JP6532202B2 - 磁性粒子、リガンド結合粒子、標的物質の検出又は分離方法、及び前記磁性粒子の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、磁性粒子、リガンド結合粒子、標的物質の検出又は分離方法、及び前記磁性粒子の製造方法に関する。

タンパク質、核酸、細胞等の標的物質を血液等の試料から検出・分離することを目的として磁性粒子やセンサーチップ等の固相担体が利用されている。固相担体を用いた検出・分離法としては、固相担体にリガンドを結合させ、これに試料を接触させることによって標的物質をリガンドと反応させる方法が一般的であるが、上記接触の際に、試料中の標的物質や不純物が、リガンドではなく固相担体の表面に非特異的に吸着し、これがノイズとなり、検出感度を低下させる場合がある。

そこで、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリルアミド）・ポリ（メタクリル酸）ブロックコポリマー等を原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）により表面に導入することでポリマーブラシを形成させた磁性粒子（特許文献１）が知られている。
しかしながら、上記磁性粒子は、磁性粒子の表面に結合した各コポリマーの側鎖部に、カルボキシ基等の反応性官能基が連続的に多数存在するものであるため、リガンドが多点で反応性官能基と結合してしまう場合がある。このようにリガンドが多点で結合すると、リガンド本来の構造が崩れ、活性が低下してしまうおそれがある。また、ＡＴＲＰで反応性官能基を導入する場合、僅かな反応条件の変化（例えば、反応時間、反応温度、系中の酸素濃度等）で反応性官能基量が増減しやすく、再現性良く所望の粒子を得るのは容易でない。

一方、反応性官能基を末端に有する鎖状ポリマーが表面に結合した構造体として、カルボキシアルキルチオ基を末端に導入した鎖状ポリマーが表面に結合した金蒸着基板（特許文献２）や、ヒドロキシエチルアミノ基を末端に導入した鎖状ポリマーが表面に結合した金蒸着基板（非特許文献１）が知られている。

特表２００９−５４２８６２号公報 特許第４８１８０５６号公報

Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４，３２９４−３３０３

斯様な背景の下、本発明者が、磁性粒子の表面に結合した鎖状ポリマーの末端に、カルボキシアルキルチオ基を導入したところ、色調変化を伴う変性が生じることが判明した。この色調変化は、上記導入に使用されるチオール基含有化合物により、磁性粒子に含まれる磁性体が還元されたことによるものと推察され、磁気性能の変化を招くおそれがある。
したがって、本発明が解決しようとする課題は、非特異吸着が生じにくく、且つ色調変化を伴うような変性が生じていない、反応性官能基を末端に有する鎖状ポリマーが表面に結合した磁性粒子を提供することにある。

そこで、本発明者は、鋭意検討した結果、親水性繰り返し単位を有する鎖状ポリマーが特定密度で表面に結合してなる磁性粒子の末端に、イミノ基又はＮ−置換イミノ基という特定の連結基を介して反応性官能基を導入することによって、非特異吸着が生じにくいだけでなく、色調変化を伴うような変性が生じていない磁性粒子が得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、＜１＞鎖状ポリマーが少なくとも表面に結合してなる磁性粒子であって、前記鎖状ポリマーが、親水性繰り返し単位を有し、且つ前記磁性粒子に結合していない側の末端に、イミノ基又はＮ−置換イミノ基を介して、反応性官能基を含む基を有する鎖状ポリマーであり、前記磁性粒子の表面に対して前記鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１本／ｎｍ²以上である、磁性粒子を提供するものである。

また、本発明は、＜２＞上記＜１＞の磁性粒子にリガンドを結合させてなる、リガンド結合粒子を提供するものである。

さらに、本発明は、＜３＞上記＜２＞のリガンド結合粒子を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法を提供するものである。

さらに、本発明は、＜４＞（工程１）重合開始基を少なくとも表面に有する原料磁性粒子を準備する工程と、（工程２）前記重合開始基を起点として、親水性モノマーを重合させる工程と、（工程３）前記工程２で原料磁性粒子の表面に形成された鎖状ポリマーの末端に、１又は２級アミノ基を有する化合物を反応させる工程を含むことを特徴とする、上記＜１＞の磁性粒子を製造する方法を提供するものである。

本発明の磁性粒子は、試料中の標的物質や不純物が表面に吸着しにくく非特異吸着が抑制されており、且つ色調変化を伴うような変性が生じていない。さらに、標的物質を試料から検出・分離する上で充分な量のリガンドを結合させることができる。
また、本発明の製造方法によれば、非特異吸着が生じにくく、色調変化を伴うような変性が生じておらず、標的物質を試料から検出・分離する上で充分な量のリガンドを結合させることができる磁性粒子を、簡便に製造できる。

＜磁性粒子＞
本発明の鎖状ポリマーが少なくとも表面に結合してなる磁性粒子は、鎖状ポリマーが、親水性繰り返し単位を有し、且つ磁性粒子に結合していない側の末端に、イミノ基（−ＮＨ−）又はＮ−置換イミノ基を介して、反応性官能基を含む基を有する、鎖状ポリマーであり、磁性粒子の表面に対して鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１本／ｎｍ²以上であることを特徴とするものである。まず、本発明の磁性粒子について詳細に説明する。

（親水性繰り返し単位）
親水性繰り返し単位としては、親水性基を有する繰り返し単位が好ましく、親水性基を側鎖に有する繰り返し単位がより好ましい。
例えば、親水性基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する繰り返し単位、親水性基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位、親水性基を有するスチレン系モノマーに由来する繰り返し単位が挙げられる。中でも、非特異吸着抑制の観点から、親水性基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する繰り返し単位、親水性基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位が好ましい。

また、親水性基としては、水酸基、アルコキシ基、ポリオキシアルキレン基、双性イオン構造を有する基、スルホニル基、スルフィニル基、リン酸基が挙げられ、これらのうち１種を有していてもよく、２種以上を有していてもよい。アルコキシ基としては、炭素数１又は２のアルコキシ基が好ましい。例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。
これらの中でも、親水性基としては、非特異吸着抑制の観点から、水酸基、双性イオン構造を有する基、ポリオキシアルキレン基、リン酸基が好ましく、水酸基、双性イオン構造を有する基、ポリオキシアルキレン基がより好ましい。

上記ポリオキシアルキレン基としては、−（Ｒ^aＯ）_q−で表される基が好ましい（Ｒ^aは、アルカンジイル基を示し、ｑは、２〜１００の整数を示す。なお、ｑ個のＲ^aは同一でも異なっていてもよい）。
Ｒ^aで示されるアルカンジイル基の炭素数は、好ましくは２〜４であり、より好ましくは２又は３であり、特に好ましくは２である。
また、Ｒ^aで示されるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。これらの中でも、エタン−１，２−ジイル基が好ましい。
ｑは、２〜１００の整数を示すが、好ましくは３〜８０の整数であり、より好ましくは４〜６０の整数であり、さらに好ましくは５〜４０の整数であり、さらに好ましくは６〜３０の整数であり、特に好ましくは７〜２０の整数である。

上記双性イオン構造を有する基としては、非特異吸着抑制の観点から、第４級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-、−ＳＯ₃ ^-及び−Ｏ−（Ｏ＝Ｐ−Ｏ^-）−Ｏ−から選ばれる１価又は２価のアニオン性官能基とを有する有機基が好ましく、下記式（１）又は（２）で表される有機基がより好ましく、下記式（１）で表される有機基が特に好ましい。

〔式（１）中、
Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｒ³は、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-又は−ＳＯ₃ ^-を示し、
Ｒ⁴及びＲ⁵は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕

〔式（２）中、
Ｒ⁶及びＲ⁷は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｒ⁸、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕

式（１）中のＲ¹及びＲ²、式（２）中のＲ⁶及びＲ⁷は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示すが、非特異吸着抑制の観点から、炭素数１〜１０の２価の有機基が好ましく、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、炭素数２〜１０の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基がより好ましく、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基が特に好ましい。
２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４がさらに好ましく、１〜３が特に好ましい。一方、２価の有機基が２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜８が好ましく、２〜６がより好ましく、２〜４がさらに好ましく、２又は３が特に好ましい。

Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁶及びＲ⁷における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。

式（１）中のＲ³としては、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-が好ましい。
式（１）中のＲ⁴及びＲ⁵、式（２）中のＲ⁸、Ｒ⁹及びＲ¹⁰としては、メチル基が好ましい。

また、親水性繰り返し単位の好適な具体例としては、下記式（３）で表される繰り返し単位が挙げられる。

〔式（３）中、
Ｒ¹¹は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ¹²は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁴−＊（Ｒ¹⁴は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（３）中のＲ¹³と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ¹³は、双性イオン構造を有する基、水酸基を有する有機基、又はポリオキシアルキレン基を有する有機基を示す。〕

式（３）中、Ｒ¹²としては、非特異吸着抑制の観点から、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−＊が好ましい。

Ｒ¹³で示される双性イオン構造を有する基は、上記双性イオン構造を有する基と同様である。

Ｒ¹³で示される水酸基を有する有機基としては、下記式（４）で表されるものが挙げられる。

〔式（４）中、Ｒ¹⁵は、２価の有機基を示す。〕

Ｒ¹⁵で示される２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられるが、好ましくは２価の炭化水素基である。
２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４がさらに好ましく、１〜３が特に好ましい。一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜８が好ましく、２〜６がより好ましく、２〜４がさらに好ましく、２又は３が特に好ましい。

Ｒ¹⁵における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。

Ｒ¹³で示されるポリオキシアルキレン基を有する有機基としては、−（Ｒ^aＯ）_q−Ｒ^bで表される基が好ましい（Ｒ^bは、炭素数１〜４のアルキル基を示す。なお、Ｒ^a及びｑは前記と同義であり、Ｒ^aはアルカンジイル基を、ｑは２〜１００の整数を、それぞれ示す）。
Ｒ^bで示されるアルキル基の炭素数は、好ましくは１〜３であり、より好ましくは１又は２である。また、Ｒ^bで示されるアルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられるが、メチル基が特に好ましい。

また、鎖状ポリマーは、上記親水性繰り返し単位以外の繰り返し単位を有していてもよいが、親水性ポリマーであるのが好ましく、上記親水性繰り返し単位のホモポリマーであるのがより好ましい。また、鎖状のビニルポリマーが好ましい。
ここで、本明細書において、親水性とは、水との親和力が強い性質を持つことを意味する。具体的には１種の繰り返し単位のみからなるホモポリマー（実施例の測定法による数平均分子量が１，０００〜１００，０００程度のもの）が、常温（２５℃）において純水１００ｇに対して１ｇ以上溶解する場合にはその繰り返し単位は親水性である。

（末端構造）
上記鎖状ポリマーは、磁性粒子に結合していない側の末端に、イミノ基（−ＮＨ−）又はＮ−置換イミノ基を介して、反応性官能基を含む基を有するものである。斯かる末端構造を、イミノ基又はＮ−置換イミノ基を含めて示すと以下の式（５）のとおりである。

〔式（５）中、
Ｒ¹⁶は、水素原子又は置換基を示し、
Ｒ¹⁷は、反応性官能基を含む基を示す。〕

Ｒ¹⁶で示される置換基としては、アルキル基が挙げられる。当該アルキル基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１又は２がより好ましい。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ¹⁶としては、効率よくリガンドが結合する観点から、水素原子が好ましい。

Ｒ¹⁷は、反応性官能基を含む基を示す。反応性官能基としては、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基、アジド基が挙げられ、これらのうち１種を有していてもよく、２種以上を有していてもよい。これらの中でも、結合したリガンドが外れにくくする観点や、リガンドとしてタンパク質や核酸等の生体分子を使用する場合に、リガンドが元来有している官能基を使用して磁性粒子と結合できる点から、カルボキシ基、トシル基、１級アミノ基、エポキシ基が好ましく、磁性粒子に対しリガンドを簡便且つ迅速に結合させやすい点等から、カルボキシ基がより好ましい。

また、Ｒ¹⁷で示される反応性官能基を含む基としては、下記式（６）で表される有機基が好ましい。

〔式（６）中、
Ｒ¹⁸は、２価の有機基を示し、
Ｙは、反応性官能基を示す。〕

Ｒ¹⁸で示される２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられる。
２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜１０が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６が特に好ましい。一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜１０が好ましく、２〜８がより好ましく、２〜６が特に好ましい。

Ｒ¹⁸における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。

また、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、簡便に鎖状ポリマーが得られる観点等から、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエステル結合を有する基が好ましく、−Ｒ^c−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ^d−＊で表される２価の基がより好ましい（Ｒ^c及びＲ^dは、それぞれ独立して、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、＊は、式（６）中のＹとの結合位置を示す）。アルカンジイル基の炭素数としては、２又は３が好ましく、２がより好ましい。アルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。

また、上記反応性官能基の含有量は、リガンド結合量の観点から、磁性粒子の固形分１ｇあたり、好ましくは０．７μｍｏｌ以上、より好ましくは１μｍｏｌ以上、さらに好ましくは２μｍｏｌ以上であり、また、好ましくは５０μｍｏｌ以下、より好ましくは４０μｍｏｌ以下、さらに好ましくは３０μｍｏｌ以下である。
反応性官能基の含有量は、例えば、反応性官能基がカルボキシ基の場合、電気伝導度測定法等により測定可能であり、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。また、反応性官能基がトシル基の場合は、磁性粒子に導入されたトシル基の紫外可視光吸収を測定するなどして求めることができ、反応性官能基がアミノ基の場合は、アミノ基にＮ−スクシイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートを反応させた後、還元し、遊離のチオピリジル基の吸光度を測定するなどして求めることができる。

また、鎖状ポリマーの上記とは別の末端は、磁性粒子の表面に結合していれば特に限定されないが、重合開始基の残基を含む２価の連結基を介して磁性粒子の表面に結合しているのが好ましい。重合開始基としては、リビング重合可能な重合開始基が好ましく、リビングラジカル重合開始基がより好ましく、原子移動ラジカル重合開始基、可逆的付加開裂連鎖移動重合開始基がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合開始基が特に好ましい。原子移動ラジカル重合開始基の残基を含む２価の連結基としては、下記式（７−１）又は（７−２）で表される２価の基が挙げられる。

〔上記式中、
Ｒ¹⁹及びＲ²³は、−Ｏ−又は−ＮＨ−を示し、
Ｒ²⁰及びＲ²⁴は、それぞれ独立して、単結合又はフェニレン基を示し、
Ｒ²¹及びＲ²²は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、
＊＊は、鎖状ポリマーの末端と結合する位置を示す。〕

Ｒ¹⁹及びＲ²³としては、−Ｏ−が好ましく、Ｒ²⁰及びＲ²⁴としては、単結合が好ましく、Ｒ²¹及びＲ²²としては、アルキル基が好ましい。
Ｒ²¹及びＲ²²で示されるアルキル基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜４がより好ましく、１又は２が特に好ましい。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。

また、本発明の磁性粒子は、磁性粒子の表面に対して上記鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１本／ｎｍ²以上である。すなわち、磁性粒子表面上で、鎖状ポリマーから構成されるポリマーブラシが形成されており、そして、上記構成により、充分な量のリガンドを結合できるようになり、且つ非特異吸着抑制効果が改善される。
上記鎖状ポリマーの密度は、非特異吸着を抑制する観点及びリガンド結合量の観点から、好ましくは０．３本／ｎｍ²以上、より好ましくは０．４本／ｎｍ²以上、さらに好ましくは０．６本／ｎｍ²以上であり、また、ポリマーブラシの形成が簡便な点で、好ましくは２本／ｎｍ²以下、より好ましくは１．６本／ｎｍ²以下、さらに好ましくは１．２本／ｎｍ²以下である。
上記鎖状ポリマーの密度は、例えば、下記式で算出可能である。具体的には、加水分解等により磁性粒子から鎖状ポリマーを遊離させ、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。
鎖状ポリマーの密度（本／ｎｍ²）＝粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数（本）／粒子１ｇの総表面積（ｎｍ²）

また、鎖状ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）としては、１，０００〜１００，０００が好ましく、３，０００〜５０，０００がより好ましく、５，０００〜３０，０００が特に好ましい。
また、鎖状ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、１，０００〜１００，０００が好ましく、３，０００〜５０，０００がより好ましく、５，０００〜３０，０００が特に好ましい。
また、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）としては、非特異吸着抑制の観点及び磁性粒子に結合されたリガンドの活性を高める観点から、１．０〜２．５が好ましく、１．０〜２．０がより好ましい。
なお、数平均分子量、重量平均分子量は、加水分解等により磁性粒子から鎖状ポリマーを遊離させ、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定したポリエチレングリコール換算の平均分子量を意味し、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。

本明細書において「磁性粒子」とは、磁性体を有する粒子を意味する。磁性粒子は、遠心分離器等を用いずに磁石等を用いて分離することができ、簡素又は自動で試料から分離できるものである。
また、磁性体は、強磁性、常磁性、超常磁性のいずれであってもよいが、磁場による分離と磁場を取り除いた後の再分散を容易にする観点から、超常磁性であることが好ましい。磁性体としては、フェライト、酸化鉄、鉄、酸化マンガン、マンガン、酸化ニッケル、ニッケル、酸化コバルト、コバルト等の金属、又は合金が挙げられる。本発明の磁性粒子は、磁性体がフェライト等のような被還元性をもつものでも、色調変化を伴うような変性が生じていない。
また、磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの粒子の少なくとも表面に、上記鎖状ポリマーを結合してなるものが挙げられる。好ましくは多孔質又は非多孔質の磁性ポリマー粒子である。

（ｉ）樹脂等の非磁性体を含む連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子
（ｉｉ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、樹脂等の非磁性体をシェルとする粒子
（ｉｉｉ）樹脂等の非磁性体で構成される核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層に、樹脂等の非磁性体層がシェル（以下、最外層シェルとも称する）として設けられた粒子
（ｉｖ）粒子の最外層に樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられていてもよい、樹脂やシリカ等からなる多孔質粒子の孔内に磁性体微粒子が分散している粒子
なお、（ｉ）〜（ｉｖ）の粒子はいずれも公知であり、常法に従い製造可能である。

上記（ｉｉｉ）の核粒子及び（ｉｖ）の多孔質粒子における樹脂としては、単官能性モノマー及び架橋性モノマーから選ばれる１種又は２種以上に由来する樹脂が挙げられる。
上記単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の単官能性芳香族ビニル系モノマー；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等の単官能性（メタ）アクリレート系モノマーが挙げられる。
上記多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）メタクリレート、アリル（メタ）アクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。

また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）における樹脂並びに上記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の最外層シェルにおける樹脂としては、グリシジル基、アミノ基及び水酸基から選ばれる１種又は２種以上の官能基を少なくとも表面に有している樹脂が好ましい。上記官能基は、樹脂表面の化学修飾により導入してもよいし、上記官能基を有するモノマー１種又は２種以上を少なくとも含むモノマー組成の重合により導入してもよい。上記化学修飾としては、例えばグリシジル基の加水分解による水酸基の生成や、ニトロ基の還元によるアミノ基の生成が挙げられる。上記官能基を有するモノマー組成としては、グリシジル基含有モノマーを少なくとも含むモノマー組成がより好ましい（以下、上記最外層シェルにおける樹脂が、グリシジル基含有モノマーを少なくとも含むモノマー組成により形成された樹脂である粒子を、グリシジル基含有磁性粒子とも称する）。なお、上記単官能性モノマー及び架橋性モノマーから選ばれる１種又は２種以上をさらに含んでいてもよい。

グリシジル基含有モノマーとしては、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。アミノ基含有モノマーとしては、２−アミノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。水酸基含有モノマーとしては、１，４−シクロヘキサンジメタノールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

また、本発明の磁性粒子の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．１〜５００μｍであり、より好ましくは０．２〜５０μｍであり、さらに好ましくは０．３〜１０μｍである。斯様な範囲とすることにより、集磁速度が速くなりハンドリング性が改善され、また、リガンド結合量が大きくなり、検出感度等が良好になる。また、平均粒径の変動係数は、２０％以下程度であればよい。
また、比表面積は、１．０〜２．０ｍ²／ｇ程度であればよい。
なお、上記平均粒径及び比表面積は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。

＜磁性粒子の製造方法＞
本発明の磁性粒子は常法を適宜組み合わせて製造することができるが、（工程１）重合開始基を少なくとも表面に有する原料磁性粒子（以下、重合開始基含有粒子とも称する）を準備する工程と、（工程２）前記重合開始基を起点として、親水性モノマーを重合させる工程と、（工程３）前記工程２で原料磁性粒子の表面に形成された鎖状ポリマーの末端に、１又は２級アミノ基を有する化合物を反応させる工程を含む方法で製造するのが好ましい。斯かる方法によれば、磁性粒子の表面に対する鎖状ポリマーが占有する密度を高密度化でき、しかも、目的とする磁性粒子を簡便に得ることができる。
なお、工程３で用いる１又は２級アミノ基を有する化合物として、１つの１又は２級アミノ基以外には反応性官能基を含まないものを用いる場合には、さらに以下の工程４を経ることで、本発明の磁性粒子が得られる。
（工程４）前記工程３で付加された末端構造に対して、付加反応、置換反応又は縮合反応によって反応性官能基を導入する工程
一方、工程３で用いる１又は２級アミノ基を有する化合物として、１つの１又は２級アミノ基に加えてさらに反応性官能基を含むものを用いる場合には、工程４を経ずとも本発明の磁性粒子が得られる。

（工程１）
重合開始基含有粒子は、例えば、水酸基、アミノ基、エポキシ基及びカルボキシ基から選ばれる１種又は２種以上（以下、これを総称して水酸基等とも称する）を少なくとも表面に有する磁性粒子（以下、水酸基等含有粒子とも称する）に、重合開始基を有する化合物を接触させ、上記水酸基等に含まれる水素原子を重合開始基に変換することで得ることができる（以下、この反応を重合開始基導入反応とも称する）。なお、上記水酸基等含有粒子のうち、水酸基を少なくとも表面に有する磁性粒子は、例えば、上記グリシジル基含有磁性粒子と無機酸、有機酸等の酸とを接触させ、グリシジル基を開環するなどして得ることができる。
また、重合開始基含有粒子は、重合開始基を有するモノマーを含むモノマー組成を重合しても得ることもできる。重合開始基を有するモノマーとしては、２−（２−ブロモイソブチリルオキシ）エチルメタクリレート等が挙げられる。

上記重合開始基を有する化合物としては、リビング重合可能な重合開始基を有する化合物が好ましく、リビングラジカル重合開始基を有する化合物がより好ましく、原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物、可逆的付加開裂連鎖移動重合開始基を有する化合物がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物が特に好ましい。原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物としては、例えば、２−ブロモイソブチリルブロミド、４−（ブロモメチル）安息香酸、２−ブロモイソ酪酸エチル、２−ブロモプロピオニルブロミド、トシルクロリド等が挙げられる。
重合開始基導入反応において、重合開始基を有する化合物の合計使用量は、水酸基等含有粒子に対し、通常５〜１００００モル当量程度であり、好ましくは１０〜５０００モル当量程度である。

重合開始基導入反応は、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の塩基性触媒存在下で行うのが好ましい。なお、これら塩基性触媒のうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
塩基性触媒の合計使用量は、重合開始基を有する化合物に対し、通常１〜１０モル当量程度であり、好ましくは１〜５モル当量程度である。
また、重合開始基導入反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等のプロトン性溶媒が挙げられ、これら溶媒は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、重合開始基導入反応の反応時間は、通常３０分〜２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。

（工程２）
工程２における重合反応の重合法は、重合開始基の種類に応じて選択すればよいが、目的物を簡便且つ容易に得る観点から、リビング重合が好ましく、リビングラジカル重合がより好ましく、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ重合）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ重合）がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合が特に好ましい。原子移動ラジカル重合で重合させることにより、幅広い種類の粒子に鎖状ポリマーを簡便に結合させることができ、しかも、生体適合性や高圧縮弾性、低摩擦特性、サイズ排除特性が、得られる磁性粒子に付与され、且つ磁性粒子の表面に対する鎖状ポリマーが占有する密度を高密度化されるため非特異吸着しにくくなる。

親水性モノマーとしては、水酸基を有するモノマー、ポリオキシエチレン基を有するモノマー、双性イオンを有する基を有するモノマー、リン酸基を有するモノマー等の他、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ジエチル（メタ）アクリルアミド等の親水性を示すものが例示される。
水酸基を有するモノマーとしては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、グリセロール１−（メタ）アクリレート、グリセロール１−（メタ）アクリルアミド等が例示される。ポリオキシエチレン基を有するモノマーとしては、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリルアミド等が例示される。双性イオンを有する基を有するモノマーとしては、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、Ｏ−［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エトキシ（オキシラト）ホスフィニル］コリン等が例示される。リン酸基を有するモノマーとしては、２−ホスフォリックエチル（メタ）アクリレート、２−ホスフォリックエチル（メタ）アクリルアミド等が例示される。
なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
親水性モノマーの合計使用量は、原料磁性粒子表面に結合している重合開始基に対し、通常５〜１００００モル当量程度であり、好ましくは１０〜５０００モル当量程度である。

また、工程２における重合反応を、原子移動ラジカル重合により行う場合は、反応効率の観点から、遷移金属化合物及び配位子の存在下で反応を行うのが好ましい。
遷移金属化合物としては、銅化合物が好ましい。銅化合物としては、臭化銅（Ｉ）、臭化銅（ＩＩ）、塩化銅（Ｉ）、塩化銅（ＩＩ）等のハロゲン化銅の他、銅（Ｉ）トリフレート、銅（ＩＩ）トリフレート等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。遷移金属化合物の合計使用量は、反応系中、通常１〜１０，０００ｐｐｍ程度である。
配位子としては、同一分子内に２つ以上の窒素原子を含む配位子が好ましい。同一分子内に２つ以上の窒素原子を含む配位子としては、トリス（２−ピリジルメチル）アミン、ビピリジン、ビピリジン誘導体、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。配位子の合計使用量は、遷移金属化合物に対し、通常０．５〜１０質量倍程度である。

また、工程２における重合反応は、反応効率の観点から、還元剤、溶媒存在下で行うのが好ましい。
還元剤としては、アスコルビン酸、グルコース、ヒドラジン、銅等が挙げられ、これら還元剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、重合反応の反応系のｐＨとしては、３〜１０が好ましい。重合反応の反応時間は、通常３０分〜１２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。重合反応は、２５〜６０℃程度の温和な条件でも進行する。

（工程３及び４）
工程３は、１又は２級アミノ基を有する化合物（以下、アミン化合物とも称する）を、工程２で原料磁性粒子の表面に形成された鎖状ポリマーの末端（例えば末端ハロゲン）に反応させることにより、鎖状ポリマーの末端部分に、イミノ基又はＮ−置換イミノ基を導入する工程である。
上記アミン化合物としては、分子内に２つ以上のアミノ基を有する化合物、分子内に１つのアミノ基と１つの水酸基を有する化合物の他、アミノ基とカルボキシ基を有する化合物、アミノ基とエポキシ基を有する化合物等が挙げられる。なお、アミン化合物として、分子内に２つ以上のアミノ基を有する化合物、アミノ基とカルボキシ基を有する化合物、アミノ基とエポキシ基を有する化合物等を用いた場合には、工程４を経ずとも本発明の磁性粒子が得られる。
分子内に２つ以上のアミノ基を有する化合物としては、エチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、ジエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、ガダベリン、ヘキサメチレンジアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、ポリエチレンイミン等が挙げられる。分子内に１つのアミノ基と１つの水酸基を有する化合物としては、エタノールアミン、３−アミノ−１−プロパノール、４−アミノ−１−ブタノール、５−アミノ−１−ペンタノール、６−アミノ−１−ヘキサノール、８−アミノ−１−オクタノール、１０−アミノ−１−デカノール、１２−アミノ−１−ドデカノール等が挙げられる。アミノ基とカルボキシ基を有する化合物としては、アミノ酸が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
アミン化合物の合計使用量は、工程２で形成された鎖状ポリマーに対し、通常０．１〜２０００モル当量程度であり、好ましくは１〜１０００モル当量程度である。

工程４は、工程３で付加された末端構造（例えば、水酸基を含む末端構造）に対して、付加反応、置換反応又は縮合反応によって反応性官能基を導入する工程である。
例えば、反応性官能基としてカルボキシ基を導入する方法としては、カルボン酸無水物を上記水酸基に付加反応させる方法等が挙げられ、反応性官能基としてトシル基を導入する方法としては、トシルクロリドを上記水酸基と反応させる方法等が挙げられる。
カルボン酸無水物としては、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸、無水フタル酸、ヘキサヒドロ無水フタル酸等が挙げられる。
なお、工程３で分子内に２つ以上のアミノ基を有する化合物やアミノ基とエポキシ基を有する化合物を用いることで鎖状ポリマー末端に導入された反応性官能基は、アミノ基又はエポキシ基からカルボキシ基やトシル基に変換してもよい。例えば、上記アミノ基に、カルボキシ基を分子内に２つ以上有する化合物又はトシルクロリドを反応させる方法、上記エポキシ基に、メルカプトプロピオン酸を反応させる方法などで行えばよい。

工程４において反応性官能基を導入するために使用する化合物の合計使用量は、工程３で付加された末端構造に対し、通常１〜１０００モル当量程度であり、好ましくは５〜５００モル当量である。

上記工程３及び４は、目的とする磁性粒子を効率よく得る観点から、工程１と同様の塩基性触媒、溶媒存在下で行うのが好ましい。塩基性触媒の合計使用量は、導入する化合物に対し、通常０．００１〜１モル当量程度であり、好ましくは０．０１〜１モル当量程度である。
工程３及び４の反応時間は、それぞれ、通常３０分〜２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。

そして、上記のようにして得られる本発明の磁性粒子は、試料中の標的物質や不純物が表面に吸着しにくく非特異吸着が抑制されており、且つ色調変化を伴うような変性が生じていない。さらに、標的物質を試料から検出・分離する上で充分な量のリガンドを結合させることができるため、本発明の磁性粒子を用いることにより、標的物質の検出・分離を高感度且つ低ノイズ化・高純度化することができる。
したがって、本発明の磁性粒子をアフィニティー担体とすることで、酵素免疫測定、放射免疫測定、化学発光免疫測定等の抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ；タンパク質、核酸等の検出；細胞、タンパク質、核酸等の生体関連物質のバイオセパレーション；薬物探索；バイオセンサー等をはじめとする、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明の磁性粒子は、イムノアッセイのため、或いは核酸検出のための使用に特に適する。

＜リガンド結合粒子＞
本発明のリガンド結合粒子は、本発明の磁性粒子にリガンドを結合させてなるものである。
上記リガンドは、標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、抗体；抗原；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；ヌクレオチド；ヌクレオシド；プロテインＡ、プロテインＧ、（ストレプト）アビジン、酵素、レクチン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；アミノ酸；ヘパリン等の糖又は多糖；脂質；ビオチン等のビタミン；薬物；基質；ホルモン；神経伝達物質等が挙げられる。
これらの中でも、診断薬用等に適したリガンド結合粒子とする観点からは、抗体、抗原が好ましい。抗体、抗原は標的物質と結合するものであればよいが、例えば、抗アンチプラスミン抗体、抗Ｄダイマー抗体、抗ＦＤＰ抗体、抗ｔＰＡ抗体、抗トロンビン・アンチトロンビン複合体抗体、抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＢＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＴＳＨ抗体、抗フェリチン抗体、抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗アポリポタンパク抗体、抗β２−ミクロブロブリン抗体、抗α１―ミクログロブリン抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ジゴキシン抗体、抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗体又はこれに対する抗原；ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ抗原、ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原又はこれに対する抗体；ＤＮＡ抗原、熱変成ヒトＩｇＧ等の自己免疫関連検査用抗原又はこれに対する抗体等が挙げられる。なお、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。

リガンドの結合は常法に従い行えばよいが、共有結合法で行うのが好ましい。例えば、反応性官能基がカルボキシ基であり、リガンドがアミノ基を有するものである場合は、脱水縮合剤を用いて結合させればよい。

本発明のリガンド結合粒子は、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明のリガンド結合粒子は、イムノアッセイのため、或いは核酸検出のための使用に特に適する。

＜標的物質の検出又は分離方法＞
本発明の試料中の標的物質を検出又は分離する方法は、本発明のリガンド結合粒子を用いることを特徴とするものである。

標的物質はリガンドと結合するものであればよいが、具体的には、抗原；モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；細胞（正常細胞、及び大腸がん細胞、血中循環がん細胞等のがん細胞）；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン等の生体関連物質が挙げられ、創薬ターゲットとなる薬物、ビオチン等の小分子化合物でもよい。なお、標的物質は、蛍光物質などにより標識化されたものでもよい。
なお、試料は、上記標的物質を含むもの又は標的物質を含む可能性があるものであればよく、具体的には、血液、血漿、血清、標的物質を含有するバッファー溶液等である。

本発明の検出又は分離方法は、本発明のリガンド結合粒子を用いる以外は常法にしたがって行えばよい。例えば、本発明のリガンド結合粒子と標的物質を含む試料を、混合するなどして接触させる工程（接触工程）、及び標的物質を捕捉したリガンド結合粒子を、磁石などを用いて試料から分離する工程（分離工程）を含む方法が挙げられる。なお、当該分離工程の後に、標的物質を検出する工程、又はリガンドと標的物質を解離させる工程を含んでいてもよい。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。

＜鎖状ポリマーの分子量測定＞
鎖状ポリマーの分子量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解することで、鎖状ポリマーを粒子から遊離させてから測定した。
すなわち、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、ｐＨ１４）４ｇに粒子１ｇを分散し、２５℃で３時間撹拌して、鎖状ポリマーを粒子から遊離した。磁気を用いて粒子を分離し、鎖状ポリマーが溶解した上清を回収した。次に、この鎖状ポリマー溶液に、溶液のｐＨが７になるまで１Ｍの塩酸を加え中和した。鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、加えた１Ｍ塩酸の重量から、生成する塩化ナトリウムの重量を計算しておき、中和後の溶液を凍結乾燥することで、粉末として、塩化ナトリウムを含む鎖状ポリマーを得た。また、鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、粉末の重量を測定しておいた。
上記粉体を検体とし、東ソー社製 ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷＸＬカラム及び日本分光社製 Ｃｈｒｏｍ ＮＡＶ クロマトグラフィデータステーションプログラムを使用して、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ ＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： ＧＰＣ）により以下の条件で測定することで、粒子表面に形成された鎖状ポリマーのＭｎ及びＭｗを測定した。
（測定条件）
流量：０．８ｍＬ／分
溶出溶媒：０．２Ｍ りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
カラム温度：２５℃
標準物質：東ソー社製 ＴＳＫｇｅｌ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ） ＳＥ−ｋｉｔ 及び和光純薬工業社製 ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ ４，０００

＜粒子表面を占める鎖状ポリマーのポリマー密度＞
粒子から遊離させた鎖状ポリマーの重量、鎖状ポリマーの数平均分子量、及び粒子の表面積から、下記式よりポリマー密度を算出した。
〔粒子表面を占める鎖状ポリマーの密度（本／ｎｍ²）〕＝〔粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数（本）〕／〔粒子１ｇあたりの総表面積（ｎｍ²）〕
なお、粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数と粒子１ｇの総表面積の算出法は以下のとおりである。
（粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数）
粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量を下記式（α）により算出し、得られた値から、粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数を下記式（β）及び（γ）により算出した。
（α）： 粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量（ｍｇ） ＝ 凍結乾燥後の粉末の重量（ｍｇ） − 塩化ナトリウムの重量（ｍｇ）
（β）： 粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（ｍｏｌ） ＝ ｛粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量（ｍｇ） ÷ 鎖状ポリマーの数平均分子量（ｇ／ｍｏｌ）｝÷１０００
（γ）： 粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（本） ＝ 粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（ｍｏｌ） × ６．０２×１０²³（アボガドロ数）
（粒子１ｇあたりの総表面積）
下記式（δ）〜（θ）により算出した。なお、式（ε）中の粒子の比重は、ポリマーの比重、磁性体の比重及び粒子に占めるポリマーと磁性体の比率から計算した。
（δ）： 粒子１個あたりの体積（μｍ³） ＝ ４／３ × π × ｛粒子の体積平均半径（μｍ）｝³
（ε）： 粒子１個あたりの質量（ｇ） ＝ 粒子１個あたりの体積（μｍ³）×粒子の比重（ｇ／μｍ³）
（ζ）： 粒子１ｇあたりの粒子数（個） ＝ １ｇ ／ 粒子１個あたりの質量（ｇ）
（η）： 粒子１個あたりの表面積（ｎｍ²） ＝ ４ × π × ｛粒子の半径（ｎｍ）｝²
（θ）： 粒子１ｇあたりの総表面積（ｎｍ²） ＝ 粒子１個あたりの表面積（ｎｍ²） × 粒子１ｇあたりの粒子数（個）

＜反応性官能基含有量＞
粒子から遊離させた鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基（カルボキシ基）の含有量を、電気伝導度測定法（Ｍｅｔｒｏｈｍ社、７９４ Ｂａｓｉｃ Ｔｉｔｒｉｎｏ）を用いて測定することで、磁性粒子の固形分１ｇあたりの反応性官能基の含有量を求めた。

＜体積平均粒径＞
各粒子の体積平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ１３ ３２０）にて測定した。

〔合成例１ 水酸基を表面に有する磁性粒子の合成〕
ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、日油（株）製）２ｇをドデシル硫酸ナトリウム１質量％水溶液２０ｇと混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを、ポリスチレン粒子（数平均粒子径：０．７７μｍ）１３ｇ及び水４１ｇの入った反応器に入れ、２５℃で１２時間撹拌した。
次いで別の容器にて、スチレン９６ｇ及びジビニルベンゼン４ｇをドデシル硫酸ナトリウム０．１質量％水溶液４００ｇで乳化させ、これを上記反応器に入れ、４０℃で２時間撹拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものを水洗し、乾燥した。この粒子を核粒子（数平均粒径：１．５μｍ）とする。

次に別の容器にて、油性磁性流体（「ＥＸＰシリーズ、ＥＭＧ」、（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。

次いで、上記核粒子１５ｇ及び上記疎水化処理された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（（株）奈良機械製作所製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６，２００ｒｐｍ）で５分間処理し、磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子（数平均粒子径：２．０μｍ）を得た。

次に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液２５０ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、次いで、上記磁性体層を有する母粒子１０ｇを加え、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱し温度を保持した。
次いで別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液７５ｇ、メタクリル酸メチル（以下、「ＭＭＡ」という。）１３．５ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）１．５ｇ及びジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、日油（株）製）０．３ｇを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、６０℃に保持した上記５００ｍＬセパラブルフラスコに２時間かけて全量滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し１時間撹拌した。
その後別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液３７．５ｇ、グリシジルメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」という。）６．５６ｇ、ＴＭＰ０．９４ｇ及びジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、日油（株）製）０．１５ｇを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、６０℃に保持した上記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間２０分かけて全量滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。続けて、この５００ｍＬセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌの硫酸水溶液１０ｍＬを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、上記５００ｍＬセパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。
以上により、水酸基を表面に有する磁性粒子を得た。

〔合成例２ 原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（１）〕
合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン７．５ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２−ブロモイソブチリルブロミド６．３ｍＬを３０分かけて滴下した。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ａ）とする。

〔合成例３ 原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（２）〕
合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン０．４ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２−ブロモイソブチリルブロミド０．２ｍＬを加えた。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ｂ）とする。

〔合成例４ 原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（３）〕
合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン０．２ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２−ブロモイソブチリルブロミド０．１ｍＬを３０分かけて滴下した。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ｃ）とする。

〔実施例１〕
（１）以下の合成経路に従い、鎖状ポリマー伸長反応を行った。

すなわち、合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、２−ヒドロキシエチルアクリルアミド（以下、「ＨＥＡＡ」という。）０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２−ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ−アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。

（２）以下の合成経路に従い、ポリマー鎖の末端に、イミノ基を介してカルボキシ基を含む基を導入した。

すなわち、上記で得られた粒子を、ジメチルスルホキシド６ｍＬに分散させ、エタノールアミン１ｍＬ、及びトリエチルアミン０．２ｍＬを加えた。４５℃で５時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、未反応の化合物を除去した。
次に、得られた粒子を、１，３−ジオキソラン４．８ｍＬに分散し、トリエチルアミン０．２ｍＬと無水コハク酸２ｇを１，３−ジオキソラン４．８ｍＬに溶解させた溶液を加えた。２５℃で４時間反応後、磁気を用いて粒子を分離し、粒子を水に分散した。
以上で、ＨＥＡＡ由来の鎖状ポリマーが表面に結合しており、且つ当該鎖状ポリマーの末端に、イミノ基を介して、カルボキシ基を含む基を有する磁性粒子１（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。磁性粒子１に結合している鎖状ポリマーのＭｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎ、及びポリマー密度を測定した。また、反応性官能基（カルボキシ基）含有量を測定した。測定結果は表１に示す。

〔実施例２〕
ＨＥＡＡを、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム（以下、「ＣＢＭＡ」という。）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＣＢＭＡ由来の鎖状ポリマーが表面に結合しており、且つ当該鎖状ポリマーの末端に、イミノ基を介して、カルボキシ基を含む基を有する磁性粒子２（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。

〔実施例３〕
ＨＥＡＡを、メトキシポリエチレングリコール（９）モノメタクリレート（Ｍ−９０Ｇ、新中村化学社製（以下、「ＭＰＥＧＭ」という。））に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＭＰＥＧＭ由来の鎖状ポリマーが表面に結合しており、且つ当該鎖状ポリマーの末端に、イミノ基を介して、カルボキシ基を含む基を有する磁性粒子３（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。

〔実施例４〕
粒子（Ａ）を合成例３で得た粒子（Ｂ）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ由来の鎖状ポリマーが表面に結合しており、且つ当該鎖状ポリマーの末端に、イミノ基を介して、カルボキシ基を含む基を有する磁性粒子４（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。

〔比較例１〕
（１）以下の合成経路に従い、鎖状ポリマー伸長反応を行った。

すなわち、合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、ＨＥＡＡ０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２−ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ−アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。

（２）以下の合成経路に従い、ポリマー鎖の末端に、チオ基を介してカルボキシ基を含む基を導入した。

すなわち、上記で得られた粒子を、ジメチルスルホキシド６ｍＬに分散させ、メルカプトプロピオン酸１ｍＬを加えた。４５℃で５時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、未反応の化合物を除去した。
以上で、ＨＥＡＡ由来の鎖状ポリマーが表面に結合しており、且つ当該鎖状ポリマーの末端に、チオ基を介して、カルボキシ基を含む基を有する磁性粒子５（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。磁性粒子５に結合している鎖状ポリマーのＭｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎ、及びポリマー密度を測定した。測定結果は表１に示す。

〔比較例２〕
粒子（Ａ）を合成例４で得た粒子（Ｃ）に変更した以外は実施例２と同様の操作を行い、ＣＢＭＡ由来の鎖状ポリマーが表面に結合しており、且つ当該鎖状ポリマーの末端に、イミノ基を介して、カルボキシ基を含む基を有する磁性粒子６（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。

〔比較例３〕
合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１ｇを１，３−ジオキソラン４．８ｍＬに分散させ、これに、トリエチルアミン０．２ｍＬと無水コハク酸０．０８ｇを１，３−ジオキソラン４．８ｍＬに溶解させた溶液を加えた。２５℃で４時間反応後、磁気を用いて粒子を分離し、粒子を水に分散した。以上により、鎖状ポリマーを有さない反応性官能基含有磁性粒子７（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。磁性粒子７について、反応性官能基（カルボキシ基）含有量を測定した。測定結果は表１に示す。

〔試験例１〕
各実施例並びに比較例１及び２で得られた磁性粒子それぞれについて、鎖状ポリマーの末端の構造を変換する前の磁性粒子（臭素末端の鎖状ポリマーが結合した磁性粒子）の色調を目視で比較することで、色調変化の有無を確認した。末端の構造を変換する前と比較して色調変化した場合、粒子が変性したといえる。

〔試験例２〕
各実施例並びに比較例２及び３で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子にＪｕｒｋａｔ細胞破砕液（タンパク質夾雑物１００μｇが含まれる）１００μＬを加え、３０分間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、粒子をＴＢＳ−Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄した。さらに磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液（０．５質量％）を加え、非特異吸着したタンパク質夾雑物を粒子から剥離した。この剥離溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色して粒子に非特異吸着したタンパク質の量を目視にて確認し、以下の基準により評価した。タンパク質の量が少ない粒子ほど非特異吸着の少ない良好な粒子といえる。評価結果は表１に示す。
（評価基準）
◎：タンパク質の吸着がみられず、非常に良好
○：タンパク質の吸着があまりみられず、良好
×：タンパク質の吸着がはっきりと確認され、不良

〔試験例３〕
各実施例並びに比較例２及び３で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子をＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）９９０μＬに分散させ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、ＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）１ｍＬに分散させ、抗ＴＳＨ抗体（フナコシ社製）１５μｇを加えた。室温で１２時間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄し、抗体結合粒子を得た。抗体結合量をＢＣＡ Ａｓｓａｙにより求めた。結果を表１に示す。

表１に示すとおり、比較例１の磁性粒子は、末端の構造を変換する前と比較して色調変化が確認された。黒色に近い色から黄褐色に近い色に変色しており、この変色は、メルカプトプロピオン酸により磁性体中のＦｅ₃Ｏ₄が還元されγ−Ｆｅ₂Ｏ₃が生成したことによるものと推察される。
また、比較例２の磁性粒子は、非特異吸着が生じやすく、しかも、リガンドが充分には結合しなかった。また、比較例３の磁性粒子は、非特異吸着が生じやすかった。
これらに対し、実施例１〜４の磁性粒子は、反応性官能基が末端に導入されたものであるにも拘わらず色調変化を伴うような変性がなく、しかも、非特異吸着が抑制されており、リガンド結合量が大きかった。

Claims (15)

1. 鎖状ポリマーが少なくとも表面に結合してなる磁性粒子であって、
   前記鎖状ポリマーが、親水性繰り返し単位を有し、且つ前記磁性粒子に結合していない側の末端に、下記式（５）で表される末端構造を有する鎖状ポリマーであり、
   前記磁性粒子の表面に対して前記鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１〜２本／ｎｍ²である、磁性粒子。
   〔式（５）中、
   Ｒ ¹⁶ は、水素原子又は置換基を示し、
   Ｒ ¹⁷ は、下記式（６）で表される有機基を示す。〕
   〔式（６）中、
   Ｒ ¹⁸ は、２価の有機基を示し、
   Ｙは、反応性官能基を示す。〕
2. 前記親水性繰り返し単位が、水酸基、アルコキシ基、ポリオキシアルキレン基、双性イオン構造を有する基、スルホニル基、スルフィニル基及びリン酸基から選ばれる親水性基を有する繰り返し単位である、請求項１に記載の磁性粒子。
3. 前記反応性官能基が、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基及びアジド基から選ばれる反応性官能基である、請求項１又は２に記載の磁性粒子。
4. 前記反応性官能基の含有量が、磁性粒子の固形分１ｇあたり０．７〜５０μｍｏｌである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の磁性粒子。
5. 前記鎖状ポリマーが、親水性ポリマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の磁性粒子。
6. 前記鎖状ポリマーが、前記親水性繰り返し単位のホモポリマーである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の磁性粒子。
7. 前記鎖状ポリマーの分子量分布が、１．０〜２．５である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の磁性粒子。
8. 前記鎖状ポリマーの数平均分子量が、１，０００〜１００，０００である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の磁性粒子。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の磁性粒子にリガンドを結合させてなる、リガンド結合粒子。
10. 前記リガンドが、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモン又は神経伝達物質である、請求項９に記載のリガンド結合粒子。
11. イムノアッセイ用又は核酸検出用である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の磁性粒子又はリガンド結合粒子。
12. 請求項９又は１０に記載のリガンド結合粒子を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法。
13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の磁性粒子を製造する方法であって、
    （工程１）重合開始基を少なくとも表面に有する原料磁性粒子を準備する工程と、
    （工程２）前記重合開始基を起点として、親水性モノマーを重合させる工程と、
    （工程３）前記工程２で原料磁性粒子の表面に形成された鎖状ポリマーの末端に、１若しくは２級アミノ基１個と反応性官能基とを有し、工程３の反応により式（５）で表される末端構造を与える化合物、又は工程３で付加された末端構造に対して付加反応、置換反応若しくは縮合反応によって反応性官能基を導入した場合に式（５）で表される末端構造を与える１若しくは２級アミノ基を有する化合物を反応させる工程
    を含むことを特徴とする、製造方法。
14. さらに、（工程４）前記工程３で付加された末端構造に対して、付加反応、置換反応又は縮合反応によって反応性官能基を導入する工程を含む、請求項１３に記載の製造方法。
15. 前記重合開始基が、原子移動ラジカル重合開始基である、請求項１３又は１４に記載の製造方法。