WO2023234034A1

WO2023234034A1 - 被覆金属基材およびその製造方法、被覆金属基材を含む複合体、ならびに被覆金属基材を製造するための高分子

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Publication number: WO2023234034A1
Application number: PCT/JP2023/018462
Authority: WO
Inventors: 由枝小松; 文久北脇
Original assignee: Ｐｈｃホールディングス株式会社
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2023-05-17
Publication date: 2023-12-07

Abstract

金属ナノ粒子および／または金属薄膜である金属基材と、金属基材の表面を被覆する高分子膜と、金属基材の表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基とを含んで成り、第１親水性基は、金属基材の表面に結合しており、高分子膜が、金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む、被覆金属基材。

Description

被覆金属基材およびその製造方法、被覆金属基材を含む複合体、ならびに被覆金属基材を製造するための高分子

　本発明は、被覆金属基材およびその製造方法、被覆金属基材を含む複合体、ならびに被覆金属基材を製造するための高分子に関する。

　バイオセンサーは、検出対象である特定の被験物質を特定の特異結合物質に特異的に反応させて複合体を形成し、複合体における特異的な結合に起因する信号によって、被験物質を検出する。
　プラズモン励起蛍光分析では、複合体は、例えば、被験物質、特異結合物質、蛍光物質、および金属粒子を含んで成る。励起光が複合体に照射されると、複合体内の金属粒子で表面プラズモン共鳴が誘起され、金属粒子の表面近傍での近接場が形成される。この近接場によって蛍光物質の蛍光強度が増大される。

　検出対象である特定の被験物質を特定の特異結合物質に特異的に反応させて複合体を形成し被検物質を分析する場合、金属粒子表面への非特異的な吸着による信号ノイズ比（ＳＮ比）悪化の問題がある。金属粒子を用いたプラズモン励起蛍光分析においても例外ではなく、金属粒子表面への非特異吸着はＳＮ比を悪化させる虞があるため、例えば、特許文献１に記載のように、金属ナノ粒子表面に、一次元状の高分子（高分子鎖）の末端を結合させて、高分子膜を形成する。複数の高分子鎖を金属基材表面と略垂直となるように金属基材表面に配列させることで、高分子鎖がブラシ状に配列した高分子膜を形成する。

国際公開第２００１／０８６３０１号

　ところで、特許文献１に記載の高分子では、本発明者らが鋭意検討した結果、検出感度をさらに改善する余地があることが分かった。具体的には、特許文献１に記載の高分子を用いると、一次元状の高分子鎖がブラシ状に配列した高分子膜となるため、金属基材表面に形成する高分子膜の膜厚を十分に薄くすることができない虞がある。これにより、被験物質を捕捉した複合体において金属基材間の離間距離を十分に小さくできず、蛍光を効果的に増強できなかった。
　また、高分子膜では、疎水性のアルキル基を含む分子鎖がブラシ状に配列しているため、ノイズ成分に寄与する非特異的吸着物質の吸着（非特異的吸着または非特異吸着）を効果的に抑制できない虞がある。

　本発明はかかる課題に鑑みて為されてものである。すなわち、本発明は、膜厚を低減して複合体における金属基材間の離間距離を十分に小さくし、かつ検出感度を高めることのできる高分子を提供することを主たる目的とする。また、そのような高分子を用いて高分子膜を形成した被覆金属基材およびその製造方法、ならびに被覆金属基材を含む複合体を提供することを主たる目的とする。

　本発明の一実施形態に係る高分子は、
　ジスルフィド基を介して結合する親水性基を側鎖の末端に有する。

　本発明の一実施形態に係る被覆金属基材は、
　金属ナノ粒子および／または金属薄膜である金属基材と、該金属基材の表面を被覆する高分子膜と、前記金属基材の表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基とを含んで成り、
　前記第１親水性基は、前記金属基材の表面に結合しており、
　前記高分子膜が、前記金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む。

　本発明の一実施形態に係る複合体は、
　前記金属ナノ粒子を含むナノ粒子体を２以上含んで成り、
　前記２以上のナノ粒子体が第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とを含み、
　前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体とが前記被験物質を介して結合されている。

　本発明の一実施形態に係る複合体は、
　前記金属ナノ粒子を含むナノ粒子体と、前記金属薄膜を含む被覆金属薄膜とを含んで成り、
　第１親水性基は、前記金属ナノ粒子の表面および前記金属薄膜の表面の少なくとも一方に結合しており、
　前記ナノ粒子体と前記被覆金属薄膜とが被験物質を介して結合されている。

　本発明の一実施形態に係る被覆金属基材の製造方法は、
　前記高分子を、金属基材の表面に接触させて、前記親水性基を前記金属基材の表面に結合させつつ、かつ前記金属基材の表面に高分子膜を形成する工程を含んで成る。

　本発明は、高分子膜の膜厚を低減して複合体における金属基材間の離間距離を十分に小さくし、かつ検出感度を高めることのできる高分子を提供することができる。また、そのような高分子を用いて高分子膜を形成した被覆金属基材およびその製造方法、ならびに被覆金属基材を含む複合体を提供することができる。

図１は、第２実施形態に係る被覆金属基材を模式的に示す断面図（（ａ）ナノ粒子体および（ｂ）被覆金属薄膜）である。図２は、図１（ａ）のＡ部拡大模式図である。図３は、第３実施形態に係る複合体を模式的に示す断面図である。図４は、第３実施形態に係る複合体を用いて被験物質を検出する測定装置を模式的に示す図である。図５は、第４実施形態に係る複合体を模式的に示す断面図である。図６は、高分子合成の各工程における吸収スペクトルを示す図である。図７は、実施例１の高分子膜の形成方法に関する反応を示す図である。図８は、実施例１の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子のＳＥＭ画像である。図９は、実施例１の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子についてのゼータ電位に対する散乱光強度比の分布を示す図である。図１０は、実施例１の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子についての粒子径に対する散乱光強度比の分布である。図１１は、実施例２の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。図１２は、実施例２の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子についてのゼータ電位に対する散乱光強度比の分布を示す図である。

　以下、本発明の実施形態であるナノ粒子体およびその製造方法、複合体ならびに測定装置を図示の実施の形態により詳細に説明する。なお、図面は模式的なものを含み、実際の寸法や比率を反映していない場合がある。

　本明細書で言及する数値範囲は、「未満」、「より大きい」および「より小さい」のような特段の用語が付されない限り、下限値および上限値そのものも含むことを意図している。例えば、１ｎｍ～５０ｎｍといった数値範囲を例にとれば、特段の用語が付されない限り、その数値範囲は下限値「１ｎｍ」および上限値「５０ｎｍ」を含むものとして解釈される。

　本明細書において、「金属基材」とは、実質的に金属から構成され、金属薄膜（または金属プレートまたは金属膜とも称する）および金属ナノ粒子を包含する基材をいう。金属ナノ粒子と金属薄膜とは主に、形状の点で相違する。本明細書において、対象部材が実質的に特定の材料から構成されるまたは対象部材が特定の材料からなるとは、対象部材が９５質量％以上、９７質量％以上、９９質量％以上、１００質量％の割合で特定の材料を含むことをいう。例えば、金属基材が実質的に金属から構成されるとは、金属基材が９５質量％以上、９７質量％以上、９９質量％以上、１００質量％の割合で金属を含むことをいう。

　本明細書において、「金属ナノ粒子」とは、実質的に金属から構成される粒子であって、そのサイズがナノメートルオーダー（例えば、数ｎｍ～１００ｎｍ）であり、その形状が球状または略球状の粒子をいう。「金属ナノ粒子」は、光（例えば、可視光）との相互作用により、他の金属ナノ粒子との間で局在表面プラズモン共鳴を引き起こす。
　本明細書において、「金属薄膜」とは、実質的に金属から構成される薄膜であって、素の膜厚がナノメートルオーダー（例えば、数ｎｍ～１００ｎｍ）である薄膜である。「金属薄膜」は、光（例えば、可視光および近赤外光）との相互作用により、金属ナノ粒子との間で局在表面プラズモン共鳴を引き起こす。

＜第１実施形態：高分子＞
　第１実施形態に係る高分子は、ジスルフィド基（ジスルフィド結合）（－Ｓ－Ｓ－）を介して結合する親水性基を側鎖の末端に有する。
　第１実施形態に係る高分子は、金属基材の表面と接触して、高分子膜および親水性基を金属基材の表面に形成することができる。これにより、被覆金属基材（第２実施形態で詳述する）を製造することができる。

［作用機序］
　第１実施形態に係る高分子で形成した高分子膜を有する複合体は、検出感度に優れる。特定の理論に拘束されるわけではないが、その理由は以下のように推測される。本実施形態に係る高分子は、例えば、一般式（１）：

（一般式（１）中、Ｘは親水性基を示し、Ｌは例えば、アミド結合を示し、ｎは繰り返し単位の数を示す）
で表すように、ジスルフィド基を介して結合する親水性基を側鎖の末端に有する（以下、一般式（１）で表される高分子を第１実施形態では「高分子（１）」とも称し、第２実施形態以降では「高分子３Ｂ」とも称する）。本発明者らは、ジスルフィド基を開裂させることで、その一方のＳ原子を高分子膜の膜厚低減に寄与させ、その他方のＳ原子を親水性基の露出し易さ向上に寄与させるということを案出した。より具体的には、本発明者は、ジスルフィド基の開裂により、下記の２つの態様が実可能となり得ることを案出した；
（第１態様）：
　高分子主鎖から分岐する側鎖末端についた一方のＳ原子を金属基材表面の所定箇所に結合させる態様、ならびに
（第２態様）：
　他方の親水性基Ｘと接続したＳ原子を、上記金属基材表面の所定箇所とは異なる箇所にて接続させる態様。
　以上により、本発明では、上述のように、「高分子膜の膜厚低減」および「親水性基の露出し易さ向上」が可能となる。

　詳しくは、高分子（１）を金属基材と接触させると、ジスルフィド基の硫黄原子間の結合のうちの少なくとも一部が開裂し、金属基材の表面に硫黄原子を介する結合部位を形成する。これにより、形成される高分子膜では、高分子膜を構成する高分子が側鎖の末端で金属基材と結合する。高分子膜は、その構成する高分子の主鎖が金属基材表面に対して略平行となるように金属基材表面を二次元状に覆う構造を有するため、例えば、特許文献１に示すような一次元状の高分子が金属基材の表面に対して略垂直に配列して形成される高分子膜に比べ、高分子膜の膜厚を低減することができる。これにより複合体における金属基材間の離間距離を十分に小さくすることができる。

　なお、本明細書において、高分子の主鎖とは、高分子の主たる骨格を成す炭化水素鎖（例えば、アルキレン鎖）であって、高分子を構成する複数の繰り返し単位が互いに結合して延在する方向な平行な炭化水素鎖をいう。この炭化水素鎖は、例えば、エーテル基、アミド結合およびエステル結合のようなヘテロ原子を含む２価の基を有してもよい。
　また、本明細書において、高分子の側鎖とは、主鎖から分岐した炭化水素鎖をいう。側鎖の炭化水素鎖も主鎖の炭化水素鎖と同様にヘテロ原子を含む２価の基を有してもよい。

　また、ジスルフィド基の硫黄原子間の結合の開裂では、金属基材の表面への硫黄原子を介する結合部位の形成と並行して、金属基材の表面に硫黄原子を介して親水性基を結合させる。これにより、形成される高分子膜では、親水性基が露出しやすい構造をとり得る。これにより、非特異的吸着を抑制し、例えば、プラズモン励起蛍光分析における信号－ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を向上することができる。
　以上から、第１実施形態に係る高分子で形成した高分子膜を有する複合体は、検出感度に優れる。

　一般式（１）中、繰り返し単位の数を示すｎは、例えば、高分子（１）の重量平均分子量Ｍｗが１２，０００より大きくなるような数である。

（親水性基）
　親水性基は、極性基および／または帯電性基を含む。極性基としては、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホニル基、リン酸基、およびアルキレンオキシド基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。帯電性基は、例えば、極性基が帯電した基および双性イオン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。双性イオン基は、例えば、ホスホリルコリン基およびベタイン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。

　本発明者らは、非特異吸着物質は疎水的部位を含むため、高分子膜への非特異的な吸着を抑制するためには、親水性部位が有効であることを見出した。そして、親水性部位が形成される高分子膜から露出し得る場合に、非特異吸着を有効に抑制できることを見出した。これらの技術的知見に基づいて、側鎖末端にジスルフィド結合を介して結合する親水性基を有する高分子（１）を導き出した。

　本発明者らは、親水性基に加え、高分子膜を構成する高分子の主鎖骨格に親水性部位を導入することが非特異吸着の抑制に有効であることを見出した。
　非特異吸着をさらに抑制する観点から、好ましくは、高分子（１）の主鎖骨格にアミド結合を含む。
　非特異吸着をさらに抑制する観点から、好ましくは、高分子（１）の主鎖骨格に１または複数のアミノ酸に由来する構造を有する。このようなアミノ酸は、例えば、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つを含む。
　非特異吸着をさらに抑制する観点から、好ましくは、高分子（１）の主鎖骨格にブロックポリマーとして生体適合性ポリマーを含む。このような生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートが挙げられる。

　用語「１または複数の」は、本明細書において、より具体的には「１または２以上の」を示し、「１もしくは複数の」（より具体的には「１もしくは２以上の」）も同義である。

　高分子（１）は側鎖に正帯電性基をさらに含んでもよい。この側鎖には、ジスルフィド基を有さない。このような正帯電性基は、第１級アンモニウム基、第２級アンモニウム基、第３級アンモニウム基、第４級アンモニウム基およびグアニジル基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ_２ ^＋）ＮＨ_２）からなる群より選択される少なくとも１種である。
　高分子（１）はこのような正帯電性基を含む場合、形成される高分子膜は、金属基材の表面と静電結合を形成できる。これにより、高分子膜はより強固に固定される。

　高分子（１）は側鎖に疎水性基をさらに含んでもよい。この側鎖には、ジスルフィド結合を有さない。このような疎水性基は、芳香族環状基、脂肪族環状基および脂肪族鎖状基からなる群より選択される少なくとも１種である。高分子（１）はこのような疎水性基を含む場合、形成される高分子膜は、金属基材の表面と疎水結合を形成できる。これにより、当該高分子膜はより強固に固定される。

（高分子の製造方法）
　高分子の製造方法の一例を説明する。高分子の製造方法は、例えば、ジスルフィド基を側鎖に導入する工程（ジスルフィド基導入工程）と、親水性基を導入する工程（親水性導入工程）とを含んで成る。
　以下のスキーム１：

（スキーム１中、Ｘは親水性基を示し、Ｙは、例えば、ピリジル基を示し、ＺおよびＴは官能部位を示し、Ｌは、例えば、２価の結合部位を示し、ｎは繰り返し単位の数を示し、ＺとＴとは互いに異なり、互いに結合しＬを形成する）
を参照して高分子（１）の製造方法を説明する。スキーム１は、高分子（１）の製造法を説明するための反応式を示す。なお、スキーム１におけるＬ、Ｘおよびｎは、一般式（１）におけるＬ、Ｘおよびｎとそれぞれ同義である。

－ジスルフィド基導入工程－
　スキーム１に示すように、ジスルフィド基導入工程は、例えば、側鎖に官能部位Ｚを有する高分子（式（３）で表される高分子（以下、高分子（３）とも称する））に、ジスルフィド基を有する化合物（式（４）で表される化合物（以下、ジスルフィド基を有する化合物（４）とも称する））を反応させて、ジスルフィド基を有する高分子（式（２）で表される高分子（以下、高分子（２）とも称する））を得る。官能部位ＺおよびＴは、互いに異なり、例えば、アミノ基、カルボキシル基、およびエステル結合のような反応性置換基である。この反応は、例えば、アミノ基がカルボキシル基またはエステル結合を攻撃してアミド結合を形成する求核置換反応である。反応温度は、例えば、室温（２０℃～２５℃）であり、反応時間は、例えば、１時間以上４時間以下である。

　高分子（３）における官能部位Ｚとしては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、およびエステル基が挙げられる。高分子（３）としては、例えば、

が挙げられる。

　ジスルフィド基を有する化合物（４）としては、例えば、

が挙げられる。

－親水性導入工程－
　親水性導入工程では、高分子（２）に親水性基を有するチオール化合物（式（５）で表されるチオール化合物（以下、チオール化合物（５）とも称する））を反応させて、親水性基を有する高分子（１）を得る。この反応は、高分子（２）のジスルフィド結合にチオール基が攻撃するチオール求核反応である。反応温度は、例えば、３５～４０℃（特に℃）であり、反応時間は、例えば、３０分以上～２時間以上（特に１時間以上）である。チオール化合物（５）としては、例えば、

が挙げられる。

＜第２実施形態：被覆金属基材＞
　第２実施形態に係る被覆金属基材の被覆膜（すなわち、高分子膜）は、第１実施形態に係る高分子によって形成され得る。つまり、高分子膜を構成する高分子は、第１実施形態に係る高分子に由来し得る。なお、第２実施形態において、第１実施形態と同一の符号は、第１実施形態と同じ構成であるため、その説明を省略する。

　第２実施形態に係る被覆金属基材は、金属基材と、金属基材の表面を被覆する高分子膜と、金属基材の表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基とを含んで成り、
　第１親水性基は、金属基材の表面に結合しており、
　高分子膜が、金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む。

［作用機序］
　第２実施形態に係る被覆金属基材は、検出感度を高めることができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、その理由は以下のように推測される。本実施形態に係る被覆金属基材は、金属基材の表面に結合した第１親水性基を含む。第１親水性基は、被覆金属基材への非特異吸着を抑制するため、被験物質の検出においてＳ／Ｎ比の低下が抑制され、検出感度が向上する。
　また、本実施形態に係る被覆金属基材は、第１親水性基に加え、金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む高分子膜を含んで成る。このように、高分子膜に非特異吸着抑制機能を持たせなくてもよいため、高分子膜の膜厚を薄くすることができる。これにより、被験物質の検出において形成される複合体において被覆金属基材の間の距離を小さくすることができる。
　以上から、第２実施形態に係る被覆金属基材は、検出感度を高めることができると考えられる。

［被覆金属基材の基本構成］
　図１を参照して被覆金属基材を説明する。図１は、第２実施形態に係る被覆金属基材を模式的に示す断面図である。被覆金属基材１としては、ナノ粒子体１Ａと、被覆金属薄膜１Ｂとがある。

　図１（ａ）に示すように、ナノ粒子体１Ａは、金属ナノ粒子２Ａである金属基材２と、金属基材２の表面を被覆する高分子膜３と、金属基材２の表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基７Ａ（図１（ａ）では不図示）とを含んで成る。ナノ粒子体１Ａは、蛍光物質６および／または特異結合物質４を、さらに含んで成り得る。

　金属ナノ粒子２Ａは、励起光照射により局在表面プラズモン共鳴（または局在型表面プラズモン共鳴；Localized Surface Plasmon Resonance：LSPR、以下、単に「プラズモン共鳴」とも称する）を引き起こす。高分子膜３は、金属ナノ粒子２Ａの表面を被覆し、金属基材２の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む。第１親水性基７は、金属基材２の表面に結合している。

　図１（ｂ）に示すように、被覆金属薄膜１Ｂは、金属薄膜２Ｂである金属基材２と、金属基材２の表面を被覆する高分子膜３と、金属基材２の表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基７（図１（ｂ）では不図示）とを含んで成る。被覆金属薄膜１Ｂは、特異結合物質４を、さらに含んで成り得る。

　金属薄膜２Ｂは、励起光照射により局在表面プラズモン共鳴を引き起こす。高分子膜３は、金属薄膜２Ｂの表面を被覆し、金属基材２の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む。第１親水性基７は、金属基材２の表面に結合している。

　被覆金属基材１は、プラズモン励起蛍光分析に用いることができる。別の表現をすれば、被覆金属基材１は、表面プラズモン励起増強蛍光分光免疫測定法に用いることができる。被覆金属基材１は、検体中の被験物質を捕捉し、例えば、２つの被覆金属基材１と１つの被験物質とを含む複合体（第３、第４実施形態で詳述する）を形成することができる。複合体に励起光を照射すると、プラズモン共鳴を起こし近接場を形成する。この近接場によって、蛍光強度が増大する。つまり、電場増強効果が得られる。

　被覆金属基材１はまた、非特異的な結合部位をブロッキング剤によってブロッキングされてもよい。ブロッキングされた被覆金属基材１は、検出対象以外の物質（すなわち、被験物質以外の物質）への特異結合物質４の非特異的な結合の形成が抑制され、バックグラウンドおよび偽陽性信号を低減し、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。かかる場合、検出感度をより向上させることができる。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スキムミルクおよびカゼインのようなタンパク質、ならびに化学合成ポリマーである。

　ナノ粒子体１Ａが溶媒中に存在する場合、ナノ粒子体１Ａの分散液は、ナノ粒子体１Ａの分散性を向上させる目的で、分散剤をさらに含んでもよい。このような分散剤としては、例えば、ヘパリンナトリウムが挙げられる。

（金属基材）
　金属基材２は、その表面を高分子膜３で被覆されている。金属基材２は、好ましくは金または銀を含んで成り、より好ましくは銀を含んで成る。金属基材２は、金属ナノ粒子２Ａおよび金属薄膜２Ｂである。

－金属ナノ粒子－
　金属ナノ粒子２Ａは、金属ナノ粒子２Ａを構成する金属の種類によって異なるが、特定の波長を有する光と相互作用し、局在表面プラズモン共鳴を起こす。銀ナノ粒子（銀から実質的になるナノ粒子）では４００ｎｍ～５３０ｎｍに、金ナノ粒子（金から実質的になるナノ粒子）では５１０ｎｍ～５８０ｎｍに局在表面プラズモン共鳴のピークがある。これは金属ナノ粒子２Ａの粒子径により異なる。例えば、粒子径が２０ｎｍの銀ナノ粒子は、波長４０５ｎｍの光と共鳴する。粒子径が２０ｎｍの金からなるナノ粒子は、波長５２４ｎｍの光と共鳴する。金属ナノ粒子２の粒子径（平均一次粒子径）は、例えば、５ｎｍ～１００ｎｍである。金属ナノ粒子２の粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、金属ナノ粒子２の画像を撮像し、画像での金属ナノ粒子２の粒子径を測長し、複数の粒子径の平均値（測定数：例えば、少なくとも１０以上）を算出することにより得ることができる。

－金属薄膜－
　金属薄膜２Ｂは、金属薄膜２Ｂを構成する金属の種類によって異なるが、特定の波長を有する光（例えば、可視光）と相互作用し、金属ナノ粒子との間で局在表面プラズモン共鳴を起こす。

（高分子膜）
　高分子膜３は金属基材２の表面を被覆する。高分子膜３は、金属消光膜として機能する。複合体においては、高分子膜３は、少なくとも高分子膜３の厚み分、金属基材２の表面から蛍光物質６を離間して配置させることができる。このため、励起した蛍光物質６が金属基材２の表面に接触して消光することを抑制し、検出感度の低下を抑制できる。高分子膜３の存在は、ＳＥＭまたはＴＥＭを用いて、ナノ粒子体１の画像を撮像し、画像での被覆金属基材１を観察し、確認することができる。

　図２を参照して、高分子膜３を詳細に説明する。図２は、図１（ａ）のＡ部拡大図であり、ナノ粒子体１Ａの高分子膜３と金属ナノ粒子２Ａの表面との界面付近の拡大模式図である。なお、ナノ粒子体１Ａの高分子膜３は、被覆金属薄膜１Ｂの高分子膜３と実質的に同じ構成であるため、以下、ナノ粒子体１Ａの高分子膜３について説明する。

　高分子膜３は、金属ナノ粒子２の表面との間に硫黄原子を介した結合部位３ａを含む（つまり、高分子膜３を構成する高分子３Ａは、金属基材２（金属ナノ粒子２Ａ）の表面との間に硫黄原子を介した結合部位３ａを含む）。高分子膜３は、正帯電性基３ｂおよび疎水性基３ｃからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含んでもよい（例えば、高分子膜３を構成する高分子３Ａは、高分子３Ａの側鎖に正帯電性基３ｂおよび疎水性基３ｃからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含んでもよい。この側鎖はジスルフィド基を有しない。）。この側鎖には、より具体的には、高分子膜３は、金属ナノ粒子２の表面との間に硫黄原子を介した結合部位３ａに加え、正帯電性基３ｂとしての第１級アンモニウム基（－ＮＨ_３ ^＋）と、疎水性基３ｃとをさらに含んでもよい。結合部位３ａは、硫黄原子を介して金属ナノ粒子２の表面と高分子膜３との間を結合する。正帯電性基３ｂは、負帯電性の金属ナノ粒子２の表面との間に静電結合（イオン結合）ｂを形成する。疎水性基３ｃは、金属ナノ粒子２の表面と疎水結合ｃを形成する。
　なお、本明細書では、高分子膜３を構成する高分子を「高分子３Ａ」とも称し、高分子膜３を反応により形成する、原料としての高分子を「高分子３Ｂ」とも称する。これらの２つの高分子の表記を分けることで、区別しやすくするためである。

　上記３つの結合はいずれも金属ナノ粒子２の表面と比較的強い結合である。高分子膜３は、結合部位３ａによって金属ナノ粒子２の表面に安定的に固定される。さらに、高分子膜３は、疎水結合ｃおよび正帯電性基３ｂによる静電結合ｂによって、さらに安定的に金属ナノ粒子２の表面に固定され得る。このように高分子膜３は、金属ナノ粒子２の表面に安定的に固定されるため、蛍光物質６と金属ナノ粒子２の表面とを所定の距離で安定して隔てることができる。よって、本実施形態では、励起した蛍光物質６の消光が抑制され、検出感度の低下を抑制し得る。

　さらに、高分子膜３は、高分子３Ａを含んで構成され得るため、シリカ層に比べ、化学修飾しやすく、表面改質等の必要性が低い。これにより、シリカ層に比べ膜厚を小さくして、複合体における金属ナノ粒子２Ａ間距離を適度に減少させることができる。よって、より効率的に近接場が形成され、検出感度をより向上させることができる。

　高分子膜３を構成し得る高分子３Ａは、図２に示すように、金属ナノ粒子２の表面との間に硫黄原子を介した結合部位３ａに加え、正帯電性基３ｂおよび疎水性基３ｃからなる群より選択される少なくとも１つを含むことができる。硫黄原子を介した結合部位３ａ、正帯電性基３ｂおよび疎水性基３ｃの存在は、赤外分光法、エネルギー分散型X線分光法（ＴＥＭ-ＥＤＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ―ＳＩＭＳ）および核磁気共鳴分光法を用いて、それらに由来する信号を測定することで、確認することができる。

　高分子膜３を構成する高分子３Ａは、高分子３Ａの側鎖に、ジスルフィド基を介して結合する第２親水性基７Ｂを高分子３Ａの１分子鎖当たり１または複数含むことができる。高分子膜３を構成する高分子３Ａが第２親水性基７Ｂを含むことで、高分子膜３への非特異吸着を抑制することができる。第２親水性基７Ｂは、高分子膜の形成において反応しきれずの残ったジスルフィド結合に結合する親水性基である。例えば、原料としての高分子３Ｂ（第１実施形態に係る高分子）中のジスルフィド結合を介して結合する親水性基の一部に由来する。第２親水性基７Ｂを含む高分子３Ａは、高分子膜３の形成方法における反応条件を緩やかにすること（例えば、より低い反応温度、および／またはより短い反応時間のような反応条件）で調製することができる。緩やかな反応条件としては、例えば、１２～３６時間より短い反応時間、および／または２０～３０℃より低い反応温度である。

　第２親水性基７Ｂは、極性基および／または帯電性基を含む。極性基は、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホニル基、リン酸基、およびアルキレンオキシド基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。帯電性基は、例えば、極性基が帯電した基および双性イオン基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、前記双性イオン基が、ホスホリルコリン基およびベタイン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。

　高分子膜３を構成する高分子３Ａは、好ましくは高分子３Ａの主鎖骨格にアミド結合を含む。高分子３Ａがその主鎖骨格にアミド結合を有すると、高分子３Ａは親水性を有するため、高分子３Ａで構成される高分子膜３への非特異吸着が抑制され、検出感度がさらに向上する。

　高分子３Ａは、主鎖骨格に１または複数のアミノ酸に由来する構造を含む。このようなアミノ酸は、例えば、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸グルタミン、アスパラギン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つを含む。高分子３Ａがその主鎖骨格に１または複数のアミノ酸に由来する構造を有すると、高分子３Ａは親水性を有するため、高分子３Ａで構成される高分子膜３への非特異吸着が抑制され、検出感度がさらに向上する。

　高分子膜３を構成する高分子３Ａは、好ましくは高分子３Ａの主鎖骨格にブロックポリマーとして生体適合性ポリマーを含む。高分子３Ａの主鎖骨格にブロックポリマーとして生体適合性ポリマーを含むと、高分子３Ａは親水性を有するため、高分子３Ａで構成される高分子膜３への非特異吸着が抑制され、検出感度がさらに向上する。このような生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリメタクリルアクリレートが挙げられる。

　高分子膜３を構成する高分子３Ａは、高分子３Ａの主鎖が金属基材２の表面に対して略平行となるように、金属基材２の表面を二次元状に覆うことができる。このような高分子３Ａによる被覆態様は、高分子３Ａの複数の側鎖の末端が硫黄原子を介して金属基材２の表面に結合することで実現され得る。また、高分子膜３は、高分子３Ａの主鎖が金属基材２の表面に対して略平行となるように高分子３Ａが金属基材２の表面を覆うため、高分子鎖がブラシ状に配列して形成された高分子膜（先行技術：国際公開第２００１／０８６３０１号）に比べ、高分子膜３の膜厚を低減できる。

－硫黄原子を介した結合部位－
　硫黄原子を介した結合部位３ａは、例えば、側鎖としてジスルフィド結合を含む部位を有する高分子と、金属基材２（金属ナノ粒子２Ａ）とを混合することで形成される。

－正帯電性基－
　正帯電性基３ｂは、金属基材２（金属ナノ粒子２Ａ）の表面と比較的強い静電結合ｂを形成することができる。正帯電性基３ｂは、本明細書において、１価以上の価数を有し、完全に正に電離した基である。高分子膜３を構成する高分子に含まれる複数の正帯電性基３ｂを考慮した場合、正帯電性基３ｂは、下記の数式（１）：

［数式（１）中、ｐＫａは高分子膜３を構成する高分子３Ａに含まれる電気的に中性な基であって、正に帯電すれば、正帯電性基（より具体的には、第１級アンモニウム基（－ＮＨ_３ ^＋）等）３ｂとなり得る基（以下、電気的中性基とも称する）（より具体的には、第１アミノ基（－ＮＨ_２）等）のｐＫａを示し、ｐＨは被験物質を検出する環境（より具体的には、検体等）のｐＨを示し、Ｂは高分子３Ａに含まれる電気的中性基を示し、ＢＨ^＋は高分子３Ａに含まれる正帯電性基３ｂを示す］
で表されるｐＫａが７以上である基をいう。つまり、正帯電性基３ｂは、高分子膜３を構成する高分子３Ａの電気的中性基および正帯電性基３ｂが被験物質を検出する環境（例えば、ｐＨおおよそ６～８の検体）中で、下記の化学平衡式（２）：

で表される平衡状態を形成している場合であって、正帯電性基３ｂの濃度（［ＢＨ^＋］）が電気的中性基の濃度（［Ｂ］）に比べ１０倍以上大きい基をいう。

　正帯電性基３ｂは、好ましくは第１級アンモニウム基、第２級アンモニウム基、第３級アンモニウム基、第４級アンモニウム基およびグアニジル基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ_２ ^＋）ＮＨ_２）からなる群より選択される少なくとも１種である。

－疎水性基－
　疎水性基３ｃは、金属基材２（金属ナノ粒子２Ａ）の表面との間で疎水結合ｃを形成することができる。
　疎水性基３ｃは、例えば、芳香族環状基、脂肪族環状基および脂肪族鎖状基からなる群より選択される少なくとも１種である。

　芳香族環状基としては、例えば、芳香族炭素環基および芳香族複素環基が挙げられる。芳香族炭素環基は、芳香族複素環を含まず、環員原子がすべて炭素原子である芳香族環を含む基である。芳香族炭素環基としては、例えば、アリール基（より具体的には、フェニル基等）およびアリールアルキル基（より具体的には、ベンジル基等）が挙げられる。芳香族複素環基は、環員原子の少なくとも１つがヘテロ原子（より具体的には、酸素原子、硫黄原子および窒素原子等）である芳香族環を含む基である。芳香族複素環基としては、例えば、含窒素芳香族複素環基（より具体的には、ピリジル基（ピリジニル基）等）、含硫黄芳香族複素環基および含酸素芳香族複素環基が挙げられる。

　脂肪族環状基は、芳香族環を含まず、非芳香族環からなる環状基を含む基である。脂肪族環状基としては、例えば、脂肪族炭素環基および脂肪族複素環基が挙げられる。脂肪族炭素環基は、環員原子がすべて炭素原子である非芳香族環を含む基であり、例えば、シクロアルキル基が挙げられる。脂肪族複素環基は、環員原子の少なくとも１つがヘテロ原子である非芳香族環を含む基である。

　脂肪族鎖状基は、芳香族環および非芳香族環を含まない鎖状（より具体的には、直鎖状および分岐鎖状）の基である。脂肪族鎖状基としては、例えば、脂肪族炭素鎖基（より具体的には、アルキル基およびアルキレン基等）および脂肪族ヘテロ鎖基が挙げられる。アルキル基としては、例えば、ブチル基である。アルキレン基としては、例えば、ｎ－ブチレン基である。

　高分子膜３の膜厚は、好ましくは１ｎｍ～５０ｎｍであり、より好ましくは１ｎｍ～１０ｎｍである。高分子膜３の膜厚が５０ｎｍ以下であると、２つの金属ナノ粒子２間の空間に近接場が効率的に形成される離間距離（離隔距離）となるため、検出感度がさらに向上する。また、高分子膜３の厚みが１ｎｍ以上であると、金属ナノ粒子２と蛍光物質が所定の距離を設けて配置されるため、測定において励起した蛍光物質の消光が抑制され、検出感度がさらに向上する。
　なお、本明細書において、離間距離（離隔距離）とは、複合体において被験物質を介して結合する２つのナノ粒子体にそれぞれ含まれる金属ナノ粒子表面間の距離の最小値（最短距離）をいう。

（第１親水性基）
　第１親水性基７Ａは、金属基材２の表面に結合している。より具体的には、第１親水性基７Ａは、金属基材２の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む。このような結合部位は、例えば、出発物質として金属基材２（金属ナノ粒子２Ａ）と、高分子３Ｂまたはジスルフィド結合を有する化合物（第１実施形態参照）とを混合させることで、形成することができる。

　第１親水性基７Ａは、極性基および／または帯電性基を含む。
　極性基は、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホニル基、リン酸基、およびアルキレンオキシド基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、
　帯電性基は、例えば、極性基が帯電した基および双性イオン基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、前記双性イオン基が、ホスホリルコリン基およびベタイン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。

　第１親水性基７Ａは、好ましくは、高分子膜３から露出する。かかる場合、高分子膜３への非特異吸着をさらに抑制する。

（蛍光物質）
　蛍光物質６は、金属基材２の表面および／または高分子膜３に標識されている。

　蛍光物質６は、蛍光消光を抑制する観点から、リンカー部（例えば、アミド基を含むアルキレン基等）を介して金属基材２の表面に標識されていることが好ましい。蛍光物質６がリンカー部を介して金属基材２の表面に標識されている場合、リンカー部が蛍光物質６と金属基材２の表面との間に位置し、励起した蛍光物質６が金属基材２の表面に接触することを防止しやすい。これにより、蛍光消光がさらに抑制されると考えられる。

　蛍光物質６は、プラズモン共鳴する光波長で励起され、蛍光を発する。蛍光物質は、例えば、ユーロピウムおよびルテニウムのような金属の錯体（金属錯体）が挙げられる。ルテニウム錯体としては、例えば、カウンターアニオンを有し得るトリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）が挙げられる。

　蛍光物質６は、ストークスシフトが大きいことが好ましい。ここで、ストークスシフトは、蛍光物質６の吸収スペクトルにおける吸収ピーク波長（最大励起波長）と、蛍光物質６の蛍光スペクトルにおける蛍光ピーク波長（最大蛍光波長）との差である。蛍光物質６のストークスシフトが大きい場合、吸収スペクトルと蛍光スペクトルとが重なりにくく、検出する蛍光に励起光（の散乱光）が入りにくく、より正確な蛍光強度を測定することができる。

　蛍光物質６の蛍光スペクトルは、シャープであることが好ましい。蛍光スペクトルがシャープであると、蛍光物質６の吸収スペクトルとの重なりにくいため、検出する蛍光に励起光（の散乱光）が入りにくく、より正確な蛍光強度を測定することができる。

（特異結合物質）
　特異結合物質４は、検体中の被験物質（第３実施形態にて詳細に説明する）と特異的に結合するナノサイズ（最長が３～１５ｎｍであるサイズ）の物質である。被験物質としては、例えば、血液、血漿、尿、または唾液である検体に由来する被験物質である。

　特異結合物質４は、例えば、抗体（以下、ナノ抗体と称する）、リガンド、酵素ならびに核酸鎖（より具体的には、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖）からなる群より選択される少なくとも１つである。本実施形態では、このような特異結合物質４を結合させた被覆金属基材１は、検出感度により優れる。例えば、特異結合物質４としてのナノ抗体は、抗原抗体反応により、その先端部（抗原結合部位）で、被験物質としての抗原と特異的に結合して複合体を形成する。特異結合物質４としてのリガンドは、被験物質としてのタンパク質と、リガンド・レセプター反応によって特異的なタンパク質－リガンド結合して複合体を形成する。特異結合物質４としての核酸鎖は、塩基対の相補性に基づいて、相補的な関係にある核酸鎖と核酸鎖の対（二本鎖）を形成する。特異結合物質４としての酵素は、その活性部位（活性中心）で基質特異性（立体特異性）に基づいて被験物質としての基質と酵素－基質複合体を形成する。これらの特異的結合は、非共有結合であり、例えば、水素結合、ならびに分子間力、疎水的相互作用および電荷的相互作用に起因する結合である。

　ナノ抗体は、例えば、ＶＨＨ（variable domain of heavy chain antibody）抗体、断片化抗体（より具体的には、Ｆａｂ（Fragment Antigen Binding）抗体等）およびそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つである。ＶＨＨ抗体は、単一ドメイン抗体である。変異体は、抗原に対する特異結合性を有する範囲内で、アミノ酸配列の一部を組み換えた抗体または置換基を導入した抗体である。ナノ抗体がＶＨＨ抗体、断片化抗体、およびそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つであると、これらのナノ抗体は比較的体積が小さいため、例えば、複合体における２つの金属基材２間の距離（離隔距離）を狭め、近接場をより効率的に形成し、蛍光強度をさらに増大させることができる。

　ナノ抗体の分子質量は、好ましくは６０，０００Ｄａ以下であり、より好ましくは３０，０００Ｄａ以下であり、さらに好ましくは２０，０００Ｄａ以下である。分子質量が６０，０００Ｄａ以下（特に、３０，０００Ｄａ以下、または２０，０００Ｄａ以下）であると、ナノ抗体の体積が比較的小さいため、複合体における離隔距離を狭め、近接場をより効率的に形成し、蛍光強度をさらに増大させることができる。分子質量の測定方法は、電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）、ゲルろ過クロマトグラフィー、および静的光散乱法などである。

　特異結合物質４は、高分子膜３に直接的に結合してもよく、架橋剤に由来するリンカー部（より具体的には、ＳＭ（ＰＥＧ）_ｎ（ここで、ｎは、４，６および８等））を介して高分子膜３に間接的に結合してもよい。このような架橋剤としては、例えば、アミノ基－スルフヒドリル基間架橋剤（より具体的には、ＮＨＳ－マレイミド基架橋剤等）が挙げられる。

［被覆金属基材の製造方法］
　第２実施形態に係る被覆金属基材１の製造方法は、ジスルフィド結合を介して結合する親水性基７を側鎖の末端に有する高分子３Ｂを、金属基材２の表面に接触させて、親水性基７を金属基材２の表面に結合させつつ、かつ金属基材２の表面に高分子膜３を形成する工程（高分子膜形成工程）を含んで成る。高分子膜形成工程では、１の工程で、金属基材２への親水性基７の結合と、高分子膜形成とを並行して実施できる。このように、従来技術に対して簡素化できるため、コストをより低減することができる。被覆金属基材の製造方法における出発物質としての高分子は、第１実施形態に係る高分子である。

　高分子３Ｂを金属基材２の表面に接触させる反応では、反応時間は、例えば、１２～３６時間である。反応温度は、例えば、２０～３０℃である。また、この反応は攪拌条件下で行うこともできる。

　好適な態様では、側鎖において、ジスルフィド基から親水性基７までの第１側鎖長は、ジスルフィド基から高分子３Ｂの主鎖までの第２側鎖長に比べ長い。かかる場合、高分子膜３を構成する高分子３Ａにおいて、第２側鎖長は、金属基材２の表面と結合する側鎖の長さ（つまり、金属基材２の表面と硫黄原子を介した結合部位から高分子膜３を構成する高分子３の主鎖までの側鎖の長さ）に相当する。第１側鎖長は、金属基材２の表面と硫黄原子を介した結合部位から第１親水性基７Ａの先端までの長さに相当する。よって、かかる場合、第１親水性基７Ａは高分子膜３から露出しやすくなる。このため、高分子膜３への非特異吸着をさらに抑制することができる。

＜第３実施形態：複合体＞
　第３実施形態では、２つのナノ粒子体が被験物質を介して結合する複合体を例に挙げて説明する。第３実施形態において、第１実施形態および第２実施形態と同一の符号は、それぞれ第１実施形態および第２実施形態と同じ構成であるため、原則としてその説明を省略する。

　なお、第３実施形態に係る複合体（複合ナノ粒子体）は、被験物質を検出する際に、第２実施形態に係る被覆金属基材（ナノ粒子体）が被験物質を挟み込むように捕捉して形成され得る。複合体は、２以上のナノ粒子体を含んで構成される。
　第３実施形態に係る複合体は、２以上のナノ粒子体を含んで構成される。第３実施形態に係る複合体を形成することができる被覆金属基材１は、金属基材２として金属ナノ粒子２Ａを含むナノ粒子体１Ａであって、ナノ粒子体１Ａとして第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とが含まれ、第１親水性基７Ａは、第１ナノ粒子体の金属ナノ粒子２Ａの表面および第２ナノ粒子体の第２金属ナノ粒子の表面の少なくとも一方に結合しており、第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とが被験物質を介して結合された複合体を形成する被覆金属基材１である。

　図３を参照して、複合体を説明する。図３は、第３実施形態に係る複合体を模式的に示す断面図である。第３実施形態に係る複合体４０Ａは、金属ナノ粒子２Ａを含むナノ粒子体１Ａを２つ含んで成り、２つのナノ粒子体１Ａが第１ナノ粒子体１０Ａと第２ナノ粒子体２０Ａとを含み、第１ナノ粒子体１０Ａと第２ナノ粒子体２０Ａとが被験物質３０を介して結合されている。
　詳しくは、複合体４０Ａは、検出対象である被験物質３０と、２つのナノ粒子体１０Ａ，２０Ａとを含んで成る。２つのナノ粒子体１０Ａ，２０Ａは、複合体４０Ａにおいて、被験物質３０を介して結合されている。つまり、第３実施形態に係る複合体４０Ａは、第２実施形態に係るナノ粒子体１Ａが被験物質３０を介して結合されて形成され得る。２つのナノ粒子体１０Ａ，２０Ａのうち、一方を第１ナノ粒子体１０Ａと称し、もう一方のナノ粒子体を第２ナノ粒子体２０Ａと称する。このように複合体４０Ａは、ナノ粒子体１として第１ナノ粒子体１０Ａと第２ナノ粒子体２０Ａとを含む。

　複合体４０Ａにおいて、第１ナノ粒子体１０Ａは、金属ナノ粒子としての第１金属ナノ粒子１２Ａと、高分子膜としての第１高分子膜１３Ａと、第１親水性基７Ａ（図３では不図示）とを含んで成る。つまり、複合体４０Ａにおいて、第１ナノ粒子体１０Ａは、第１金属ナノ粒子１２Ａと、第１金属ナノ粒子１２Ａの表面を被覆する第１高分子膜１３Ａと、第１金属ナノ粒子１２Ａの表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基７Ａとを含んで成り、第１親水性基７Ａが第１金属ナノ粒子１２Ａの表面に結合しており、第１高分子膜１３Ａが第１金属ナノ粒子１２Ａの表面との間に硫黄原子を介した結合を含む。第１ナノ粒子体１０Ａは、第１高分子膜１３Ａに結合した第１特異結合物質１４Ａと、第１特異結合物質１４Ａに結合した第１蛍光物質１６Ａとをさらに含んで成る。

　複合体４０Ａにおいて、第２ナノ粒子体２０Ａは、金属ナノ粒子としての第２金属ナノ粒子２２Ａと、高分子膜としての第２高分子膜２３Ａと、第１親水性基７Ａ（図３では不図示）とを含んで成る。つまり、複合体４０Ａにおいて、第２ナノ粒子体２０Ａは、第１金属ナノ粒子２２Ａと、第２金属ナノ粒子２２Ａの表面を被覆する第２高分子膜２３Ａと、第２金属ナノ粒子２２Ａの表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基７Ａとを含んで成り、第１親水性基７Ａが第２金属ナノ粒子２２Ａの表面に結合しており、第２高分子膜２３Ａが第２金属ナノ粒子２２Ａの表面との間に硫黄原子を介した結合を含む。第２ナノ粒子体２０Ａは、第２高分子膜２３Ａに結合した第２特異結合物質２４Ａと、第２特異結合物質２４Ａに結合した第２蛍光物質２６Ａとをさらに含んで成る。

　蛍光強度をより増大させる観点から、励起した蛍光物質１６Ａ，２６Ａが消光されにくい範囲で、離隔距離Ｌが小さい方が好ましい。より具体的には、好適な態様では、複合体４０Ａにおける２つのナノ粒子体１０Ａ，２０Ａが互いに近接する。より好適な態様では、複合体４０Ａにおける第１ナノ粒子体１０Ａの第１高分子膜１３Ａと第２ナノ粒子体２０Ａの第２高分子膜２３Ａとが接触するように２つのナノ粒子体１０Ａ，２０Ａが互いに近接する。さらに好適な態様では、複合体４０Ａにおける第１ナノ粒子体１０Ａの第１高分子膜１３Ａおよび第２ナノ粒子体２０Ａの第２高分子膜２３Ａのうちの少なくともいずれかの高分子膜が収縮して接触するように２つのナノ粒子体１０Ａ，２０Ａが互いに近接する。

　さらに好適な態様において、高分子膜１３Ａ，２３Ａのうちの少なくともいずれかの高分子膜が収縮して互いに接触する場合、例えば、図３に記載の複合体４０Ａでは、被験物質３０と、被験物質３０に結合する特異結合物質１４Ａ，２４Ａと、蛍光物質１６Ａ，２６Ａとのうちの少なくとも１つを、高分子膜１３Ａ，２３Ａ中に入り込ませることができると考えられる。また、より好適な態様において、高分子膜１３Ａ，２３Ａが互いに接触する場合、例えば、図３に記載の複合体４０Ａでは、さらに好適な態様と同様に被験物質３０と、被験物質３０に結合する特異結合物質１４Ａ，２４Ａと、蛍光物質１６Ａ，２６Ａとのうちの少なくとも１つを、高分子膜１３Ａ，２３Ａ中に入り込ませることができると考えられる。

　本実施形態では、金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面を被覆する膜が高分子膜１３Ａ，２３Ａであるため、蛍光強度を増大させることができる。その理由は以下のように推測される。金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面を被覆する膜が高分子膜１３Ａ，２３Ａであり、高分子膜１３Ａ，２３Ａは、無機酸化物を含む無機膜に比べ、比較的高い柔軟性を有する。このため、複合体４０Ａにおいて、高分子膜１３Ａ，２３Ａが収縮することができ、これにより２つの金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａが高分子膜の膜厚２つ分（高分子膜１３Ａの膜厚＋高分子膜２３Ａの膜厚）に相当する距離よりも近接することが可能となる。つまり、金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面を被覆する膜が高分子膜１３Ａ，２３Ａであるため、離隔距離Ｌは、高分子膜の膜厚２つ分未満となり得る。これにより、プラズモン増強効果が得やすく、蛍光強度がより増大する。なお、本明細書において、「高分子膜の膜厚２つ分」における高分子膜の膜厚とは、離隔距離の対象となる収縮した部分の高分子膜１３Ａ，２３Ａの膜厚ではなく、離隔対象とならない収縮していない部分の高分子膜１３Ａ，２３Ａの膜厚である。

　本実施形態では、高分子膜１３Ａ，２３Ａを構成する高分子３Ａが、その側鎖（より具体的には、側鎖末端）に金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面との間に硫黄原子を介した結合部位３ａを含む。これにより、蛍光強度がさらに増大させることができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、その理由は以下のように推測される。かかる場合、結合部位３ａは金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面と結合を形成するため、高分子３Ａは網目状構造を有し、金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面を網目状に被覆すると考えられる。このように高分子３Ａは網目状構造を有するため、さらに比較的高い柔軟性を有する。このため、複合体４０Ａにおいて、高分子膜１３Ａ，２３Ａがさらに収縮することができ、これにより２つの金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａが高分子膜の膜厚２つ分に相当する距離よりもさらに近接することが可能となる。よって、本実施形態では、離隔距離Ｌは、高分子膜の膜厚２つ分未満となり得、プラズモン増強効果がさらに得られ、蛍光強度がさらに増大する。

　好適な態様では、高分子膜１３Ａ，２３Ａを構成する高分子３Ａが、その側鎖（より具体的には、側鎖末端）に金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面との間に硫黄原子を介した結合部位３ａに加え、正帯電性基３ｂおよび疎水性基３ｃからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む。これにより、蛍光強度がさらに増大する。特定の理論に拘束されるわけではないが、その理由は以下のように推測される。かかる場合、正帯電性基３ｂおよび疎水性基３ｃからなる群より選択される少なくとも１つは金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面と結合を形成するため、高分子３Ａは網目状構造を有し、金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面を網目状に被覆すると考えられる。このように高分子３Ａは網目状構造を有するため、さらに比較的高い柔軟性を有する。このため、複合体４０Ａにおいて、高分子膜１３Ａ，２３Ａがさらに収縮することができ、これにより２つの金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａが高分子膜の膜厚２つ分に相当する距離よりもさらに近接することが可能となる。よって、本実施形態では、離隔距離Ｌは、高分子膜の膜厚２つ分未満となり得、プラズモン増強効果がさらに得られ、蛍光強度がさらに増大する。

　第１ナノ粒子体１０Ａと第２ナノ粒子体２０Ａとの間の離隔距離Ｌは、例えば、１２ｎｍ～５２ｎｍであり、好ましくは１２ｎｍ～２７ｎｍである。離隔距離Ｌは、第１金属ナノ粒子１２Ａと第２金属ナノ粒子２２Ａとの間の距離であって、第１ナノ粒子体１０Ａの表面上の第１点Ｐ１と、第２ナノ粒子体２０Ａの表面上の第２点Ｐ２とで結ばれる線分が最小となる距離である。離隔距離Ｌが５２ｎｍ以下である場合、複合体４０Ａに励起光が照射されると、第１，第２金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａ間の表面近傍の空間でより効率的に近接場が発生するため、蛍光強度をより増大させることができる。

　金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面を被覆する膜が高分子膜１３Ａ，２３Ａであり、高分子膜１３Ａ，２３Ａが金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面との間に硫黄原子を介した結合部位３ａを含む。このため、離隔距離Ｌは、上述のように、複合体４０Ａにおける２つの金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面を被覆する高分子膜の膜厚２つ分に相当する距離よりも近接することができる。例えば、高分子膜１３Ａ，２３Ａの厚みが５ｎｍである場合、離隔距離Ｌは、１０ｎｍ未満（より具体的には、２～９ｎｍ、３～８ｎｍおよび４～７ｎｍ等）となり得る。

（蛍光物質）
　蛍光物質１６Ａ，２６Ａは、図３に示すように、複合体４０Ａにおいて第１金属ナノ粒子１２Ａと第２金属ナノ粒子２２Ａとの間に少なくとも位置づけられていることが好ましい。金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａ間では近接場が効率的に生じる空間であるため、金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａ間の空間に蛍光物質１６Ａ，２６Ａが位置づけられることで蛍光強度が増大されやすいからである。

（被験物質）
　被験物質３０は、検体に含まれる検出対象となる物質である。被験物質３０としては、例えば、抗原、タンパク質、基質、および核酸鎖が挙げられる。被験物質３０は、特異結合物質１４Ａ，２４Ａと特異的に結合する。例えば、抗原は、少なくとも２つの抗原決定基を有し、抗原決定基で第１，第２特異結合物質１４Ａ，２４Ａと特異的結合を形成する。抗原は、例えば、ｃ反応性タンパク質、ミオグロビン、トロポニンＴ、トロポニンＩ、およびＢＮＰ等のようなタンパク質、ならびにインフルエンザウイルス、およびＲＳウイルス等のようなウイルスの抗原タンパク質である。被験物質３０は、例えば、血液、血漿、尿、または唾液のような検体に由来する被験物質である。つまり、被験物質３０を含む検体としては、例えば、血液、血漿、血清、尿、および唾液である。検体は、溶媒および緩衝液（より具体的には、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline：ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、およびＭＥＳ緩衝液など）をさらに含んでもよい。

（複合体を用いた被験物質の検出方法）
　第３実施形態に係る複合体を用いた被験物質の検出方法の一例を説明する。
　第２実施形態に係るナノ粒子体１Ａを検体に分散させて、検体中に含まれる被験物質３０を捕捉して複合体４０Ａを形成する。

　表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：SPFS）において、複合体４０Ａに励起光を照射すると、局在表面プラズモン共鳴が起き、金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａの表面近傍（特に、２つの金属ナノ粒子１２Ａ，２２Ａ間の表面近傍）で効率的に近接場が形成される。近接場および双極子－双極子機構によって、複合体４０Ａの蛍光物質１６Ａ，２６Ａが効率的に励起され、蛍光が増強する。蛍光光量を測定することによって、検体中の被験物質を検出することができる。

（複合体を用いて被験物質を検出する測定装置）
　図４を参照して、第３実施形態に係る複合体４０Ａを用いて被験物質を検出する測定方法の一例を説明する。図４は、第３実施形態に係る複合体を用いて被験物質を検出する測定装置を模式的に示す図である。図４に示すように、測定装置１００は、励起用光源１１０と、励起光照射光学系１２０と、試薬容器１３０と、受光光学系１４０と、受光素子１５０とを備える。
　励起用光源１１０は、励起光１１２を照射する。励起用光源１１０は、例えば、レーザーである。励起光照射光学系１２０は、励起光１１２の集光のように断面径の調整等を行い、入射励起光１２２を出力する。励起光照射光学系１２０は、レンズ１２４および偏光素子（λ／２板）１２６である。励起光照射光学系１２０から出力した入射励起光１２２は、試薬容器１３０に入射し、試薬容器１３０内の測定試料に照射される。試薬容器１３０は、例えば、着脱可能な容器（より具体的には、セル、およびプレパラート等）、およびマイクロ流路チップである。マイクロ流路チップは、微小な流路を有するチップである。試薬容器１３０がマイクロ流路チップである場合、例えば、第１実施形態に係るナノ粒子体（試薬）と検体とを混合して連続的に供給することができる。このため、あらかじめ測定試料を混合して調製する必要がなく、連続的に測定することが可能となる。

　入射励起光１２２が照射された測定試料は、蛍光（検出光１３２）を発する。受光光学系１４０は、試薬容器１３０への入射励起光１２２の進行方向に対して直角方向に配置される。受光光学系１４０は、測定試料から発せられた検出光１３２の断面径等を調整し、入射励起光１２２の散乱光を取り除く、もしくは光量を調整することが出来る。受光光学系１４０は、レンズ１４４および光学フィルタ１４６である。光学フィルタ１４６は、例えば、バンドパスフィルタ、およびダイクロイックミラーである。

　受光光学系１４０を通過した蛍光１４２は、受光素子１５０で検出される。受光素子１５０は、例えば、ＰＤ、ＡＰＤ、ＰＭＴ、ＣＣＤカメラ、および分光器である。受光素子１５０は、単一波長の蛍光量の測定、蛍光スペクトルの測定、および２次元平面の蛍光イメージング作成が可能である。

＜第４実施形態：複合体＞
　第４実施形態に係る複合体（ナノ粒子体付き金属薄膜）は、異種の被覆金属基材（被覆金属薄膜とナノ粒子体）で構成される点で、同種の被覆金属基材（ナノ粒子体）で構成される第３実施形態に係る複合体と異なる。第４実施形態において、第１実施形態～第３実施形態と同一の符号は、第１実施形態～第３実施形態とそれぞれ同じ構成であるため、原則としてその説明を省略する。

　なお、第４実施形態に係る複合体は、被験物質を検出する際に、第２実施形態に係る被覆金属基材（被覆金属薄膜と、２以上のナノ粒子体）が被験物質を挟み込むように捕捉して形成され得る。
　第４実施形態に係る複合体は、被覆金属薄膜１Ｂと（１以上の）ナノ粒子体１Ａとを含んで構成される。第４実施形態に係る複合体を形成することができる被覆金属基材１は、金属基材２として金属ナノ粒子２Ａを含むナノ粒子体１Ａと、金属基材２として金属薄膜２Ｂを含む被覆金属薄膜１Ｂとを含んで成り、第１親水性基７Ａは、金属ナノ粒子２Ａの表面および金属薄膜２Ｂの表面の少なくとも一方に結合しており、被覆金属薄膜１Ｂとナノ粒子体１Ａとが被験物質を介して結合された複合体を形成する被覆金属基材１である。

　複合体は、図１（ａ）に示す第２実施形態に係るナノ粒子体１Ａと、図１（ｂ）に示す第３実施形態に係る被覆金属薄膜１Ｂとを含んで成り、ナノ粒子体１Ａおよび被覆金属薄膜１Ｂが被験物質３０を介して結合している。第１親水性基７Ａは、金属ナノ粒子２Ａの表面および金属薄膜２Ｂの表面の少なくとも一方に結合している。

　図５を参照して、複合体を説明する。図５は、第４実施形態に係る複合体を模式的に示す断面図である。詳しくは、複合体４０Ｂは、検出対象である被験物質３０と、２以上の第３ナノ粒子体１０Ｂおよび１つの第１被覆金属基材２０Ｂとを含んで成る。第３ナノ粒子体１０Ｂと第１被覆金属基材２０Ｂとは、複合体４０Ｂにおいて、被験物質３０を介して結合されている。つまり、第４実施形態に係る複合体４０Ｂは、第２実施形態に係るナノ粒子体１Ａと被覆金属薄膜１Ｂとが被験物質３０を介して結合されて形成され得る。

　複合体４０Ｂにおいて、第３ナノ粒子体１０Ｂは、金属ナノ粒子としての第３金属ナノ粒子１２Ｂと、高分子膜としての第３高分子膜１３Ｂと、第１親水性基７Ａ（図５では不図示）とを含んで成る。つまり、複合体４０Ｂにおいて、第３ナノ粒子体１０Ｂは、第３金属ナノ粒子１２Ｂと、第３金属ナノ粒子１２Ｂの表面を被覆する第３高分子膜１３Ｂと、第３金属ナノ粒子１２Ｂの表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基７Ａ（図５では不図示）とを含んで成り、第１親水性基７Ａが第３金属ナノ粒子１２Ｂの表面に結合しており、第３高分子膜１３Ｂが第３金属ナノ粒子１２Ｂの表面との間に硫黄原子を介した結合を含む。第３ナノ粒子体１０Ｂは、第３高分子膜１３Ｂに結合した第３特異結合物質１４Ｂと、第３特異結合物質１４Ｂに結合した第３蛍光物質１６Ｂとをさらに含んで成る。

　複合体４０Ｂにおいて、第１被覆金属基材２０Ｂは、金属基材としての第１金属薄膜２２Ｂと、高分子膜としての第４高分子膜２３Ｂと、第１親水性基７Ａ（図５では不図示）とを含んで成る。つまり、複合体４０Ｂにおいて、第１被覆金属基材２０Ｂは、第１金属薄膜２２Ｂと、第１金属薄膜２２Ｂの表面を被覆する第４高分子膜２３Ｂと、第１金属薄膜２２Ｂの表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基７Ａ（図５では不図示）とを含んで成り、第１親水性基７Ａが第１金属薄膜２２Ｂの表面に結合しており、第４高分子膜２３Ｂが第１金属薄膜２２Ｂの表面との間に硫黄原子を介した結合を含む。第１被覆金属基材２０Ｂは、第４高分子膜２３Ｂに結合した第４特異結合物質２４Ｂをさらに含んで成る。

（複合体を用いた被験物質の検出方法）
　第４実施形態に係る複合体を用いた被験物質の検出方法の一例を説明する。
　図４に示す測定装置を用いる。試薬容器１３０に、後述する被験物質３０および第３ナノ粒子体１０Ｂと接触するように、第４高分子膜２３Ｂを露出させて第１被覆金属基材２０Ｂを設置する。試薬容器１３０に被験物質３０を含む分散液をフローして、第４高分子膜２３Ｂに接触させる。これにより、第４高分子膜２３Ｂに結合した第４特異結合物質２４Ｂに被験物質３０を特異的に結合させる。次いで、第３ナノ粒子体１０Ｂを含む分散液を試薬容器１３０にフローして、第４高分子膜２３Ｂに接触させる。これにより、第１被覆金属基材２０Ｂの第４特異結合物質２４Ｂに結合した被験物質３０に、第３ナノ粒子体１０Ｂを特異的に結合させる。その結果、複合体４０Ｂが形成する。
　第３実施形における測定方法と同様にして、蛍光を測定する。これにより、被験物質を検出する。

　本発明は上述の実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で設計変更可能であり、第１～第４実施形態のうちの少なくとも２つを組み合わせてもよい。

　第４実施形態では、複合体（ナノ粒子体付き金属薄膜）４０Ｂは、１の被験物質３０を介して１のナノ粒子体１０Ｂと、高分子膜２３Ｂで被覆された金属薄膜２２Ｂとが結合して形成されたが、これに限定されない。複合体（複合ナノ粒子体付き金属薄膜）は、例えば、１の被験物質３０を介して１の複合体４０Ａと、高分子膜２３Ｂで被覆された金属薄膜２２Ｂとが結合して形成されてもよい。

　第２実施形態では、ナノ粒子体１Ａ、および被覆金属薄膜１Ｂに標識されている蛍光物質６は、図１に示すように、それぞれ３つおよび２つ標識されていたが、これに限定されない。特異結合物質４の数（図１）も同様である。また、第３実施形態に係る複合体４０Ａにおける蛍光物質１６Ａ，２６Ａおよび特異結合物質１４Ａ，２４Ａの数（図３）も同様である。さらに第４実施形態に係る複合体４０Ｂにおける蛍光物質１６Ｂおよび特異結合物質１４Ｂ，２４Ｂの数（図５）も同様である。

　第２～４実施形態では、蛍光物質は、特異結合物質に結合させていたが、これに限定されない。例えば、蛍光物質は、高分子膜に結合させてもよい。

　第３実施形態では、測定装置１００における受光光学系１４０は、試薬容器１３０への入射励起光１２２の進行方向に対して直角方向に配置されているが、これに限定されない。受光光学系１４０は、例えば、入射励起光１２２の進行方向に対して平行方向に配置されてもよく、または入射励起光１２２の進行方向に対して鋭角もしくは鈍角となる方向に配置されてもよい。

　以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。また、特に明記しない限り、実施例における部および％は質量基準である。

　また、実施例では、金属ナノ粒子の分散液中での濃度を吸光度で表記することもある。吸光度は、紫外可視分光光度計（ＴＥＣＡＮジャパン株式会社製「ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００　ＰＲＯ」）を用いて、測定された。なお、吸光度の表記ОＤに下付きに付された数字は、吸収波長を示す。例えば、ＯＤ_４５５＝０．１は、波長４５５ｎｍでの吸光度が０．１であることを示す。

＜実施例１＞
［高分子の調製］
　以下のようにして実施例１の高分子を作製した。

（高分子へのジスルフィド結合の導入：ジスルフィド基導入工程）
　（３ａ－１）側鎖に官能部位を有する高分子としてのポリ－Ｌ－リシン（株式会社ペプチド研究所製「３０７５」、重量平均分子量Ｍｗ＞１２，０００、以下「ＰＬＬ」とも称する）と、（４－１）ジスルフィド基を有する化合物としての３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド－ＰＥＧ４－ＮＨＳ（Thermo Fisher Scientific社製、製造番号「26128」、「ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ」）とを、室温および４時間の条件で、小型回転培養器（タイテック株式会社製「ＲＴ－３０ｍiｎi）を用いて攪拌し、混合した。その結果、（２－１）側鎖にＳＰＤＰリンカーおよびジスルフィド結合を介してピリジル基（ピリジニル基）を有する高分子（以下、「ジスルフィド基を有する高分子」とも称する）を得た。この合成反応は、反応式（ｒ－１）：

で示すように、ポリ－Ｌ－リシンの第１級アミノ基が３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド－ＰＥＧ４－ＮＨＳのＮＨＳエステル基に攻撃する求核置換反応である。

（高分子への親水性基の導入：親水性基導入工程）
　（２－１）ジスルフィド基を有する高分子、および（５ｊ－１）親水性基を有するチオール化合物（sulfobetaine 3-undecanetiol 同仁化学「Ｓ３５０」）を３７℃および１時間の条件で攪拌および混合した。その結果、（１－１）側鎖にＳＰＤＰリンカーおよびジスルフィド結合を介してベタインが結合した高分子（以下、「ベタイン導入高分子」（ＰＬＬ－Ｓ－Ｓ－ベタイン）とも称する）を得た。合成した（１－１）ベタイン導入高分子は、疎水性基（ｎ－ブチレン基）と、正帯電性基（第１アンモニウム基）とを有していた。この合成反応は、反応式（ｒ－２）：

に示すように、（５ｊ－１）親水性基を有するチオール化合物のチオール基が（２－１）ジスルフィド基を有する高分子のジスルフィド基に攻撃するチオール求核反応である。

　図６を参照して、（１－１）ＰＬＬ－Ｓ－Ｓ－ベタインの同定を説明する。図６は、高分子合成の各工程における吸収スペクトルを示す図である。実線が、反応（ｒ－１）後の吸収スペクトル、破線が反応（ｒ－２）後の吸収スペクトル、一点鎖線が反応（ｒ－２）後に限外濾過処理を行った吸収スペクトルを示す。

　吸収スペクトル（実線）の２８０ｎｍ付近の吸収ピークは、（２－１）ジスルフィド基を有する高分子のピリジル基に帰属された。吸収スペクトル（破線）の３４３ｎｍ付近の吸収ピークは、以下の共鳴構造：

を有する３－メルカプトピリジンに帰属された。３－メルカプトピリジンは、反応（ｒ－２）で生成する副生物である。吸収スぺクトル（１点鎖線）は、可視域に極大ピークを有しなかった。これらの結果から、上記反応（ｒ－１）および反応（ｒ－２）が進行して、（１－１）ＰＰＬ－Ｓ－Ｓ－ベタインが生成していることを確認した。

［高分子膜の形成および親水性基の金属ナノ粒子表面への標識］
　得られた（１－１）ＰＬＬ－Ｓ－Ｓ－ベタインを金属ナノ粒子としての銀ナノ粒子（ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｘ製「ＡＧＣＢ８０－１Ｍ」，直径８０ｎｍ，ＯＤ_４５５＝０．１）の分散液１ｍＬに、添加し、室温およびオーバーナイトの条件で、小型回転培養器（タイテック株式会社製「ＲＴ－３０ｍiｎi」）を用いて攪拌し、混合した。その結果、高分子膜で被覆され、かつ親水性物質（ベタイン）で標識された銀ナノ粒子（以下、「親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子」とも称する）の分散液を得た。この反応では、銀の還元作用によって、（１－１）親水性基を有する高分子のジスルフィド基が開裂する。開裂によって生じたポリＬリジン部分と、親水性基とがそれぞれ銀ナノ粒子の表面と硫黄原子を介して結合する。その結果、図７（実施例１の高分子膜の形成方法に関する反応を示す図）に示すように、親水性物質としてのベタインが硫黄原子を介して銀ナノ粒子表面に標識され、かつ高分子膜が硫黄原子を介して銀ナノ粒子表面に結合する。つまり、本工程は親水性基の標識と、高分子膜の形成とが並行して進行するものであった。

［評価方法］
（ＳＥＭ画像）
　走査型電子顕微鏡（株式会社日立ハイテク製「Ｒｅｇｕｌｕｓ８２２０」）を用いて、得られた実施例１の親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子のＳＥＭ画像（倍率３００Ｋ倍）を撮像した。図８は、実施例１の親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。図８に示すように得られたＳＥＭ画像において、銀ナノ粒子が高分子膜で被覆されていることを確認した。

（ゼータ電位および粒度分布による測定評価）
　ゼータ電位測定装置（ＭＡＬＶＥＲＮ社製「ＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ　ｎａｎｏ－ＺＳ」）を用いて、実施例１の親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子のゼータ電位および粒度分布を測定した（それぞれ測定数ｎ＝３）。図９を参照してゼータ電位の測定結果を説明する。図９は、実施例１の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子についてのゼータ電位に対する散乱光強度比の分布（ゼータ電位分布）を示す図である（詳しくは、３回測定して得た分布のうち１の分布である）。ゼータ電位に対する散乱光強度比の分布は、それらのピークが－５．７７～－２．３３ｍＶに存在する分布であった。高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子は、全体的にわずかに負帯電していた。

　図１０を参照して粒度分布の測定結果を説明する。図１０は、実施例１の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子についての粒子径に対する散乱光強度比の分布（粒度分布）を示す図である（詳しくは、３回測定して得た分布ののうち１の分布である）。粒子径に対する散乱光強度比の分布では、９７．９３ｎｍ（期待値Ｍ）±０．１６３ｎｍ（多分散性指数Polydispersity Index（ＰＤＩ））であった。

＜実施例２＞
　反応（ｒ－２）における親水性基を有するチオール化合物を（５ｊ－１）から（５ｋ－１）で表されるホスホルコリン基を有するチオール化合物（医科学創薬株式会社製「商品コード；ＭＣＰ－03-0001―ＰＣ」）：

（５ｋ－１）
に変更した以外は実施例１と同様にして（２－１）ジスルフィド基を有する高分子（ＰＬＬ－Ｓ－Ｓ－ＰＣ）を得た。実施例１と同様の吸収スペクトルが得られた。

　実施例２の親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子のＳＥＭ画像（倍率３００Ｋ倍）を撮像し、ゼータ電位分布および粒度分布を得た。図１１に、実施例２の親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。図１１から銀ナノ粒子が高分子膜で被覆されていることを確認した。実施例２の親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子について、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ―ＳＩＭＳ）を用いて測定した。その結果、銀ナノ粒子が存在する領域にリン酸の存在を確認することができた。このリン酸は、銀ナノ粒子表面に結合したホスホルコリン基に由来するフラグメントであると結論づけた。図１２に、実施例２の高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子についてのゼータ電位分布を示す（詳しくは、３回測定して得た分布のうちの１の分布である）。ゼータ電位分布から、それらのピークが＋２０～＋２７ｍＶに存在する分布であった。高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子は、全体的にわずかに正帯電していた。表１：

に実施例２の親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子の粒度分布に関する期待値Ｍおよび多分散性指数ＰＤＩを示す。

＜比較例１＞
　比較例１では、銀ナノ粒子を被覆するための高分子を（１－１）ＰＬＬ－Ｓ－Ｓ－ベタインからＰＬＬ（株式会社ペプチド研究所製「３０７５」）に変更した以外は、実施例１と同様に高分子被覆銀ナノ粒子を作製した。比較例１では、実施例１と同様に、ゼータ電位分布を測定した。比較例１のゼータ電位分布は、そのピークが＋５０ｍＶ付近に存在する分布であった。高分子被覆銀ナノ粒子は、全体的に正帯電していた。

＜比較例２＞
　比較例２では、高分子被覆親水性基標識銀ナノ粒子の代わりに銀ナノ粒子（ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｘ製「ＡＧＣＢ８０－１Ｍ」，直径８０ｎｍ）を使用した以外は、実施例１と同様にして、粒度分布およびゼータ電位分布を測定した。比較例２のゼータ電位分布は、そのピークが－５０ｍＶ付近に存在する分布であった。銀ナノ粒子は、全体的に負帯電していた。

（実施例１～２および比較例１～２の比較）
　実施例１～２のゼータ電位分布では、ピーク位置のゼータ電位の絶対値が、比較例１～２のピーク位置のゼータ電位の絶対値に比べ小さかった。通常、ゼータ電位が０ｍＶ付近に近づくと凝集し、一次粒子状態で分散するのは困難である。それにもかかわらず、実施例１～２の粒度分布の結果では、期待値が銀ナノ粒子の粒径（８０ｎｍ）よりわずかに大きいだけであった。この増加分は、高分子膜の膜厚分であると考えられる。また、ＰＤＩもそれほど大きくはなかった。これらを考慮すると、親水性基標識高分子被覆銀ナノ粒子（被覆金属基材）が一次粒子状態で分散しているものと考えられる。これは、金属基材の表面に親水性基が存在することによるものと考えてられる。以上から、ノイズ成分に寄与する非特異的吸着物質の吸着を効果的に抑制できるものと考えられる。

　本開示に係る被覆金属基材およびその製造方法、被覆金属基材を含む複合体、ならびに被覆金属基材を製造するための高分子の態様は、以下の通りである。
＜１＞
　金属ナノ粒子および／または金属薄膜である金属基材と、該金属基材の表面を被覆する高分子膜と、前記金属基材の表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基とを含んで成り、
　前記第１親水性基は、前記金属基材の表面に結合しており、
　前記高分子膜が、前記金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む、被覆金属基材。
＜２＞
　前記第１親水性基は、前記金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む、＜１＞に記載の被覆金属基材。
＜３＞
　前記高分子膜を形成する高分子が、該高分子の側鎖に前記金属基材の表面との間に前記硫黄原子を介した前記結合部位を含む、＜１＞または＜２＞に記載の被覆金属基材。
＜４＞
　前記高分子膜を構成する高分子が、該高分子の側鎖に、ジスルフィド基を介して結合する第２親水性基を該高分子の１分子鎖当たり１または複数含む、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜５＞
　前記高分子が、該高分子の側鎖に前記第２親水性基をさらに含み、
　前記第１親水性基および前記第２親水性基が、各々独立に、極性基および／または帯電性基を含み、
　前記極性基が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホニル基、リン酸基、およびアルキレンオキシド基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、
　前記帯電性基が、前記極性基が帯電した基および双性イオン基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、前記双性イオン基が、ホスホリルコリン基およびベタイン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜４＞に記載の被覆金属基材。
＜６＞
　前記高分子膜を構成する高分子は、該高分子の主鎖骨格にアミド結合を含む、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜７＞
　前記高分子膜を構成する高分子が、該高分子の側鎖に正帯電性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記正帯電性基は、第１級アンモニウム基、第２級アンモニウム基、第３級アンモニウム基、第４級アンモニウム基およびグアニジル基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ_２ ^＋）ＮＨ_２）からなる群より選択される少なくとも１種である、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜８＞
　前記高分子膜を構成する高分子が、該高分子の側鎖に疎水性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記疎水性基は、芳香族環状基、脂肪族環状基および脂肪族鎖状基からなる群より選択される少なくとも１種である、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜９＞
　前記高分子は、主鎖骨格に１または複数のアミノ酸に由来する構造を含み、
　前記アミノ酸は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸グルタミン、アスパラギン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜３＞～＜８＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１０＞
　前記高分子膜を構成する高分子は、該高分子の主鎖骨格にブロックポリマーとして生体適合性ポリマーを含む、＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１１＞
　蛍光物質および／または検体中の被験物質と特異的に結合する特異結合物質をさらに含んで成る、＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１２＞
　前記特異結合物質が、ナノ抗体である、＜１１＞に記載の被覆金属基材。
＜１３＞
　前記高分子膜の膜厚は、１ｎｍ～１０ｎｍである、＜１＞～＜１２＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１４＞
　プラズモン励起蛍光分析に用いる被覆金属基材である、＜１＞～＜１３＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１５＞
　前記金属基材が金または銀を含んで成る、＜１＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１６＞
　前記金属基材として前記金属ナノ粒子を含むナノ粒子体であって、
　前記ナノ粒子体として第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とが含まれ、
　前記第１親水性基は、前記第１ナノ粒子体の前記金属ナノ粒子の表面および前記第２ナノ粒子体の前記金属ナノ粒子の表面の少なくとも一方に結合しており、
　前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体とが被験物質を介して結合された複合体を形成する、＜１＞～＜１５＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１７＞
　前記金属基材として前記金属ナノ粒子を含むナノ粒子体と、前記金属基材として前記金属薄膜を含む被覆金属薄膜とを含んで成り、
　前記第１親水性基は、前記金属ナノ粒子の表面および前記金属薄膜の表面の少なくとも一方に結合しており、
　前記被覆金属薄膜と前記ナノ粒子体とが被験物質を介して結合された複合体を形成する、＜１＞～＜１６＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜１８＞
　前記被験物質が、血液、血漿、尿、または唾液である検体に由来する被験物質である、＜１６＞または＜１７＞に記載の被覆金属基材。
＜１９＞
　前記高分子膜を構成する分子は、該高分子の主鎖が前記金属基材の表面に対して略平行となるように、前記金属基材の表面を二次元状に覆う、＜１＞～＜１８＞のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
＜２０＞
　＜１＞～＜１９＞のいずれか１項に記載の金属ナノ粒子を含むナノ粒子体を２以上含んで成り、
　前記２以上のナノ粒子体が第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とを含み、
　前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体とが被験物質を介して結合されている、複合体。
＜２１＞
　＜１＞～＜１９＞のいずれか１項に記載の金属ナノ粒子を含むナノ粒子体と、＜１＞～＜１９＞のいずれか１項に記載の金属薄膜を含む被覆金属薄膜とを含んで成り、
　前記第１親水性基は、前記金属ナノ粒子の表面および前記金属薄膜の表面の少なくとも一方に結合しており、
　前記ナノ粒子体と前記被覆金属薄膜とが被験物質を介して結合されている、複合体。
＜２２＞
　ジスルフィド基を介して結合する親水性基を側鎖の末端に有する、高分子。
＜２３＞
　前記親水性基が、極性基および／または帯電性基を含み、
　前記極性基が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホニル基、リン酸基、およびアルキレンオキシド基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、
　前記帯電性基が、前記極性基が帯電した基および双性イオン基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、前記双性イオン基が、ホスホリルコリン基およびベタイン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜２２＞に記載の高分子。
＜２４＞
　前記高分子の側鎖に正帯電性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記正帯電性基は、第１級アンモニウム基、第２級アンモニウム基、第３級アンモニウム基、第４級アンモニウム基およびグアニジル基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ_２ ^＋）ＮＨ_２）からなる群より選択される少なくとも１種である、＜２２＞または＜２３＞に記載の高分子。
＜２５＞
　前記高分子の側鎖に疎水性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記疎水性基は、芳香族環状基、脂肪族環状基および脂肪族鎖状基からなる群より選択される少なくとも１種である、＜２２＞～＜２４＞のいずれか１項に記載の高分子。
＜２６＞
　前記高分子の主鎖骨格にアミド結合を含む、＜２２＞～＜２５＞のいずれか１項に記載の高分子。
＜２７＞
　前記高分子の主鎖骨格に１または複数のアミノ酸に由来する構造を有し、
　前記アミノ酸は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜２２＞～＜２６＞のいずれか１項に記載の高分子。
＜２８＞
　前記高分子の主鎖骨格にブロックポリマーとして生体適合性ポリマーを含む、＜２２＞～＜２７＞のいずれか１項に記載の高分子。
＜２９＞
　＜２２＞～＜２８＞のいずれか１項に記載の高分子を、金属基材の表面に接触させて、前記親水性基を前記金属基材の表面に結合させつつ、かつ前記金属基材の表面に高分子膜を形成する工程を含んで成る、被覆金属基材の製造方法。
＜３０＞
　前記側鎖において、前記ジスルフィド基から前記親水性基までの第１側鎖長は、前記ジスルフィド基から前記高分子の主鎖までの第２側鎖長に比べ長い、＜２９＞に記載の被覆金属基材の製造方法。

　１　・・・被覆金属基材
　１Ａ　・・・ナノ粒子体
　１Ｂ　・・・被覆金属薄膜
　２　・・・金属基材
　２Ａ　・・・金属ナノ粒子
　２Ｂ　・・・金属薄膜
　３　・・・高分子膜
　３Ａ　・・・（高分子膜を構成する）高分子
　３Ｂ　・・・（高分子膜を形成する）高分子
　４　・・・特異結合物質
　６　・・・蛍光物質
　７　・・・親水性基
　７Ａ　・・・第１親水性基
　７Ｂ　・・・第２親水性基
　１０Ａ　・・・第１ナノ粒子体
　１０Ｂ　・・・第３ナノ粒子体
　１２Ａ　・・・第１金属ナノ粒子
　１２Ｂ　・・・第３金属ナノ粒子
　１３Ａ　・・・第１高分子膜
　１３Ｂ　・・・第３高分子膜
　１４Ａ　・・・第１特異結合物質
　１４Ｂ　・・・第３特異結合物
　１６Ａ　・・・第１蛍光物質
　１６Ｂ　・・・第３蛍光物質
　２０Ａ　・・・第２ナノ粒子体
　２０Ｂ　・・・第１被覆金属基材
　２２Ａ　・・・第２金属ナノ粒子
　２２Ｂ　・・・第１金属薄膜
　２３Ａ　・・・第２高分子膜
　２３Ｂ　・・・第４高分子膜
　２４Ａ　・・・第２特異結合物質
　２４Ｂ　・・・第４特異結合物質
　２６Ａ　・・・第２蛍光物質
　３０　・・・被験物質
　４０Ａ，４０Ｂ　複合体
　Ｌ　・・・離隔距離（離間距離）

Claims

　金属ナノ粒子および／または金属薄膜である金属基材と、該金属基材の表面を被覆する高分子膜と、前記金属基材の表面への非特異吸着を抑制する第１親水性基とを含んで成り、
　前記第１親水性基は、前記金属基材の表面に結合しており、
　前記高分子膜が、前記金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む、被覆金属基材。
　前記第１親水性基は、前記金属基材の表面との間に硫黄原子を介した結合部位を含む、請求項１に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜を形成する高分子が、該高分子の側鎖に前記金属基材の表面との間に前記硫黄原子を介した前記結合部位を含む、請求項１または２に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜を構成する高分子が、該高分子の側鎖に、ジスルフィド基を介して結合する第２親水性基を該高分子の１分子鎖当たり１または複数含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記高分子が、該高分子の側鎖に前記第２親水性基をさらに含み、
　前記第１親水性基および前記第２親水性基が、各々独立に、極性基および／または帯電性基を含み、
　前記極性基が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホニル基、リン酸基、およびアルキレンオキシド基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、
　前記帯電性基が、前記極性基が帯電した基および双性イオン基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、前記双性イオン基が、ホスホリルコリン基およびベタイン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項４に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜を構成する高分子は、該高分子の主鎖骨格にアミド結合を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜を構成する高分子が、該高分子の側鎖に正帯電性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記正帯電性基は、第１級アンモニウム基、第２級アンモニウム基、第３級アンモニウム基、第４級アンモニウム基およびグアニジル基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ_２ ^＋）ＮＨ_２）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～６のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜を構成する高分子が、該高分子の側鎖に疎水性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記疎水性基は、芳香族環状基、脂肪族環状基および脂肪族鎖状基からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～７のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記高分子は、主鎖骨格に１または複数のアミノ酸に由来する構造を含み、
　前記アミノ酸は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸グルタミン、アスパラギン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項３～８のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜を構成する高分子は、該高分子の主鎖骨格にブロックポリマーとして生体適合性ポリマーを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　蛍光物質および／または検体中の被験物質と特異的に結合する特異結合物質をさらに含んで成る、請求項１～１０のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記特異結合物質が、ナノ抗体である、請求項１１に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜の膜厚は、１ｎｍ～１０ｎｍである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　プラズモン励起蛍光分析に用いる被覆金属基材である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記金属基材が金または銀を含んで成る、請求項１～１４のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記金属基材として前記金属ナノ粒子を含むナノ粒子体であって、
　前記ナノ粒子体として第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とが含まれ、
　前記第１親水性基は、前記第１ナノ粒子体の前記金属ナノ粒子の表面および前記第２ナノ粒子体の前記金属ナノ粒子の表面の少なくとも一方に結合しており、
　前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体とが被験物質を介して結合された複合体を形成する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記金属基材として前記金属ナノ粒子を含むナノ粒子体と、前記金属基材として前記金属薄膜を含む被覆金属薄膜とを含んで成り、
　前記第１親水性基は、前記金属ナノ粒子の表面および前記金属薄膜の表面の少なくとも一方に結合しており、
　前記被覆金属薄膜と前記ナノ粒子体とが被験物質を介して結合された複合体を形成する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　前記被験物質が、血液、血漿、尿、または唾液である検体に由来する被験物質である、請求項１６または１７に記載の被覆金属基材。
　前記高分子膜を構成する分子は、該高分子の主鎖が前記金属基材の表面に対して略平行となるように、前記金属基材の表面を二次元状に覆う、請求項１～１８のいずれか１項に記載の被覆金属基材。
　請求項１～１９のいずれか１項に記載の金属ナノ粒子を含むナノ粒子体を２以上含んで成り、
　前記２以上のナノ粒子体が第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とを含み、
　前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体とが被験物質を介して結合されている、複合体。
　請求項１～１９のいずれか１項に記載の金属ナノ粒子を含むナノ粒子体と、請求項１～１９のいずれか１項に記載の金属薄膜を含む被覆金属薄膜とを含んで成り、
　前記第１親水性基は、前記金属ナノ粒子の表面および前記金属薄膜の表面の少なくとも一方に結合しており、
　前記ナノ粒子体と前記被覆金属薄膜とが被験物質を介して結合されている、複合体。
　ジスルフィド基を介して結合する親水性基を側鎖の末端に有する、高分子。
　前記親水性基が、極性基および／または帯電性基を含み、
　前記極性基が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホニル基、リン酸基、およびアルキレンオキシド基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、
　前記帯電性基が、前記極性基が帯電した基および双性イオン基からなる群より選択される少なくとも１つを含み、前記双性イオン基が、ホスホリルコリン基およびベタイン基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の高分子。
　前記高分子の側鎖に正帯電性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記正帯電性基は、第１級アンモニウム基、第２級アンモニウム基、第３級アンモニウム基、第４級アンモニウム基およびグアニジル基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ_２ ^＋）ＮＨ_２）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２２または２３に記載の高分子。
　前記高分子の側鎖に疎水性基をさらに含み、
　前記側鎖は、ジスルフィド結合を有さず、
　前記疎水性基は、芳香族環状基、脂肪族環状基および脂肪族鎖状基からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の高分子。
　前記高分子の主鎖骨格にアミド結合を含む、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の高分子。
　前記高分子の主鎖骨格に１または複数のアミノ酸に由来する構造を有し、
　前記アミノ酸は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の高分子。
　前記高分子の主鎖骨格にブロックポリマーとして生体適合性ポリマーを含む、請求項２２～２７のいずれか１項に記載の高分子。
　請求項２２～２８のいずれか１項に記載の高分子を、金属基材の表面に接触させて、前記親水性基を前記金属基材の表面に結合させつつ、かつ前記金属基材の表面に高分子膜を形成する工程を含んで成る、被覆金属基材の製造方法。
　前記側鎖において、前記ジスルフィド基から前記親水性基までの第１側鎖長は、前記ジスルフィド基から前記高分子の主鎖までの第２側鎖長に比べ長い、請求項２９に記載の被覆金属基材の製造方法。