KR20220024866A - 생체자기 마이크로스피어와 그 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents

생체자기 마이크로스피어와 그 제조 방법 및 사용 방법 Download PDF

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정 장
지 수
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Abstract

생체자기 마이크로스피어 및 그 제조 방법 및 단백질 분리 및 정제 방법. 생체자기 마이크로스피어의 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면은 분지쇄를 갖는 하나 이상의 선형 중합체를 갖고; 분지쇄를 갖는 선형 중합체의 일단은 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 공유 결합으로 커플링 되고, 다른 부분은 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 자유로우며; 선형 중합체의 백본은 폴리올레핀 백본이며, 선형 중합체의 백본 형성 과정에서 가교제가 필요하지 않다. 제조된 생체자기 마이크로스피어는 표적 단백질의 효율적인 용출을 구현하고 표적 단백질의 체류 시간 및 체류율을 효과적으로 줄일 수 있으며 조작이 쉽고 널리 사용된다.

Description

생체자기 마이크로스피어와 그 제조 방법 및 사용 방법
본 출원은 2019년 6월 21일에 출원된 중국 특허 출원 번호 CN 2019105401326에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생체자기 마이크로스피어와 이의 제조방법 및 생체자기 마이크로스피어를 이용한 단백질 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.
단백질 분리 및 정제는 바이오 의약품의 제조, 생물학적 단백질 분자의 검출 및 진단, 단백질 구조 분석 등 다양한 분야에서 널리 이용되고 있다. 종래 기술에서, 단백질 분리 및 정제를 위해 일반적으로 사용되는 다수의 기술은 니켈 컬럼, 단백질 A 컬럼, 비오틴 컬럼 등을 포함한다. 니켈 컬럼 기술에서 히스티딘 태그 단백질은 캐리어에 고정된 니켈 이온에 의해 혼합 시스템에서 분리될 수 있다. 이 단계에서 일반적으로 사용되는 캐리어는 아가로스 겔이다. 겔 물질의 3차원 다공성 구조는 물질의 비표면적 증가를 촉진하여 니켈 이온을 고정시키는 부위를 증가시키고 표적 단백질에 대한 결합능을 향상시킨다.
물질의 3차원 다공성 구조 덕분에 복수의 표적 단백질 결합 부위의 수를 크게 증가시킬 수 있지만, 물질 내부의 다공성 구조는 또한 단백질이 용출될 때 단백질의 체류 시간을 증가시킬 수 있고, 그리고 물질 내부의 다수의 불연속 공간 또는 사각 모서리(dead corner)는 단백질이 물질 내부로부터 용출되는 것을 방지하여 체류율을 증가시킨다. 표적 단백질 결합 부위가 물질의 외부 표면에만 고정되어 있으면 표적 단백질이 물질 내부로 들어가는 것을 방지할 수 있으므로 용출공정 중 표적 단백질의 체류 시간 및 체류율을 크게 줄일 수 있다. 그러나 물질의 외부 표면만 사용하면 물질의 비표면적이 크게 줄어들고 표적 단백질 결합 부위의 수도 크게 감소한다.
중합체는 복수의 단량체 분자의 중합에 의해 얻어지는 거대분자 화합물이다. 중합 후 활성 부위를 갖는 단량체 분자는 수득된 중합체가 많은 활성 부위를 가질 수 있게 하여 활성 부위의 수를 증가시킬 수 있다. 활성 부위에 의해 복수의 상응하는 결합 부위가 추가로 커플링될 수 있다. 분자 사슬이 가교되어 네트워크 구조를 형성하는 중합체, 단일 선형 분자 사슬을 갖는 중합체, 많은 분지쇄를 갖는 중합체 등 많은 유형의 중합체가 있다. 다른 유형의 중합체는 각각 다른 분야에서 다양한 응용 분야를 가지고 있다.
본 발명은 생체자기 마이크로스피어 및 이의 제조 방법 및 생체자기 마이크로스피어를 이용한 단백질 분리 및 정제 방법을 제공한다. 생체자기 마이크로스피어는 기능화 된 자성 마이크로스피어며, 표적 단백질의 분리 및 정제는 자성 마이크로스피어의 외부 표면만을 사용하여 수행되며; 자성 마이크로스피어의 외부 표면은 분지쇄를 갖는 선형 중합체로 변형되어 표적 단백질의 고효율 및 고속 결합을 달성하는 동시에, 용출공정 중의 표적 단백질의 체류 시간 및 체류율을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
제1측면에 따르면, 본 발명은 생체자기 마이크로스피어를 제공하며, 여기서 생체자기 마이크로스피어는 자성 마이크로스피어 본체를 갖고, 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면은 분지쇄를 갖는 하나 이상의 선형 중합체를 갖고; 분지쇄를 갖는 선형 중합체의 일단은 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 공유 결합되고, 선형 중합체의 백본은 폴리올레핀 백본이고, 선형 중합체의 분지쇄는 작용기를 함유하고, 작용기는 표적물에 바인딩할 수 있다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 선형 중합체는 아크릴산, 아크릴레이트, 아크릴 에스테르, 메타크릴산, 메타크릴레이트, 메타크릴 에스테르, 기타 아크릴 단량체, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 하나의 중합에 의해 수득되고; 바람직하게는, 선형 중합체의 백본 형성 과정에서 가교제가 필요하지 않다.
선형 중합체의 분지쇄에는 작용기가 포함되어 있으며 이 작용기는 표적물에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 선형 중합체의 분지쇄는 특이적 결합 부위(즉, 작용기가 특이적 결합 부위임)를 포함하고, 특이적 결합 부위는 표적물에 특이적으로 결합할 수 있다.
보다 바람직하게는, 특이적 결합 부위는 니켈 이온이고, 니켈 이온은 His 태그의 표지에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 선형 중합체의 작용기는 카르복실, 히드록실, 아미노, 메르캅토(sulfhydryl), 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나이다.
바람직한 구체예 중 하나에서, 선형 중합체는 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 직접 고정되거나 링킹그룹을 통해 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 간접적으로 고정된다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 자성 마이크로스피어는 SiO2 코팅된 자성 입자이다.
바람직한 구체예 중 하나에서, 자성 입자는 철 화합물, 철 합금, 산화아연, 산화망간 혼합물, 산화가돌리늄 혼합물, 코발트 화합물, 니켈 화합물, 니켈 합금, 산화망간, 망간 합금, 산화아연, 산화가돌리늄, 산화크롬 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 화학 성분을 갖는다.
바람직한 구체예 중 하나에서, 자성 입자는 산화철, 산화아연, 산화망간 혼합물, 산화가돌리늄 혼합물, 산화코발트, 산화니켈, 산화망간, 산화아연, 산화가돌리늄, 산화크롬 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 화학 성분을 갖는다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 자성 입자는 산화철, 철, 코발트, Co2+, 질화철, Mn3O4, GdO, 니켈, Ni2+ 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 화학 성분; 여기서, 산화철은 바람직하게는 Fe3O4, γ-Fe2O3, 또는 이들의 조합이다.
바람직한 실시양태 중 다른 하나에서, 자성 입자는 Fe3O4, γ-Fe2O3, 질화철, Mn3O4, AlNi(Co), FeCr(Co), FeCrMo, FeAlC, AlNi(Co), FeCrCo, ReCo, ReFe, PtCo, MnAlC, CuNiFe, AlMnAg, MnBi, FeNi(Mo), FeSi, FeAl, FeNi(Mo), FeSiAl, BaO·6Fe2O3, SrO·6Fe2O3, PbO·6Fe2O3, GdO 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나를 포함하는 화학 성분을 갖고; 여기서 Re는 희토류 원소인 레늄이다.
제2측면에 따르면, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 본 발명의 제1측면에 따른 생체자기 마이크로스피어의 제조방법을 제공한다:
(1) 자성 마이크로스피어 A를 형성하기 전에 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노기를 도입함으로써 자성 마이크로스피어 본체에 화학적 개질을 수행하는 단계;
바람직한 실시예 중 하나에서, 자성 마이크로스피어 본체에 대한 화학적 변형은 실란 커플링제로 수행된다;
(2) 카르복실기와 아미노기 사이의 공유 반응을 이용하여 자성 마이크로스피어 A의 외부 표면에 아크릴산 분자를 공유 결합으로 커플링하고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하고 자성 마이크로스피어 B를 형성하는 단계;
(3) 가교제 없이, 얻어진 선형 중합체가 자성 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유 결합으로 커플링된 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응에 의해 아크릴계 단량체 분자를 중합시킨 후, 고-액 분리를 수행하고 액체상을 제거하여 자성 마이크로스피어 C를 얻는 단계;
상기 작용기가 특이적 결합 부위를 포함하는 경우, 상기 방법은 (4) 자성 마이크로스피어 C의 선형 중합체의 분지쇄에서 특이적 결합 부위를 커플링시키는 단계를 더 포함하고;
바람직한 실시예 중 하나에서, 아크릴 단량체 분자는 나트륨 아크릴레이트 단량체 분자이다.
전술한 단계 (1) 및 (2)는 다음 단계 (I)로 결합될 수 있다: (I) 트리메톡시실란화 아크릴 분자를 채택하여 자성 마이크로스피어 본체에 화학적 개질을 수행하고, 탄소-탄소 이중 결합을 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 도입한 후 자성 마이크로스피어 B를 형성한다.
트리메톡시실란화된 아크릴 분자는, 예를 들어, γ-메타크릴옥시 프로필 트리메톡실 실란(KH570 아실옥시실란, CAS: 2530-85-0)일 수 있다.
바람직한 실시예 중 하나에서, 자성 마이크로스피어 C의 선형 중합체의 분지쇄는 니켈 이온을 함유한다. 본 실시예에서, 상기 방법은 (4) 트리카르복실산 아민의 잔기에 있는 3개의 카르복실기와 Ni2+를 착화하여 자성 마이크로스피어 D, 즉, 표적 생체자기 마이크로스피어를 얻기 전에, 자성 마이크로스피어 C에 트리카르복실산 아민을 커플링시키는 단계;를 더 포함하고, 여기서 표적 생체자기 마이크로스피어는 His 태그의 표지에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시예 중 하나에서, 트리카르복실산 아민은 N,N-비스(카르복시메틸)-L-리신이고, N,N-비스(카르복시메틸)-L-리신의 양은 바람직하게는 0.5 g/L 내지 550g/L.이다.
바람직한 실시예 중 하나에서, 단계 (2)에서 자성 마이크로스피어 A의 제조를 위한 아크릴산의 양은 0.002 mol/L 내지 20 mol/L이다.
바람직한 실시예 중 하나에서, 단계 (3)에서 자성 마이크로스피어 B의 제조를 위한 아크릴산나트륨의 양은 0.53 mol/L 내지 12.76 mol/L이다.
제3측면에 따르면, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 본 발명의 제1측면에 따른 생체자기 마이크로스피어를 이용한 단백질 분리방법을 제공한다:
(1) 생체자기 마이크로스피어에 결합 완충액을 첨가하여 잘 혼합하고, 생체자기 마이크로스피어를 자기적으로 분리하고, 분리된 생체자기 마이크로스피어를 분리하고자 하는 단백질이 포함된 용액에 첨가한 후 잘 혼합하고 배양하여 표적 단백질이 결합하는 생체자기 마이크로스피어 E를 얻는 단계;
(2) 상등액을 제거하기 전에 고액 분리를 수행하고, 생체자기 마이크로스피어 E를 세척액으로 세척하고, 생체 마이크로스피어 E를 용리제로 용리하여 상등액을 수집하는 단계;
(3) 상등액으로부터 타겟 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
제4측면에 따르면, 본 발명은 단백질 분리 및 정제, 면역분석, 표적 항체 약물 농축, 표적 약물 전달, 핵산 분리 및 추출, 세포 분류, 효소 고정화, 유전자 벡터 구성 등을 포함하는, 본 발명의 제1측면에 따른 생체자기 마이크로스피어의 다양한 응용을 제공한다.
본 발명의 다수의 주요 이점 및 유익한 효과는 다음과 같다:
(1) 제조된 생체자기 마이크로스피어는 혼합 시스템에서 생체자기 마이크로스피어로 많은 양의 표적 단백질을 효율적으로 포획하여 표적 단백질의 고속 결합을 달성할 수 있다;
(2) 제조된 생체자기 마이크로스피어는 표적 단백질의 효율적인 용출을 구현하고 용출 과정에서 표적 단백질의 체류 시간 및 체류율을 효과적으로 감소시킬 수 있다;
(3) 제조된 생체자기 마이크로스피어의 조작 및 사용이 용이하다. 특히, 작은 자석 조각을 이용하여 간단하게 생체자기 마이크로스피어의 위치 및 응집 상태를 효율적으로 제어할 수 있고, 용액 내 생체자기 마이크로스피어의 신속한 분산 및 응집을 달성하여, 고속 원심분리기와 같은 값비싼 대규모 실험 설비 없이, 단백질 분리 및 정제를 보다 용이하고 더 빠르게 할 수 있다;
(4) 제조된 생체자기 마이크로스피어는 면역분석법, His-tagged 단백질과 같은 표적 단백질의 신속한 분리 및 정제, 표적 항체 약물 농축, 표적 약물 전달, 핵산 분리 및 추출, 세포 분류, 효소 고정화, 유전자 벡터 구축을 포함하여 널리 사용될 수 있다;
(5) 자성 마이크로스피어 본체의 치수를 조절하고 본 발명에 따른 자성 마이크로스피어의 표면에 수용성이 다른 다수의 중합체를 결합하여, 제조된 자성 마이크로스피어의 수용성, 용액 내 크기, 현탁 특성 등의 복수의 특성을 조절할 수 있다;
(6) 본 발명에 의해 제공되는 생체자기 마이크로스피어는 침강되기 전에 2일 이상 유지하면서 수성 액체에 안정적으로 현탁될 수 있다. 또한, 생체자기 마이크로스피어는 지속적인 교반 없이 수성 액체 시스템에서 안정적으로 현탁될 수 있으며, 이는 독특한 구조 설계로 인한 우수한 성능이다. 한편으로는, 자성 마이크로스피어 본체의 크기는 10 미크론 미만, 또는 심지어 1 미크론 미만이 되도록 배치될 수 있으며; 다른 한편으로는, 자성 마이크로스피어 본체의 외면에 친수성 중합체를 코팅하고, 자성 마이크로스피어 본체의 외면에 중합체의 그래프트 밀도를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 친수성, 구조 유형, 유체역학적 반경, 사슬 길이, 분지쇄 수, 분지쇄 길이 등을 포함하는 복수의 특성을 조정하여, 시스템에서 생체자기 마이크로스피어의 현탁 상태를 보다 잘 제어할 수 있다.
그림 1은 SDS-PAGE를 사용한 전기영동 검출의 다이어그램을 나타낸다. 왼쪽 및 오른쪽의 이미지는 각각 본 발명의 생체자기 마이크로스피어(즉, 니켈 자성 비드, KM 자성 비드라고도 함)와 대조군(대조군 니켈 비드)의 마이크로스피어의 두 가지 정제 결과 사이의 비교를 보여준다.
도 2는 폴리아크릴산 자성 비드와 KM 자성 비드로 처리 전과 후의 IVTT 반응 용액의 RFU 값의 차이를 비교한 것이다(차이는 IVTT 반응 용액의 RFU 값에서 유동 용액(flow-through solution)의 RFU 값을 뺀 값이다). 그룹 A와 B는 서로 다른 조건에서 합성된 두 종류의 폴리아크릴산 자성 비드에 대응된다. 그룹 B는 KM 자성 비드의 합성 방법에 따라 제조된다. 그룹 A의 합성 과정에서 용액 X와 용액 Y는 수상으로 대체된다. 횡좌표에 있는 라벨의 부피(2μL, 20μL)는 각각 2μL 자성 비드 및 20μL 자성 비드를 나타내는 자성 비드의 양에 해당한다.
도 3은 KH570 변형 경로로 제조된 폴리아크릴산 자성 비드의 RFU 값(IVTT 반응 용액의 RFU 값에서 유동 용액의 RFU 값을 뺀 값)과 IVTT 반응 용액의 RFU 값을 비교한 것이다. .
그림 4는 소듐 폴리아크릴레이트 자성 비드(B-KM 자성 비드, 191220-ZZ-1)의 순도 테스트 전기 영동 다이어그램을 나타내고, 여기서 100%는 희석되지 않은 순수한 IVTT 반응 용액을 의미하며; 60%는 순수한 IVTT 반응 용액의 60%(부피 기준)에 희석제 40%(부피 기준)를 혼합한 것을 의미한다.
그림 5는 SiO2 코팅된 자성 마이크로스피어의 도립현미경 사진을 보여준다. (A) 정적 상태에서 직경 1μm; (B) 흐르는 상태에서 직경 1 μm; (C) 직경 10μm; (D) 직경 100μm. 그림 (A) 및 (B)의 각 축척은 10μm이다. 도면 (C) 및 (D)의 각 눈금은 100μm이다.
도 6은 1μm 및 10μm 자성 마이크로스피어로 제조한 KM 자성 비드(니켈 자성 비드)의 정제 효과를 비교한 것이다. 여기서, PC는 정제될 1차 용액(IVTT 반응 용액, 1mL 반응 시스템)에 해당하고; Ni1 자성 비드와 Ni10 자성 비드는 각각 1μm 및 10μm 자성 마이크로스피어를 사용하며; 10 μL, 5 μL 및 1 μL은 각각 사용된 니켈 자성 비드의 부피에 해당한다.
도 7은 1 μm 및 100 μm 자성 마이크로스피어로 제조된 KM 자성 비드(니켈 자성 비드)의 정제 효과를 비교한 것이다. 여기서, PC는 정제될 1차 용액(IVTT 반응 용액, 1mL 반응 시스템)에 해당하고; Ni1 자성 비드와 Ni100 자성 비드는 각각 1μm 및 100μm 자성 마이크로스피어를 사용하며; 10 μL, 5 μL 및 1 μL은 각각 사용된 니켈 자성 비드의 부피에 해당한다.
본 발명은 구체적인 실시예 및 실시예와 함께 하기에 추가로 예시될 것이다. 이들 실시예 및 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적으로 설명된 조건이 없는 실험 방법과 관련하여, 바람직하게는 위에서 설명된 특정 실시예에 의해 안내된 조건을 따르고 참조할 수 있으며 Sambrook et.al, Molecular Cloning에 설명된 조건과 같은 통상적인 조건을 따를 수 있다: 실험실 매뉴얼(뉴욕: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), "무세포 단백질 합성을 위한 실험실 매뉴얼", "Alexander S. Spirin 및 James R. Swartz 편집. 무세포 단백질 합성: 방법 및 프로토콜[M]. 2008” 또는 제조업체가 권장하는 조건을 따른다.
다른 언급이 없는 한, 본 발명에서 백분율 및 부분은 각각 중량 백분율 및 중량 부분을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시예에 사용된 물질 및 시약은 모두 시판되는 제품이다. 달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 온도는 섭씨 온도(℃)로 제공된다.
용어
물질에는 분자, 분자 집합체, 분자 접합체, 분자 복합체 및 기타 형태가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
표적은 본 발명의 생체자기 마이크로스피어에 의해 결합되는 물질, 바람직하게는 생체분자 또는 생리활성 물질을 의미한다. 예를 들어, 여기에는 단백질(예: 항체, 항원, 항생제, 인터루킨 등), 단백질 복합체, 단백질 접합체(예: 당단백질), 핵산 분자(예: DNA, RNA 등), 단백질 및 핵산 접합체 또는 복합체, 바이러스, 세포, 리포솜, 소포 및 기타 물질들이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 생체자기 마이크로스피어는 선형 중합체의 분지쇄에 포함된 작용기를 통해 표적과 결합함으로써 표적의 분리 및 정제를 달성할 수 있다. 본 발명에서 표적은 바람직하게는 단백질 물질이다. 단백질 물질은 예를 들어 단백질 복합체, 단백질 접합체, 단백질 및 핵산 접합체 또는 복합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 구조를 포함하는 단백질 또는 물질일 수 있다. 단백질 접합체는 공유 결합, 동적 공유 결합, 초분자력(예: 수소 결합) 및 기타 수단에 의해 형성된다. 단백질 복합체는 복합체 형성에 의해 형성된다.
표적 단백질 및 단백질의 표적은 단백질 물질을 의미한다.
His 태그가 붙은 라벨은 표적으로 사용할 수 있으며, His 태그(히스티딘 태그)를 가지고 있는 물질을 의미하고; His 태그의 운반은 표적이 His에 의해 포착될 때 His 태그와 표지된 부분 사이의 연결이 안정적인 한, 공유 결합, 동적 공유 결합, 초분자 상호작용을 포함하지만 이에 국한되지 않는 연결 방법에 의해 달성될 수 있고, 태그 및 His 태그가 지정된 레이블은 캡처 프로세스 동안 전체적으로 안정적으로 존재할 수 있다.
본 발명에서 단백질과 단백질들은 동일한 의미를 가지며 혼용될 수 있다. 융합 단백질도 일종의 단백질이다. 넓은 의미에서, 본 발명의 단백질은 폴리펩티드를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한(예를 들어, 특정 서열을 명시하는) 본 발명에 관련된 임의의 단백질은 이의 유도체도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
단백질 유도체: 단백질 유도체는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이, 적어도 C-말단 태그, N-말단 태그, C-말단 및 N-말단 태그를 적어도 포함하며, 여기서 C-말단은 COOH-말단을 나타내고 N-말단은 NH2-말단을 나타낸다. 태그는 폴리펩티드 태그 또는 단백질 태그일 수 있다. 단백질 유도체는 또한 염 형태, 착물, 에스테르 화합물, 치환 생성물 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 화학적 변형 방법으로부터의 생성물을 포함할 수 있다. 화학적 변형 방법은, 예를 들어 이온화, 염수화, 탈염, 착화, 탈복합화, 탈착물화, 킬레이트화, 탈킬레이트화, 부가 반응, 치환 반응, 제거 반응, 삽입 반응, 산화 반응, 환원 반응, 번역 후 변형 등을 포함한다. 특히, 상기 방법은, 예를 들어, 산화, 환원, 메틸화, 탈메틸화, 아민화, 카르복실화 및 가황(vulcanization)을 포함한다.
강하게 자화될 수 있는 작은 입자 크기를 갖는 자성 마이크로스피어 또는 마이크로스피어는 또한 자성 비드로 설명될 수 있다. 바람직하게는 0.1㎛ 내지 1000㎛ 범위의 직경을 갖는다.
자성 마이크로스피어 본체: SiO2 코팅된 Fe3O4 입자와 같은 SiO2 코팅된 자성 입자.
자성 마이크로스피어 A: 아미노 변형된 자성 마이크로스피어.
자성 마이크로스피어 B: 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 자성 마이크로스피어.
자성 마이크로스피어 C: 아크릴 중합체에 의해 변형된 자성 마이크로스피어.
자성 마이크로스피어 D: 자성 마이크로스피어 C를 사용하여 얻은 니켈 이온과 복합된 생체자기 마이크로스피어.
자성 마이크로스피어 E: 자성 마이크로스피어 D가 표적(예: 단백질), 즉 포획된 물질을 포함하는 자성 마이크로스피어와 결합된 생성물.
KM 자성 비드: 아크릴산 나트륨을 단량체 분자로 사용하여 중합 반응에 의해 얻은 폴리아크릴산 나트륨 자성 비드. 폴리아크릴산나트륨 자성 비드는 실시예에서 부분적으로 합성된 폴리아크릴산 자성비드의 기본 구조와 일치하는 기본 구조를 갖는다. 폴리아크릴산 자성 비드를 제조할 때 중합을 위한 단량체 분자로 아크릴산이 사용된다.
선형 중합체와 선형 중합체들은 동일한 의미를 가지며 혼용될 수 있다.
아크릴 중합체: -C(COO-)-C- 단위 구조를 갖는 단독 중합체 또는 공중합체를 말한다. 공중합체의 공중합 형태는 선형 백본 및 계량측기(a metered side group) COO-를 적절하게 제공할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 메틸 치환기(-CH3C(COO-)-C-에 해당)와 같은 다른 치환기는 중합 반응의 진행에 영향을 미치지 않는 한, 탄소-탄소 이중 결합에 존재할 수 있다. COO-는 -COOH 형태, 또는 염 형태(예: 나트륨 염), 또는 포르메이트 형태(바람직하게는, 메틸 포르메이트-COOCH3, 에틸 포르메이트-COOCH2CH3와 같은 알킬 포르메이트; 히드록시에틸 포르메이트-COOCH2CH2OH일 수도 있음)일 수 있다. -C(COO-)-C- 단위 구조의 구체적인 구조 형태는 -CH(COOH)-CH2-, -CH(COONa)-CH2-, -MeC(COOH)-CH2-, - MeC(COONa)-CH2-, -CH(COOCH3)-CH2-, -CH(COOCH2CH2OH)-CH2-, -MeC(COOCH3)-CH2-, -MeC(COOCH2CH2OH)-CH2-, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. Me는 메틸이다. 상기 단위 구조(호모폴리머에 해당) 중 하나만 또는 두 개 이상의 단위 구조(코폴리머에 해당)가 중합체 분자의 선형 백본에 존재할 수 있다.
아크릴계 단량체 분자: 위에서 언급한 아크릴계 중합체를 합성하는 데 사용할 수 있는 단량체 분자를 말하며, C(COO-)=C, 예를 들어 CH(COOH)=CH2, CH(COONa)=CH2, CH3C(COOH)=CH2, CH3C(COONa)=CH2, CH(COOCH3)=CH2, CH(COOCH2CH2OH)=CH2, CH3C(COOCH3)=CH2, CH3C(COOCH2CH2OH)=CH2 등의 기본 구조를 갖는다.
분지쇄: 분지쇄(branched chain)와 측쇄쇄(side branched chain)는 동일한 의미를 가지며 혼용될 수 있다. 본 발명에서 분지쇄는 선형 중합체의 백본에 결합된 측쇄 또는 측기를 의미한다. 분기 체인의 길이와 크기에 대한 특별한 요구 사항은 없다. 분지쇄는 예를 들면, 카르복실, 히드록실 및 아미노와 같은 짧은 분지쇄일 수 있거나, 원자수가 많은 긴 분지쇄일 수 있다. 분지쇄의 구조는 특별히 제한되지 않는다. 선형 또는 분지형 구조를 갖는 분지쇄일 수 있다. 분지쇄는 또한 추가 측쇄 또는 측기를 함유할 수 있다. 분지쇄의 구조적 특징, 예를 들어 개수, 길이, 크기, 재분지 정도 등은 선형 백본의 유연한 스윙이 이루어질 수 있도록 선택되어 네트워크 구조가 형성되지 않고 분지쇄가 쌓이지 않아 체류율(retention ratio) 이 증가하지 않는다. 백본의 분지쇄는 조정 가능한 거리로 서로 이격될 수 있다.
정제 매질(purification medium)은 표적을 특이적으로 포착하기 위해 사용되는 기능적 요소를 의미한다. 본 발명의 생체자기 마이크로스피어의 정제 매질은 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 결합된 선형 중합체의 분지쇄에 위치한다.
그룹: 단일 원자 또는 원자들의 그룹일 수 있으며, 자유 라디칼 형태일 수 있거나, 이온 형태일 수 있다.
중합체 분지쇄의 작용기: 반응 활성을 나타내거나 활성화 후 반응성 활성을 갖는 것이 특징이다. 다른 물질의 활성기와 직접 상호작용할 수 있거나 활성화된 후에 다른 물질의 활성기와 상호작용할 수 있어, 다른 물질이 중합체의 분지쇄에 결합된다. 중합체 분지쇄의 작용기의 바람직한 형태 중 하나는 특이적 결합 부위이다. 다른 물질은 정제 매질 또는 포획 대상이 될 수 있다.
결합: 공유 결합, 동적 공유 결합, 초분자 상호작용 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는 공유 또는 비공유 결합일 수 있다. 초분자 상호작용에는 수소 결합, 일부 특이적 결합 효과 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
특이적 결합 부위: 본 발명에서 특이적 결합 부위는 중합체의 분지쇄에서 결합 기능을 갖는 그룹 또는 구조적 부분을 의미한다. 그룹 또는 구조적 부분은 특정 표적의 특정 인식 또는 결합을 달성할 수 있다. 특이적 결합은 배위, 착화, 정전기력, 반 데르 발스 힘, 수소 결합, 공유 결합 등을 통해 달성될 수 있다.
세척액: 불순한 단백질과 같은 불순물을 용출; 용출 후, 불순한 단백질은 세척 용액으로 제거된다.
유동 용액(flow-through solution): 정제된 자성 비드로 배양하고 분리하여 얻은 투과액을 말한다. 용액에는 분리되지 않은 잔여 타겟이 포함되어 있다. 예를 들어, 유동 용액은 유동 용액 1, 유동 용액 2 및 유동 용액 3과 같이 친화성 컬럼에 첨가되어 컬럼을 관통하는 용액을 의미할 수 있으며, 이는 각각 컬럼을 처음으로 투과하는 용액, 컬럼을 통해 두 번째로 투과하는 용액, 및 컬럼을 통해 세 번째로 투과하는 용액을 나타낸다.
용리액: 표적 단백질을 용리한다; 용리 후, 표적 단백질은 용리액에 존재한다.
결합 능력: 예를 들어, 자성 마이크로스피어가 단백질에 결합하도록 하는 능력.
친화도: 농도 등급이 다른 기질 용액을 사용하여 자성 마이크로스피어가 기질의 50%만 결합하는 기질 농도를 나타낸다.
PNA: 펩타이드 핵산은 글리코실 포스페이트 백본이 폴리펩타이드 백본으로 대체된 DNA 유사체이다. 1980년대 덴마크의 유기화학자 Ole Buchardt와 생화학자 Peter Nielsen이 최초로 발명한 핵산서열 특이 시약이다. 1세대 및 2세대 안티센스 시약을 기반으로 컴퓨터 설계를 거쳐 최종적으로 인공적으로 합성되는 3세대 안티센스 시약이다. 이는 새로운 DNA 유사체이다. 특히, DNA에서 5탄당 포스포디에스테르 결합의 백본는 중성 펩티드 사슬 아미드 2-아미노에틸글리신 결합으로 대체되고, 나머지 구조는 DNA와 동일하다. PNA는 Watson-Crick 염기쌍을 통해 DNA 또는 RNA 서열을 인식하고 결합하여 안정적인 이중 나선 구조를 형성할 수 있다. PNA는 음전하가 없고 그와 DNA 또는 RNA 사이에 정전기적 반발이 발견되지 않기 때문에, 결합의 안정성과 특이성이 크게 향상된다; PNA-DNA 혼성화 또는 PNA-RNA 혼성화는 DNA-DNA 혼성화 또는 DNA-RNA 혼성화와 다르며, 전자는 혼성화 시스템의 염 농도에 거의 영향을 받지 않는다. 또한 PNA와 DNA 또는 RNA 분자의 혼성화 능력은 DNA/DNA 또는 DNA/RNA보다 훨씬 우수하다. 높은 혼성화 안정성, 특정 서열을 인식하는 능력이 우수하며, 뉴클레아제 및 프로테아제에 의해 가수분해되지 않는다. 또한 리간드와 연결되어 세포에 동시 형질감염될 수 있다. 위에서 언급한 장점은 다른 올리고뉴클레오티드에서는 불가능하다. 많은 DNA 분자가 가지고 있지 않은 위에서 언급한 이점의 관점에서, 지난 10년 동안 사람들은 많은 하이테크 분야에서 PNA의 응용을 발견했다.
eGFP: 강화된 녹색 형광 단백질.
RFU: 상대 형광 단위.
RLU: 상대 조명 단위.
용액 X: 2-모르폴린에탄설폰산(CAS: 4432-31-9)의 최종 농도가 0.01-1 mol/L이고 NaCl이 최종 농도가 0.1-2 mol/L인 수용액.
용액 Y: 최종 농도 0.0684 mol/L의 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 최종 농도 0.0316 mol/L의 인산이수소나트륨, 및 최종 농도 0.15 mol/L의 염화나트륨을 포함하는 수용액과 같은, pH 7.2-7.5의 PBS 완충액.
본 발명에서, "바람직하게(예를 들어, 바람직한, 바람직하게는, 바람직하게, 바람직하다 등)", "더 바람직하게는", "더 나은", "가장 바람직하게는" 및 기타 바람직한 실시예는 본 발명의 범위 및 실시예에 대한 임의의 제한을 부과하는 것이 아니라 일부 실시예를 제공하기 위해 기술된다.
본 발명의 설명 전반에 걸쳐, "바람직한 것 중 하나", "바람직한 실시예 중 하나", "바람직한 실시예 중 하나", "바람직한 실시예", "바람직한 실시예에서", "일부 바람직한 실시예에서", "바람직하게", "바람직하게", "더 바람직하게", "가장 바람직하게", "더욱 바람직하게" 및 기타 바람직한 방법 뿐만 아니라 "실시예 중 하나", "방법 중 하나", "예", "특정 예", "예를 들어", "예를 들어", "~와 같은" 및 기타 예시적인 열거 방법은 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 실시예에서 설명된 특정 특징은 본 발명의 적어도 하나의 실시예에 포함된다. 본 발명에서, 실시예에서 설명된 특정 특징은 임의의 적절한 방식으로 임의의 하나 또는 복수의 실시예에서 조합될 수 있다. 본 발명에서, 각각의 바람직한 실시예에 대한 기술적 솔루션은 또한 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
"광학적으로"는 본질적이지 않은 것을 의미하며, 이는 본 발명의 기술적 솔루션을 구현할 수 있는지 여부에 달려 있다. 본 발명에서 "광학 방식"은 본 발명의 기술적 솔루션에 적합하다면 본 발명을 구현하는데 사용될 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 "이들의 조합" 및 "이들의 임의의 조합"은 모두 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 전술한 목적물의 임의의 적절한 조합을 지칭한다. 상기 정의에서 다루는 범위는 "또는 이들의 조합", "또는 이들의 조합", "및 이들의 조합", "및 이들의 조합" 등과 같은 표현을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서, "그의 임의의 조합"은 조합의 수가 "1보다 큼"을 의미하고 적용 범위에서 다음 그룹을 나타낸다: "하나 또는 둘 이상으로 구성된 그룹".
본 발명에서, "하나 이상" 및 "적어도 하나", "이들의 조합", "또는 이들의 조합", "및 이들의 조합", "또는 이들의 임의의 조합", "및 이들의 임의의 조합"은 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용될 수 있고, "1" 또는 "1보다 큰" 양을 나타낸다.
본 발명에서, "또는/및", "및/또는"의 사용은 "이들 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합"을 의미하며, 또한 이들 중 적어도 하나를 의미한다.
본 발명에서, "보통", "통상적인", "일반적으로", "항상"이라는 용어로 기술된 선행 기술의 기술적 수단도 본 발명의 내용에 대한 참조로서 인용된다. 달리 명시되지 않는 한, 이들 용어에 의해 변형된 기술적 수단은 일부 기술적 특징의 바람직한 실시예 중 하나로 간주될 수 있다. 그러나, 그것들은 본 발명의 범위 및 범위를 제한하지 않는다는 점에 유의해야 한다.
IVTT 시스템: 시험관내 전사 및 번역 시스템은 외인성 DNA를 주형으로 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템(또는 시험관내 단백질 합성 시스템이라고 함)이다. 무세포 단백질 합성 시스템은 외인성 mRNA 또는 DNA를 단백질 합성의 주형으로 사용하여 단백질 합성에 필요한 기질 및 전사 및 번역 관련 단백질 인자의 첨가를 인공적으로 제어하여 표적 단백질의 합성을 달성할 수 있다. 본 발명의 무세포 단백질 합성 시스템은 특별히 제한되지 않으며, 효모 세포 추출물, 대장균 세포 추출물, 포유동물 세포 추출물, 식물 세포 추출물 또는 곤충 세포 추출물인 세포 추출물에 기초한 무세포 단백질 합성 시스템 중 하나 또는 임의의 조합일 수 있다. 본 발명의 시험관내 단백질 합성 시스템은 온전한 세포의 존재를 배제하지 않으며, 극소량 또는 소량의 온전한 세포가 그 안에 포함될 수 있지만, 바람직하게는 온전한 세포를 포함하지 않는다는 것에 유의해야 한다.
본 발명의 상기 언급된 기술적 특징 및 이하에 구체적으로 기술된 기술적 특징(예: 실시예)은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 서로 결합되어 새로운 또는 바람직한 기술적 해결책을 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 기술적 해결책이 달성될 수 있는 한. 간결함을 위해 여기에서 세부사항을 반복하지 않을 것이다.
제1측면에 따르면, 본 발명은 생체자기 마이크로스피어를 제공하며, 여기서 생체자기 마이크로스피어는 자성 마이크로스피어 본체를 갖고, 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면은 분지쇄를 갖는 하나 이상의 라이너 중합체를 갖고; 분지쇄를 갖는 선형 중합체의 한쪽 말단은 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 공유 결합으로 커플링되고 다른 부분은 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되며, 선형 중합체의 백본은 폴리올레핀 백본이고; 바람직하게는, 선형 중합체의 백본 형성 과정에서 가교제가 필요하지 않다.
선형 중합체는 적어도 하나의 선형 백본을 함유하고, 각각의 선형 백본은 작용기를 함유하는 적어도 3개의 분지쇄를 보유하며, 즉, 각각의 선형 백본은 적어도 3개의 기능화된 분지쇄를 보유하고; 선형 중합체는 3개 이상의 작용기를 함유한다. 본 실시예에서 중합체는 선형 백본의 높은 유연성을 가질 뿐만 아니라, 분지쇄 수를 고배율로 하는 장점이 있어, 고속 및 고처리량의 결합, 및 효율적이고 높은 비율(높은 수율)의 분리가 달성될 수 있다.
자성 마이크로스피어 본체를 구성하기 위해서는, 자성 입자를 선택하고 자성 입자를 실리카로 코팅하는 것이 바람직하다. 자성 입자는 자성 물질 또는 자성 성분을 포함하고, 상기 자성 입자는 철 화합물(예: 산화철), 철 합금, 산화아연, 산화망간 혼합물, 산화가돌리늄 혼합물, 코발트 화합물(예: 산화코발트), 니켈 화합물(예: 산화니켈), 니켈 합금, 산화망간, 망간 합금, 산화아연, 산화가돌리늄 및 산화크롬으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나, 즉 하나 이상의 성분, 즉, 이들 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 화학 성분을 갖는다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 자성 입자는 산화철, 철, 코발트, Co2+, 질화철, Mn3O4, GdO, 니켈, Ni2+ 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 화학 성분을 갖는다; 여기서, 산화철은 바람직하게는 자철광(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe2O3), 또는 이들 두 산화물의 조합이고, 더 바람직하게는 산화철은 Fe3O4이다.
바람직한 실시양태 중 다른 하나에서, 자성 입자는 Fe3O4, γ-Fe2O3, 질화철, Mn3O4, AlNi(Co), FeCr(Co), FeCrMo, FeAlC, AlNi(Co), FeCrCo, ReCo, ReFe, PtCo, MnAlC, CuNiFe, AlMnAg, MnBi, FeNi(Mo), FeSi, FeAl, FeNi(Mo), FeSiAl, BaO·6Fe2O3, SrO·6Fe2O3, PbO·6Fe2O3, GdO 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 화학 성분을 갖는다; 여기서 Re는 희토류 원소인 레늄이다. Mo는 몰리브덴이다.
본 발명의 자성 마이크로스피어 본체의 크기(예를 들어, 부피)는 특별히 제한되지 않고, 임의의 가능한 입자 크기일 수 있지만, 바람직하게는 자성 마이크로스피어 본체의 직경은 0.1㎛ 내지 1000㎛ 이다. 직경 크기는 달리 명시되지 않는 한 평균 크기를 나타낸다. 예를 들어, 1 μm 내지 1000 μm의 범위에 있으며, 구체적으로 예를 들어 1 μm, 10 μm, 100 μm, 200 μm, 500 μm, 800 μm 및 1000 μm이고; 본 발명의 바람직한 직경 중 하나는 1㎛이다.
생체자기 마이크로스피어의 경우, 입자 크기가 작아 단백질 합성 반응 시스템에서 단백질 고체 시스템이 현탁되는데 도움이 되며 단백질 발현 생성물과보다 완전히 접촉하여 단백질 생성물이 보다 효율적인 방식으로 포획되고, 결합율(결합 효율)이 향상된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 0.1 ㎛ 내지 10 ㎛ 범위의 직경을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 0.2 ㎛ 내지 6 ㎛ 범위의 직경을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 0.4 ㎛ 내지 5 ㎛ 범위의 직경을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 0.5 ㎛ 내지 3 ㎛ 범위의 직경을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 0.2 ㎛ 내지 1 ㎛ 범위의 직경을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛ 범위의 직경을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 1 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 직경을 갖는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 자성 마이크로스피어 본체는 0.1 μm, 0.15 μm, 0.2 μm, 0.25 μm, 0.3 μm, 0.35 μm, 0.4 μm, 0.45 μm, 0.5 μm, 0.55 μm, 0.6 μm, 0.65 μm, 0.7 μm, 0.75 μm, 0.8 μm, 0.85 μm, 0.9 μm, 0.95 μm, 1 μm, 1.5 μm, 2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm , 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 80 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm, 250 μm, 300 μm, 350 μm, 400 μm, 450 μm, 500 μm, 550 μm, 600 μm, 650 μm, 700 μm, 750 μm, 800 μm, 850 μm, 900 μm, 950 μm, 1000 μm 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 직경(편차가 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%일 수 있음) 또는 선택된 어떠한 두 값 사이의 범위 내의 직경을 갖는다.
형성된 자성 마이크로스피어 본체 및 자성 마이크로스피어 본체를 포함하는 자성 마이크로스피어는 한편으로 외부 자기장의 작용하에 신속하게 위치 결정, 안내 및 분리될 수 있고, 다른 한편으로는 활성 작용기, 예를 들어, 히드록실, 카르복실, 알데히드기, 아미노기, 니켈 이온을 표면 개질 또는 화학적 중합 등에 의해 자성 마이크로스피어 본체 또는 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 부여할 수 있다. 또한 자성 마이크로스피어 본체 또는 자성 마이크로스피어는 생물학적으로 항체, 세포, DNA 등과 같은 활성 물질에 공유 결합, 비공유 결합 및 기타 방법을 통해 결합된다.
자성 마이크로스피어 본체를 커플링하기 위해 사용되는 중합체는 폴리아크릴산, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴산, 및 폴리메타크릴레이트 및 기타 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 카르복실 분지쇄를 갖는 하나 이상의 거대분자일 수 있다.
바람직한 구체예 중 하나에서, 생체자기 마이크로스피어의 외부 표면에 커플링된 선형 중합체는 아크릴산, 아크릴레이트, 아크릴산 에스테르, 메타크릴산, 메타크릴레이트, 메타크릴산 에스테르 등 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 중합에 의해 수득되며, 바람직하게는 중합 공정에서 가교제가 필요하지 않다.
선형 중합체의 분지쇄에는 작용기가 포함되어 있으며, 이 작용기는 표적물에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 선형 중합체의 분지쇄는 특이적 결합 부위(즉, 작용기가 특이적 결합 부위임)를 포함하고, 특이적 결합 부위는 표적물에 특이적으로 결합할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 특이적 결합 부위는 니켈 이온이고, 상기 니켈 이온은 His 태그(히스티딘 태그)의 라벨에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 선형 중합체의 작용기는 카르복실, 히드록실, 아미노, 술프히드릴 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
바람직한 구체예 중 하나에서, 선형 중합체는 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 직접 고정되거나, 링킹 그룹(linking group)를 통해 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 간접적으로 고정된다.
형성된 생체자기 마이크로스피어는 활성 물질을 결합하는 데 사용할 수 있다. 활성 물질은 링커 분자를 통해 직접 결합되거나 결합될 수 있다. 링커 분자는 핵산 분자, 펩타이드 핵산, 핵산 앱타머, 데옥시리보핵산, 리보핵산, 류신 지퍼, 나선-턴-나선 모티프, 징크 핑거 모티프, 올리고뉴클레오티드, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 항-합텐 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다. 물론, 링커 분자는 또한 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-PNA, RNA-RNA, RNA-PNA 및 PNA-PNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 이중 가닥 핵산 구조, 이중 나선, 호모하이브리드 또는 헤테로하이브리드일 수 있다.
두 번째 측면에 따르면, 본 발명은 다음 복수의 단계들을 포함하는, 본 발명의 제1측면에 따른 생체자기 마이크로스피어를 제조하는 방법을 제공한다:
단계 (1): 자성 마이크로스피어 본체를 제공하고, 자성 마이크로스피어 본체의 표면에 화학적 개질을 수행하고, 반응기 R1을 도입하는 단계;
단계 (2): 선택적으로, 반응기 R1 사이의 공유 결합 반응에 의해 작용기 R2를 도입하는 단계; 작용기 R2는 중합 반응을 시작하기 위한 반응성 중심 RC로서 기능할 수 있고; 단계 (1)의 반응기 R1이 중합 반응을 시작하기 위한 반응성 중심 RC로서 기능할 수 있는 경우, 이 단계는 생략되어 단계 (3)으로 직접 진행할 수 있고; 부가 중합(라디칼 중합, 양이온 중합, 음이온 중합)의 경우, 반응성 중심 RC는 개시 중심이고; 단계적 중합의 경우 반응성 중심 RC는 중합체 사슬의 "성장"을 위한 시작점으로도 기능할 수 있고;
반응기는 커플링 반응을 거쳐 공유 결합을 형성할 수 있는 그룹을 의미한다;
단계 (3): 단량체 분자 M1을 첨가하고, 반응성 중심 RC를 출발점으로 하여 단량체 분자 MG의 중합 반응을 개시하는 단계; 단량체 분자 MG는 기능화된 분지쇄 말단을 제공할 수 있는 하나 이상의 단량체 분자 MB를 포함하고; 기능화된 분지쇄 말단은 분지쇄 말단이 작용기 F1이거나 변형 후에 작용기 F1으로 변형될 수 있음을 의미하고; 중합 반응을 통해 분지쇄를 갖는 선형 중합체의 사슬 백본이 형성되고, 반응성 중심 RC에 선형 중합체를 공유 고정하기 위한 연결점이 형성되고;
작용기는 공유 결합, 동적 공유 결합, 초분자 상호 작용 및 기타 결합 능력을 형성할 수 있다.
중합 반응의 메커니즘은 특별히 제한되지 않으며; 예를 들어, 라디칼 중합, 양이온 중합, 음이온 중합 및 단계적 중합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
단량체 분자 MG는 단일 유형의 분자일 수 있고, 단독 중합 반응을 수행할 수 있고; 그것은 또한 다른 유형의 분자들의 조합일 수 있으며, 공중합 반응이 수행될 수 있으며; 기능화된 분지쇄를 제공할 수 있는 단량체 분자 MB는, 예를 들어 아크릴 단량체 분자(라디칼 중합 가능) 등이다;
단계 (4): 분지쇄 말단에서 정제 매질과 작용기 F1 간의 상호작용을 이용하여 분지쇄 말단에 정제 매질을 결합시켜 "자성 마이크로스피어 본체 - 분지쇄를 갖는 선형 중합체 - 정제 매질"의 구조를 갖는 생체자기 마이크로스피어를 얻는 단계.
상기 언급된 단계는 개별적으로 또는 적절한 조합으로 동시에 수행될 수 있다.
정제 매질은 생체자기 마이크로스피어에서 표적 대상을 특이적으로 포획하기 위해 사용되는 기능적 요소를 말한다.
"분지쇄 말단에서 정제 매질과 작용기 F1 사이의 상호작용"은, 예를 들어 공유 결합, 동적 공유 결합, 초분자 상호작용(예: 친화성 복합 상호작용) 등이다.
생체자기 마이크로스피어의 제조 방법은 다음을 포함하는 복수의 단계를 포함할 수 있다:
단계 (1): 자성 마이크로스피어 본체를 제공하고, 자성 마이크로스피어 A를 형성하기 전에 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노기를 도입함으로써 자성 마이크로스피어 본체에 화학적 개질을 수행하는 단계;
바람직한 실시양태 중 하나에서, 자성 마이크로스피어 본체에 대한 화학적 변형은 실란 커플링제로 수행된다;
단계 (2): 카르복실기와 아미노기 사이의 공유 반응을 이용하여 자성 마이크로스피어 A의 외부 표면에 아크릴산 분자를 공유 결합으로 커플링하여, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하고 자성 마이크로스피어 B를 형성하는 단계;
단계 (3): 가교제 없이, 얻어진 선형 중합체를 자성 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유 결합시킨 탄소-탄소 이중 결합 사이의 중합 반응에 의해 아크릴계 단량체 분자를 중합시킨 후, 고액 분리 및 액상 제거를 통해 자성 마이크로스피어 C를 얻는 단계;
상기 작용기가 특이적 결합 부위를 포함하는 경우, 상기 방법은 (4) 자성 마이크로스피어 C의 선형 중합체의 분지쇄에서 특이적 결합 부위를 커플링시키는 단계를 더 포함한다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 아크릴 단량체 분자는 나트륨 아크릴레이트 단량체 분자이다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 자성 마이크로스피어는 자석에 의해 침전되고, 액상이 제거되며, 세척 후에 자성 마이크로스피어 C가 얻어진다.
앞서 설명한 단계 (1)과 (2)는 하나의 단계로 결합될 수 있으며, 즉 단계 (2)는 생략될 수 있다. 예를 들어, 다음 단계 (I)로 결합될 수 있다: 단계 (I): 트리메톡시실란화된 아크릴 분자를 채택하여 자성 마이크로스피어에 화학적 개질을 수행하고, 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 탄소-탄소 이중 결합을 도입한 다음 자성 마이크로스피어 B를 형성하는 단계. 특히, 3-(메타크릴옥시)프로필트리메톡시실란(KH570 acyloxysilane, CAS: 2530-85-0)을 사용하여 자성 마이크로스피어 본체를 개질시키고, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여 자성 마이크로스피어 B를 형성할 수 있고, 탄소-탄소 이중 결합은 중합 반응을 개시하는 활성 중심으로 작용할 수 있다. 이 개질 경로 또는 KH570 개질 경로라고도 한다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 자성 마이크로스피어 C의 선형 중합체의 분지쇄는 니켈 이온을 함유한다. 본 실시예에서, 상기 방법은 (4) 트리카르복실산 아민의 잔기에 있는 3개의 카르복실기와 Ni2+를 커플링하여 자성 마이크로스피어 D, 즉, 표적 생체자기 마이크로스피어를 얻기 전에, 자성 마이크로스피어 C에 트리카르복실산 아민을 커플링시키는 단계; 여기서 표적 생체자기 마이크로스피어는 His 태그의 표지에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 트리카르복실산 아민의 3개의 카르복실기는 N(C-COOH)3)의 구조를 형성하여, 니켈 이온이 착화될 수 있다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 트리카르복실산 아민은 N,N-비스(카르복시메틸)-L-리신이고, N,N-비스(카르복시메틸)-L-리신의 양은 바람직하게는 0.5 g/ L ~ 550g/L.이다.
바람직한 구체예 중 하나에서, 단계 (2)에서 자성 마이크로스피어 A의 제조를 위한 아크릴산의 양은 0.002 mol/L 내지 20 mol/L 범위이다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 단계 (3)에서 자성 마이크로스피어 B의 제조를 위한 아크릴산나트륨의 양은 0.53 mol/L 내지 12.76 mol/L 범위이다.
특히, 본 발명은 다음과 같은 기술적 솔루션을 제공한다:
(1) SiO2로 코팅된 Fe3O4 자성 비드는 자성 마이크로스피어 본체로 사용된다; 커플링제(예: 3-아미노프로필트리에톡시실란, APTES, CAS: 919-30-2, 아민화된 커플링제 및 실란 커플링제, 특히 아민화된 실란 커플링제)는 SiO2 코팅된 Fe3O4 자성 마이크로스피어 본체를 화학적으로 개질하는데 사용되고, 아미노기는 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 도입되어 자성 마이크로스피어 A를 형성한다;
(2) 아크릴산 분자는 카르복실기와 아미노기 사이의 공유 반응을 이용하여 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 공유 결합을 커플링되어 탄소-탄소 이중 결합을 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 도입하고 탄소-탄소 이중 결합으로 외부 표면이 개질된 자성 마이크로스피어 B를 얻는다;
(3) 아크릴계 단량체 분자(예: 아크릴산나트륨 단량체 분자)의 선형 중합은 탄소-탄소 이중 결합 사이의 중합 반응에 의해 실현되고; 중합 반응이 진행되는 동안, 중합 생성물을 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 공유 결합하여 자성 마이크로스피어 C를 수득하고, 이때 그의 외부 표면은 아크릴계 중합체로 공유 개질된다.
특히, 본 발명은 다음과 같은 기술적 솔루션을 추가로 제공한다:
(I) SiO2 코팅된 Fe3O4 자성 비드는 자성 마이크로스피어 본체로 사용된다. 커플링제(예: 3-(메타크릴로일옥시)프로필트리메톡시실란, CAS: 2530-85-0)는 SiO2로 코팅된 Fe3O4 자성 마이크로스피어 본체를 화학적으로 개질하는데 사용되며, 알릴 탄소-탄소 이중 결합은 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 도입되어 외부 표면이 탄소-탄소 이중 결합으로 외부 표면이 개질된 자성 마이크로스피어 B를 형성한다;
(II) 아크릴 단량체 분자(예: 아크릴산나트륨 단량체 분자)의 선형 중합은 탄소-탄소 이중 결합 사이의 중합 반응에 의해 실현되고; 중합 반응이 진행되는 동안 중합 생성물이 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 공유 결합으로 커플링되어 외부 표면이 아크릴계 중합체로 공유 개질된 자성 마이크로스피어 C를 얻는다.
형성된 선형 중합체는 한쪽 끝이 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 공유 결합으로 커플링되어 있고, 나머지 부분은 용액에서 유리되고 용액 내 분자와 완전히 접촉하여 표적 단백질의 포획을 향상시킬 수 있다. 표적 단백질은 용리 과정에서 자성 마이크로스피어의 제약을 직접 제거하여 용리액에 직접 도입되게 할 수 있다. 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 물리적으로 감겨 있거나 자성 마이크로스피어와 통합된 중합체와 비교하여, 공유 고정화된 선형 중합체는 분자 사슬의 적층을 효과적으로 줄이며, 용액에서 분자 사슬의 스트레치 및 스윙을 강화하고, 표적 단백질의 포획을 향상시키며, 용리 과정에서 표적 단백질의 체류율 및 체류 시간을 단축시킨다.
단량체 분자로 아크릴산나트륨을 예로 들면, 중합 생성물은 폴리아크릴산나트륨이다. 폴리아크릴산나트륨의 백본은 선형 폴리올레핀 백본이며, 많은 측쇄 COONa가 백본을 따라 공유 연결되어 있고, 분지쇄에 포함된 작용기는 COONa이다; 여기에서 중합 반응은 가교제(예: N,N'-methylene bisacrylamide, CAS: 110-26-9)를 사용하지 않고, 대신 중합 생성물이 가교제 첨가 없이 선형 백본을 갖는 선형 중합체를 생성할 수 있고, 분자 사슬이 서로 가교 결합된 네트워크 폴러미의 형성을 방지할 수 있다. 분자 사슬이 서로 가교 결합된 네트워크 중합체가 형성되면, 다공성 구조가 형성되어 표적 단백질의 용리 효율에 영향을 미친다.
(4) 아크릴산나트륨의 중합에 의해 얻어지는 자성 마이크로스피어 C를 예로 들면, 약산성계에서 반응을 행하기 때문에, 아크릴산나트륨은 수상에서 나트륨 이온과 아크릴산 이온으로 분해된다. 약산계 시스템에서 대부분의 아크릴산 이온은 카르복실기를 가진 아크릴산이 된다. 소듐 폴리아크릴레이트의 선형 분자 사슬이 자성 마이크로스피어의 외부 표면에 공유 결합으로 가교된 후, 트리카르복실산 아민(예: N,N-비스(카르복시메틸)-L-리신, CAS: 113231-05-3)이 카르복실기와 아미노기 사이의 공유결합 반응을 이용하여 선형 중합체의 분지쇄에 공유결합으로 커플링한 다음, N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신의 카르복실기 3개에 니켈이온을 가하여 킬레이트화하여 히스티딘 태그 단백질의 분리 및 정제를 위한 생체자기 마이크로스피어를 얻는다.
제3측면에 따르면, 본 발명은 다음 복수의 단계들을 포함하는 제1측면에 따른 생체자기 마이크로스피어를 이용하여 단백질을 분리하는 방법을 제공한다:
(1) 생체자기 마이크로스피어에 결합 완충액을 첨가하고 잘 혼합하고, 생체자기 마이크로스피어를 자기적으로 분리하고, 분리된 생체자기 마이크로스피어를 분리하고자 하는 단백질이 포함된 용액에 첨가한 후 잘 혼합하여 배양하여 표적 단백질이 결합하는 생체자기 마이크로스피어 E를 얻는 단계;
(2) 상등액을 제거하기 전에 고액 분리를 수행하고, 생체자기 마이크로스피어 E를 세척액으로 세척하고, 생체 마이크로스피어 E를 용리제로 용리하여 상등액을 수집하는 단계;
바람직한 실시양태 중 하나에서, 고체-액체 분리는 자기 인력에 의해 수행되고;
바람직한 구체예 중 하나에서, 고체-액체 분리는 원심분리에 의해 수행된다;
(3) 상등액으로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 생체자기 마이크로스피어 대 처리될 단백질 용액의 비율은 부피 기준으로 1:10 내지 1:80 범위이다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 생체자기 마이크로스피어 대 처리될 단백질 용액의 비율은 부피 기준으로 1:10 내지 1:60 범위이다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 생체자기 마이크로스피어 대 처리될 단백질 용액의 비율은 부피 기준으로 1:10 내지 1:50 범위이다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 생체자기 마이크로스피어 대 처리될 단백질 용액의 비는 부피 기준으로 1:20 내지 1:50 범위이다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 생체자기 마이크로스피어 대 처리될 단백질 용액의 비는 부피 기준으로 1:20 내지 1:40 범위이다.
일부 구현예에서, 시험관내 단백질 합성 반응이 완료된 후의 반응 용액은 분리하고자 하는 단백질을 포함하는 용액으로 직접 사용된다. 예를 들어, IVTT 반응(시험관내 전사 및 번역 반응)이 완료된 후, 수득된 IVTT 반응 용액을 분리하고자 하는 단백질을 포함하는 용액으로 사용한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 시험관내 단백질 합성 시스템에 의해 요구되는 다양한 인자는, 예를 들어 일본의 PURE 시스템(예를 들어, PURExpress 키트)을 참조하여, 개별적으로 또는 조합하여 외인성으로 추가된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 시험관내 단백질 합성 시스템은 다음을 포함한다:
(a) 세포 추출물; 바람직하게는, 효모 세포 추출물;
(b) 폴리에틸렌 글리콜과 같은 임의의 적합한 크라우딩제(crowding agent);
(c) 선택적인 외인성 수크로스; 및
(d) 용매가 물 또는 수성 용매인 임의의 용매.
구성 요소 (c) 및 (d)에서의 "선택적"이라는 용어는 독립적으로 필요하지 않을 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 시험관내 단백질 합성 시스템은 효모 세포 추출물, 트리히드록시메틸 아미노메탄(Tris), 아세트산칼륨, 아세트산마그네슘, 뉴클레오시드 삼인산 혼합물(NTP), 아미노산 혼합물, 인산칼륨, 아밀라제, 폴리에틸렌글리콜, 말토덱스트린 등을 포함한다. 형광 단백질 DNA 등과 같은 표적 단백질을 코딩하는 핵산 주형은 시험관내 단백질 합성 반응을 위해 시험관내 단백질 합성 시스템에 더 추가될 수 있다.
표적 단백질을 포함하는 반응 용액을 얻기 위해 시험관 내 단백질 합성 반응을 위한 시험관 내 단백질 합성 시스템에 핵산 주형(예: 형광 단백질을 코딩하는 DNA)을 더 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 표적 단백질은 정제 태그를 포함하고; 표적 단백질이 히스티딘 정제 태그를 포함하는 경우, 니켈 이온에 특이적으로 결합할 수 있어 본 발명의 생체자기 마이크로스피어를 분리 및 정제에 사용할 수 있다.
본 발명에서, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템에서 효모 세포 추출물의 비율은 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 효모 세포 추출물의 부피 기준 함량은 20%-70%(v/v) 범위, 바람직하게는 30%-60%(v/v) 범위, 보다 바람직하게는 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템의 총 부피를 기준으로 40%-50%(v/v), 추가로 예를 들어 50%(v/v)의 범위이다.
본 발명에서, 세포 추출물은 바람직하게는 온전한 세포를 포함하지 않는다. 보고된 적절한 세포 추출물 제조 기술을 선택하여 세포 추출물을 제조할 수 있다. 세포 추출물의 제조는 일반적으로 적절한 양의 효모 세포를 제공하고, 세포를 파괴하고, 고액 분리를 수행하고, 상등액을 수집하는 적어도 다음 단계를 포함한다. 상기 세포 추출물의 제조 방법에 따라 얻어진 추출 생성물은 미량 또는 극소량의 온전한 세포가 남아 있을 수 있으며, 이러한 형태의 추출 생성물도 본 발명의 세포 추출물의 범위에 속한다. 세포 추출물은 온전한 세포의 존재를 배제하지 않는다.
마찬가지로, 시험관내 단백질 합성 시스템은 세포 추출물을 포함할 때 온전한 세포의 존재를 배제하지 않는다. 이러한 온전한 세포들의 존재 이면에는 많은 요인이 있다. 온전한 세포는 세포 추출물을 준비하는 과정에서 잔류할 수 있다; 또는 의도적으로 도입될 수 있는데, 예를 들어, 추가된 세포의 단순 단편화에 의해 수득된 세포 단편일 수 있고, 세포 단편은 완전히 단편화된 생성물과 온전한 세포의 혼합물일 수 있고; 또는 개별적으로 추가된 온전한 세포이다.
일반적인 세포 추출물(효모 세포 추출물 포함)은 단백질 합성에 필요한 리보솜, tRNA, 단백질 번역을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소, 개시 인자, 연장 인자 및 종결 방출 인자를 포함한다. 또한, 효모 추출물(효모 세포 추출물 포함)은 세포질로부터 유래된 일부 다른 단백질, 특히 가용성 단백질을 추가로 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 효모 세포 추출물은 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 세포 추출물이다. 일부 바람직한 구체예에서, 클루이베로마이세스는 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 락티스 var. 초파리(Kluyveromyces lactis var. drosophilarum), 클루이베로마이세스 락티스 var. 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 마르시아누스 var. 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스 var. 마르시아누스, 클루이베로마이세스 마르시아누스 var. 바누데니(Kluyveromyces marxianus var. vanudenii), 클루이베로마이세스 도브잔스키(Kluyveromyces dobzhanskii), 클루이베로마이세스 아에스투아리(Kluyveromyces aestuarii), 클루이베로마이세스 논페르멘탄스(Kluyveromyces nonfermentans), 클루이베로마이세스 위커하미이(Kluyveromyces wickerhamii), 클루이베로마이세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 후베이엔시스(Kluyveromyces hubeiensis), 클루이베로마이세스 폴리스포루스(Kluyveromyces polysporus), 클루이베로마이세스 시멘시스(Kluyveromyces siamensis), 클루이베로마이세스 야로위이(Kluyveromyces yarrowii), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
시험관 내 단백질 합성 시스템에 필요한 모든 단백질 성분(예: RNA 폴리머라제)은 내인성 방식 또는 외인성 방식으로 추가될 수 있다. 내인성 방식으로 첨가되는 단백질 성분은 세포 추출물의 성분 중 하나로 첨가될 수 있음을 의미하며; 단백질 성분이 외인성으로 첨가된다는 것은 비세포 추출물의 형태로 제공되는 것을 의미하는데, 이는 단일 물질일 수도 있고 둘 이상의 물질이 혼합된 물질일 수도 있다. 외인성 방법으로 첨가하는 경우, 하나 또는 둘 이상의 물질의 정제 생성물인 것이 바람직하다. 단백질 조성물이 내인성 방식으로 제공되는 경우, CN108690139A, CN109423496A, CN106978439A, CN110408635A, CN110551700A, CN110093284A, CN110845622A, CN110938649A, CN2018116198190, "분자 및 세포 생물학(Molecular and Cellular Biology), 1990, 10(1):353-360"을 포함하지만 이에 국한되지 않는 기존 문서 및 인용 문서에 제공된 유전자 변형 방법을 참조할 수 있다. 이러한 방법에는 코딩 서열을 세포 내 에피솜 플라스미드에 삽입하는 방법, 코딩 유전자를 세포 게놈에 통합하는 방법, 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 그것이 외인성 방식으로 제공되는 경우, 단백질 조성물의 함량은 시스템에 의해 요구되는 대로 제어 및 조정될 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 효모 세포 추출물, 트리스, 아세트산칼륨, 아세트산마그네슘, 뉴클레오시드 삼인산 혼합물(NTP), 아미노산 혼합물, 인산칼륨, 당(글루코스, 수크로스, 말토덱스트린 및 이들의 조합 중 임의의 하나이며, 말토덱스트린이 포함되는 경우 아밀라아제도 포함하는 것이 바람직함), 폴리에틸렌 글리콜, RNA 중합효소 등을 포함한다. RNA 중합효소는 내인성 또는 외인성으로 제공될 수 있다. RNA 폴리머라제의 보다 바람직한 형태 중 하나는 T7 RNA 폴리머라제이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 외인성으로 첨가된 RNA 중합효소를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 외인성으로 첨가된 T7 RNA 중합효소를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 클루이베로마이세스 락티스 세포 추출물 및 외인성으로 첨가된 T7 RNA 중합효소를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, T7 RNA 중합효소의 농도는 0.01 mg/mL 내지 0.3 mg/mL 범위이다. 일부 다른 바람직한 실시양태에서, T7 RNA 중합효소의 농도는 0.02mg/mL 내지 0.1mg/mL 범위이다. 일부 추가의 바람직한 예에서, T7 RNA 폴리머라제의 농도는 0.027mg/mL 내지 0.054mg/mL 범위이다. 일부 추가의 바람직한 예에서, T7 RNA 폴리머라제의 농도는 0.04 mg/mL이다.
본 발명에서, 효모 세포 추출물의 단백질 함량은 바람직하게는 20mg/mL 내지 100mg/mL, 보다 바람직하게는 50mg/mL 내지 100mg/mL 범위이다. 단백질 함량을 측정하는 방법은 Coomassie bright blue assay이다.
시험관내 무세포 단백질 합성 시스템에서 뉴클레오시드 삼인산 혼합물은, 바람직하게는 아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 시티딘 트리포스페이트, 및 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명에서 각 단일 뉴클레오티드의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 구체예 중 하나에서, 각각의 단일 뉴클레오티드의 농도는 0.5mM 내지 5mM 범위, 바람직하게는 1.0mM 내지 2.0mM 범위이다.
시험관내 무세포 단백질 합성 시스템에서 아미노산 혼합물은 천연 또는 비천연 아미노산을 포함할 수 있으며, D형 아미노산 또는 L형 아미노산을 포함할 수 있다. 대표적인 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 20가지 유형의 천연 아미노산을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 각각의 아미노산의 농도는 바람직하게는 0.01mM 내지 0.5mM 범위, 보다 바람직하게는 0.02mM 내지 0.2mM 범위, 예를 들어 0.05mM, 0.06mM, 0.07mM, 및 0.08mM이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그의 유사체를 추가로 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체의 농도(w/v)는 단백질 합성 시스템의 총 중량 또는 부피를 기준으로 0.1% 내지 8%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 더욱 바람직하게는 1% 내지 2% 범위이다. PEG의 대표적인 예는 PEG3000, PEG8000, PEG6000 및 PEG3350을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 시스템은 다른 다양한 분자량(예: PEG 200, 400, 1500, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 등)을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 수크로스를 추가로 포함한다. 수크로스의 농도(w/v)는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 수크로스의 농도는 단백질 합성 시스템의 총 부피를 기준으로 0.2% 내지 4%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 보다 바람직하게는 0.5% 내지 1% 범위이다.
효모 추출물에 추가하여, 일부 바람직한 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 22mM 트리스(pH 8), 30-150mM 아세트산칼륨, 1.0-5.0mM 마그네슘 아세테이트, 1.5-4mM 뉴클레오시드 삼인산 혼합물, 0.08-0.24mM 아미노산 혼합물, 20-25mM 인산칼륨, 0.001-0.005mg/mL 아밀라아제, 1%-4%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜, 320-360mM 말토덱스트린(글루코스 단위 몰량 기준), 8-25 ng/μL 형광 단백질 DNA 등을 더 포함한다. 또한, 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템의 총 부피는 10 μL 내지 10000 μL, 바람직하게는 15 μL 내지 100μL 범위, 바람직하게는 30μL이다. 상기 효모 추출물은 클루이베로마이세스 세포 추출물이 바람직하고, 클루이베로마이세스 락티스 세포 추출물이 보다 바람직하다.
효모 추출물에 추가하여, 일부 바람직한 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 22mM 트리스(pH 8), 30-150mM 아세트산칼륨, 1.0-5.0mM 마그네슘 아세테이트, 1.5-4mM 뉴클레오시드 삼인산 혼합물, 0.08-0.24mM 아미노산 혼합물, 20-25mM 인산칼륨, 0.001-0.005mg/mL 아밀라제, 1%-4%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜, 320-360mM 말토덱스트린(글루코스 단위 몰량 기준), 0.027-0.054 mg/mL T7 RNA 중합효소(내인성, 외인성, 또는 이들의 조합) 등의 성분을 더 포함한다. 이들 성분은 시험관내 단백질 합성 반응을 위해 8-25ng/μL 형광 단백질 DNA와 혼합될 수 있다. 바람직한 실시양태 중 하나에서, 반응 부피는 15 μL 내지 300 μL 범위이다. 바람직한 실시양태 중 하나에서, 반응 부피는 15 μL 내지 100 μL 범위이다. 바람직한 반응 부피 중 하나는 30 μL이다.
제4측면에 따르면, 본 발명은 단백질 분리 및 정제, 면역분석, 표적 항체 약물 농축, 표적 약물 전달, 핵산 분리 및 추출, 세포 분류, 효소 고정화, 유전자 벡터 구성을 위한 제1측면에 따른 생체자기 마이크로스피어의 복수의 응용을 제공한다.
실시예 1: 생체자기 마이크로스피어 합성
1.1. 준비 절차
구체적으로, 0.5-1000mL(20%, v/v)의 SiO2 코팅된 Fe3O4 자성 마이크로스피어 수용액을 측정하고, 자성 마이크로스피어를 무수 에탄올로 세척하고, 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, CAS: 919-30-2)의 10-300mL 에탄올 용액(5%~50%, v/v)을 세척된 자성 마이크로스피어에 첨가하고 2-72시간 동안 반응시킨 후, 무수 에탄올과 증류수로 세척하여 아미노 변형 자성 마이크로스피어인 자성 마이크로스피어 A를 얻었다.
0.0001-1 mol 아크릴산을 용액 X(최종 농도 0.01-1 mol/L의 NaCl 및 최종 농도 0.1-2 mol/L에서 2-모르폴린에탄설폰산(MES, CAS: 4432-31-9)을 함유하는 수용액)로 옮기고, 0.001-0.5 mol 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC·HCl, CAS: 25952-53-8) 및 0.001-0.5 mol N-히드록시숙신이미드(NHS, CAS: 6066-82-6)을 용액 X에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 3-60분 동안 반응시키고, 상기 언급된 용액을 0.5-50 mL 자성 마이크로스피어 A를 함유하는 PBS 완충 용액에 첨가하여 1-48시간 동안 반응시킨 다음, 자성 마이크로스피어를 증류수로 세척하여 외부 표면이 탄소-탄소 이중 결합으로 개질된 자성 마이크로스피어 B를 얻었다.
0.5 - 200 mL 5 - 30%(w/v) 아크릴산 나트륨 용액을 0.5 - 50 mL 자성 마이크로스피어 B에 첨가한 다음, 10 μL-20 mL 2% - 20%(w/v) 암모늄 퍼설페이트 용액 및 1 μL-1mL 테트라메틸에틸렌디아민을 용액에 가하여 3~60분간 반응시킨 후, 증류수로 자성 마이크로스피어를 세척하여 자성 마이크로스피어 C를 얻었다.
0.5-50mL 자성 마이크로스피어 C를 용액 X로 옮기고, 0.001-0.5mol 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC·HCl) 및 0.001-0.5mol N-히드록시숙신이미드(NHS)를 용액 X에 첨가하고, 혼합물을 3-60분 동안 반응시킨 후, 용액 Y에 0.0001-1 mol N,N-비스(카르복시메틸)-L-리신(CAS: 113231-05-3, 트리카르복실산 아민)이 용해된 용액을 첨가하고 1-48시간 동안 반응시킨 후, 0.0001-1mol의 황산니켈 고체입자를 반응 시스템에 첨가하고 5분 내지 24시간 동안 반응시킨 후, 자성 마이크로스피어를 증류수로 세척하여 자성 마이크로스피어 D, 즉 니켈 이온을 정제 매질로 사용하고 His 태그에 특이적으로 결합하는 표지를 분리 및 정제하는 능력을 갖는 본 발명의 생체자기 마이크로스피어를 얻었다.
1.2. 구체적인 준비 방법
여기서, 생체자기 마이크로스피어 합성을 위한 바람직한 실시예는 다음과 같다: SiO2가 코팅된 Fe3O4 자성 마이크로스피어(입자 크기 1μm)의 50mL 수용액(고형분 함량 20%(v/v))을 측정하고, 자성 마이크로스피어를 자석에 의해 침전시키고, 액상을 제거하고, 자성 마이크로스피어를 60mL 무수 에탄올로 매회 총 5회 세척하였다. 세척된 자성 마이크로스피어에 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, CAS: 919-30-2)의 100mL 에탄올 용액(25%, v/v)을 첨가하고 50°C의 수조에서 48시간 동안 기계적으로 교반한 다음, 70℃의 수조에서 2시간 동안 기계적으로 교반하고, 자성 마이크로스피어를 자석에 의해 침전시키고, 액상을 제거하고, 자성 마이크로스피어를 60mL 무수 에탄올로 매회 총 2회 세척한 다음, 자성 마이크로스피어를 60mL의 증류수로 매회 총 3회 세척하여 자성 마이크로스피어 A를 얻었다.
0.01 mol 아크릴산을 100 mL 용액 X(최종 농도 0.1mol/L의 2-모르폴린에탄설폰산(MES, CAS: 4432-31-9) 및 최종 농도 0.5 mol/L의 NaCl을 함유하는 수용액)로 옮기고, 0.04 mol 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC·HCl, CAS: 25952-53-8) 및 0.04 mol N-히드록시숙신이미드(NHS, CAS: 6066-82-6)를 용액 X에 첨가하여, 얻어진 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고, 용액의 pH를 NaHCO3 고체 분말로 7.2로 조정하고, pH가 조정된 상기 언급된 용액을 10mL 자성 마이크로스피어 A를 함유하는 100mL PBS 완충 용액에 첨가하고, 30℃의 수조에서 20시간 동안 기계적으로 교반한 다음, 자성 마이크로스피어를 자석에 의해 침전시키고, 액상을 제거하고, 자성 마이크로스피어를 60mL의 증류수로 매회 총 6회 세척하여 자성 마이크로스피어 B를 얻었다.
자성 마이크로스피어 B 1mL에 2.08mol/L 아크릴산나트륨 용액 12mL를 가한 후, 10%(w/v) 암모늄 퍼설페이트 용액 450μL와 테트라메틸에틸렌디아민 45μL를 가한 다음, 상기 혼합물을 상온에서 30분간 반응시키고, 자성 마이크로스피어를 자석에 의해 침전시키고, 액상을 제거하고, 자성 마이크로스피어를 10mL 증류수로 매회 총 6회 세척하여 자성 마이크로스피어 C를 얻었다.
합성된 자성 마이크로스피어 C를 10mL 용액 X로 옮기고, 0.004mol 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC·HCl) 및 0.004mol N-히드록시숙신이미드(NHS)를 용액 X에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 자석에 의해 자성 마이크로스피어를 침전시키고, 액상을 제거한 다음, 자성 마이크로스피어를 10mL 증류수로 매회 총 3회 세척하고; 0.002 mol N,N-비스(카르복시메틸)-L-리신(CAS: 113231-05-3)을 칭량하고 10mL 용액 Y에 용해시키고, 용액의 pH를 NaHCO3 고체 분말로 7로 조정하고, 용액을 세척된 자성 마이크로스피어에 첨가하고, 30℃의 수조에서 20시간 동안 기계적으로 교반하고, 0.02 mol 황산니켈 고체 입자를 반응 시스템에 첨가하여 용액을 2시간 동안 계속 교반하고, 자성 마이크로스피어를 자석을 이용하여 침전시키고, 액상을 제거한 다음, 6mL의 증류수로 매회 총 10회 세척하여 니켈 자성 비드, 즉, 이하 KM 자성 비드로 약칭되는 본 발명의 생체자기 마이크로스피어인 자성 마이크로스피어 D를 얻었다.
실시예 2: 생체자기 마이크로스피어의 효과
KM 자성 비드의 효과를 검증하기 위하여, KM 자성 비드(본 발명의 생체자기 마이크로스피어, 니켈 자성 비드 및 중합 반응에서 단량체로 사용된 소듐 아크릴레이트)와 대조군 니켈 비드를 비교하는 실험을 수행하였다. 대조군 니켈 비드는 시판되는 Sangon 니켈 비드(Ni-NTA 아가로스 수지, 카탈로그 번호: C600033-0025, Sangon Biotech(Shanghai))를 사용하였으며, KM 자성 비드와 폴리아크릴산 자성 비드(중합 반응에서 단량체로 아크릴산을 사용하여 당사 연구실에서 제조)의 결합력과 단백질 순도를 비교하는 실험을 실시하였다.
이 실시예에서,
S20190820-1: 수상이 Y 용액을 대체했으며 중합 과정에서 (중합 촉진을 위해) TEMED를 사용하지 않았다.
S20190820-2: KH570 변형 경로로 자성 마이크로스피어 B를 제조하고, 아크릴산을 단량체 분자로 사용하여 폴리아크릴산 자성 비드(S20190820-2)를 제조하였으며, TEMED를 사용하고 완충액은 Y 용액이었다.
그룹 A: 용액 X와 Y는 합성 과정에서 수상으로 대체되었다. 중합 단량체로는 아크릴산을 사용하였다. 기타 제조 조건은 실시예 1의 KM 자성 비드 제조 조건과 동일하였다.
그룹 B: KM 자성 비드의 합성 방법을 참조하여 제조되었다. 중합 단량체로는 아크릴산을 사용하였다. 기타 제조 조건은 실시예 1의 KM 자성 비드 제조 조건과 동일하였다.
2.1. 결속력 비교 시험
2.1.1. KM 자성 비드(니켈 자성 비드)와 대조군 니켈 비드의 비교
KM 자성 비드를 결합 완충액(pH 8.0의 50mM Tris-HCl, 500mM 염화나트륨, 5mM 이미다졸)으로 3회 세척하고, 상등액 및 침전물을 분리하였다. 대조군 니켈 비드를 상기 결합 완충액으로 동일한 방법으로 세척한 후, 상등액과 침전물을 분리하였다. 상응하는 양의 비드를 하기 표 1에 따라 상이한 원심분리 튜브에 넣었다.
KM 자성 비드(nickel magnetic bead) 및 대조 니켈 비드 및 그 수
No. 니켈 비드의 양 No. KM 자성 비드의 양
S1 10 μL M1 10μL
S2 3.3 μL M2 3.3μL
S3 1.0 μL M3 1.0μL
eGFP(히스티딘 태그가 eGFP의 N-말단에 부착됨)를 발현하는 IVTT 반응액 3mL를 얻고, 3mL 결합 완충액(RFU 값은 1265.33)를 첨가하여 잘 혼합한 후, 4°C에서 4000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 침전물을 버리고, 비드 현탁액을 함유하는 상기 언급된 각각의 원심분리 튜브에 1mL의 상등액을 첨가한 다음, 이들을 완전히 혼합하고, 회전 하에 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다.
상등액을 분리하여 유동 용액을 얻었다. 비드를 1mL 세척 용액(pH 8.0의 50mM Tris-HCl, 500mM 염화나트륨, 20mM 이미다졸)으로 2회 세척하고, 마지막으로 비드를 각각 1mL 및 200μL 용리액(50mM Tris-HCl 및 pH 8.0, 500mM 염화나트륨, 250mM 이미다졸)으로 용출시켰다. 세척 또는 용출의 각 단계에 대해, 모두 4°C에서 5~10분간 회전하면서 배양하고, 각 단계에서 얻은 상등액을 수집하고, Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 RFU 값을 측정하여, 제품 함량을 산출했다.
정제된 eGFP에 따라 표준곡선을 작성하고, eGFP의 단백질 질량 농도와 이에 상응하는 RFU 값 사이의 환산식을 계산하였고, 얻어진 환산식은 다음과 같다:
Figure pct00001
여기서, X는 단백질 질량 농도(μg/mL)를 나타내고 Y는 RFU 형광 판독값을 나타낸다.
자성 마이크로스피어의 결합능은 다음과 같이 계산하였다: Y의 값을 상기 식에 대입하여 X의 값을 구하였다. 여기서, 구한 X는 단백질 질량 농도이다. X에 용출 부피를 곱하여 용출된 단백질 질량(W)을 얻었다. W를 자성 마이크로스피어의 컬럼 베드 부피(예를 들어, 컬럼 베드 No. S1의 부피는 10μL)로 나누어 단위 부피당 자성 마이크로스피어에 결합하는 표적 단백질의 질량을 구했으며, 얻어진 질량은 mg/mL 단위의 결합능이었다.
결과는 KM 자성 비드의 결합 능력이 대조군 니켈 비드보다 3배 이상 높음을 보여준다(표 2 참조).
KM 자성 비드와 대조 니켈 비드의 결합력 비교
RFU value 10 μL 3.3 μL 1.0 μL
KM 자성비드 대조군 니켈 비드 KM 자성비드 대조군 니켈 비드 KM 자성비드 대조군 니켈 비드
IVTT 반응용액 1265.33
유동 용액 29.33 80.67 38.33 582.00 678.67 1083.67
세척용액 1 12.67 148.00 48.00 195.00 208.67 98.33
세척용액 2 10.33 98.00 64.33 63.33 130.67 26.00
용리액 1 1477.33 810.67 1328.67 406.00 551.33 59.00
용리액 2 228.00 75.00 144.33 40.33 31.00 8.67
결합능(mg/mL) 10 4 28 8 32 2
2.1.2. KM 자성 비드와 폴리아크릴산 자성 비드의 결합능 비교(S20190820-1 자성 비드)
실시예 1과 같은 방법으로 KM 자성 비드를 제조하였으며, 중합용 단량체로 소듐 아크릴레이트를 사용하였다.
중합용 단량체로 아크릴산나트륨 대신 아크릴산을 사용하여 폴리아크릴산 자성비드(S20190820-1)를 제조하였다. 용액 Y는 합성 동안 수상으로 대체되었다.
동일한 부피 및 동일한 소스의 IVTT 반응 용액을 각각 처리하였다. 2.2.1에 나타낸 시험분석법을 이용하여 결합능을 비교하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다. IVTT 반응용액과 유동 용액 모두 1mL의 부피를 가졌다(유동 용액 손실은 무시할 수 있음). 그 결과 KM 자성 비드의 투과액의 RFU 값은 272에 불과하였고, 폴리아크릴산 자성 비드(S20190820-1 자성 비드)의 투과액의 RFU 값은 272보다 유의하게 높고, 컬럼 베드 부피가 2 μL일 때 1188에 도달했으며, 여기서 값은 KM 자성 비드의 4-5배였다. 그 결과 KM 자성 비드의 결합능은 컬럼 베드 부피가 2 μL일 때 폴리아크릴산 자성 비드(S20190820-1)보다 20배 이상 높았고, 컬럼 베드 부피가 10μL 및 50μL일 때 KM 자성 비드의 결합능은 폴리아크릴산 자성 비드(S20190820-1)의 21배, 26배 정도였다. 따라서 KM 자성 비드와 동일한 효과를 얻으려면 폴리아크릴산 자성 비드의 양이 KM 자성 비드의 20배 이상이어야 한다.
KM 자성 비드와 S20190820-1 자성 비드의 결합력 비교
RFU value 2 μL column bed 10 μL column bed 50 μL column bed
KM 자성 비드 S20190820-1 S20190820-1 S20190820-1
유동 용액 272 1188 866 311
2.1.3. 폴리아크릴산 자성 비드의 효과 분석
아크릴산나트륨 대신 아크릴산을 중합 단량체로 사용하여 폴리아크릴산 자성 비드를 제조하였다.
실시예 1의 방법으로 KM 자성 비드를 제조하였다.
폴리아크릴산 자성 비드는 다음 두 가지 다른 조건에서 제조되었다.
그룹 A: 용액 X와 Y는 합성 과정에서 수상으로 대체되었다. 중합 단량체로는 아크릴산을 사용하였다. 기타 제조 조건은 실시예 1의 KM 자성 비드 제조 조건과 동일하다.
그룹 B: KM 자성 비드의 합성 방법을 참조하여 제조되었다. 중합 단량체로는 아크릴산을 사용하였다. 기타 제조 조건은 실시예 1의 KM 자성 비드 제조 조건과 동일하다.
섹션 2.1.1의 테스트 분석 방법을 참조하여 각 그룹에 동일한 부피와 동일한 소스의 IVTT 반응 용액을 처리했다. 도 2는 Group A 및 Group B에서 제조된 폴리아크릴산 자성 비드와 KM 자성 비드의 IVTT 반응 용액 처리 전후의 RFU 값의 차이를 비교한 것으로, 그 차이는 IVTT 반응 용액의 RFU 값에서 유동 용액의 RFU 값을 빼서 얻어진다. 분석 결과 KM 자성 비드의 결합능이 폴리아크릴산 자성 비드보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. 특히, KM 자성 비드의 결합능은 폴리아크릴산 자성 비드의 5-10배일 수 있고; 컬럼 베드 부피가 2μL일 때, KM 자성 비드의 결합능은 그룹 A 및 그룹 B에서 각각 제조된 폴리아크릴산 자성 비드 결합능의 5배, 10배였다.
2.1.4. KH570 변형 경로
KH550 변형 경로의 경우, 아미노 그룹은 먼저 아민화된 실란 커플링제 KH550(3-아미노프로필트리에톡시실란, CAS: 919-30-2)을 사용하여 도입(자성 마이크로스피어 A를 얻기 위해)한 다음, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여 자성 마이크로스피어 B를 얻었다.
KH570 변형 경로는 KH550 변형 경로와 다르다. KH570 변형 경로는 트리메톡시실란화 메타크릴산 분자 KH570(CAS: 2530-85-0, 3-(메타크릴옥시)프로필트리메톡시실란, 알릴 실란 커플링제)을 채택하여 자성 마이크로스피어 본체를 변형하고, 탄소-탄소 이중 결합을 직접 도입하여 자성 마이크로스피어 B를 얻었다.
KH570 변형 경로를 이용하여 자성 마이크로스피어 B를 제조하였고, 아크릴산을 단량체 분자로 사용하여 폴리아크릴산 자성 비드(S20190820-2)를 제조 및 획득하였으며, 완충액은 Y 용액이었다. 동일한 부피와 동일한 소스의 IVTT 반응 용액을 각각 처리하고, 2.1.1.의 방법을 테스트 및 분석에 사용하였다. 사용된 자성 비드의 부피는 20 μL이고, IVTT 반응 용액의 부피는 1 mL이었다. IVTT 반응용액(원액), 유동 용액, 세척용액 및 용리액의 RFU 값을 각각 테스트했다. IVTT 반응용액의 RFU 값은 800, 유동 용액의 RFU 값은 173이었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 분석 결과 KH570 변형 경로에 의해 얻은 폴리아크릴산 자성 비드의 결합능(약 2 mg/mL)이 상기한 KM 자성 비드의 결합능 보다 낮았다.
2.1.5. 농도가 다른 중합 단량체를 사용한 B-KM 자성 비드의 제조
KM 자성 비드의 제조 방법과 비교하여, 중합 단량체인 아크릴산나트륨의 단량체 농도를 2.08 mol/L에서 2.496 mol/L로 증가시켰다. 그 외의 제조 방법 및 변수는 실시예 1과 동일하게 하여, 폴리아크릴산나트륨 자성 비드(B-KM 자성 비드, 191220-ZZ-1)를 얻었다.
2.1.1.의 방법으로 결합능을 시험 및 분석하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 서로 다른 부피(2μL, 4μL, 8μL)의 자성 비드를 사용하여 3가지 결합능 시험을 수행하였다. 자성 비드의 부피가 4μL 및 8μL인 경우 자성 비드가 과도함을 알 수 있었다. 부피가 2μL인 자성 비드의 결합능은 2.1.1에서 언급한 식에 의해 약 85.6 mg/mL로 계산되었다.
B-KM 자성 비드(191220-ZZ-1)의 결합능 시험 및 분석
자성비드의 양 RFU 값 결합효과(%) 결합능(mg/ml)
Total 유동 E1 E2
2 μL 4428 214 20241 1729 95.2 85.6
4 μL 132 23862 2741 97.0 /
8 μL 93 23675 5631 97.9 /
표 4에서 Total은 처리하고자 하는 IVTT 반응 용액에 해당하고, 유동은 유동 용액에 해당하고, E1은 80μL 용리액을 사용한 1차 용리 과정에서 얻어진 용액, E2는 80 μL 용리액을 사용한 2차 용리 과정에서 얻어진 용액에 해당한다.
2.2. 순도 시험
2.2.1. KM 마그네틱 비드 및 대조 니켈 비드 정제 제품의 순도 시험
순도 시험
No. eGFP를 발현하는 IVTT 반응용액(DNA 주형의 첨가 후 반응) eGFP를 발현하지 않는 IVTT 반응용액(DNA 주형을 첨가하지 않고 반응) 희석된 IVTT 반응용액의 농도
1 1mL 0 100%
2 0.8mL 0.2mL 80%
3 0.6mL 0.4mL 60%
4 0.4mL 0.6mL 40%
5 0.2mL 0.8mL 20%
6 0.1mL 0.9mL 10%
7 0.01mL 0.99mL 1%
8 0 mL 1mL 0%
섹션 2.1.1의 대조군 니켈 비드 및 KM 자성 비드를 결합 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 500mM 염화나트륨, 5mM 이미다졸)으로 각각 3회 세척하고, 상등액과 침전물을 분리하였다. 각 종류의 비드 3 μL를 각각 8개의 원심분리기 튜브에 각각 피펫팅했다(표 5 참조).
eGFP를 발현하는 IVTT 반응액 6mL와 eGFP를 발현하지 않는 IVTT 반응액 6mL를 획득하고, 획득한 IVTT 반응액을 각각 4000rpm, 4℃, 10분간 원심분리하였다. 침전물은 버리고 두 종류의 IVTT 반응용액의 상등액을 표 5의 부피비로 혼합하여 eGFP 단백질 농도가 다른 8개의 용액군을 얻었다. 8개의 용액군을 상응하는 비드 원심분리 튜브에 각각 첨가하고(각각 KM 자성 비드 및 대조군 니켈 비드 사용) 이들을 완전히 혼합하고 회전 하에 4℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다.
eGFP를 발현하는 IVTT 반응용액은 IVTT 시스템(eGFP를 코딩하는 DNA 주형 사용)을 이용하여 시험관내 단백질 합성 반응을 수행하여 얻은 반응액을 말한다. 희석제로서 eGFP를 발현하지 않는 IVTT 반응용액은 eGFP를 코딩하는 DNA 주형이 IVTT 시스템에 첨가되지 않았음을 의미하며, 이렇게 얻어진 반응용액 내의 단백질은 모두 불순한 단백질이었다. 표적 단백질을 발현하지 않는 반응용액을 IVTT 반응용액에 혼합하면, IVTT 반응에 다른 비율의 불순한 단백질이 혼입될 수 있다. eGFP 단백질 농도가 다른 용액에 대해 SDS-PAGE 전기영동을 하여 정제된 eGFP 단백질의 순도를 비교하였다. 표 5에서 희석된 IVTT 반응 용액의 농도가 낮을수록 표적 단백질의 함량이 낮고 불순한 단백질의 함량이 많다.
상등액을 분리하여 유동 용액을 얻었다. 대조군 니켈 비드 및 KM 자성 비드를 각각 1mL 세척 용액(pH 8.0의 50mM Tris-HCl, 500mM 염화나트륨, 20mM 이미다졸)으로 두 번 세척하고, 마지막으로, 비드를 200μL 용리액(pH 8.0의 50mM Tris-HCl, 500mM 염화나트륨, 250mM 이미다졸)으로 한 번만 용리했다. 세척 또는 용출의 각 단계에 대해, 모두 4°C에서 5~10분간 회전하면서 배양하였고, 각 단계에서 얻은 상등액을 모아 RFU 값을 측정하였다.
30μL의 용리액을 8μL 로딩 완충액(pH 6.8의 Tris-HCl 250mM, 10%(w/v) SDS, 0.5%(w/v) 브로모페놀 블루(BPB, CAS: 115-39-9), 50%(v/v) 글리세롤, 5%(v/v) β-메르캅토에탄올)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 8분 동안 균일하게 끓이고, 모든 로딩 샘플에 대해 SDS-PAGE 전기영동 검출을 수행하였다. 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1의 젤 이미지는 밴드의 밝기 값을 얻기 위해 Image-J 소프트웨어로 분석되었다. 계산 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6에서 레인(lane)은 각 레인의 번호, Total은 각 레인의 각 밴드의 전체 밝기, eGFP는 각 레인의 타겟 밴드(eGFP, 약 26.7kDa)의 밝기를 나타낸다. eGFP/Total은 마그네틱 비드를 정제하여 얻은 시료 내 표적 단백질의 함량 비율을 반영한다.
각 밴드의 전체 밝기에 대한 타겟 밴드 eGFP의 밝기의 비율, 즉 eGFP/Total은 순도를 나타낸다. 결과는 KM 자성 비드의 정제로 얻은 순도가 대조 니켈 비드의 정제로 얻은 것보다 더 나은 것으로 나타났다. 여기서, KM 자성 비드의 정제된 제품의 순도는 최대 92.5%일 수 있다.
두 개의 자성 비드를 정제하여 얻은 시료의 전기영동 검출 밴드의 밝기 값 비교
사용된 자성 비드 lane eGFP Total eGFP/Total
KM 자성비드 1 10061.5 11094 0.907
2 9882.4 11001.4 0.898
3 9684.8 10466.8 0.925
4 9139.4 9959.5 0.918
5 8121.6 9480.6 0.857
6 6433.6 8999 0.715
7 6057 35508.4 0.171
8 2536.1 72200.9 0.035
대조군 니켈 비드 1 8164.4 9441.8 0.865
2 8008.2 9237.6 0.867
3 7509.4 8649.6 0.868
4 7006.6 8061.7 0.869
5 5847.6 6592.9 0.887
6 5025.7 6278.2 0.801
7 4221.3 37958.9 0.111
8 1765 56558.8 0.031
2.2.2. B-KM 마그네틱 비드 정제물의 순도 시험
상기 언급된 섹션 2.1.5에서 얻은 B-KM 자성 비드의 순도 테스트와 분석을 수행하였다. 전기영동 스펙트로그램에서 각 밴드의 밝기 값은 Image-J 소프트웨어로 분석되었다. 결과는 표적 단백질의 순도가 최대 97%일 수 있음을 보여주었다. 도 4를 참조하면, 100%는 순수한 IVTT 반응용액을 나타낸다. 60%는 부피로 순수한 IVTT 반응 용액의 60%와 부피로 희석제의 40% 혼합을 나타낸다.
실시예 3: 생체자기 마이크로스피어의 효과 검증
3.1. 반딧불이 루시퍼라아제의 분리 및 정제
KM 마그네틱 비드의 효과를 더 확인하기 위해 IVTT 반응을 수행하여 반딧불이 루시퍼라아제(루시퍼라아제로 약칭할 수 있음)를 발현시키고, 친화도 분석을 수행하였다. 반딧불이 루시퍼라아제는 히스티딘 태그를 포함하고, 얻어진 단백질 생성물은 His 태그의 표지이다.
KM 자성 비드 및 대조군 니켈 비드를 결합 완충액(pH 8.0을 갖는 50mM Tris-HCl, 500mM 염화나트륨, 5mM 이미다졸)으로 3회 세척하고, 상등액 및 침전물을 분리하였다. 3 μL의 각 종류의 비드를 7개의 원심분리 튜브에 피펫으로 옮겼다(표 7 참조).
반딧불이 루시퍼라아제(히스티딘 태그 함유)를 발현하는 IVTT 반응용액 1mL를 획득하고, 획득된 IVTT 반응용액을 4000rpm에서, 4℃에, 10분간 원심분리하였다. 침전물을 버리고 상등액과 결합 완충액을 표 7의 부피비로 혼합하였다. 생성된 혼합물을 상응하는 원심분리 튜브에 첨가하고 완전히 혼합하고 회전 하에 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
IVTT 반딧불이 루시퍼라아제 시스템
1mL 시스템에 첨가된 샘플의 양
No. 루시퍼라아제 백분율/% 루시퍼라아제/μL 결합 완충액/μL
1 5 50 950
2 2 20 980
3 1.5 15 985
4 1 10 990
5 0.8 8 992
6 0.6 66 994
7 0.4 4 996
상등액을 분리하여 유동 용액을 얻었다. 비드를 1mL 세척 용액(pH 8.0을 갖는 50mM Tris-HCl, 500mM 염화나트륨, 20mM 이미다졸)으로 2회 세척하고; 마지막으로, 비드를 200μL 용리액(pH 8.0의 50mM Tris-HCl, 500mM 염화나트륨, 250mM 이미다졸)으로 한 번만 용리했다. 세척 또는 용출의 각 단계에 대해 모두 4°C에서 5~10분간 회전하면서 배양하고, 각 단계에서 얻은 상등액을 수집하고, Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 RFU 값을 측정했다.
IVTT 반응용액으로 처리한 반딧불이 루시퍼라아제의 검출 결과
No. 루시퍼라아제백분율(%) 반응용액RLU 값 유동 용액 RLU 값 결합효율
(%)		 기질농도(mg/mL)
1 5 168497750 6832107 95.9 0.339
2 2 63708857 2866446 95.5 0.129
3 1.5 51453687 2366899 95.4 0.105
4 1 23863700 1249596 94.8 0.049
5 0.8 15474300 847806 94.5 0.033
6 0.6 10211157 623941 93.9 0.022
7 0.4 6620700 406262 93.9 0.015
결합효율 = (1-유동 용액 RLU 값/반응용액 RLU 값) x 100% 공식에 따라 결합 효율을 계산하고, 친화도 값은 기질의 50%가 결합될 때의 기질의 농도였다.
정제된 루시퍼라아제에 따라 표준곡선을 작성하였으며, 루시페라아제의 RLU 값을 단백질 질량 농도로 변환하는 공식은 Y=5(E+08)X-850502, 즉 Y=5x108×X-850502이다. 여기서, X는 단백질 질량 농도(μg/mL)를 나타내고 Y는 RFU 형광 판독값을 나타낸다. 테스트 범위에서 Y는 기본적으로 X에 비례했다.
측정된 반응용액 및 유동 용액의 RLU 판독값을 위의 공식에 대입하여 각각 표적 단백질 농도를 계산하였다.
실험 결과(표 8)에서 표적 단백질의 질량 농도를 339 μg/ml에서 15 μg/ml로 감소시켰을 때 표적 단백질에 대한 KM 마그네틱 비드의 결합효율이 여전히 90% 이상 훨씬 높음을 알 수 있다. No.7의 반응용액의 RLU 값이 기기의 검출한계에 가깝기 때문에, 목적 단백질 농도를 더 이상 낮추지 않고 결합효율을 50%로 낮추어 특정 친화도 값을 얻을 수 있다. 그러나 반정성적 결론을 얻을 수 있다. 즉, KM 자성 비드가 표적 단백질에 강한 친화력을 가지며 친화력이 적어도 ng/ml 수준에 도달할 수 있다는 것이다.
3.2. B-KM 자성 비드의 친화성 시험 및 분석
소듐 폴리아크릴레이트 자성 비드(200224-ZZ-1)는 상기 섹션 2.1.5의 B-KM 자성 비드 제조 방법을 사용하여 제조되었다. eGFP를 발현하는 IVTT 반응용액을 이용하여 3.1절에 기술된 방법에 따라 친화성 시험 및 분석을 수행하였고, 그 결과를 표 9에 나타내었다. 결합 효율은 90% 이상이었고 최대 99.3%까지 가능하였다.
표적 단백질이 90% 흡착된 농도(결합 효율 90%)가 0.3 μg/mL(300 ng/mL)인 경우 반정성적 결론을 얻을 수 있다. 즉, ng/mL 수준에 도달한다.
B-KM 자성 비드의 친화도 분석
eGFP 백분율 (%) RFU 값 결합효율(%) (200224-ZZ-1)
반응용액 전체 유동 용액
(200224-ZZ-1)		 NC
0 1 1 2 0.0
0.5 32 2 1 96.8%
1 58 3 2 98.2%
2 127 7 5 98.4%
5 310 8 6 99.3%
10 556 11 7 99.3%
여기서 NC는 음성대조군이고 RFU 값은 배경 값으로 사용된다.
결합 효율의 계산 공식은: (반응용액 RFU 값 - 유동 용액 RFU 값) / (반응용액 RFU 값 - NC RFU 값)이다.
실시예 4 자성 마이크로스피어의 크기가 정제 효과에 미치는 영향 조사
4.1. SiO2 코팅된 자성 마이크로스피어(자성 마이크로스피어 본체, 자성 비드, 유리 비드라고도 함)의 제조
Fe3O4 마이크로스피어 20g을 에탄올 310mL와 물 125mL의 혼합용매에 넣고, 여기에 28%(wt) 암모니아수 45mL를 넣고 테트라에틸 오르토실리케이트 22.5mL를 적가한 후 교반하여 실온에서 24시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 마이크로스피어를 에탄올과 물로 세척하였다. 서로 다른 입자 크기(약 1 μm, 10 μm, 100 μm)를 갖는 Fe3O4 마이크로스피어를 원료로 사용하였고, 얻어진 유리 비드의 입자 크기를 조절하였다. 다양한 입자 크기를 갖는 Fe3O4 마이크로스피어는 통상적인 기술 수단으로 제조할 수 있다.
제조된 자성 마이크로스피어는 정제 매질을 개질하거나 요소-정제 매질 연결하기 위한 기본 재료로 사용되므로 자성 마이크로스피어 본체라고도 한다.
제조된 자성 마이크로스피어는 자성 코어를 가지고 있어 자력으로 제어하여 이동, 분산, 침강 및 기타 작업을 수행할 수 있으므로, 넓은 의미에서 일종의 자성 비드이다.
제조된 자성 마이크로스피어는 SiO2 코팅된 층이 있으므로 유리 비드라고도 하며, 이는 자성 코어에 의한 중합체, 정제 매질, 시험관 내 단백질 합성 시스템의 구성 요소, 핵산 주형, 단백질 발현 생성물 등의 구성 또는 구성요소의 흡착을 감소시킬 수 있다.
4.2. 다양한 크기의 유리 비드로 니켈 자성 비드 제조(SiO2 코팅된 자성 마이크로스피어)
1 μm, 10 μm 및 100 μm 직경의 유리 비드를 단계 4.1에 나타낸 제조 방법에 의해 자성 마이크로스피어로 제조한 다음, 실시예 1의 방법을 사용하여 니켈 자성 비드 Ni1, Ni10 및 Ni100을 각각 제조하였다. 다른 반응 매개변수는 유리 비드의 원료를 제외하고는 모두 동일했다.
준비된 니켈 자성 비드의 크기와 형태를 관찰하기 위해 현미경으로 사진을 찍는다. 그 결과를 도 5에 나타내었고, 약 1㎛(도 5(A) 및 (B)), 10㎛(도 5(C)) 및 100㎛(도 5(D))의 직경을 갖는 유리 비드를 얻었다. 도 5(A)는 정지 상태에서 촬영한 사진이고, 도 5(B)는 유동 상태에서 촬영한 사진이다.
4.3. IVTT 반응 용액의 정제 결과 비교
4.3.1. 체외 단백질 합성 시스템 구축(D2P 시스템, DNA-to-Protein 시스템)
시험관내 단백질 합성 반응은 바닥이 평평한 세포 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 샘플에 대해 3개의 병렬 샘플을 설정하고 평균 및 표준 편차(오차 막대)를 계산했다.
각 성분의 최종 농도는 다음과 같다. 9.78mM Tris·HCl, pH 8.0, 80mM 아세트산칼륨, 5mM 마그네슘 아세테이트, 1.8mM 뉴클레오사이드 삼인산 혼합물(아데노신 삼인산, 구아노신 삼인산, 시티딘 삼인산 및 우리딘 삼인산 포함, 뉴클레오사이드 삼인산의 각 종류별 농도는 1.8mM), 0.7mM 아미노산 혼합물(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 포함, 아미노산의 종류별 농도는 0.1mM), 15mM 포도당, 320mM 말토덱스트린(몰 농도는 글루코스 단위로 계산되며, 질량 부피 농도는 52mg/mL), 24mM 인산삼칼륨, 2%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 8000, 및 최종적으로 50부피%의 클루이베로마이세스 락티스 세포 추출물; 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 세포 추출물은 내인적으로 발현된 T7 RNA 중합효소를 함유한다.
클루이베로마이세스 락티스 세포 추출물은 CN109423496A에 기재된 방법을 사용하여 제조되었다. 일반적으로 T7 RNA 중합효소의 코딩 유전자를 클루이베로마이세스 락티스의 게놈에 통합하고 수득한 유전자 변형 균주를 배양에 사용하였으며, 적당량의 세포를 얻은 후 세포 추출물을 제조하였다.
4.3.2. 8His-mEGFP를 코딩하는 핵산 주형(DNA 주형)의 제조
8His-mEGFP(히스티딘 태그로 표지된 mEGFP, 여기서 mEGFP는 eGFP의 A206K 돌연변이체임)의 코딩 유전자를 포함하는 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 삽입하고 PCR 증폭 및 상동 단편 재조합 방법을 이용하여 mEGFP를 발현하는 플라스미드 벡터를 제작하였다. 플라스미드는 유전자 시퀀싱에 의해 정확한 것으로 확인되었다. 플라스미드 벡터는 T7 프로모터, 5'UTR, 리더 펩타이드의 코딩 서열, 8xHis(히스티딘 태그), mEGFP 코딩 서열, 3'UTR, LAC4 터미네이터, f1 ori(복제 기원 부위), AmpR 프로모터, AmpR 유전자(암피실린 내성 유전자), ori(고복사수 복제 기원 부위), lacI 프로모터, lacI(lac 억제제) 코딩 유전자 및 기타 기능적 구성요소를 포함한다.
RCA 증폭법을 채택하여 8His-mEGFP를 코딩하는 플라스미드 DNA를 핵산 주형으로 사용하고, phi29 DNA 중합효소를 이용하여 in vitro DNA 증폭을 수행하여 8His-mEGFP를 코딩하는 DNA 주형을 얻었다.
4.3.3. 시험관 내 단백질 합성 반응 수행(IVTT 반응)
4.3.2에서 제조된 8His-mEGFP(15ng/μL)를 인코딩하는 DNA 주형을 4.3.1.에서 구축한 시험관내 단백질 합성 시스템에 첨가하고 잘 혼합하였다. 혼합물을 실온(20~30℃)에서 3시간 동안 진탕시키면서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, IVTT 반응 용액(PC 그룹, 오리지널 단백질 용액)을 얻었다.
4.4. 정제 및 RFU 테스트
IVTT 반응 용액을 4.2.에서 준비한 다양한 크기의 니켈 자성 비드로 정제하여 자성 마이크로스피어의 크기가 정제 효과에 미치는 영향을 조사하였다.
1mL IVTT 반응 용액을 피펫팅하고 10μL, 5μL, 1μL 니켈 자성 비드 Ni1(1μm), 10μL, 5μL, 1μL 니켈 자성 비드 Ni10(10μm), 10μL, 5μL, 1 μL 니켈 자성 비드 Ni100(100μm)을 1mL IVTT 반응 용액에 첨가했다. 용액을 로테이터로 회전시켜 잘 섞이도록 하고 3시간 동안 배양하였다. 자석을 사용하여 용액에서 자성 비드를 분리하고 수집된 상등액을 침투 용액으로 기록했다. 투과액에 대해 형광시험을 수행하였으며, RFU 값은 자성 비드에 결합되지 않은 단백질의 양을 반영하였다. 샘플 처리: 샘플을 4°C에서 1분 동안 4000rpm에서 원심분리했다. 테스트할 샘플을 마이크로플레이트 리더에 넣고 여기 파장/방출 파장(Ex/Em): 488 nm/507 nm 507 nm를 사용하여 상대 형광 단위(RFU)를 결정했다.
4.5. 정제 결과 분석
니켈 자성 비드 Ni1(1μm)과 니켈 자성 비드 Ni10(10μm)의 정제 결과 비교를 도 6에 나타내었다. 니켈 자성 비드 Ni1(1μm)과 니켈 자성 비드 Ni10(100 μm)의 정제 결과 비교는 도 7에 나타내었다. 여기서, PC군은 4.3.3에서 얻은 IVTT 반응액의 RFU 시험 결과이다. 10 μL, 5 μL 및 1 μL은 각각 첨가된 니켈 자성 비드의 부피를 나타낸다. PC군의 RFU 값을 침투 용액의 RFU 값에서 빼서 차이를 구하였으며, 그 차이는 자성 비드에 결합된 단백질의 양에 해당하므로 단백질 결합 효율을 추정할 수 있다.
도 6에서, IVTT 반응 용액에서 단백질 생성물 8His-mEGFP의 농도는 97.4㎍/mL이었다. 니켈 자성 비드 Nil(1μm)의 단백질 결합 효율은 니켈 자성 비드 Nil(1μm)의 부피가 10μL, 5μL, 1μL일 때 각각 98.2%, 97.6%, 53.8%였다. 니켈 자성 비드 Nil0(10μm)의 단백질 결합 효율은 니켈 자성 비드 Nil0(10μm)의 부피가 10μL, 5μL, 1μL일 때 각각 96.9%, 51.9%, 24.7%였다. 니켈 자성 비드 Ni1(1μm)의 단백질 결합 효율은 각각 1.3%, 46.8% 및 54.1% 증가했다.
도 7에서, IVTT 반응 용액에서 단백질 생성물 8His-mEGFP의 농도는 57.9㎍/mL이었다. 3가지 다른 부피의 니켈 자성 비드 Ni1(1μm)의 단백질 결합 효율은 모두 98% 보다 높았고(98.3%-98.9%), 니켈 자성 비드 Nil00(100μm)의 단백질 결합 효율은 니켈 자성 비드 Nil 100(100μm)의 부피가 10μL, 5μL, 1μL 일 때 각각 87.5%, 46.9%, 15.2%였다. 니켈 자성 비드 Ni1(1μm)의 단백질 결합 효율은 각각 11.5%, 52.5% 및 84.6% 증가했다.
실시예 5: 중합체 사슬 길이의 영향 조사
5.1. 중합체 사슬 길이가 다른 자성 마이크로스피어의 제조
실시예 1의 방법을 사용하여 정제 매질로서 니켈 이온을 사용하여 자성 마이크로스피어를 제조하였으며, 여기서 중합된 단량체 나트륨 아크릴레이트의 농도는 각각 2.08mol/L 및 2.496mol/L이었으며, L15 및 L18로 표기되었다.
5.2. 정제 및 RFU 테스트
PC 용액(IVTT 반응이 완료되었을 때 얻은 IVTT 반응 용액)은 실시예 4에서 4.3에 기술된 방법으로 제조하였다. PC 용액을 상이한 비율로 희석하여 상이한 농도의 단백질 생성물(8His-mEGFP)을 함유하는 오리지널 단백질 용액을 얻었다.
음성 대조군(NC군)을 설정하였다: PC군을 참고하여 DNA 주형을 첨가하지 않고 동일한 조작을 수행하였고 수득된 "IVTT 반응 용액"을 NC군으로 하였다.
실시예 4에서 4.4의 방법을 사용하여 정제를 수행하였다. 희석 비율이 다른 1mL의 오리지널 단백질 용액을 얻었고, 2μL의 니켈 자성 비드를 첨가하고 반응을 위해 인큐베이션하였다. 마그네틱 비드가 분리된 투과액과 2세트의 용리액(용리액 1, 용리액 2)을 각각 채취하였다.
RFU 테스트는 실시예 4의 4.4의 방법을 사용하여 수행되었다(표 10 및 표 11). SDS-PAGE 전기영동 시험도 수행하였다(도시되지 않음). 시험할 용액에 대해 SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다. 염색은 Coomassie Brilliant Blue R-250을 사용하여 하룻밤 방치하였다. 탈색 후 목적 단백질 밴드를 관찰하여 목적 단백질의 분자량이 정확한지 분석하고 목적 단백질의 순도를 분석하는 데 사용할 수 있다. 검출 매개변수: 융합 단백질 생성물을 함유하는 용리액 30 μL를 수득하고, 5% β-메르캅토에탄올을 함유하는 5x 로딩 완충액 7.5 μL를 용리액에 첨가한 다음, 혼합물을 95℃에서 10분 동안 가열하고, 및 SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다. 염색은 Coomassie Brilliant Blue R-250을 사용하여 하룻밤 방치하였다. 탈색 후 목적 단백질 밴드의 크기와 순도를 관찰하였다.
표 10에서 단백질 결합 효율은 하기 식 1-(RFUft-RFU0)/(RFUori-RFU0), 즉 (RFUori-RFUft)/(RFUori-RFU0)로 계산하였다. 해당 비율로 희석된 NC 그룹의 원래 단백질 용액과 용액은 동일한 부피를 가졌고, 침투 용액의 부피는 기본적으로 원래 단백질 용액 및 NC 그룹의 용액과 동일하였다. 표 10에서 알 수 있듯이, 중합체 사슬 길이가 증가할수록 니켈 자성 비드에 의한 단백질 생성물의 포획율(결합 효율, 결합율)도 증가함을 알 수 있다. L15(2.08mol/L 아크릴산나트륨) RFU320 및 L18(2.496mol/L 아크릴산나트륨) RFU310의 단백질 결합 효율은 각각 85% 및 99%였다. L18의 단백질 결합 효율은 16.5% 증가했다.
표 11에서 고농도 단백질 용액을 사용한 경우 L15(2.08mol/L 아크릴산나트륨) 및 L18(2.496mol/L 아크릴산나트륨)의 단백질 결합 효율은 각각 41.78% 및 55.55%였으며, 자성 비드의 단위 부피당 단백질 결합능은 각각 40.0 μg/μL 및 61.7 μg/μL이다. 중합체 사슬이 길고 분지된 사슬이 많은 L18의 단백질 결합 효율과 자성 비드의 단위 부피당 단백질 결합능은 각각 33.0% 및 54.5% 증가했다.
또한, 용출액 함유 단백질 제품의 SDS-PAGE 전기영동 검출 결과, L15(2.08 mol/L 아크릴산나트륨)의 순도에 비해 L18(2.496 mol/L sodium acrylate)의 순도도 증가함을 확인하였다.
2.08 mol/L 및 2.496 mol/L 아크릴산나트륨으로 중합된 니켈 자성 비드의 정제 결과 비교
L15
2.08 mol/L 아크릴산나트륨		 L18
2.496 mol/L 아크릴산나트륨 (긴 사슬)
RFU 평균 단백질 결합 효율 RFU 평균 단백질 결합 효율
오리지널 단백질 용액 NC군 투과용액 오리지널 단백질 용액 NC군 투과용액
RFU ori RFU 0 RFU ft RFU ori RFU 0 RFU ft
21 3 4 94% 32 1 2 96.8%
38 3 4 97% 58 2 3 98.2%
79 5 8 96% 127 5 7 98.4%
153 7 21 90% 310 6 8 99.3%
320 14 61 85% 556 7 11 99.3%
11. 2.08 mol/L 및 2.496 mol/L 아크릴산나트륨으로 중합된 생체자성 비드의 정제 결과 비교(자성 비드의 부피는 2 μL임)
아크릴산나트륨 농도 측정형태 오리지널 단백질 용액 투과용액 용리액 1 용리액 2 단백질 결합 효율 결합능(mg/mL)
L15

2.08 mol/L		 RFU value 2820 323 10891 1902 　/ /
농도(μg/mL) 191.3 18.8 872.9 126.2 　/ /
부피(mL) 1 1 0.08 0.08 / /
단백질 양(μg) 191.3 18.8 69.8 10.1 41.78% 40.0
L18

2.496 mol/L		 RFU 값 4521 879 16085 1140 　
농도(μg/mL) 317.5 56.0 1469.8 73.7 / /
부피(mL) 0.7 0.7 0.08 0.08 / /
단백질 양(μg) 222.3 39.2 117.6 5.9 55.55% 61.7
농도: 단백질 제품의 농도는 실시예 2에서 섹션 2.1의 변환 공식을 사용하여 얻는다.
단백질 결합 효율 = (용리액 1 + 용리액 2)/오리지널 단백질 용액, 이는 단백질 양을 기준으로 한다.
자성 비드의 단위 부피당 단백질 결합량 = (용리액 1의 단백질 양 + 용리액 2의 단백질 양)/결합 용량이라고도 하는 자성 비드의 부피(mg/mL 또는 μg/μL).
결합능: 자성 비드의 단위 부피당 단백질 결합량.
이상의 설명은 본 발명의 일부 실시예에 불과하며, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않는다.
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Claims (14)

  1. 생체자기 마이크로스피어의 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면이 분지쇄를 갖는 적어도 하나의 선형 중합체를 갖는 생체자기 마이크로스피어로서; 상기 분지쇄를 갖는 선형 중합체의 일단은 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 공유 결합으로 커플링되고, 복수의 다른 부분들은 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에서 유리되고; 상기 선형 중합체의 백본은 폴리올레핀 백본이고, 상기 선형 중합체의 분지쇄에는 작용기가 포함되어 있으며, 이 작용기는 대상물에 결합할 수 있는, 생체자기 마이크로스피어.
  2. 제1항에 있어서, 상기 선형 중합체는 아크릴산, 아크릴레이트, 아크릴산에스테르, 메타크릴산, 메타크릴산, 메타크릴산에스테르, 기타 복수의 아크릴계 단량체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 중합하여 얻어지며; 바람직하게는, 선형 중합체의 백본 형성 과정에서 가교제가 필요하지 않는, 생체자기 마이크로스피어.
  3. 제1항에 있어서, 상기 작용기는 특이적 결합 부위를 포함하고, 상기 특이적 결합 부위는 표적 대상에 특이적으로 결합할 수 있고;
    바람직하게는, 특이적 결합 부위는 니켈 이온이고, 니켈 이온은 His 태그의 표지에 특이적으로 결합할 수 있는, 생체자기 마이크로스피어.
  4. 제1항에 있어서, 상기 선형 중합체의 작용기는 카르복실, 히드록실, 아미노, 술프히드릴 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 생체자기 마이크로스피어.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선형 중합체는 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 직접 고정되거나, 링킹그룹을 통해 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 간접적으로 고정되는, 생체자기 마이크로스피어.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자성 마이크로스피어 본체는 SiO2가 코팅된 자성 입자인, 생체자기 마이크로스피어.
  7. 제6항에 있어서, 상기 자성입자는 철화합물, 철합금, 산화아연, 산화망간 혼합물, 산화가돌리늄 혼합물, 코발트화합물, 니켈화합물, 니켈합금, 망간 산화물, 망간 합금, 아연 산화물, 가돌리늄 산화물, 크롬 산화물, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 화학성분을 가지며,
    바람직한 실시예 중 하나에서, 상기 자성 입자는 산화철, 산화아연, 산화망간 혼합물, 산화가돌리늄 혼합물, 산화코발트, 산화니켈, 산화망간, 산화아연, 산화가돌리늄, 크롬 산화물, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 화학성분을 가지고;
    바람직한 실시예 중 하나에서, 상기 자성 입자는 산화철, 철, 코발트, Co2+, 질화철, Mn3O4, GdO, 니켈, Ni2+ 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 화학 성분을 가지며; 여기서, 산화철은 바람직하게는 Fe3O4, γ-Fe2O3, 및 이들의 조합이고;
    바람직한 실시예 중 다른 하나에서, 상기 자성 입자는 Fe3O4, γ-Fe2O3, 질화철, Mn3O4, AlNi(Co), FeCr(Co), FeCrMo, FeAlC, AlNi(Co), FeCrCo, ReCo, ReFe, PtCo, MnAlC, CuNiFe, AlMnAg, MnBi, FeNi(Mo), FeSi, FeAl, FeNi(Mo), FeSiAl, BaO·6Fe2O3, SrO·6Fe2O3, PbO·6Fe2O3, GdO 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 화학 성분을 가지며; 여기서 Re는 희토류 원소인 레늄인, 생체자기 마이크로스피어.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 생체자기 마이크로스피어의 제조방법으로서, 하기 복수의 단계를 포함하는 생체자기 마이크로스피어의 제조방법.
    (1) 자성 마이크로스피어 A를 형성하기 전에 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 아미노기를 도입함으로써 자성 마이크로스피어 본체에 화학적 개질을 수행하는 단계;
    바람직한 실시예 중 하나에서, 상기 자성 마이크로스피어 본체에 대한 화학적 개질은 실란 커플링제로 수행된다;
    (2) 카르복실기와 아미노기의 공유 반응을 이용하여 자성 마이크로스피어 A의 외부 표면에 아크릴산 분자를 공유 결합으로 커플링함으로써, 탄소-탄소 이중 결합을 도입하여 자성 마이크로스피어 B를 형성하는 단계;
    (3) 가교제 없이, 얻어진 선형 중합체가 자성 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유 결합된 탄소-탄소 이중 결합의 중합 반응에 의해 아크릴계 단량체 분자를 중합한 후, 고액 분리하고 액상을 제거하여 자성 마이크로스피어 C를 얻는 단계;
    상기 작용기가 특이적 결합 부위를 포함하는 경우, 상기 방법은 (4) 자성 마이크로스피어 C의 선형 중합체의 분지쇄에서 특이적 결합 부위를 커플링시키는 단계;를 더 포함하고;
    바람직한 실시예 중 하나에서, 아크릴 단량체 분자는 아크릴산나트륨 단량체 분자이다.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 있어서, 하기 복수의 단계를 포함하는 생체자기 마이크로스피어의 제조방법.
    (I) 트리메톡시실란화된 아크릴 분자를 사용하여 자성 마이크로스피어 본체에 화학적 개질을 수행하고, 자성 마이크로스피어 B를 형성하기 전에 자성 마이크로스피어 본체의 외부 표면에 탄소-탄소 이중 결합을 도입하는 단계;
    상기 트리메톡시실란화된 아크릴 분자는 바람직하게는 γ-메타크릴옥시 프로필 트리메톡실 실란이다;
    (II) 가교제의 부재하에, 얻어진 선형 중합체가 자성 마이크로스피어 B의 외부 표면에 공유 결합된 탄소-탄소 이중 결합 사이의 중합 반응에 의해 아크릴계 단량체 분자를 중합한 후, 고액 분리하고 액상을 제거하여 자성 마이크로스피어 C를 얻는 단계;
    상기 작용기가 특이적 결합 부위를 포함하는 경우, 상기 방법은 (4) 자성 마이크로스피어 C의 선형 중합체의 분지쇄에서 특이적 결합 부위를 커플링시키는 단계;를 더 포함하고,
    바람직한 실시예 중 하나에서, 상기 아크릴 단량체 분자는 아크릴산나트륨 단량체 분자이다.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 하기의 단계를 더 포함하는 생체자기 마이크로스피어의 제조방법.
    (4) 트리카르복실산 아민을 자성 마이크로스피어 C에 결합시킨 후, Ni2+를 트리카르복실산 아민의 잔기에 있는 3개의 카르복실기와 커플링시켜 자성 마이크로스피어 D, 즉 표적 생체자기 마이크로스피어를 얻는 단계; 여기서 상기 표적 생체자기 마이크로스피어는 His 태그의 표지에 특이적으로 결합할 수 있다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 트리카르복실산 아민은 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신이고, 상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신의 양은 바람직하게는 범위는 0.5g/L ~ 550g/L인, 생체자기 마이크로스피어의 제조방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서 자성 마이크로스피어 A의 제조를 위한 아크릴산의 양이 0.002 mol/L 내지 20 mol/L 범위이고; 단계 (3)에서 자성 마이크로스피어 B의 제조를 위한 아크릴산나트륨의 양은 0.53 mol/L 내지 12.76 mol/L 범위인, 생체자기 마이크로스피어의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 생체자기 마이크로스피어를 이용한 단백질의 분리 방법으로서,
    (1) 생체자기 마이크로스피어에 결합 완충액을 첨가하여 잘 혼합하고, 생체자기 마이크로스피어를 자기적으로 분리하고, 분리된 생체자기 마이크로스피어를 분리하고자 하는 단백질이 포함된 용액에 첨가하고 잘 혼합하고 배양하여, 표적 단백질이 결합하는 생체자기 마이크로스피어 E를 얻는 단계;
    (2) 상등액을 제거하기 전에 고액 분리를 수행하고, 생체자기 마이크로스피어 E를 세척액으로 세척하고, 생체 마이크로스피어 E를 용리제로 용리하여 상등액을 수집하는 단계;
    (3) 상기 상등액으로부터 표적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 생체자기 마이크로스피어를 이용한 단백질의 분리 방법.
  14. 단백질 분리 및 정제, 면역분석, 표적 항체 약물 농축, 표적 약물 전달, 핵산 분리 및 추출, 세포 분류, 효소 고정, 및 유전자 벡터 구성을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 생체자기 마이크로스피어의 복수의 용도.
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