面に結合させることにより、調製した磁気ミクロスフェアの水溶性、溶液中での大きさ、懸濁特性を含む複数の特性を調整することができる。
（６）本発明により提供される生物磁気ミクロスフェアは、水性液体に安定に懸濁でき、沈むまでに２日以上維持する。さらに生物磁気ミクロスフェアは、水性液体中に連続的に攪拌することなく安定的に懸濁することができ、これはユニークな構造設計によってもたらされた優れた性能である。一方で、前記磁気ミクロスフェア本体の大きさは、１０ミクロン以下、またさらには１ミクロン以下に処置することができ、他方で、磁気ミクロスフェア本体の外表面を親水性ポリマーで被覆し、磁気ミクロスフェア本体の外表面へのポリマーのグラフト密度を調整するとともに、親水性、構造の種類、流体力学的半径、鎖長、分岐鎖数、分岐鎖長等々を含む複数の特性を調整して、システム中での生物磁気ミクロスフェアの懸濁状態をよりよく制御することができる。

図１は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動検出を示す図である。左側および右側の画像はそれぞれ、本発明の生物磁気ミクロスフェア（つまりニッケル磁気ビーズ、またＫＭ磁気ビーズとも知られている）および対照群のミクロスフェア（対照ニッケルビーズ）の２つの精製結果の比較を示す。

図２は、ポリアクリル酸磁気ビーズおよびＫＭ磁気ビーズによる処理の前後の、ＩＶＴＴ反応液のＲＦＵ値の差の比較を示す（差はＩＶＴＴ反応液のＲＦＵ値マイナスフロースルー液のＲＦＵ値で求める）。Ａ群およびＢ群は、異なる条件下で合成した２種のポリアクリル酸磁気ビーズに対応する。Ｂ群は、ＫＭ磁気ビーズの合成方法に従って調製する。Ａ群の合成プロセス中、溶液Ｘおよび溶液Ｙは水相に置き換えた。横軸うえのラベルにおける体積（２μＬ、２０μＬ）は磁気ビーズの量に対応し、それぞれ２μＬの磁気ビーズおよび２０μＬの磁気ビーズを表す。

図３は、ＫＨ５７０修飾経路により調製したポリアクリル酸系磁気ビーズのＲＦＵ値（ＩＶＴＴ反応液のＲＦＵ値マイナスフロースルー液のＲＦＵ値により得る）とＩＶＴＴ反応液のＲＦＵ値との比較を示す。

図４は、ポリアクリル酸ナトリウム磁気ビーズ（Ｂ－ＫＭ磁気ビーズ、１９１２２０－ＺＺ－１）の純度試験の電気泳動図を示し、ここで、１００％は、希釈なしの純粋なＩＶＴＴ反応液を指し、６０％は、４０％（体積）の希釈液と混合した純粋なＩＶＴＴ反応液６０％（体積）を指す。

図５は、ＳｉＯ_２被覆磁気ミクロスフェア本体の倒立顕微鏡写真を示す。（Ａ）静置状態での直径１μｍ、（Ｂ）流動状態での直径１μｍ、（Ｃ）直径１０μｍ、（Ｄ）直径１００μｍ。図（Ａ）および（Ｂ）の各目盛は１０μｍ、図（Ｃ）および（Ｄ）の各目盛は１００μｍである。

図６は、１μｍおよび１０μｍの磁気ミクロスフェアで調製したＫＭ磁気ビーズ（ニッケル磁気ビーズ）の精製効果の比較を示す。ここで、ＰＣは精製する主要溶液（ＩＶＴＴ反応液、１ｍＬ反応系）に対応し、Ｎｉ１磁気ビーズおよびＮｉ１０磁気ビーズはそれぞれ１μｍおよび１０μｍの磁気ミクロスフェア本体を使用し、１０μＬ、５μＬ、および１μＬはそれぞれ使用したニッケル磁気ビーズの体積に対応する。

図７は、１μｍおよび１００μｍの磁気ミクロスフェアで調製したＫＭ磁気ビーズ（ニッケル磁気ビーズ）の精製効果の比較を示す。ここで、ＰＣは精製すべき主要溶液（ＩＶＴＴ反応液、１ｍＬ反応系）に対応し、Ｎｉ１磁気ビーズおよびＮｉ１００磁気ビーズはそれぞれ１μｍおよび１００μｍの磁気ミクロスフェア本体を使用し、１０μＬ、５μＬ、１μＬはそれぞれ使用したニッケル磁気ビーズの体積に対応する。

詳細な説明

以下、本発明を具体的な例および実施形態と組合せてさらに説明する。これらの例および実施形態は、説明のためにのみ提供されるものであり、本発明の範囲に対する限定とみなされるべきではないことを理解すべきである。以下の例において、具体的な条件が記載されていない実験方法に関しては、好ましくは、上述の具体的な例に案内された条件に従いおよび参照し、従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）、“Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、“Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓ． Ｓｐｉｒｉｎ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｒ． Ｓｗａｒｔｚ． Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［Ｍ］． ２００８”に記載された条件または、製造者が推奨する条件に従うことができる。

特に明記しない限り、本発明におけるパーセンテージおよび部は、それぞれ重量パーセンテージおよび重量部を意味する。特に明記しない限り、本発明の例で使用される材料および試薬は、すべて市販品である。特に明記しない限り、本発明における温度は摂氏温度（℃）で示される。

用語
物質には、分子、分子集合体、分子共役体、分子複合体および他の形態が含まれるが、これらに限定されない。
標的とは、本発明の生物磁気ミクロスフェアにより結合される物質を指し、好ましくは生物分子または生理活性物質である。例えば、タンパク質（例えば、抗体、抗原、抗生物質、インターロイキンなど）、タンパク質複合体、タンパク質結合体（例えば、糖タンパク質）、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質と核酸の結合体または複合体、ウイルス、細胞、リボソーム、ベシクルおよび他の物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の生物磁気ミクロスフェアは、線状ポリマーの分岐鎖に含まれる官能基を介して標的と結合することができ、これにより目的の分離および精製を達成することができる。本発明において、標的は、好ましくは、タンパク質物質である。タンパク質物質は、タンパク質またはタンパク質構造を含む物質であり得、例えば、タンパク質複合体、タンパク質結合体、タンパク質と核酸の結合体または複合体を含むが、これらに限定されるものではない。タンパク質結合体は、共有結合、動的共有結合、超分子力（例えば、水素結合）および他の手段によって形成される。タンパク質複合体は、複合体によって生成される。
標的タンパク質およびタンパク質の対象は、タンパク質物質を指す。
Ｈｉｓタグ標識は標識として用いることができ、Ｈｉｓタグ（ヒスチジンタグ）を担持する物質を指し、Ｈｉｓタグの担持は、標的がＨｉｓタグにより捕捉される際に、Ｈｉｓタグと標識部分との結合が安定しており、捕捉のステップでＨｉｓタグ標識が全体として安定的に存在することができる限り、共有結合、動的共有結合、超分子相互作用などの結合方法で達成することができる。

本発明では、タンパク質と複数形のタンパク質は同じ意味をもち、互換的に使用することができる。また、融合タンパク質もタンパク質の一種である。広義には、本発明のタンパク質はポリペプチドを含む。本発明に係る任意のタンパク質は、特に指定しない限り（特定の配列を指定するなど）、その誘導体も含むものと理解すべきである。

タンパク質誘導体：タンパク質誘導体は、当業者が一般的に理解しているように、少なくともＣ末端タグ、Ｎ末端タグ、Ｃ末端およびＮ末端タグを含み、Ｃ末端はＣＯＯＨ末端を指し、Ｎ末端はＮＨ_２末端を指す。タグは、ポリペプチドタグまたはタンパク質タグであり得る。また、タンパク質誘導体は、塩形態、複合体、エステル化合物、置換生成物などを含むがこれらに限定されない、化学修飾法によるそれらの生成物を含んでいてもよい。化学修飾法は、例えば、イオン化、塩化、脱化、複合体化、脱複合体化、キレート化、脱キレート化、付加反応、置換反応、脱離反応、挿入反応、酸化反応、還元反応、翻訳後修飾などを含む。特に、前記方法は例えば、酸化、還元、メチル化、脱メチル化、アミノ化、カルボキシル化、加硫などを含む。

磁気ミクロスフェア、または強く磁化できる小さな粒径のミクロスフェアは、磁気ビーズともいうことができる。好ましくは、それらは、直径は０．１μｍから１０００μｍまでの範囲内の直径を有する。
磁気ミクロスフェア本体：ＳｉＯ_２被覆粒子、例えばＳｉＯ_２被覆Ｆｅ_３Ｏ_４粒子。
磁気ミクロスフェアＡ：アミノ修飾された磁気ミクロスフェア。
磁気ミクロスフェアＢ：炭素－炭素二重結合を含む磁気ミクロスフェア。
磁気ミクロスフェアＣ：アクリルポリマーで修飾された磁気ミクロスフェア。
磁気ミクロスフェアＤ：磁気ミクロスフェアＣを用いて得られたニッケルイオンで複合化された生物磁気ミクロスフェア。
磁気ミクロスフェアＥ：標的（例えばタンパク質）と組み合わされた磁気ミクロスフィアＤの生成物、つまり、捕捉した物質を含む磁気ミクロスフェア。
ＫＭ磁気ビーズ：アクリル酸ナトリウムをモノマー分子として用いて重合反応によって得られるポリアクリル酸ナトリウム磁気ビーズ。ポリアクリル酸ナトリウム磁気ビーズは、例で部分合成したポリアクリル酸磁気ビーズの基本構造と一致する基本構造を有している。ポリアクリル酸磁気ビーズを調製する際には、重合のためのモノマー分子としてアクリル酸を使用する。

線状ポリマーおよび複数形の線状ポリマーは同じ意味を持ち、互換的に使用することができる。
アクリルポリマー：－Ｃ（ＣＯＯ－）－Ｃ－の単位構造を持つホモポリマーまたはコポリマーを指す。共重合体の共重合形態は、線状のバックボーンおよび計量された側基ＣＯＯ－を適宜付与できる限り、特に限定されない。炭素―炭素二重結合上には、重合反応の進行に影響を与えない限り、他の置換基が存在してもよく、例えばメチル置換基（－ＣＨ_３Ｃ（ＣＯＯ）－Ｃ－に相当）が挙げられる。ＣＯＯ－は、－ＣＯＯＨの形、塩の形（例えば、ナトリウム塩）、またはホルマートの形（好ましくはギ酸アルキル、例えば、ギ酸メチル－ＣＯＯＣＨ_３、ギ酸エチル－ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、また、それは、ギ酸ヒドロキシエチル－ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨでもよい）にあり得る。Ｃ（ＣＯＯ－）－Ｃ－単位構造の具体的な構造形態は、－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ（ＣＯＯＮａ）－ＣＨ_２－、－ＭｅＣ（ＣＯＯＨ）－ＣＨ_２－、－ＭｅＣ（ＣＯＯＮａ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）－ＣＨ_２－、－ＭｅＣ（ＣＯＯＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＭｅＣ（ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）－ＣＨ_２－、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。Ｍｅはメチルである。ポリマー分子の線状バックボーン上には、上記単位構造のうち１種だけ（ホモポリマーに対応）、または２種以上の単位構造（コポリマーに対応）が存在することができる。
アクリルモノマー分子：上述のアクリルポリマーの合成に用いることができ、Ｃ（ＣＯＯ－）＝Ｃの基本構造を持つモノマー分子、例えば、ＣＨ（ＣＯＯＨ）＝ＣＨ_２、ＣＨ（ＣＯＯＮａ）＝ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｃ（ＣＯＯＨ）＝ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｃ（ＣＯＯＮａ）＝ＣＨ_２、ＣＨ（ＣＯＯＣＨ_３）＝ＣＨ_２、ＣＨ（ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）＝ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｃ（ＣＯＯＣＨ_３）＝ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｃ（ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）＝ＣＨ_２などを指す。
分岐鎖：分岐鎖および分岐側鎖は同じ意味を持ち、互換的に使用することができる。本発明において、分岐鎖とは、線状ポリマーのバックボーン上に結合した側鎖または側基を指す。分岐鎖の長さおよび大きさに特別な要件はない。分岐鎖は、短い分岐鎖、例えば、カルボキシル、ヒドロキシルおよびアミノなどでもよいし、または原子数の多い長い分岐鎖であってもよい。分岐鎖の構造は特に限定されない。線状であってもよいし、分岐した構造を有する分岐鎖であってもよい。また、分岐鎖は、さらに側鎖または側基を含んでいてもよい。分岐鎖の構造上の特徴、例えば、数、長さ、大きさ、および再分岐の度合いなどは、線状バックボーンの柔軟な揺れが達成される選択され、そのため、ネットワーク構造が形成されず、分岐鎖が積層されず、滞留率が高くならないようになっている。また、バックボーン上の分岐鎖は、調整可能な距離で互いに離間することができる。
精製媒体とは、標的を特異的に捕捉するために用いられる機能要素を指す。本発明の生物磁気ミクロスフェアの精製媒体は、磁気ミクロスフェア本体の外表面に結合した線状ポリマーの分岐鎖に位置する。

基：単一の原子または、原子の群であり得、フリーラジカルの形にあり得、またはイオンの形にあり得る。
ポリマーの分岐鎖の官能基：反応活性を特徴とするか、または活性化された後に反応活性を有する。他の物質の活性基と直接相互作用することができる、あるいは活性化された後に他の物質の活性基と相互作用することができ、故に他の物質がポリマーの分岐鎖に結合する。ポリマーの分岐鎖の官能基の好ましい形態の一つは、特異的結合部位である。他の物質は、精製媒体であってもよいし、捕捉すべき標的であってもよい。
結合：共有結合でも非共有結合でもよく、共有結合、動的共有結合、超分子相互作用などを含むが、これらに限定されない。超分子相互作用は、水素結合、いくつかの特異な結合効果などを含むが、これらに限定されない。
特異的結合部位：本発明において、特異的結合部位とは、ポリマーの分岐鎖において結合機能を有する基または構造部分を指す。該基または構造部分は、特定の標的の特異的な認識または結合を達成することができる。特異的結合は、配位、錯形成、静電力、ファンデルワールス力、水素結合、共有結合などによって達成することができる。

洗浄液：不純タンパク質などの不純物を溶出させるもので、溶出後は洗浄液で不純タンパク質を除去する。
フロースルー液：精製した磁気ビーズでインキュベートした後、分離して得られた浸透液のことを指す。この溶液は、分離されなかった残存の標的を含んでいる。例えば、フロースルー液は、アフィニティーカラムに添加され、カラムを通過した溶液を指し、例えば１回目にカラムを通過した溶液、２回目にカラムを通過した溶液、３回目にカラムを通過した溶液を表すフロースルー液１、フロースルー液２、フロースルー液３である。
溶出液：標的タンパク質を溶出させる。溶出後、標的タンパク質は溶出液中に存在する。

結合能：例えば、磁気ミクロスフェアをタンパク質に結合させる能力である。
アフィニティ：異なる濃度グレードを有する基質溶液を用いて、磁気ミクロスフェアが基質の５０％にしか結合しない基質濃度を指す。
ＰＮＡ：ペプチド核酸。グリコシルリン酸バックボーンをポリペプチドバックボーンに置き換えたＤＮＡアナログである。１９８０年代にデンマークの有機化学者オーレ・ブカールトと生化学者ピーター・ニールセンによって初めて発明された核酸配列特異的試薬である。第１世代および第２世代のアンチセンス試薬をベースに、コンピュータ設計によって構築され、最終的に人工的に合成された３世代のアンチセンス試薬である。これは全く新しいＤＮＡアナログである。特に、ＤＮＡのペントースホスホジエステル結合のバックボーンを中性のペプチド鎖アミド２－アミノエチルグリシン結合に置き換えたもので、構造のその他の部分はＤＮＡと同じである。ＰＮＡは、ワトソン・クリック塩基対を介してＤＮＡまたはＲＮＡの配列を認識および結合し、安定した二重らせん構造を形成することができる。ＰＮＡは負の電荷を持たず、ＤＮＡまたはＲＮＡとの間に静電的な反発が見られないため、結合の安定性や特異性が大幅に向上する。ＰＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＰＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリタ―ゼーションとは異なり、前者はハイブリタイゼーション系の塩濃度によりほとんど影響されない。加えて、ＰＮＡのＤＮＡまたはＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーション能力は、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡのそれよりもはるかに優れている。高いハイブリタイゼーション安定性、特定の配列を認識する優れた能力を示し、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼにより加水分解されない。また、リガンドと連結して細胞に共導入することも可能である。上記のような利点は、他のオリゴヌクレオチドにはないものである。多くのＤＮＡ分子が持っていない上述の利点に鑑み、過去１０年間にわたって多くのハイテク分野でＤＮＡの用途が見出されてきた。

ｅＧＦＰ：高感度緑色タンパク質。
ＲＦＵ：相対蛍光単位。
ＲＬＵ：相対発光量。
溶液Ｘ：０．０１～１ｍｏｌ／Ｌの最終濃度で２－モルホリンエタンスルホン酸（ＣＡＳ：４４３２－３１－９）および０．１～２ｍｏｌ／Ｌの最終濃度でＮａＣｌを含む水溶液。
溶液Ｙ：ｐＨ７．２～７．５を有するＰＢＳ緩衝液、例えば、０．０６８４ｍｏｌ／Ｌの最終濃度でリン酸水素二ナトリウム、０．０３１６ｍｏｌ／Ｌの最終濃度でリン酸二水素ナトリウムおよび０．１５ｍｏｌ／Ｌの最終濃度で塩化ナトリウムを含む水溶液。

本発明において、「好ましくは（例えば、好む、好ましい、好ましくは、好まれる、など）」、「より好ましくは」、「さらに好ましくは」、「最も好ましくは」などの好ましい実施形態は、本発明の範囲および実施形態に限定を課すものではなく、いくつかの実施形態を提供するために例示されたものである。
本発明の説明を通して、「好ましい一つ」、「好ましい実施形態の一つ」、「好ましい実施形態の一つ」、「好ましい例」、「好ましい実施形態において」、「いくつかの好ましい実施形態において」、「好んで」、「好ましい」、「より好ましい」、「最も好ましい」、「さらに好ましい」、および他の好ましい方法、または、「実施形態の一つ」、「方法の一つ」、「例」、「具体例」、「例えば」、「～のような」「例えば」などの例示的な列挙方法は、本発明の範囲を限定するものではなく、実施形態に記載された具体的な特徴は、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれる。本発明では、実施形態で説明した具体的な特徴は、任意の適切な方法で組み合わせることができる。また、本発明では、それぞれの好ましい実施形態の技術的解決策も、任意の好適な方法で組み合わせることができる。

「任意に」とは、何かが必須ではないという意味で、本発明の技術的解決策を実施できるかどうか次第である。本発明において、「任意の」とは、本発明の技術的解決策に適したものであれば、本発明の実施に用いることができることを意味する。

本発明において、「それらの組合せ」および「それらの任意の組合せ」は、いずれもそれらの組合せが本発明の目的に達成できる限り、前述の列挙された対象の任意の適切な組み合わせを指す。上記の定義でカバーされる範囲は、「またはそれらの組合せ」、「またはそれらの組合せ」、「およびそれらの組合せ」、「およびそれらの組合せ」などの表現を含むが、これらに限定されない。本発明において、「それらの任意の組合せ」とは、組合せの数が「１以上であることを意味し、以下、いずれか一つ、または少なくとも二つで構成される群を網羅的に表す。

本発明では、「１種以上」、および「少なくとも１種」、「それらの組合せ」、「またはそれらの組合せ」、「およびそれらの組合せ」、「またはそれら任意の組合せ」、「およびそれらの任意の組合せ」は、同じ意味を持ち、交換可能に使用することができ、量が「１」に等しいか、または「１より大きい」ことを表す。

本発明において、「または／および」、「および／または」の使用は、「それらのいずれか一つまたはそれらの組合せ」を意味し、また、それらのうちの少なくとも一つを意味する。

本発明では、「通常」、「従来」、「一般的に」、「常に」という用語で記述された先行技術の技術手段も、本発明の内容の参考文献として引用される。特に明記しない限り、これらの用語で改良された技術手段は、いくつかの技術的特徴の好ましい実施形態の一つとみなすことができる。しかし、それらは本発明の範囲と限定するものではないことに留意すべきである。

ＩＶＴＴシステム：インビトロ転写および翻訳システム。それは、外因性ＤＮＡを鋳型として用い無細胞タンパク質合成システム（またはインビトロタンパク質合成システムと呼ばれる）である。外因性のｍＲＮＡまたはＤＮＡをタンパク質合成の鋳型として用い、タンパク質合成に必要な基質、および転写および翻訳関連タンパク質因子の添加を人為的に制御することで、無細胞タンパク質合成システムは標的タンパク質の合成を達成することができる。本発明の無細胞タンパク質合成システムは、特に限定されるものではなく、次の細胞抽出物：酵母細胞抽出物、大腸菌細胞抽出物、哺乳動物細胞抽出物、植物細胞抽出物、または昆虫細胞抽出物をベースとした無細胞タンパク質合成システムの一つまたは任意の組合せであってもよい。本発明のインビトロタンパク質合成システムは、無傷細胞の存在を排除するものではなく、極めて少量または少量の無傷細胞をそこに含めることができるが、好ましくは、無傷細胞を含まない。

上述した本発明の技術的特徴および以下で具体的に説明する技術的特徴（例においてなど）は、本発明の技術的解決策を達成できる限り、本発明の範囲を逸脱することなく、互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることを理解すべきである。簡潔にするために、詳細はここでは繰り返さない。

本発明の第一方面では、生物磁気ミクロスフェアを提供し、前記生物磁気ミクロスフェアは、磁気ミクロスフェア本体を有し、前記磁気ミクロスフェア本体の外表面は、分岐鎖を有する少なくとも１種の線状ポリマーを有し、前記分岐鎖を有する線状ポリマーの一端は磁気ミクロスフェア本体の外表面に共有結合され、他の部分は磁気ミクロスフェア本体の外表面上で自由であり、前記線状ポリマーのバックボーンはポリオレフィンバックボーンであり、好ましくは、前記線状ポリマーのバックボーン形成プロセスにおいて架橋剤を必要としない。

線状ポリマーは、少なくとも１種の線状バックボーンを含み、各線状バックボーンは、官能基を含む少なくとも３つの分岐鎖を担持し、すなわち各線状バックボーンは、少なくとも３つの官能分岐鎖を担持し、線状ポリマーは、少なくとも３つの官能基を含んでいる。本実施形態では、ポリマーは線状バックボーンの高い柔軟性を有するだけでなく、分岐鎖の数の高拡大という利点を有し、故に高速かつ高スループットの結合、および高効率かつ高比率（高収率）の分離を達成することができる。

磁気ミクロスフェア本体を構成するためには、磁気粒子を選択し、その磁気粒子をシリカで被覆することが好ましい。磁気粒子は、磁気材料または磁気成分を含み、磁気粒子は鉄化合物（例えば、酸化鉄）、鉄合金、酸化亜鉛、酸化マンガン混合物、酸化ガドリニウム混合物、コバルト化合物（例えば、酸化コバルト）、ニッケル化合物（例えば、酸化ニッケル）、ニッケル合金、酸化マンガン、マンガン合金、酸化亜鉛、酸化ガドリニウム、酸化クロム、つまり、それらの成分の少なくとも１種以上、すなわち、それらのいずれか１種、またはそれらのいずれかの組合せである。

好ましい実施形態の一つでは、磁気粒子は、酸化鉄、鉄、コバルト、Ｃｏ^２＋、窒化鉄、Ｍｎ_３Ｏ_４、ＧｄＯ、ニッケル、Ｎｉ^２＋、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択された１種を含む化学成分を有し、ここで酸化鉄は、好ましくはマグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグへマイト（γ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはこれら２種の酸化物の組合せであり、より好ましくは、酸化鉄はＦｅ_３Ｏ_４である。
好ましい実施形態の別の一つでは、磁気粒子は、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３、窒化鉄、Ｍｎ_３Ｏ_４、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＭｏ、ＦｅＡｌＣ、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＣｏ、ＲｅＣｏ、ＲｅＦｅ、ＰｔＣｏ、ＭｎＡｌＣ、ＣｕＮｉＦｅ、ＡｌＭｎＡｇ、ＭｎＢｉ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉ、ＦｅＡｌ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉＡｌ、ＢａＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＳｒＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＰｂＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＧｄＯ、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択された１種を含む化学成分を有し、ここで、Ｒｅは、希土類元素であるレニウムである。Ｍｏはモリブデンである。
本発明の磁気ミクロスフェア本体の大きさ（体積など）は特に限定されず、達成可能な任意の粒径であり得るが、好ましくは磁気ミクロスフェア本体の直径は０．１μｍから１０００μｍまでの範囲内にある。なお、特に断りのない限り、直径サイズは平均サイズを指す。例えば、１μｍから１０００μｍまでの範囲内にあり、具体的には、例えば、１μｍ、１０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、８００μｍ、および１０００μｍであり、本発明の好ましい直径の一つは１μｍである。

生物磁気ミクロスフェアは、粒子径が小さいほど、タンパク質固体系をタンパク質合成反応系に懸濁させる助けとなり、タンパク質発現生成物とより十分に接触させることができるので、タンパク質生成物をより効果的に捕捉し、結合率（結合効率）を向上させることができる。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、０．１μｍから１０μｍまでの範囲内の直径を有する。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、０．２μｍから６μｍまでの範囲内の直径を有する。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、０．４μｍから５μｍまでの範囲内の直径を有する。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、０．５μｍから３μｍまでの範囲内の直径を有する。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、０．２μｍから１μｍまでの範囲内の直径を有する。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、０．５μｍから１μｍまでの範囲内の直径を有する。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、１μｍから１０００μｍまでの範囲内の直径を有する。
いくつかの好ましい実施形態では、磁気ミクロスフェア本体は、０．１μｍ、０．１５μｍ、０．２μｍ、０．２５μｍ、０．３μｍ、０．３５μｍ、０．４μｍ、０．４５μｍ、０．５μｍ、０．５５μｍ、０．６μｍ、０．６５μｍ、０．７μｍ、０．７５μｍ、０．８μｍ、０．８５μｍ、０．９μｍ、０．９５μｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍからなる群から選択された直径（直径の偏差は±２５％、±２０％、±１５％、±１０％であり得る）または同群から選択された任意の２つの間の範囲内の直径を有する。

形成された磁気ミクロスフェア本体および磁気ミクロスフェア本体を含む磁気ミクロスフェアは、一方では外部磁場の作用下で速やかに位置決め、案内されおよび分離することができ、他方では、表面修飾または化学重合などにより、磁気ミクロスフェア本体または磁気ミクロスフェアの外表面に、活性官能基、例えば、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド基、アミノ基、ニッケルイオンを付与することができる。さらに、磁気ミクロスフェア本体または磁気ミクロスフェアは、共有結合、非共有結合そのほかの方法により、抗体、細胞、ＤＮＡなどの生物学的活性物質に結合することができる。

磁気ミクロスフェア本体に結合するために用いるポリマーは、ポリアクリル酸、ポリアクリラート、ポリメタクリル酸、ポリメタクリラートおよび他のポリマーからなる群から選らばれたカルボキシル分岐鎖を有する１種以上のポリマーであり得る。
好ましい実施形態の一つでは、生物磁気ミクロスフェアの外表面に結合した線状ポリマーは、アクリル酸、アクリラート、アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリラート、メタクリル酸エステルなどおよびそれらの組合せからなる群から選択された１種の重合によって得られる。好ましくは、重合プロセスにおいて架橋剤を必要としない。

線状ポリマーの分岐鎖は官能基を含み、その官能基は標的物に結合することができる。好ましくは、線状ポリマーの分岐鎖は、特異的結合部位を含み（すなわち、官能基は、特異的結合部位である）、特異的結合部位は、標的物に特異的に結合することができる。
さらに好ましくは、特異的結合部位はニッケルイオンであり、当該ニッケルイオンはＨｉｓタグ（ヒスチジンタグ）の標識に特異的に結合することができる。
好ましい実施形態の一つでは、線状ポリマーの官能基は、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、およびそれらの組合せからなる群から選択される１種である。
好ましい実施形態の一つでは、線状ポリマーは、磁気ミクロスフェア本体の外表面に直接固定されているか、あるいは連結基を介して磁気ミクロスフェア本体の外表面に固定されている。
形成された生物磁気ミクロスフェアは、活性物質を結合するために使用することができる。活性物質は、直接結合するか、またはリンカー分子を介して結合することができる。リンカー分子は、核酸分子、ペプチド核酸、核酸アプタマー、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックスモチーフ、ジンクフィンガーモチーフ、オリゴヌクレオチド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは抗ハプテン抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される１種であり得る。もちろん、リンカー分子は、二本鎖核酸構造、二重らせん、ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＰＮＡ、ＲＮＡ―ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＰＮＡおよびＰＮＡ―ＰＮＡからなる群から選択されるホモハイブリットまたはヘテロハイブリットであることもできる。

本発明の第二方面では、下記の手続きを含む、第一方面で述べる生物磁気ミクロスフェアを調製する方法が提供される。
ステップ（１）：磁気ミクロスフェア本体を提供し、その磁気ミクロスフェア本体の表面に化学修飾を行い、反応性基Ｒ１を導入する。
ステップ（２）：任意に、反応性基Ｒ１との間の共有結合反応により、官能基Ｒ２を導入する。官能基Ｒ２は、重合反応を開始するための反応中心ＲＣとして機能することができ、ステップ（１）の反応性基Ｒ１が、重合反応を開始するための反応中心ＲＣとして機能することができる場合、このステップを省略して、直接ステップ（３）に進むことができる。付加重合（ラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合）では、反応中心ＲＣは開始中心であり、段階重合では、反応中心ＲＣがポリマー鎖の「成長」の開始点として機能することもできる。
反応性基とは、結合反応を起こして共有結合の形成を受けてできる基を指す。
ステップ（３）：モノマー分子Ｍ１を添加し、反応中心ＲＣを出発点として用いることにより、モノマー分子ＭＧの重合反応を開始する。モノマー分子ＭＧは、官能化された分岐鎖末端を提供できる少なくとも１種のモノマー分子ＭＢである。機能化された分岐鎖末端とは、分岐鎖末端が官能基Ｆ１であるか、または修飾後に官能基Ｆ１に変換可能できることを意味する。重合反応により分岐鎖を有する線状ポリマーの鎖バックボーンが形成され、線状ポリマーを共有結合で固定するための結合点が反応中心ＲＣに形成される。

官能基は、共有結合、動的共有結合、超分子相互作用、その他の結合能力を形成することができる。

重合反応のメカニズムは特に限定されず、例えば、ラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合、および段階重合からなる群から選択することができる。
モノマー分子ＭＧは、単一種の分子であり得、その場合ホモ重合反応を行うことができ、また異なる種類の分子の組合せもあり得、その場合共重合反応を行うことができる。官能化された分岐鎖を提供することができるモノマー分子ＭＢは、例えば、アクリルモノマー分子（ラジカル重合が可能である）などである。
ステップ（４）：精製媒体と分岐鎖末端の官能基Ｆ１との相互作用を用いることによって分岐鎖末端に精製媒体を結合させて、「磁気ミクロスフェア本体－分岐鎖を有する線状ポリマー－精製媒体」の構造を有する生物磁気ミクロスフェアを得る。
上述の各ステップは、別々に実施することも、または適切な組み合わせで同時に実施することもできる。

精製媒体とは、生物磁気ミクロスフェアに標的物を特異的に捕捉するために用いられる機能要素のことを指す。
「精製媒体と分岐鎖末端の官能基Ｆ１との相互作用」は、例えば共有結合、動的共有結合、超分子相互作用（例えば、親和性複合体相互作用）などがある。

生物磁気ミクロスフェアを準備する方法は、下記の手続きを含んでいてもよい。
ステップ（１）：磁気ミクロスフェア本体を提供し、磁気ミクロスフェアＡを形成する前に、磁気ミクロスフェアの外表面にアミノ基を導入することによって、磁気ミクロスフェア本体に化学修飾を行う。
好ましい実施形態の一つでは、磁気ミクロスフェア本体に対する化学修飾は、シランカップリング剤を用いて行われる。
ステップ（２）：カルボキシル基およびアミノ基の共有結合反応を用いることによって、アクリル酸分子を磁気ミクロスフェアＡの外表面に共有結合で結合させて、炭素－炭素二重結合を導入し、磁気ミクロスフェアＢを形成する。
ステップ（３）：架橋剤がないという条件で、アクリルモノマー分子を炭素－炭素二重結合間の重合反応により重合させ、得られた線状状ポリマーを磁気ミクロスフェアＢの外表面に共有結合させた後、固液分離を行い、液相を除去して磁気ミクロスフェアＣを得る。
前記官能基が、前記特異的結合部位を含む場合には、前記方法は、磁気ミクロスフェアＣの線形ポリマーの分岐鎖で特異的結合部位を結合させるステップ（４）をさらに含む。

好ましい実施形態の一つでは、アクリルモノマー分子は、アクリル酸ナトリウムモノマー分子である。
好ましい実施形態の一つでは、磁石によって磁気ミクロスフェアを沈殿させ、液相を除去し、洗浄後に磁気ミクロスフェアＣを得る。

上述のステップ（１）および（２）は、一つのステップにまとめることができ、すなわち、ステップ（２）を省略することができる。例えば、両者は、以下の、トリメトキシシラン化されたアクリル分子を採用することにより磁気ミクロスフェア本体に化学修飾を行い、磁気ミクロスフェアＢを形成する前に、磁気ミクロスフェア本体の外表面に炭素－炭素二重結合を導入するステップ（Ｉ）に合体させることができる。特に、３－（メタクリロキシ）プロピルトリメトキシシラン（ＫＨ５７０アシルオキシシラン、ＣＡＳ：２５３０－８５－０）は磁気ミクロスフェア本体を修飾するために用いられ、炭素－炭素二重結合が導入されて磁気ミクロスフェアＢを形成し、その炭素－炭素二重結合が重合反応を開始させる活性中心として機能することができる。この修飾経路は、ＫＨ５７０修飾経路とも呼ばれている。
好ましい実施形態の一つでは、磁気ミクロスフェアＣの線状ポリマーの分岐鎖は、ニッケルイオンを含む。本実施形態において、本方法は、トリカルボキシルアミンを磁気ミクロスフェアＣに結合させた後、トリカルボキシルアミンの残基の３つのカルボキシル基にＮｉ^２＋を錯化させて、磁気ミクロスフェアＤ、すなわち、目的生物磁気ミクロスフェアを得るステップ（４）を含み、ここで、目的生物磁気ミクロスフェアは、Ｈｉｓタグの標識に特異的に結合することができる。

好ましい実施形態の一つでは、トリカルボキシルアミンの３つのカルボキシル基はＮ（Ｃ－ＣＯＯＨ）_３）の構造を形成し、ニッケルイオンが錯化され得る。
好ましい実施形態の一つでは、トリカルボキシルアミンはＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンであり、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンの量は、好ましくは０．５ｇ／Ｌから５５０ｇ／Ｌまでの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、ステップ（２）における磁気ミクロスフェアＡの調製のためのアクリル酸の量は、０．００２ｍｏｌ／Ｌから２０ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、ステップ（３）における磁気ミクロスフェアＢの調製のためのアクリル酸ナトリウムの量は、０．５３ｍｏｌ／Ｌから１２．７６ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内である。

特に、本発明は以下のような技術的解決策を提供する。
（１）磁気ミクロスフェア本体としてＳｉＯ_２被覆Ｆｅ_３Ｏ_４磁気ビーズを用い、カップリング剤（例えば３－アミノプロピルトリエトキシシラン；ＡＰＴＥＳ ＣＡＳ：９１９－３０－２、アミノ化カップリング剤、シランカップリング剤、特にアミノ化シランカップリング剤）を用いてＳｉＯ_２被覆Ｆｅ_３Ｏ_４磁気体ミクロスフェア本体を化学的に修飾し、磁気ミクロスフェアの外表面にアミノ基を導入して、磁気ミクロスフェアＡを形成する。
（２）カルボキシル基とアミノ基の共有結合反応を用いることによりアクリル酸分子を磁気ミクロスフェアの外表面に結合させ、磁気ミクロスフェアの外表面に炭素－炭素二重結合を導入し、外表面が炭素－炭素二重結合で修飾された磁気ミクロスフェアＢを得る。
（３）アクリルモノマー分子（例えばアクリル酸ナトリウムモノマー分子）線状重合を炭素－炭素二重結合間の重合反応により達成し、重合反応が行われている間に、重合生成物が磁気ミクロスフェアの外表面に共有結合し、外表面がアクリルポリマーで共有結合的に修飾された磁気ミクロスフェアＣを得る。

特に、本発明は、さらに以下の技術的解決策を提供する。
（Ｉ）磁気ミクロスフェア本体としてＳｉＯ_２被覆Ｆｅ_３Ｏ_４磁気ビーズを用い、カップリング剤（例えば、３－（メタクリロイルオキシ）プロピルトリメトキシシラン、ＣＡＳ：２５３０－８５－０）を用いてＳｉＯ_２被覆Ｆｅ_３Ｏ_４磁気ミクロスフェア本体を化学的に修飾し、アリル炭素－炭素二重結合を磁気ミクロスフェア本体の外表面に導入して、外表面が炭素－炭素二重結合で修飾された磁気ミクロスフェアＢを形成する。
（ＩＩ）アクリルモノマー分子（例えば、アクリル酸ナトリウムモノマー分子）の線状重合を、炭素－炭素二重結合間の重合反応によって達成する。重合反応が行われている間に、重合生成物が磁気ミクロスフェアの外表面に共有結合し、外表面がアクリルポリマーで共有結合的に修飾された磁気ミクロスフェアＣを得る。

ここで形成される線状ポリマーは、一端が磁気ミクロスフェアの外表面に共有結合しており、残りの部分は溶液中で自由であり、溶液中の分子と十分に接触し、対象タンパク質の捕獲を向上させることができる。対象タンパク質は、溶出工程で磁気ミクロスフェアからの拘束を直接排除し、直接溶出液に入ることができる。磁気ミクロスフェアの外表面に物理的に巻回されたポリマーまたは磁気ミクロスフェアと一体化したポリマーと比較して、共有結合で固定化した線状ポリマーは、分子鎖の積層を効果的に減らし、溶液中の分子鎖の伸縮および揺れを強化し、対象タンパク質の捕獲を向上させ、溶出工程における対象タンパク質の滞留率および滞留時間を短縮することができる。

モノマー分子としてアクリル酸ナトリウムを例にとると、重合生成物はポリアクリル酸ナトリウムである。ポリアクリル酸ナトリウムのバックボーンは線状のポリオレフィンバックボーンであり、バックボーンに沿って多数の側鎖ＣＯＯＮａが共有結合しており、側鎖に含まれる官能基もＣＯＯＮａであり、ここでの重合反応は、架橋剤（Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、ＣＡＳ：１１０－２６－９など）を使用せず、代わりに、架橋剤を添加せずに、重合生成物は線状バックボーンを有するポリマーを生成することができ、分子鎖同士が互いに架橋したネットワークポリマーの生成を回避するものである。分子鎖同士が架橋したネットワークポリマーが生成すると、多孔質構造を形成することによって、対象タンパク質の溶出効率が影響を受ける。

（４）アクリル酸ナトリウムの重合で得られる磁気ミクロスフェアＣを例にとると、反応は弱酸性系で行われるため、アクリル酸ナトリウムは水相でナトリウムイオンとアクリル酸イオンに分解される。弱酸性系では、アクリル酸イオンはほとんどがカルボキシル基を有するアクリル酸になる。ポリアクリル酸ナトリウムの線状分子鎖が磁気ミクロスフェアの外表面に共有結合で架橋された後、トリカルボキシルアミン（例えばＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジン、ＣＡＳ．１１３２３１－０５－３）をカルボキシル基とアミノ基との共有結合反応を用いることにより線状ポリマーの分岐鎖に共有結合させ、ついでニッケルイオンを加えてＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンの三つのカルボキシル基にキレート化させ、ヒスチジンタグタンパク質の分離および精製用の生物磁気ミクロスフェアを得る。

本発明の第三方面では、第三方面で述べる生物磁気ミクロスフェアを用いてタンパク質を分離する方法であって、下記の手続きを含む方法を提供する。

（１）生物磁気ミクロスフェアに結合緩衝液を加えてよく混合し、生物磁気ミクロスフェアを磁気的に分離し、分離した生物磁気ミクロスフェアを分離するタンパク質を含む溶液に加えてから良く混合し、その中でインキュベートして、対象タンパク質が結合した生物磁気ミクロスフェアＥを得る。
（２）上澄み液を除去する前に固液分離を行い、生物磁気ミクロスフェアＥを洗浄液で洗浄し、生物磁気ミクロスフェアＥを溶出液で溶出し、上澄みを収集する。
好ましい実施形態の一つでは、固液分離は磁力によって行われる。
好ましい実施形態の一つでは、固液分離は遠心分離によって行われる。
（３）上澄みから対象タンパク質を分離および精製する。

好ましい実施形態の一つでは、処理するタンパク質溶液に対する生物磁気ミクロスフェアの比率は、体積で１：１０から１：８０までの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、処理するタンパク質溶液に対する生物磁気ミクロスフェアの比率は、体積で１：１０から１：６０までの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、処理するタンパク質溶液に対する生物磁気ミクロスフェアの比率は、体積で１：１０から１：５０までの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、処理するタンパク質溶液に対する生物磁気ミクロスフェアの比率は、体積で１：２０から１：５０までの範囲内にある。
好ましい実施形態の一つでは、処理するタンパク質溶液に対する生物磁気ミクロスフェアの比率は、体積で１：２０から１：４０までの範囲内にある。

いくつかの実施形態では、インビトロタンパク質合成反応完了後の反応液を、分離すべきタンパク質を含む溶液として直接使用する。例えば、ＩＶＴＴ反応（インビトロ転写および翻訳反応）完了後、得られたＩＶＴＴ反応液を分離するタンパク質を含む溶液として使用する。
いくつかの好ましい実施形態では、インビトロタンパク質合成システムが必要とする様々な因子が、別々にまたは組み合わせて外因的に添加されるが、これは、例えば、日本のＰＵＲＥシステム（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓキット）を参考にしている。
いくつかの好ましい実施形態では、インビトロのタンパク質合成システムは、
（ａ）細胞抽出物、好ましくは、酵母細胞抽出物、
（ｂ）いずれかの適切なクラウディング剤、例えば、ポリエチレングリコール、
（ｃ）任意の外因性スクロース、および
（ｄ）溶媒は水または水性溶媒である任意の溶媒、
を含む。
成分（ｃ）および（ｄ）の「任意の」という用語は、独立に必ずしも必要でない。
好ましい実施形態では、本発明によるインビトロタンパク質合成システムは、酵母細胞抽出物、トリヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ヌクレオシド三リン酸混合物（ＮＰＴ）、アミノ酸混合物、リン酸カリウム、アミラーゼ、ポリエチレングリコール、マルトデキストリンなどを含む。また、インビトロタンパク質合成反応のために、蛍光タンパク質ＤＮＡなどの標的タンパク質をエンコードする核酸鋳型をインビトロタンパク質合成反応システムにさらに加えることができる。

核酸鋳型（例えば、蛍光タンパク質をエンコードするＤＮＡ）は、標的タンパク質を含む反応液を得るためのインビトロタンパク質合成反応のために、さらにインビトロ合成タンパク質システムに添加することができる。好ましくは、標的タンパク質が精製タグを含み、標的タンパク質がヒスチジン精製タグを含むとき、ニッケルイオンと特異的に結合することができるので、本発明の生物磁気ミクロスフェアは分離および精製に使用することができる。

本発明において、インビトロ無細胞タンパク質合成システムにおける酵母細胞抽出物の割合は特に限定されない。一般的に、酵母細胞抽出物の体積含有率は、インビトロ無細胞タンパク質合成システムの総体積を基準として、２０％～７０％（ｖ／ｖ）の範囲内、好ましくは３０％～６０％（ｖ／ｖ）の範囲内、より好ましくは４０％～５０％（ｖ／ｖ）の範囲内、さらには、例えば５０％（ｖ／ｖ）である。

本発明において、細胞抽出物は、好ましくは、無傷細胞を含まない。細胞抽出物を調製するために適切な既報告の細胞抽出物調製技術を選択することができる。細胞抽出物の調製は、通常、少なくとも次の、適量の酵母細胞を提供するステップ、細胞を破砕するステップ、固液分離を行うステップ、および上澄みを回収するステップを含む。細胞抽出物の調製方法に従って得られた抽出物には、少量またはごく少量の無傷細胞が残っている場合があり得、この種の抽出物もまた本発明の細胞抽出物の範囲に含まれる。細胞抽出物は、無傷細胞の存在を排除するものではない。

同様に、インビトロタンパク質の合成システムは、細胞抽出物を含むとき、無傷細胞の存在を排除しない。それらの無傷細胞の存在の背後には多くの要因がある。無傷細胞は、細胞抽出物を調製するステップでの残渣であってもよく、または意図的に導入されたものであってもよく、例えば、それは添加した細胞を単に断片化して得られた細胞断片であってもよいし、その細胞断片は、完全に断片化された生成物と無傷細胞との混合物であってもよいし、あるいは、個々に添加された無傷細胞であってもよい。

典型的な細胞抽出物（酵母細胞抽出物を含む）は、タンパク質の翻訳に必要なリボソーム、ｔＲＮＡ、タンパク質翻訳のためのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、および開始因子、伸長因子、終結放出因子を含む。さらに酵母抽出物（酵母細胞抽出物を含む）は、細胞質に由来する他のタンパク質、特に可溶性タンパク質をさらに含む。

いくつかの好ましい実施形態では、酵母細胞抽出物は、クルイベロミセス細胞抽出物である。いくつかの好ましい実施形態において、クルイベロミセスは、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ラクチス）、クルイベロミセス・ラクチス変種ドロソフィララム、クルイベロミセス・ラクチス変種ラクチス、クルイベロミセス・マルキシアヌス、クルイベロミセス・アルキシアヌス変種ラクチス、クルイベロミセス・マルキシアヌス変種マルキシアヌス、クルイベロミセス・マルキシアヌス変種バヌデニー、クルイベロミセス・ドブシャンスキイ、クルイベロミセス・アエステツアリイ、クルイベロミセス・ノンファーメンタス、クルイベロミセス・ウィッカーハミイ、クルイベロミセス・サーモトレランス、クルイベロミセス・フラジリス、クルイベロミセス・フベイエンシス、クルイベロミセス・ポリスポラム、クルイベロミセス・シアメンシス、クルイベロミセス・ヤロウィおよびこれらの組合せが挙げられる。

インビトロタンパク質合成システムで必要とされるどのようなタンパク質成分（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）も、内因的な方法で添加することも、または外因的な方法で添加することもできる。タンパク質成分を内因的な方法で添加するとは、細胞抽出物の成分の一つとして添加することを意味し、一方、外因的な方法で添加するとは、非細胞の形で提供することを意味し、それは単一物質であっても、または２種以上の物質の組合せであってもよい。外因的な方法で添加する場合は、好ましくは１種２種またはそれ以上の物質の精製物である。タンパク質組成物を内因的な方法で提供する場合、以下の既存の文献や引用文献に記載されている、ＣＮ１０８６９０１３９Ａ、ＣＮ１０９４２３４９６Ａ、ＣＮ１０６９７８４３９Ａ、ＣＮ１１０４０８６３５Ａ、ＣＮ１１０５５１７００Ａ、ＣＮ１１００９３２８４Ａ、ＣＮ１１０８４５６２２Ａ、ＣＮ１１０９３８６４９Ａ、ＣＮ２０１８１１６１９８１９０、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９０，１０（１）：３５３－３６０”で提供されている遺伝子組み換え方法を参照することができるが、これらに限定されない。これらの方法には、コーディング配列を細胞内エピソーマルプラスミドに挿入する方法、コーディング遺伝子を細胞ゲノムに組込む方法、またはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。外因的な方法で提供される場合は、タンパク質組成物の含有量は、システムの必要に応じて制御および調整することができる。

いくつかの好ましい例では、インビトロ無細胞タンパク質合成システムは、酵母細胞抽出物、トリス、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ヌクレオシド三リン酸混合物（ＮＰＴ）、アミノ酸混合物、リン酸カリウム、糖類（グルコース、スクロース、マルトデキストリンおよびそれらの組合せのいずれかであり、マルトデキストリンが含まれる場合にはアミラーゼも好ましく含まれる）、ポリエチレングリコール、ＲＮＡポリメラーゼなどを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、内因的に提供され、または、外因的に添加され得る。ＲＮＡポリメラーゼのより好ましい形態の一つはＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。

いくつかの好ましい実施形態では、インビトロ無細胞タンパク質合成システムは、外因的に添加されたＲＮＡポリメラーゼを含む。
いくつかの好ましい実施形態では、インビトロ無細胞タンパク質合成システムは、外因的に添加されたＴ７ＴＮＡポリメラーゼを含む。
いくつかの好ましい実施形態では、インビトロ無細胞タンパク質合成システムは、クルイベロミセス・ラクチス細胞抽出物および外因的に添加されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの好ましい実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬから０．３ｍｇ／ｍＬまでの範囲内にある。いくつかの他の好ましい実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、０．０２ｍｇ／Ｌから０．１ｍｇ／ｍＬまでの範囲内にある。いくつかのさらに好ましい例では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、０．０２７ｍｇ／ｍＬから０．０５４ｍｇ／ｍＬまでの範囲内にある。いくつかのさらなる好ましい例では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度は０．４ｍｇ／ｍＬである。
本発明において、酵母細胞抽出物のタンパク質含有量は、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬまでの範囲内にあり、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬまでの範囲内にあり、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬまでの範囲内にある。タンパク質含量の測定方法は、クーマシーブリリアントブルーアッセイである。

インビトロ無細胞タンパク質合成システムにおけるヌクレオシド三リン酸の混合物は、好ましくは、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸およびウリジン三リン酸を含む。本発明において、各単一のヌクレオチドの濃度は特に限定されない。好ましい実施形態の一つでは、各単一のヌクレオチドの濃度は、０．５ｍＭから５ｍＭまでの範囲内にあり、好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭまでの範囲内にある。

インビトロ無細胞タンパク質合成システムにおけるアミノ酸混合物は天然アミノ酸または非天然アミノ酸を含んでいてもよく、Ｄ型アミノ酸またはＬ型アミノ酸を含んでいてもよい。代表的なアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含むが、これらに限定されるものではない。各アミノ酸の濃度は、好ましくは、０．０１ｍＭから０．５ｍＭまでの範囲内、より好ましくは０．０２ｍＭから０．２ｍＭまでの範囲内、例えば、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．0８ｍＭである。

いくつかの好ましい実施形態では、インビトロ無細胞タンパク質合成システムは、さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその類似体を含む。ポリエチレングリコールまたはその類似体の濃度は、特に限定されない。一般に、ポリエチレングリコールまたはその類似体の濃度（ｗ／ｖ）は、タンパク質合成システムの総重量または総体積を基準にして、０．１％から８％までの範囲内、好ましくは０．５％から４％までの範囲内、より好ましくは１％から２％までの範囲内にある。ＰＥＧの代表的な例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ３３５０を含むが、これらに限定されるものではない。本発明によるシステムは、さらに他の様々な分子量を有するポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２００、４００、１５００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００など）を含んでいてもよいことを理解すべきである。
いくつかの好ましい実施形態では、インビトロ無細胞タンパク質合成システムは、さらにスクロースを含む。スクロースの濃度（ｗ／ｖ）は特に限定されない。一般にスクロースの濃度は、タンパク質合成システムの総体積を基準にして、０．２％から４％までの範囲内、好ましくは０．５％から４％までの範囲内、より好ましくは０．５％から１％までの範囲内にある。

酵母抽出物に加えて、いくつかの好ましいインビトロ無細胞タンパク質合成システムは、さらに以下の成分：２２ｍＭトリス（ｐＨ８）、３０～１５０ｍＭ酢酸カリウム、１．０～５．０ｍＭ酢酸マグネシウム、１．５～４ｍＭヌクレオシド三リン酸混合物、０．０８～０．２４ｍＭアミノ酸混合物、２０～２５ｍＭリン酸カリウム、０．００１～０．００５ｍｇ／ｍＬアミラーゼ、１％～４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール、３２０～３６０ｍＭマルトデキストリン（グルコースユニットのモル量を基準とする）、８～２５ｎｇ／μＬ蛍光タンパク質ＤＮＡなどを含む。さらに、インビトロ無細胞タンパク質合成システムの総体積は、１０μＬから１００００μＬまでの範囲内、好ましくは１５μＬから１００μＬまでの範囲内、好ましくは３０μＬである。酵母抽出物は、好ましくはクルイベロミセス細胞抽出物であり、より好ましくはクルイベロミセス・ラクチス細胞抽出物である。
酵母抽出物に加えて、いくつかの好ましいインビトロ無細胞タンパク質合成システムは、さらに以下の成分：２２ｍＭトリス（ｐＨ８）、３０～１５０ｍＭ酢酸カリウム、１．０～５．０ｍＭ酢酸マグネシウム、１．５～４ｍＭヌクレオシド三リン酸混合物、０．０８～０．２４ｍＭアミノ酸混合物、２０～２５ｍＭリン酸カリウム、０．００１～０．００５ｍｇ／ｍＬアミラーゼ、１％～４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール、３２０～３６０ｍＭマルトデキストリン（グルコース単位のモル量を基準とする）、０．０２７～０．０５４ｍｇ／ｍＬＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（内因的、外因的、またはそれらの組合せ）などを含む。インビトロタンパク質合成反応のために、それらの成分を８～２５ｎｇ／μＬの蛍光タンパク質ＤＮＡと混合することができる。好ましい実施形態の一つにおける、反応体積は、１５μＬから３００μＬまでの範囲内にある。好ましい実施形態における反応体積は、１５μＬから１００μＬまでの範囲内にある。好ましい反応体積の一つは、３０μＬである。

第四方面では、タンパク質の分離および精製、免疫測定、標的抗体薬の濃縮、標的ドラックデリバリー、核酸の分離および抽出、細胞選別、酵素の固定化、遺伝子ベクター構築のための第一方面で述べる生物磁気ミクロスフェアの複数の用途を提供する。

例１．生物磁気ミクロスフェアの合成
１．１．調製手順
具体的には、０．５～１０００ｍＬ（２０％、ｖ／ｖ）のＳｉＯ_２被覆Ｆｅ_３Ｏ_４磁気ミクロスフェアの水溶液を測定し、磁気ミクロスフェアを無水エタノールで洗浄し、洗浄した磁気ミクロスフェアに１０～３００ｍＬの３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ，ＣＡＳ：９１９－３０－２）のエタノール溶液（５％～５０％、ｖ／ｖ）を加え、２～７２時間反応させた後、磁気ミクロスフェアを無水エタノールおよび蒸留水で洗浄して、アミノ修飾磁気ミクロスフェアである磁気ミクロスフェアＡを得た。

０．０００１～１モルのアクリル酸を溶液Ｘ（２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ、ＣＡＳ：４４３２－３１－９）を０．０１～１ｍｏｌ／Ｌの最終濃度で、ＮａＣｌを０．１－２ｍｏｌ／Ｌの最終濃度で含む水溶液）に移し、０．００１～０．５モルの１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＣＡＳ：２５９５２－５３－８）および０．００１～０．５モルのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、ＣＡＳ：６０６６－８２－６）を溶液Ｘに加え、得られた混合物を３～６０分反応させ、上記溶液を、０．５～５０ｍＬの磁気ミクロスフェアＡを含むＰＢＳ緩衝液に加え、１～４８時間反応させ、磁気ミクロスフェアを蒸留水で洗浄して、外表面が炭素－炭素二重結合で修飾された磁気ミクロスフェアＢを得た。

５～３０％（ｗ／ｖ）のアクリル酸ナトリウム溶液０．５～２００ｍＬを、０．５～５０ｍＬの磁気ミクロスフェアＢに加えた後、その溶液に２～２０％（ｗ／ｖ）の過硫酸アンモニウム溶液１０μＬ～２０ｍＬとテトラメチルエチレンジアミン１μＬ～１ｍＬを加えた後、その混合物を３～６０分間反応させ、磁気ミクロスフェアを蒸留水で洗浄し、磁気ミクロスフェアＣを得た。

磁気ミクロスフェアＣ０．５～５０ｍＬを溶液Ｘに移し、０．００１～０．５モルの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ－ＨＣＬ）および０．００１～０．５モルのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を溶液Ｘに加え、その混合物を３～６０分間反応させた後、０．００0１～１モルのＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジン（ＣＡＳ：１１３２３１－０５－３、トリカルボキシルアミン）を溶解した溶液Ｙを加えて、１～４８時間反応させ、この反応系に０．０００１～１モルの硫酸ニッケル固体粒子を加えて５分～２４時間反応させ、磁気ミクロスフェアを蒸留水で洗浄して磁気ミクロスフェアＤ、すなわちニッケルイオンを精製媒体として用い、Ｈｉｓタグに特異的に結合する標識を分離および精製する能力を有する本発明の生物磁気ミクロスフェアを得た。

１．２．具体的な調製方法
ここで、生物磁気ミクロスフェアの合成についての好ましい実施形態は以下の通りである。ＳｉＯ_２被覆Ｆｅ_３Ｏ_４磁気ミクロスフェア（１μｍの粒径を有する）の５０ｍＬ水溶液（固形分は２０％（ｖ／ｖ））を測定し、磁気ミクロスフェアを磁石で沈殿させ、液相を除去し、磁気ミクロスフェアを６０ｍＬの無水エタノールで１回ずつ、計５回洗浄した。洗浄した磁気ミクロスフェアに、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ；ＣＡＳ：９１９－３０－２）のエタノール溶液（２５％、ｖ／ｖ）１００ｍＬを加え、５０℃の水浴中で４８時間機械的に攪拌し、次いで７０℃の水浴中で２時間機械的に攪拌し、磁気ミクロスフェアを磁石で沈殿させ、液相を除去した後、磁気ミクロスフェアを６０ｍＬの無水エタノールで１回ずつ、計３回洗浄し、磁気ミクロスフェアＡを得た。

０．０１モルのアクリル酸を１００ｍＬの溶液Ｘ（の２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ、ＣＡＳ：４４３２－３１－９）を０．１ｍｏｌ／Ｌの最終濃度で、およびＮａＣｌを０．５ｍｏｌ／Ｌの最終濃度で含む水溶液）に移し、０．０４モルの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＣＡＳ：２５９５２－５３－８）および０．０４モルのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、ＣＡＳ：６０６６－８２－６）を溶液Ｘに加え、得られた混合物を室温で１５分間攪拌し、溶液のｐＨをＮａＨＣＯ_３固体粉末で７．２に調整し、ｐＨを調整した上記溶液を、磁気ミクロスフェアＡ１０ｍＬを含むＰＢＳ緩衝液１００ｍＬに添加し、３０℃の水浴中で２０時間機械的に攪拌し、磁気ミクロスフェアを磁石で沈殿させ、液相を除去し、磁気ミクロスフェアを６０ｍＬの蒸留水で１回ずつ、計６回洗浄し、磁気ミクロスフェアＢを得た。

１２ｍＬの２．０８ｍｏｌ／Ｌアクリル酸ナトリウム溶液を１ｍＬの磁気ミクロスフェアＢに加えた後、その溶液に４５０μＬの１０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム溶液と４５μＬのテトラメチルエチレンジアミンを加え、その混合物を室温で３０分間反応させ、磁気ミクロスフェアを磁石で沈殿させ、液相を除去し、磁気ミクロスフェアを１０ｍＬの蒸留水で１回ずつ、計６回洗浄し、磁気ミクロスフェアＣを得た。

合成した磁気ミクロスフェアＣを１０ｍＬの溶液Ｘに移し、０．００４モルの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）と０．００４モルのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を溶液Ｘに加え、その混合物を室温で３０分間攪拌し、磁気ミクロスフェアを磁石で沈殿させ、液相を除去した後、磁気ミクロスフェアを１０ｍｌの蒸留水で１回ずつ、計３回洗浄し、０．００２モルのＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジン（ＣＡＳ：１１３２３１－０５－３）を秤量し、１０ｍＬの溶液Ｙに溶解し、この溶液のＰＨをＮａＨＣＯ_３固体粉末で７に調整し、この溶液を洗浄した磁気ミクロスフェアに加え、３０℃のウォーターバスで２０時間機械的に攪拌し、この反応系に０．０２モルの硫酸ニッケル固体粒子を加え、この溶液を２時間連続的に攪拌し、磁気ミクロスフェアを磁石で沈殿させ、液相を除去した後、磁気ミクロスフェアを６ｍＬの蒸留水で１回ずつ、計１０回洗浄して、ニッケル磁気ビーズである磁気ミクロスフェアＤ、すなわち、以下、ＫＭ磁気ビーズと略す本発明の生物磁気ミクロスフェアを得た。

例２．生物磁気ミクロスフェアの効果
ＫＭ磁気ビーズの効果を検証するために、ＫＭ磁気ビーズ（本発明の生物磁気ミクロスフェアであるニッケル磁気ビーズ重合反応におけるモノマーとして、アクリル酸ナトリウムを使用した。）および対照ニッケルビーズを比較する実験を行った。対照ニッケルビーズは、市販のサンゴン社製ニッケルビーズ（Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂、カタログ番号：Ｃ６０００３３－００２５、サンゴンバイオテック社（上海））であり、そしてＫＭ磁気ビーズおよびポリアクリル酸磁気ビーズ（当社実験室で調製、重合反応におけるモノマーにとしてアクリル酸を使用した）の比較する実験を行い、結合能およびタンパク質純度を比較する実験を実施した。

本実施形態では、
Ｓ２０１９０８２０－１：Ｙ溶液を水相に置き換え、ＴＥＭＥＤは重合プロセスで使用しなかった（重合を促進するため）。
Ｓ２０１９０８２０―2：磁気ミクロスフェアＢは、ＫＨ５７０修飾経路で調製し、ポリアクリル酸磁気ビーズ（Ｓ２０１９０８２０―２）はモノマー分子としてアクリル酸を用いて調製し、ＴＥＭＥＤを使用し、緩衝液は溶液Ｙであった。
Ａ群：合成プロセス中に、溶液Ｘおよび溶液Ｙを水相に置き換えた。重合モノマーとしてアクリル酸を用いた。その他の調製条件は、例１のＫＭ磁気ビーズの調製条件と同じであった。
Ｂ群：ＫＭ磁気ビーズの合成方法を参考にして調製した。重合モノマーとして、アクリル酸を用いた。その他の調製条件は、例１のＫＭ磁気ビーズの調製条件と同じであった。

２．１．結合能比較試験
２．１．１．ＫＭ磁気ビーズ（ニッケル磁気ビーズ）と対照ニッケルビーズの比較
ＫＭ磁気ビーズを結合緩衝液（５０ｍＭのｐＨ８．０のトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのイミダゾール）で３回洗浄し、上澄みおよび沈殿物を分離した。対照ニッケルビーズも同様に上記結合緩衝液で洗浄した後、上澄みおよび沈殿物を分離した。以下の表１に従って、対応する量のビーズを異なる遠心分離管にセットした。

ｅＧＦＰ（ｅＧＦＰのＮ末端にヒスチジンタグを付した）を発現する、３ｍＬのＩＶＴＴ反応液を取得し、３ｍＬの結合緩衝液（ＲＦＵ値は１２６５．３３）を加えて、それらをよく混合し、その後４℃、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。沈殿物を捨て、ビーズ懸濁液の入った上記の遠心分離管のそれぞれに１ｍＬの上澄みを加えた後、それらをよく混合し、４℃で３時間、回転させながらインキュベートした。
上澄みを分離し、フロースルー液を得た。ビーズを１ｍＬの洗浄液（５０ｍＭのｐＨ８．０のトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾール）で２回洗浄し、最後に１ｍＬおよび２００μＬの溶出液（５０ｍＭのｐＨ８．０のトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウム、２５０ｍＭのイミダゾール）でそれぞれ溶出した。洗浄または溶出の各ステップのために、いずれも回転させながら４℃で５～１０分間インキュベートし、各ステップで得られた上澄みを回収し、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００／Ｍ２００マルチファンクショナルマイクロプレートリーダーを用いてＲＦＵ値を測定し、生成物含有量を算出した。

精製されたｅＧＦＰに従って、標準曲線を作成し、ｅＧＦＰのタンパク質質量濃度とそれに対応するＲＦＵ値との変換式を算出したところ、得られた変換式は以下の通りであった。

ここで、Ｘはタンパク質質量濃度（μｇ／ｍＬ）を表し、ＹはＲＦＵ蛍光測定値であった。

磁気ミクロスフェアの結合能は、次のように計算した：
上式にＹの値を代入してＸの値を求めた。ここで、得られたＸはタンパク質質量濃度であった。Ｘに溶出量を乗じて、溶出したタンパク質質量（Ｗ）を求めた。Ｗを磁気ミクロスフェアのカラムベッド体積（例えば、カラムベッドＮｏ．Ｓ１の体積は１０μＬである）で除することで、単位体積あたりの磁気ミクロスフェアに結合する標的タンパク質の質量を求め、得られた質量が結合能（ｍｇ／ｍＬ）であった。
結果は、ＫＭ磁気ビーズの結合能は、対照ニッケルビーズのそれよりも３倍超高いことを示している。（表２参照）

２．１．２．ＫＭ磁気ビーズおよびポリアクリル酸磁気ビーズ（Ｓ２０１９０８２０－１磁気ビーズ）の結合能の比較
例１の方法でＫＭ磁気ビーズを調製し、重合用モノマーとしてアクリル酸ナトリウムを使用した。
重合用モノマーとして、アクリル酸ナトリウムの代わりにアクリル酸を使用し、ポリアクリル酸磁気ビーズを調製した（Ｓ２０１９０８２０－１）。合成の際に溶液Ｙを水相に置き換えた。
同じ体積および同じソースを有するＩＶＴＴ反応液をそれぞれ処理した。結合能の比較は、２．２．１に示した試験分析法を用いて行い、結果を表３に示した。ＩＶＴＴ反応液およびフロースルー液のどちらも、１ｍＬの体積を有していた（フロースルー液の損失は無視できる）。結果は、ＫＭ磁気ビーズのフロースルー液のＲＦＵ値は２７２に過ぎず、ポリアクリル酸磁気ビーズ（Ｓ２０１９０８２０－１磁気ビーズ）のフロースルー液のＲＦＵ値は２７２を大幅に上回り、カラムベッド体積が２μＬの時には１１８８にまで達し、ここで、その値はＫＭ磁気ビーズの４～５倍の値を示した。この結果は、ＫＭ磁気ビーズの結合能は、カラムベッド体積が２μＬの場合、ポリアクリル酸磁気ビーズ（Ｓ２０１９００００８２０－１）の結合能の２０倍を超え、カラムベッド体積が１０μＬまたは５０μＬの場合、ポリアクリル酸磁気ビーズ（Ｓ２０１９０８２０－１）のそれの約２１倍、２６倍であることがわかった。その結果、ＫＭ磁気ビーズと同等の効果を達成するためには、少なくともポリアクリル酸磁気ビーズの量はＫＭ磁気ビーズの量の少なくとも２０倍にすべきである。

２．１．３．ポリアクリル酸磁気ビーズの効果の分析
重合モノマーとしてアクリル酸ナトリウムの代わりにアクリル酸を使用し、ポリアクリル酸磁気ビーズを調製した。
ＫＭ磁気ビーズは例１の方法を用いて調製した。
ポリアクリル酸磁気ビーズは、以下の２種の異なる条件で調製した。
Ａ群：合成プロセス中で、溶液Ｘおよび溶液Ｙを水相に置き換えた。重合モノマーとして、アクリル酸を使用した。その他の調製条件は、例１のＫＭ磁気ビーズの調製条件と同様である。
Ｂ群：ＫＭ磁気ビーズの合成方法を参考にして調製した。重合モノマーとして、アクリル酸を使用した。その他の調製条件は、例１のＫＭ磁気ビーズの調製条件と同様である。

２．１．１項の試験分析方法を参考に、各群を同一体積および同一ソースを有するＩＶＴＴ反応液で処理した。図２は、ＩＶＴＴ反応液処理前後の、Ａ群およびＢ群で調製したポリアクリル酸磁気ビーズとＫＭ磁気ビーズのＲＦＵ値の差、すなわち、この差はＩＶＴＴ反応液のＲＦＵ値からフロースルー液のＲＦＵ値を差し引いて得られる。分析結果は、ＫＭ磁気ビーズの結合能は、ポリアクリル酸磁気ビーズのそれより、はるかに高いことを示した。特に、ＫＭ磁気ビーズの結合能は、ポリアクリル酸磁気ビーズのそれより５～１０倍となり得、カラムベッド体積が２μＬであった場合、ＫＭ磁気ビーズの結合能はＡ群およびＢ群で調製したポリアクリル酸磁気ビーズのそれぞれ１０倍、５倍であった。

２．１．４．ＫＨ５７０修飾経路
ＫＨ５５０修飾経路のために、まずアミノ化シランカップリング剤ＫＨ５５０（３－アミノプロピルトリエトキシシラン、ＣＡＳ：９１９－３０－２）を用いてアミノ基を導入し（磁気ミクロスフェアＡを得た。）、次いで炭素－炭素二重結合を導入して磁気ミクロスフェアＢを得た。
ＫＨ５７０修飾経路は、ＫＨ５５０修飾経路と異なるものであった。ＫＨ５７０修飾経路では、磁気ミクロスフェアの修飾にトリメトキシシラン化メタクリル酸分子ＫＨ５７０（ＣＡＳ：２５３０―８５―０、３－（メタクリロキシ）プロピルトリメトキシシラン、アリルシランカップリング剤）を採用し、炭素－炭素二重結合を直接導入して磁気ミクロスフェアＢを得た。
ＫＨ５７０修飾経路を用いて磁気ミクロスフェアＢを調製し、アクリル酸をモノマー分子として使用し、ポリアクリル酸磁気ビーズ（Ｓ２０１９０８２０ー２）を調製して得、緩衝液は溶液Ｙであった。また、同一体積および同一ソースを有するＩＶＴＴ反応液をそれぞれ処理し、２．１．１．の方法を試験および分析のために用いた。使用した磁気ビーズの体積は２０μＬであり、ＩＶＴＴ反応液の体積は１ｍＬであった。ＩＶＴＴ反応液（原液）、フロースルー液、洗浄液および溶出液のＲＦＵ値をそれぞれ試験した。ＩＶＴＴ反応液のＲＦＵ値は８００であり、フロースルー液のＲＦＵ値は１７３であった。結果を図３に示した。分析結果は、ＫＨ５７０修飾経路によって得られたポリアクリル酸磁気ビーズの結合能（約２ｍｇ／ｍＬ）は、上述のＫＭ磁気ビーズのそれよりも低いことを示した。
２．１．５．異なる濃度を有する重合モノマーを使用したＢ－ＫＭ磁気ビーズの調製
ＫＭ磁気ビーズの調製方法と比較して、重合モノマーアクリル酸ナトリウムのモノマー濃度を２．０８ｍｏｌ／Ｌから２．４９６ｍｏｌ／Ｌに増加させた。その他の調製方法および条件は例１と同様であり、ポリアクリル酸ナトリウム磁気ビーズ（Ｂ－ＫＭ磁気ビーズ、１９１２２０－ＺＺ－１）を得た。

２．１．１．の方法を使用することにより、結合能を試験し、分析し、結果を表４に示した。異なる体積（２μＬ、４μＬ、８μＬ）を有する磁気ビーズを使用して、3回の結合能の試験を行った。磁気ビーズの体積が４μＬおよび８μＬであったとき、磁気ビーズが過剰であることがわかった。２μＬの体積を有する磁気ビーズの結合能は、２．１．１．項の上述の式により、約８５．６ｍｇ／ｍＬと算出された。

表４において、総量は、処理するＩＶＴＴ反応液に対応し、フロースルーはフロースルー液に対応し、Ｅ１は８０μＬの溶出液を用いた第１の溶出プロセスで得られた溶液に対応し、Ｅ２は８０μＬの溶出液を用いた第２の溶出プロセスで得られた溶液に対応する。

２．２．純度試験
２．２．１．ＫＭ磁気ビーズおよび対照ニッケルビーズの精製生成物の純度試験

２．１．１．項における対照ニッケルビーズおよびＫＭ磁気ビーズは、それぞれ、結合緩衝液（５０ｍＭのｐＨ８．０のトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのイミダゾール）で３回洗浄し、上澄みと沈殿物を分離した。各種のビーズの３μＬをそれぞれ８本の遠心分離管（表５に示すとおり）にピペットで移した。
ｅＧＦＰを発現しているＩＶＴＴ反応液６ｍＬおよびｅＧＦＰを発現していないＩＶＴＴ反応液６ｍＬを取得し、取得した各ＩＶＴＴ反応液を、それぞれ、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間別々に遠心分離した。沈殿物を捨て、２種類のＩＶＴＴ反応液の上澄みを表５の体積比で混合し、異なるｅＧＦＰタンパク質濃度を有する８群の溶液を得た。この８群の溶液を、それぞれ、対応するビーズ遠心分離管に加え（ＫＭ磁気ビーズおよび対照ニッケルビーズをそれぞれ使用した）、十分に混合し、４℃で１．５時間、回転下にインキュベートした。

ｅＧＦＰを発現しているＩＶＴ反応液とは、ＩＶＴＴシステムを使用して（ｅＧＦＰをエンコードするＤＮＡ鋳型を使用する）インビトロタンパク質合成反応を行って得られた反応液を指す。ｅＧＦＰを発現していないＩＶＴＴ反応液は、希釈剤として、ｅＧＦＰをエンコードするＤＮＡ鋳型をＩＶＴＴシステムに添加していないことを意味し、このように得られた反応液中のタンパク質は、すべて不純タンパク質である。標的タンパク質を発現していない反応液をＩＶＴＴ反応液に混ぜた場合、異なる割合の不純タンパク質がＩＶＴＴ反応に取り込まれ得る。異なるｅＧＦＰタンパク質濃度を有する溶液に対しＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、精製されたｅＧＦＰタンパク質の純度を比較した。表５では、希釈したＩＶＴＴ反応液の濃度が低いほど、標的タンパク質の含有量が少なく、そして不純なタンパク質の含有量が多い。

上澄みを分離してフロースルー液を得た。対照ニッケルビーズおよびＫＭ磁気ビーズを、それぞれ１ｍＬの洗浄液（５０ｍＭのｐＨ８．０のトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾール）で２回洗浄し、最後にビーズを２００μＬの溶出液（５０ｍＭのｐＨ８．０のトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウム、２５０ｍＭのイミダゾール）で１回のみ、溶出させた。洗浄または溶出の各ステップのために、いずれも４℃で５～１０分間、回転下にインキュベートし、各ステップで得られた上澄みを回収し、ＲＦＵ値を測定した。
溶出液３０μＬをローディングバッファー（２５０ｍＭのｐＨ６．８のトリス－ＨＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー（ＢＰＢ、ＣＡＳ：１１５―３９－９）、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、５％の（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノール）８μＬに加え、その結果として生じる混合物を８分間均一に煮沸し、全てのローディングサンプルについてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動検出を行った。結果を図１に示した。図１のゲル画像をＩｍａｇｅ－Ｊソフトウェアで分析し、バンドの輝度値を求めた。算出結果を表６に示した。

表６において、レーンは各レーンの番号、総量は各レーンの各バンドの輝度の合計、ｅＧＦＰは各レーンの標的バンド（ｅＧＦＰ、約２６．７ｋＦＤａ）の輝度であった。ｅＧＦＰ／総量は、磁気ビーズの精製により得られたサンプル中の標的タンパク質の含有率比を反映している。
各バンドの合計輝度に対する標的バンドのｅＧＦＰの輝度の比、すなわち、ｅＧＦＰ／総量は純度を表した。結果は、ＫＭ磁気ビーズの精製により得られた純度が対照ニッケルビーズの精製により得られた純度よりも優れていることを示した。ここで、ＫＭ磁気ビーズの精製生成物の純度は、９２．５％までになり得る。

２．２．２．Ｂ－ＫＭ磁気ビーズの精製生成物の純度試験
前述の２．１．５項で得られたＢ－ＫＭ磁気ビーズの純度試験および分析を行った。電気泳動スペクトログラムの各バンドの輝度値をＩｍａｇｅ－Ｊソフトウェアで分析した。結果は、標的タンパク質の純度が９７％までになり得ることを示した。図４を参照すると、１００％は、純粋なＩＶＴＴ反応液を指し、６０％は、６０体積％の純粋なＩＶＴＴ反応液と４０体積％の希釈液を混合したものを指す。

例３．生物磁気ミクロスフェアの効果の検証
３．１．ホタルルシフェラーゼの分離および精製
ＫＭ磁気ビーズの効果をさらに検証するために、ＩＶＴＴ反応を行って、ホタルルシフェラーゼ（ルシフェラーゼと略すことができる）を発現させ、アフィニティ分析を行った。ホタルルシフェラーゼはヒスチジンタグを含み、得られたタンパク質生成物はＨｉｓタグの標識である。
ＫＭ磁気ビーズおよび対照ニッケルビーズを結合緩衝液（ｐＨ８．０を有するトリス－ＨＣｌ５０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ、イミダゾール5ｍＭ）で３回洗浄し、上澄みと沈殿物を分離した。各種ビーズ３μＬを７本の遠心分離管にピペットで移した（表７に示すとおり）。
ホタルルシフェラーゼ（ヒスチジンタグを含む）を発現しているＩＶＴＴ反応液１ｍＬを取得し、取得したＩＶＴＴ反応液を４０００ｒｐｍで、４℃で１０分間、遠心分離した。沈殿物を捨て、上澄みを表７の体積比で結合緩衝液と混合した。結果として生じた混合物を対応する遠心分離管に加え、十分混合し、回転下に４℃で１時間インキュベートした。

上澄み液を分離して、フロースルー液を得た。ビーズを１ｍＬの洗浄液（ｐＨ８．０を有するトリス－ＨＣｌ５０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ）で２回洗浄し、最後にビーズを２００μＬの溶出液（ｐＨ８．０を有するトリス－ＨＣｌ５０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ、イミダゾール２５０ｍＭ）で１回だけ溶出させた。洗浄または溶出の各ステップのために、いずれも４℃で５～１０分間、回転下にインキュベートし、各ステップで得られた上澄みを回収し、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００／Ｍ２００マルチファンクショナルマイクロプレートリーダーを用いることによってＲＦＵ値を測定した。

以下の式：結合効率＝（１－フロースルー溶液のＲＬＵ値／反応溶液のＲＬＵ値）×１００％に従って、結合効率を算出し、アフィニティ値は、基質の５０％が結合したときの基質濃度であった。
精製したルシフェラーゼに従って、標準曲線を描き、ルシフェラーゼのＲＬＵ値をタンパク質質量濃度に変換する式をＹ＝５（Ｅ＋０８）Ｘ－８５０５０２、すなわち、Ｙ＝５×１０^８×Ｘ－８５０５０２と推測した。ここで、Ｘはタンパク質質量濃度（μｇ／ｍＬ）を表し、ＹはＲＦＵ蛍光測定値であった。試験範囲では、Ｙは、基本的には、Ｘに比例していた。
反応液およびフロースルー液のＲＬＵ測定値を上記の式に代入して、それぞれ、標的タンパク質濃度を算出した。

実験結果（表８）から、標的タンパク質の質量濃度を３３９μｇ／ｍＬから１５μｇ／ｍＬまでに下げたとき、ＫＭ磁気ビーズの標的タンパク質への結合能はなお９０％よりもはるかに高いことを見て取ることができる。Ｎｏ．７の反応液のＲＬＵ値は装置の検出限界に近いため、結合効率を５０％に低下させるために標的タンパク質の濃度をそれ以上低下させず、親和性の具体的な値を得た。しかし、半定量的な結論を得ることができた、つまり、ＫＭ磁気ビーズは標的タンパク質との強い親和性を有しており、その親和性は少なくともｎｇ／ｍｌレベルに達することができる。

３．２．Ｂ－ＫＭ磁気ビーズの親和性試験および分析
前述の２．１．５項のＢ－ＫＭ磁気ビーズの調製方法を使用してポリアクリル酸ナトリウム磁気ビーズ（２００２２４－ＺＺ－１）を調製した。３．１．項に記載された方法に従って、ｅＧＦＰを発現するＩＶＴＴ反応液を使用することによって、親和性試験および分析を行い、結果を表９に示した。結合効率は９０％を超え、９９．３％までになり得る。
９０％の標的タンパク質が吸着された濃度（９０％結合効率）が０．３μｇ／ｍＬ（３００ｎｇ／ｍＬ）であったとき、半定量的な結論が得られる、つまり、磁気ビーズの親和性はｎｇ／ｍＬのレベルに達することができる。

ここで、ＮＣは陰性対照であり、そのＲＦＵ値はバックグラウンド値として使用される。
結合効率の計算式は：（反応液のＲＦＵ値‐フロースルー液のＲＦＵ値）／（反応液のＲＦＵ値‐ＮＣのＲＦＵ値）である。

例４．精製効果に対する磁気ミクロスフェアの大きさの効果調査
４．１．ＳｉＯ_２被覆磁気ミクロスフェア（磁気ミクロスフェア本体、磁気ビーズ、ガラスビーズとも呼ばれる）の調製
Ｆｅ_３Ｏ_４ミクロスフェア２０ｇをエタノール３１０ｍＬと水１２５ｍＬの混合溶媒に入れ、その混合物に２８％（ｗｔ）アンモニア水４５ｍＬを加え、オルトケイ酸テトラエチル２２．５ｍＬを滴下した後、その混合物を室温で２４時間攪拌し、反応させた。反応が完了した後、ミクロスフェアをエタノールと水で洗浄した。異なる粒径（約１μｍ、１０μｍ、１００μｍ）を有するＦｅ_３Ｏ_４ミクロスフェアを原材料として使用し、得られたガラスビーズの粒径を制御した。異なる粒径を有するＦｅ_３Ｏ_４ミクロスフェアは、通常の技術的手段により調製することができる。
調製した磁気ミクロスフェアは、精製媒体の修飾または精製媒体の結合のための基礎材料として使用し、そのため、磁気ミクロスフェア本体とも呼ばれる。
調製した磁気ミクロスフェアは、磁気の核を有し、それは移動、分散、沈降および他の操作を達成するために磁力によって制御することができ、そのため広義での磁気ビーズの１種である。
調製した磁気ミクロスフェアは、ＳｉＯ_２被覆層を有し、そのためガラスビーズとも呼ばれ、磁気核による組成物や成分：ポリマー、精製媒体、インビトロタンパク質合成システムの構成要素、核酸鋳型、タンパク質発現生成物などの吸着を低減することができる。
４．２．異なる大きさのガラスビーズ（ＳｉＯ_２被覆磁気ミクロスフェア）を用いたニッケル磁気ビーズの調製
磁気ミクロスフェア本体として、１μｍ、１０μｍ、および１００μｍの直径を有するガラスビーズを４．１．のステップで示す調製方法によって調製した後、例１の方法を使用することによってニッケル磁気ビーズＮｉ１、Ｎｉ１０、およびＮｉ１００をそれぞれ調製した。他の反応条件は、ガラスビーズの原料を除いて全て同じであった。
顕微鏡で写真を撮り、調製したニッケル磁気ビーズの大きさおよび形態を観察する。結果は、図５に示し、約１μｍの直径を有するガラスビーズ（図５（Ａ）、（Ｂ））、１０μｍの直径を有するガラスビーズ（図５（Ｃ））および１００μｍの直径を有するガラスビーズ（図５（Ｄ））を得た。図５（Ａ）は静止状態で撮影した画像であり、図５（Ｂ）は流動状態で撮影した画像である。

４．３．ＩＶＴＴ反応液の精製結果の比較
４．３．１．インビトロタンパク質合成システム（Ｄ２Ｐシステム、ＤＮＡ－ｔｏ－プロテインシステム）の構築
インビトロタンパク質合成反応は、平底の細胞培養プレートで行った。各サンプルに３つのパラレルサンプルをセットし、平均値および標準偏差（エラーバー）を算出した。

各成分の最終濃度は：ｐＨ８．０を有するトリス－ＨＣｌ９．７８ｍＭ、酢酸カリウム８０ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、ヌクレオシド三リン酸混合物１．８ｍＭ（アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、ウリジン三リン酸を含み、各種ヌクレオシド三リン酸の濃度は１．８ｍＭである）、アミノ酸混合物０．７ｍＭ（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンを含み、各種アミノ酸の濃度は０．７ｍＭである）、グルコース１５ｍＭ、マルトデキストリン３２０ｍＭ（モル濃度はグルコース単位で計算し、質量体積濃度は５２ｍｇ／ｍＬである）、リン酸カリウム２４ｍＭ、２％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８００、そして最後に５０体積％のクルイベロマイセス・ラクチス細胞抽出物であり、クルイベロマイセス・ラクチス細胞抽出物は内因的に発現したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含んでいる。
クルイベロマイセス・ラクチスの細胞抽出物は、ＣＮ１０９４２３４９６Ａに報告されている方法を用いることによって調製した。一般的に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのコーティング遺伝子をクルイベロマイセス・ラクチスのゲノムに組み込み、得られた遺伝子組換え株を培養のために使用し、適切な量の細胞を得た後、細胞抽出物を調製した。

４．３．２．８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰをエンコードする核酸鋳型（ＤＮＡ鋳型）の調製
８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰ（ヒスチジンタグで標識されたｍＥＧＦＰで、ｍＥＧＦＰはｅＧＦＰのＡ２０６Ｋ変異体である）のコーディング遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入し、ＰＣＲ増幅法および相同フラグメント組換え法を用いることによって、ｍＥＧＦＰを発現するプラスミドベクターを構築した。このプラスミドは、遺伝子配列決定によって正しいものであることが確認された。プラスミドベクターは以下の成分：Ｔ７プロモーター、５’ＵＴＲ、リーダーペプチドのコーディング配列、８×Ｈｉｓ（ヒスチジンタグ）、ｍＥＧＦＰコーディング配列、３’ＵＴＲ、ＬＡＣ４ターミネーター、ｆ１ｏｒｉ（複数起点部位）、ＡｍｐＲプロモーター、ＡｍｐＲ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）、ｏｒｉ（高コピー数複数起点部位）、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＩ（ｌａｃ阻害剤）コーディング遺伝子、および他の機能的要素を含んでいた。
ＲＣＡ増幅法を採用することにより、８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰをエンコードするプラスミドＤＮＡを核酸鋳型として使用し、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ－ＤＮＡ増幅を行い、８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰをコードするＤＮＡ鋳型を得た。

４．３．３． インビトロタンパク質合成反応（ＩＶＴＴ反応）の実行
４．３．２．で調製した８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰをエンコードするＤＮＡテンプレート（１５ｎｇ／μＬ）を、４．３．１．で構築したインビトロタンパク質合成システムに加え、それらをよく混合した。この混合物を室温（２０～３０℃）で３時間、振とうを伴って反応させた。反応が完了した後、ＩＶＴＴ反応液（ＰＣ群、原タンパク質液）を得た。

４．４．精製およびＲＦＵ試験
ＩＶＴＴ反応溶液を４．２．項で調製した異なる大きさを有するニッケル磁気ビーズで精製し、精製効果に対する磁気ミクロスフェア本体の大きさの影響を調べた。
１ｍＬのＩＶＴＴ反応液をピペットで移し、１０μＬ、５μＬ、１μＬのニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）、１０μＬ、５μＬ、１μＬのニッケル磁気ビーズＮｉ１０（１０μｍ）、１０μＬ、５μＬ、１μＬのニッケル磁気ビーズＮｉ１００（１００μｍ）を１ｍＬのＩＶＴＴ反応液に加えた。この溶液をローテーターで回転させてよく混ぜ、３時間インキュベートした。磁石を使用して溶液から磁気ビーズを分離し、回収した上澄みを浸透液として記録した。浸透液について蛍光試験を行い、そのＲＦＵ値は磁気ビーズに結合していないタンパク質の量を反映する。試料処理：試料を４℃で１分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。試験する試料をマイクロプレートリーダーに配置し、励起波長／発光波長（Ｅｘ／Ｅｍ）：４８８ｎｍ／５０７ｎｍを使用して、相対蛍光強度単位（ＲＦＵ）を決定した。

４．５．精製結果の分析
ニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）とニッケル磁気ビーズＮｉ１０（１０μｍ）の精製結果の比較を図６に示した。ニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）とニッケル磁気ビーズＮｉ１０（１００μｍ）の精製結果の比較を図７に示した。ここで、ＰＣ群は、４．３．３．で得られたＩＶＴＴ反応液のＲＦＵ試験結果であった。１０μＬ、５μＬおよび１μＬは、それぞれニッケル磁気体ビーズの体積を表した。ＰＣ群のＲＦＵ値から浸透液のＲＦＵ値を差し引いて差を求め、その差は、磁気ビーズに結合したタンパク質の量に対応し、結果としてタンパク質の結合効果を評価することができる。
図６では、ＩＶＴＴ反応液中のタンパク質生成物８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰの濃度は９７．４μｇ／ｍＬであった。ニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）のタンパク質結合効率は、ニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）の体積量が１０μＬ、５μＬおよび１μＬであったとき、それぞれ９８．２％。９７．６％および５３．８％であった。ニッケル磁気ビーズＮｉ１０（１０μｍ）のタンパク質結合効率は、ニッケル磁気ビーズＮｉ１０（１０μｍ）の体積量が１０μＬ、５μＬおよび１μＬであったとき、それぞれ９６．９％、５１．９％および２４．７％であった。ニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）のタンパク質結合効率は、それぞれ１．３％、４６．８％および５４．１％向上した。

図７では、ＩＶＴＴ反応液中のタンパク質生成物８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰの濃度は５７．９μｇ／ｍＬであった。３種類の異なる体積を有するニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）のタンパク質結合効率は、いずれも９８％を超え（９８．３％～９８．９％）、ニッケル磁気ビーズＮｉ１００（１００μｍ）のタンパク質結合効率は、Ｎｉ１００（１００μｍ）の体積量が１０μＬ、５μＬおよび１μＬであったとき、それぞれ、８７．５％、４６．９％および１５．２％であった。ニッケル磁気ビーズＮｉ１（１μｍ）のタンパク質結合効率は、それぞれ１１．５％、５２．５％、８４．６％向上した。

例５．ポリマー鎖長の影響の調査
５．１．異なるポリマー鎖長を有する磁気ミクロスフェアの調製
例１の方法を使用することによって、ニッケルイオンを精製媒体として有する磁気ミクロスフェアを調製し、ここで重合したモノマーアクリル酸ナトリウムの濃度はそれぞれ２．０８ｍｏｌ／Ｌおよび２．４９６ｍｏｌ／Ｌであり、Ｌ１５およびＬ１８として示す。

５．２．精製およびＲＦＵ試験
ＰＣ溶液（ＩＶＴＴ反応が完了したときに得られるＩＶＴＴ反応液）を、例４の４．３．に記載した方法により調製した。このＰＣ溶液を異なる比率で希釈し、異なる濃度を有するタンパク質生成物（８Ｈｉｓ－ｍＥＧＦＰ）を含む原タンパク質溶液を得た。
陰性対照群（ＮＣ群）を設定した：ＰＣ群を参考に、ＤＮＡ鋳型の添加なしに同様の操作を行い、得られた「ＩＶＴＴ反応液」がＮＣ群であった。
精製を例４の４．４．の方法を用いて行った。異なる希釈率を有する原タンパク質溶液１ｍＬを得、２μＬのニッケル磁気ビーズを加え、反応のためにインキュベートした。磁気ビーズが分離された浸透液および２組の溶出液（溶出液１および溶出液２）をそれぞれ回収した。
ＲＦＵ試験を、例４の４．４．の方法を使用して行った（表１０および表１１）。ＳＤＳ―ＰＡＧＥ電気泳動試験も実施した（図は示さない）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動は、試験する溶液に対して行った。染色にはクーマシーブリリアンドブルーＲ－２５０を使用し、一晩放置した。脱色後、標的タンパク質のバンドが観察され、これは標的タンパク質の分子量が正しいかどうかを分析するため、および標的タンパク質の純度を分析するために使用することができる。検出パラメータ：融合タンパク質生成物を含む溶出液３０μＬを得、この溶出液に５％β－メルカプトエタノールを含む５×ローディングバッファー７．５μＬを加えた後、その混合物を９５℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ電気泳動を行った。染色にはクーマシーブリリアントブルーＲ－２５０を使用して、一晩放置した。脱色後、標的タンパク質のバンドの大きさおよびその純度を観察した。
表１０において、タンパク質結合効率は、以下の式、１―（ＲＦＵ_ｆｔ－ＲＦＵ_０）／（ＲＦＵ_ｏｒｉ－ＲＦＵ_０）、すなわち、（ＲＦＵ_ｏｒｉ‐ＲＦＵ_ｆｔ）／（ＲＦＵ_ｏｒｉ‐ＲＦＵ_０）により算出した。対応する比率で希釈された原タンパク質溶液およびＮＣ群の溶液は同じ体積を有し、浸透液の体積は原タンパク質溶液およびＮＣ群の溶液と基本的に同じであった。表１０から、ポリマー鎖長が増加するにつれて、ニッケル磁気ビーズによるタンパク質生成物の捕捉率（結合効率、結合率）もまた増加したことがわかる。Ｌ１５（２．０８ｍｏｌ／Ｌアクリル酸ナトリウム）ＲＦＵ３２０およびＬ１８（２．４９６ｍｏｌ／Ｌアクリル酸ナトリウム）ＲＦＵ３１０のタンパク質結合効率は、それぞれ８５％および９９％であり、Ｌ１８のタンパク質結合効率は１６．５％向上した。

表１１において、高濃度のタンパク質溶液を使用することにより、Ｌ１５（２．０８ｍｏｌ／Ｌアクリル酸ナトリウム）およびＬ１８（２，４９６ｍｏｌ／Ｌアクリル酸ナトリウム）のタンパク質結合効率はそれぞれ４１．７８％および５５．５５％であり、磁気ビーズの単位体積あたりのタンパク質結合能はそれぞれ４０．０μｇ／μＬおよび６１．７μｇ／μＬである。より長いポリマー鎖およびより多くの分岐鎖を有するＬ１８のタンパク質結合効率および磁気ビーズの単位体積あたりのタンパク質の結合能はより高く、それらはそれぞれ３３．０％および５４．５％増加していた。

さらに、タンパク質生成物を含む溶出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出の結果は、Ｌ１５（２．０８ｍｏｌ／Ｌアクリル酸ナトリウム）の純度に比べて、Ｌ１８（２．４９６ｍｏｌ／Ｌアクリル酸ナトリウム）の純度も向上していたことを示した。

濃度：タンパク質生成物の濃度は、例２の２．１項の変換式を使用することによって得られる。
タンパク質結合効率＝（溶出液１＋溶出液２）／原タンパク質溶液。タンパク質の質量に基づく。
磁気ビーズの単位体積あたりのタンパク質結合量＝（溶出液１のタンパク質量＋溶出液２のタンパク質量）／磁気ビーズの体積。結合能としても知られ、ｍｇ／ｍＬまたはμｇ／μＬ単位である。
結合能：磁気ビーズの単位体積あたりのタンパク質結合量。

以上の説明は、本発明の実施形態の一部に過ぎず、本発明は上記の実施形態に限定されるものではない。
本発明に記載されているすべての文書は、各文書が個別に参照により組み込まれているのと同様に、本願に参照により組み込まれている。さらに、当業者は、本発明の上に教示した内容を読んだ後に、本発明に対し様々な変更や修飾を行うことができ、これらの均等の形態も本発明の添付の手特許請求の範囲よって規定される範囲に入ることを理解すべきである。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
生物磁気ミクロスフェアであって、
前記生物磁気ミクロスフェアの磁気ミクロスフェア本体の外表面は、分岐鎖を有する少なくとも１種の線状ポリマーを有し、
前記分岐鎖を有する線状ポリマーの一端は、前記磁気ミクロスフェア本体の外表面に共有結合しており、
複数の他の部分は前記磁気ミクロスフェア本体の外表面で自由であり、前記線状ポリマーのバックボーンはポリオレフィンバックボーンであり、前記線状ポリマーの分岐鎖は官能基を含み、前記官能基は標的物に結合可能である、生物磁気ミクロスフェア。
［２］
前記線状ポリマーが、アクリル酸、アクリレート、アクリル酸エステル、メタクリレート、メタクリル酸エステル、複数のその他のアクリル系モノマー、およびそれらの組合せを含む群から選択される１種の重合により得られたものであり、
好ましくは、前記線状ポリマーのバックボーン形成プロセスにおいて、架橋剤が不要である、［１］の生物磁気ミクロスフェア。
［３］
前記官能基は特異的結合部位を含み、前記特異的結合部位は前記標的物に特異的に結合でき、好ましくは、前記特異的結合部位はニッケルイオンであり、前記ニッケルイオンは、Ｈｉｓタグの標識に特異的に結合することができる、［１］の生物磁気ミクロスフェア。
［４］
前記線状ポリマーの前記官能基が、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、及びそれらの組合せを含む群から選択される１種である、［１］の生物磁気ミクロスフェア。
［５］
前記線状ポリマーが、前記磁気ミクロスフェア本体の外表面に直接固定されている、また連結基を介して磁気ミクロスフェア本体の外表面に間接的に固定されている、［１］～［４］のいずれかの生物磁気ミクロスフェア。
［６］
前記磁気ミクロスフェア本体がＳｉＯ _２ 被覆磁気粒子である、［１］～［４］のいずれかの生物磁気ミクロスフェア。
［７］
前記磁気粒子は、鉄化合物、鉄合金、酸化亜鉛、酸化マンガン混合物、酸化ガドリニウム混合物、コバルト化合物、ニッケル化合物、ニッケル合金、酸化マンガン、マンガン合金、酸化亜鉛、酸化ガドリニウム、酸化クロム、およびこれらの組合せを含む群から選択される１種を含む化学成分を有し、
好ましい実施形態の一つでは、前記磁気粒子は、酸化鉄、酸化亜鉛、酸化マンガン混合物、酸化ガドリニウム混合物、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化マンガン、酸化亜鉛、酸化ガドリニウム、酸化クロム、およびこれらの組合せを含む群から選択される１種を含む化学成分を有し、
好ましい実施形態の一つでは、前記磁気粒子は、酸化鉄、鉄、コバルト、Ｃｏ _２ ^＋ 、窒化鉄、Ｍｎ _３ Ｏ _４ 、ＧｄＯ、ニッケル、Ｎｉ _２ ^＋ 、およびこれらの組合せからなる群から選択された一つを含む化学成分を有しており、ここで、酸化鉄は、好ましくは、Ｆｅ _３ Ｏ _４ 、γ―Ｆｅ _２ Ｏ _３ 、またはこれらの組合せであり、
好ましい実施形態の別の一つでは、前記磁気粒子は、Ｆｅ _３ Ｏ _４ 、γ－Ｆｅ _２ Ｏ _３ 、窒化鉄、Ｍｎ _３ Ｏ _４ 、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＭｏ、ＦｅＡｌＣ、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＣｏ、ＲｅＣｏ、ＲｅＦｅ、ＰｔＣｏ、ＭｎＡｌＣ、ＣｕＮｉＦｅ、ＡｌＭｎＡｇ、ＭｎＢｉ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉ、ＦｅＡｌ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉＡｌ、ＢａＯ・６Ｆｅ _２ Ｏ _３ 、ＳｒＯ・６Ｆｅ _２ Ｏ _３ 、ＰｂＯ・６Ｆｅ _２ Ｏ _３ 、ＧｄＯ、およびこれらの組合せからなる群から選択される１種を含む化学成分を有し、ここでＲｅは希土類元素であるレニウムである、［６］の生物磁気ミクロスフェア。
［８］
以下の手続きを含む請求項１～７のいずれか１項に記載の生物磁気ミクロスフェアの調製方法：
（１）磁気ミクロスフェアＡを形成する前に、磁気ミクロスフェア本体の外表面にアミノ基を導入することにより、磁気ミクロスフェア本体に対し化学修飾を行う、
好ましい実施形態の一つでは、前記磁気ミクロスフェアに対する化学修飾は、シランカップリング剤を用いて行い、
（２）カルボキシル基とアミノ基との共有結合反応を用いることにより、前記磁気ミクロスフェアＡの外表面にアクリル酸分子を共有結合させ、炭素－炭素二重結合を導入して、磁気ミクロスフェアＢを形成する、
（３）架橋剤不存在下に、前記アクリルモノマー分子を前記炭素－炭素二重結合間の重合反応により重合させ、得られた線状ポリマーを磁気ミクロスフェアＢの外表面に共有結合させた後、固液分離を行い、液相を除去して磁気ミクロスフェアＣを得る、
前記官能基が特異的結合部位を含む場合、本方法は下記の手続きを含む：（４）磁気ミクロスフェアＣの線状ポリマーの分岐鎖に特異的結合部位を結合させる、
好ましい実施形態の一つでは前記アクリルモノマー分子は、アクリル酸ナトリウムモノマー分子である。
［９］
以下の手続きを含む請求項［１］１～［７］のいずれかの調製方法：
（Ｉ）磁気ミクロスフェアＢを形成する前に、トリメトキシシラン化されたアクリル分子を用いて、磁気ミクロスフェア本体に化学修飾を行い、磁気ミクロスフェア本体の外表面に炭素－炭素二重結合を導入する、
前記トリメトキシシラン化されたアクリル分子は、好ましくはγ―メタクリロキシプロピルトリメトキシシランであり、
（ＩＩ）架橋剤の不存在下で、アクリルモノマー分子を炭素－炭素二重結合間の重合反応により重合させ、得られた線状ポリマーを磁気ミクロスフェアＢの外表面に共有結合させた後、固液分離を行い、液相を除去して磁気ミクロスフェアＣを得る、
前記官能基が前記特定の結合部位を含む場合、前記方法は、さらに下記の手続きを含む：
（４）磁気ミクロスフェアＣの線状ポリマーの分岐鎖に特異的な結合部位を結合させる、
好ましい実施形態の一つでは、前記アクリルモノマー分子は、アクリル酸ナトリウムモノマー分子である。
［１０］
（４）磁気ミクロスフェアＣにトリカルボキシルアミンを結合させた後、トリカルボキシルアミンの残基の３つのカルボキシル基にＮｉ _２ ^＋ を複合化させて、磁気ミクロスフェアＤ、すなわち、目的生物磁気ミクロスフェアを得るステップをさらに含み、ここで、目的生物磁気ミクロスフェアは、Ｈｉｓタグの標識に特異的に結合することができる［８］または［９］の調製方法。
［１１］
トリカルボキシルアミンがＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンであり、前記Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンの量が、好ましくは０．５ｇ／Ｌから５５０ｇ／Ｌまでの範囲内にある、［１０］の調製方法。
［１２］
前記ステップ（２）で磁気ミクロスフェアＡを調製するためのアクリル酸の量が、０．００２ｍｏｌ／Ｌから２０ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内にあり、前記ステップ（３）で磁気ミクロスフェアＢを調製するためのアクリル酸ナトリウムの量が、０．５３ｍｏｌ／Ｌから１２．７６ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内にある［８］～［１１］のいずれかの調製方法。
［１３］
（１）生物磁気ミクロスフェアに結合緩衝液を加えてよく混合し、前記生物磁気ミクロスフェアを磁気的に分離し、分離した生物磁気ミクロスフェアを分離すべきタンパク質を含む溶液に加えてよく混合し、その中でインキュベートして、標的タンパク質が結合した生物磁気ミクロスフェアＥを得る、
（２）上澄みを除去する前に固液分離を行い、生物磁気ミクロスフェアＥを洗浄液で洗浄し、生物磁気ミクロスフェアＥを溶出液で溶出させ、上澄みを回収する、
（３）上澄みから標的タンパク質を分離および精製する手続きを含む、［１］～［７］のいずれかの分離方法。
［１４］
タンパク質の分離および精製、免疫学的検定、標的抗体薬の濃縮、標的ドラックデリバリー、核酸の分離および抽出、細胞選別、酵素の固定化、遺伝子ベクター構築などを含む、［１］～［７］のいずれかの生物磁気ミクロスフェアの複数の用途。

Claims (20)

1. 生物磁気ミクロスフェアであって、
   前記生物磁気ミクロスフェアの磁気ミクロスフェア本体の外表面は、分岐鎖を有する少なくとも１種の線状ポリマーを有し、
   前記分岐鎖を有する線状ポリマーの一端は、前記磁気ミクロスフェア本体の外表面に共有結合しており、
   前記一端を除く他の部分は前記磁気ミクロスフェア本体の外表面で自由であり、前記線状ポリマーのバックボーンはポリオレフィンバックボーンであり、前記線状ポリマーの分岐鎖は官能基を含み、前記官能基は標的物に結合可能である、生物磁気ミクロスフェア。
2. 前記線状ポリマーが、アクリル酸、アクリレート、アクリル酸エステル、メタクリレート、メタクリル酸エステル、複数のその他のアクリル系モノマー、およびそれらの組合せを含む群から選択される１種の重合により得られたものである、請求項１に記載の生物磁気ミクロスフェア。
3. 前記官能基は特異的結合部位を含み、前記特異的結合部位は前記標的物に特異的に結合できる、請求項１に記載の生物磁気ミクロスフェア。
4. 前記特異的結合部位はニッケルイオンであり、前記ニッケルイオンは、Ｈｉｓタグの標識に特異的に結合することができる、請求項３に記載の生物磁気ミクロスフェア。
5. 前記線状ポリマーの前記官能基が、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、及びそれらの組合せを含む群から選択される１種である、請求項１に記載の生物磁気ミクロスフェア。
6. 前記線状ポリマーが、前記磁気ミクロスフェア本体の外表面に直接固定されている、また連結基を介して磁気ミクロスフェア本体の外表面に間接的に固定されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の生物磁気ミクロスフェア。
7. 前記磁気ミクロスフェア本体がＳｉＯ_２被覆磁気粒子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の生物磁気ミクロスフェア。
8. 前記磁気粒子は、鉄化合物、鉄合金、酸化亜鉛、酸化マンガン混合物、酸化ガドリニウム混合物、コバルト化合物、ニッケル化合物、ニッケル合金、酸化マンガン、マンガン合金、酸化亜鉛、酸化ガドリニウム、酸化クロム、およびこれらの組合せを含む群から選択される１種を含む化学成分を有する、または
   前記磁気粒子は、酸化鉄、酸化亜鉛、酸化マンガン混合物、酸化ガドリニウム混合物、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化マンガン、酸化亜鉛、酸化ガドリニウム、酸化クロム、およびこれらの組合せを含む群から選択される１種を含む化学成分を有する、または
   前記磁気粒子は、酸化鉄、鉄、コバルト、Ｃｏ ^２＋ 、窒化鉄、Ｍｎ_３Ｏ_４、ＧｄＯ、ニッケル、Ｎｉ ^２＋ 、およびこれらの組合せからなる群から選択された一つを含む化学成分を有する、または
   前記磁気粒子は、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ―Ｆｅ_２Ｏ_３、およびこれらの組合せからなる群から選択された一つを含む化学成分を有する、または
   前記磁気粒子は、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３、窒化鉄、Ｍｎ_３Ｏ_４、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＭｏ、ＦｅＡｌＣ、ＡｌＮｉ（Ｃｏ）、ＦｅＣｒＣｏ、ＲｅＣｏ、ＲｅＦｅ、ＰｔＣｏ、ＭｎＡｌＣ、ＣｕＮｉＦｅ、ＡｌＭｎＡｇ、ＭｎＢｉ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉ、ＦｅＡｌ、ＦｅＮｉ（Ｍｏ）、ＦｅＳｉＡｌ、ＢａＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＳｒＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＰｂＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＧｄＯ、およびこれらの組合せからなる群から選択される１種を含む化学成分を有し、ここでＲｅは希土類元素であるレニウムである、請求項７に記載の生物磁気ミクロスフェア。
9. 以下の手続きを含む請求項１～８のいずれか１項に記載の生物磁気ミクロスフェアの調製方法：
   （１）磁気ミクロスフェアＡを形成する前に、磁気ミクロスフェア本体の外表面にアミノ基を導入することにより、磁気ミクロスフェア本体に対し化学修飾を行う、
   （２）カルボキシル基とアミノ基との共有結合反応を用いることにより、前記磁気ミクロスフェアＡの外表面にアクリル酸分子を共有結合させ、炭素－炭素二重結合を導入して、磁気ミクロスフェアＢを形成する、
   （３）架橋剤不存在下に、アクリルモノマー分子を前記炭素－炭素二重結合間の重合反応により重合させ、得られた線状ポリマーを磁気ミクロスフェアＢの外表面に共有結合させた後、固液分離を行い、液相を除去して磁気ミクロスフェアＣを得る。
10. 前記磁気ミクロスフェア本体に対する化学修飾は、シランカップリング剤を用いて行う、請求項９に記載の生物磁気ミクロスフェアの調製方法。
11. 以下の手続きを含む請求項１～８のいずれか１項に記載の生物磁気ミクロスフェアの調製方法：
    （Ｉ）磁気ミクロスフェアＢを形成する前に、トリメトキシシラン化されたアクリル分子を用いて、磁気ミクロスフェア本体に化学修飾を行い、磁気ミクロスフェア本体の外表面に炭素－炭素二重結合を導入する、
    （ＩＩ）架橋剤の不存在下で、アクリルモノマー分子を炭素－炭素二重結合間の重合反応により重合させ、得られた線状ポリマーを磁気ミクロスフェアＢの外表面に共有結合させた後、固液分離を行い、液相を除去して磁気ミクロスフェアＣを得る。
12. 前記トリメトキシシラン化されたアクリル分子は、γ―メタクリロキシプロピルトリメトキシシランである、請求項１１に記載の調製方法。
13. 前記アクリルモノマー分子は、アクリル酸ナトリウムモノマー分子である、請求項９または１１に記載の調製方法。
14. 前記官能基が特異的結合部位を含み、前記方法は、さらに下記の手続きを含む：（４）磁気ミクロスフェアＣの線状ポリマーの分岐鎖に前記特異的結合部位を結合させる、請求項９または１１に記載の調製方法。
15. 手続き（４）の特異的操作方法は、次の通りである：磁気ミクロスフェアＣにトリカルボキシルアミンを結合させた後、トリカルボキシルアミンの残基の３つのカルボキシル基にＮｉ ^２＋ を複合化させて、磁気ミクロスフェアＤ、すなわち、目的生物磁気ミクロスフェアを得る、ここで、目的生物磁気ミクロスフェアは、Ｈｉｓタグの標識に特異的に結合することができる請求項１４に記載の調製方法。
16. トリカルボキシルアミンがＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンである、請求項１５に記載の調製方法。
17. 前記Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リジンの量は、０．５ｇ／Ｌから５５０ｇ／Ｌまでの範囲内にある、請求項１６に記載の調製方法。
18. 前記（２）のステップで磁気ミクロスフェアＢを調製するためのアクリル酸の量が、０．００２ｍｏｌ／Ｌから２０ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内にあり、前記（３）のステップで磁気ミクロスフェアＣを調製するためのアクリルモノマー分子がアクリル酸ナトリウムモノマー分子であり、アクリル酸ナトリウムの量が、０．５３ｍｏｌ／Ｌから１２．７６ｍｏｌ／Ｌまでの範囲内にある請求項９または１０に記載の調製方法。
19. 請求項１～８のいずれか１項に記載の生物磁気ミクロスフェアを用いてタンパク質を分離する方法であって、
    （１）生物磁気ミクロスフェアに結合緩衝液を加えてよく混合し、前記生物磁気ミクロスフェアを磁気的に分離し、分離した前記生物磁気ミクロスフェアを分離すべきタンパク質を含む溶液に加えてよく混合し、その中でインキュベートして、標的タンパク質が結合した生物磁気ミクロスフェアＥを含む懸濁液を得る、
    （２）前記標的タンパク質が結合した前記生物磁気ミクロスフェアＥを含む前記懸濁液の固液分離を行い、前記固液分離で発生した液相を除去し、前記生物磁気ミクロスフェアＥを洗浄液で洗浄し、前記生物磁気ミクロスフェアＥに結合した前記標的タンパク質を溶出液で溶出させて前記標的タンパク質を含む上澄みを得、前記上澄みを回収する、
    （３）前記上澄みから前記標的タンパク質を分離および精製する手続きを含む。
20. タンパク質の分離および精製、免疫学的検定、標的抗体薬の濃縮、標的ドラックデリバリー、核酸の分離および抽出、細胞選別、酵素の固定化、および／または遺伝子ベクター構築における、請求項１～８のいずれか１項に記載の生物磁気ミクロスフェアの使用。

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