JP6660935B2 - 固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法に関する。

タンパク質、核酸、細胞等の標的物質を血液等の試料から検出・分離することを目的として固相担体が利用されている。固相担体を用いた検出・分離法としては、固相担体にリガンドを結合させ、これに試料を接触させることによって標的物質をリガンドと反応させる方法が一般的であるが、上記接触の際に、試料中の標的物質や夾雑物が、リガンドではなく固相担体の表面に非特異的に吸着しこれがノイズとなる場合がある。

そのため、リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーとともに、双性イオン構造を有するモノマーや一定以上の長さのポリエチレングリコール鎖を有するモノマーといった親水性の高いモノマーを用いた共重合体を固相担体の表面に形成させることで、その表面の親水性を高めることにより、非特異吸着を抑制する試みがなされている（特許文献１〜３）。

特開２０１２−１８１１８１号公報 国際公開第２０１１／１２５６１８号 特開２０１２−１７７６９１号公報 特開２００８−１９１１２８号公報

しかしながら、上記のような親水性の高いモノマーを用いて固相担体表面の親水性を高めるのみでは、非特異吸着を充分に抑制するには至らず、また、リガンドを結合して用いた場合の標的物質の捕捉量にも改善の余地があった。
また、特許文献２及び３では、放射線照射グラフト重合法やシランカップリング法を利用して固相担体の表面に共重合体を結合させているが、斯様なグラフト化等の特殊な手法を利用しなくても簡便に製造できる固相担体の開発が望まれる。固相担体の表面に共重合体を形成させる簡便な手法として乳化重合法が知られているが（特許文献４）、親水性の高いモノマー由来の構造単位を含む重合体を乳化重合法で固相担体の表面に形成させることは困難であり、乳化重合法のような簡便な手法で製造できることと、非特異吸着を充分に抑制させることを両立させるのは難しかった。

したがって、本発明が解決しようとする課題は、簡便な手法で製造でき、非特異吸着が発生しにくく、リガンドを結合した場合に優れた標的物質捕捉性能を示す固相担体を提供することにある。

そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、（Ａ）双性イオン構造を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して１〜３５質量％と、（Ｂ）リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して７０質量％以下と、（Ｃ）リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーに由来する構造単位とを含む共重合体が少なくとも固相の表面を形成することを特徴とする固相担体が、乳化重合法を利用して簡便に製造でき、非特異吸着が発生しにくく、リガンドを結合した場合に優れた標的物質捕捉性能を示すことを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜４＞を提供するものである。

＜１＞ 以下の構造単位（Ａ）〜（Ｃ）を含む共重合体が少なくとも固相の表面を形成することを特徴とする、固相担体。
（Ａ）双性イオン構造を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して１〜３５質量％
（Ｂ）リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して７０質量％以下
（Ｃ）リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーに由来する構造単位

＜２＞ 上記＜１＞の固相担体にリガンドを結合させてなる、リガンド結合固相担体。

＜３＞ 上記＜２＞のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法。

＜４＞ 双性イオン構造を有するモノマー：全モノマーに対して１〜３５質量％と、リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマー：全モノマーに対して７０質量％以下と、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーとを、原料担体の存在下でラジカル重合させる工程を含むことを特徴とする、固相担体の製造方法。

本発明の固相担体は、簡便な手法で製造できる。しかも、非特異吸着が発生しにくく、リガンドを結合した場合に優れた標的物質捕捉性能を示すため、本発明の固相担体にリガンドを結合して用いることによって、高感度且つ低ノイズで標的物質の検出等を行うことができる。
また、本発明の製造方法によれば、非特異吸着が発生しにくく、リガンドを結合した場合に優れた標的物質捕捉性能を示す固相担体を簡便に製造できる。

〔固相担体〕
本発明の固相担体は、以下の構造単位（Ａ）〜（Ｃ）を含む共重合体（以下、共重合体（Ｉ）とも称する）が少なくとも固相の表面を形成することを特徴とするものである。ここで、本明細書において、「固相の表面を形成する」とは、固相（基材）そのものが共重合体（Ｉ）を含むこと、或いは共重合体（Ｉ）で固相（基材）が物理的に被覆されることなどによって、共重合体（Ｉ）が固相の表面を形成することいい、共重合体（Ｉ）が固相表面から形成されるグラフト鎖であることを除く概念である。
（Ａ）双性イオン構造を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して１〜３５質量％
（Ｂ）リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して７０質量％以下
（Ｃ）リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーに由来する構造単位

＜構造単位（Ａ）＞
共重合体（Ｉ）は、双性イオン構造を有するモノマーに由来する構造単位を、全構造単位に対して１〜３５質量％含む。斯かる構造単位に含まれる双性イオン構造により、固相担体表面の親水性を高めることができ、非特異吸着が抑制される。なお、構造単位（Ａ）は、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、水素イオン、水酸化物イオン等の対イオンを有していてもよい。以下いずれの態様においても同様である。

双性イオン構造を有するモノマーに由来する構造単位としては、例えば、双性イオン構造を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、双性イオン構造を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位、双性イオン構造を有するスチレン系モノマーに由来する構造単位が挙げられ、これらのうち１種を含んでいてもよく、２種以上を含んでいてもよい。
これらの中でも、非特異吸着抑制の観点から、双性イオン構造を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、双性イオン構造を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位が好ましく、双性イオン構造を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位がより好ましい。

双性イオン構造としては、非特異吸着抑制の観点から、第４級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-、−ＳＯ₃ ^-及び−Ｏ−（Ｏ＝Ｐ−Ｏ^-）−Ｏ−から選ばれる１価又は２価のアニオン性官能基とを有するものが好ましく、下記式（１）又は（２）で表されるものが特に好ましい。

〔式（１）中、
Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｒ³は、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-又は−ＳＯ₃ ^-を示し、
Ｒ⁴及びＲ⁵は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕

〔式（２）中、
Ｒ⁶及びＲ⁷は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｒ⁸、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕

式（１）中のＲ¹及びＲ²、式（２）中のＲ⁶及びＲ⁷は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示すが、非特異吸着抑制の観点から、炭素数１〜１０の２価の有機基が好ましい。当該有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が好ましく、２価の炭化水素基がより好ましい。

２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が更に好ましく、１〜３が特に好ましい。一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、その合計炭素数としては、２〜８が好ましく、２〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましく、２又は３が特に好ましい。

Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁶及びＲ⁷における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。

式（１）中のＲ³としては、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-が好ましい。
式（１）中のＲ⁴及びＲ⁵、式（２）中のＲ⁸、Ｒ⁹及びＲ¹⁰としては、メチル基が好ましい。

構造単位（Ａ）の好適な具体例としては、下記式（３）で表される構造単位が挙げられる。

〔式（３）中、
Ｒ¹¹は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ¹²は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁴−＊（Ｒ¹⁴は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（３）中のＲ¹³と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ¹³は、双性イオン構造を示す。〕

式（３）中、Ｒ¹²としては、非特異吸着抑制の観点から、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁴−＊が好ましく、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊がより好ましい。
また、Ｒ¹³で示される双性イオン構造は上記双性イオン構造と同様であり、非特異吸着抑制の観点から、第４級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-、−ＳＯ₃ ^-及び−Ｏ−（Ｏ＝Ｐ−Ｏ^-）−Ｏ−から選ばれる１価又は２価のアニオン性官能基とを有するものが好ましく、式（１）又は（２）で表されるものが特に好ましい。
また、Ｒ¹⁴としては、水素原子が好ましい。

双性イオン構造を有するモノマーとしては、例えば、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトエチル）ジメチルアミニウム、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトプロピル）ジメチルアミニウム、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホメチル）アンモニウムヒドロキシド、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホエチル）アンモニウムヒドロキシド、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、Ｏ−［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エトキシ（オキシラト）ホスフィニル］コリン等が挙げられ、これらのうち１種を用いてよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

構造単位（Ａ）の含有量は、共重合体（Ｉ）中の全構造単位に対して１〜３５質量％である。本発明の固相担体は、共重合体（Ｉ）中の構造単位（Ａ）が低含量であるため、乳化重合法を利用して簡便に製造することができる。その一方で本発明の固相担体は、上記のように共重合体（Ｉ）中の構造単位（Ａ）が低含量であるにも拘らず、非特異吸着が発生しにくく、リガンドを結合して用いた場合に低ノイズで標的物質の検出等を行うことができるという驚くべき性能を有する。
構造単位（Ａ）の含有量は、全構造単位に対して、好ましくは３質量％以上であり、また、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２５質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下、更に好ましくは１５質量％以下、特に好ましくは１０質量％以下である。
なお、共重合体（Ｉ）中の各構造単位の含有量は、例えば、Ｘ線光電子分光分析や元素分析等を利用して測定すればよい。

＜構造単位（Ｂ）＞
共重合体（Ｉ）は、リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーに由来する構造単位を、全構造単位に対して７０質量％以下含む。構造単位（Ｂ）は、リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーに由来する構造単位のうち、構造単位（Ａ）以外のものを意味する。
リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーに由来する構造単位としては、例えば、（メタ）アクリル酸又はその塩に由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有するスチレン系モノマーに由来する構造単位が挙げられ、これらのうち１種を含んでいてもよく、２種以上を含んでいてもよい。
これらの中でも、簡便な手法で製造できる点や非特異吸着抑制の観点等から、（メタ）アクリル酸又はその塩に由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位が好ましく、リガンドと化学結合可能な官能基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位がより好ましい。

また、リガンドと化学結合可能な官能基としては、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アジド基が挙げられる。これらの中でも、標的物質捕捉性能の観点や、リガンドとしてタンパク質や核酸等の生体分子を使用する場合にリガンドが元来有している官能基を使用して固相担体と結合できる点から、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基が好ましく、カルボキシ基がより好ましい。

また、リガンドと化学結合可能な官能基の含有量は、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、固相担体の固形分１ｇあたり、好ましくは１μｍｏｌ以上、より好ましくは１０μｍｏｌ以上、更に好ましくは２５μｍｏｌ以上、特に好ましくは５０μｍｏｌ以上であり、また、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは８００μｍｏｌ以下、より好ましくは６５０μｍｏｌ以下、更に好ましくは５００μｍｏｌ以下である。
リガンドと化学結合可能な官能基の含有量は、例えば、リガンドと化学結合可能な官能基がカルボキシ基の場合、電気伝導度測定法等により測定可能であり、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。また、リガンドと化学結合可能な官能基がトシル基の場合は、トシル基の紫外可視光吸収を測定するなどして求めることができ、リガンドと化学結合可能な官能基がアミノ基の場合は、アミノ基にＮ−スクシイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートを反応させた後、還元し、遊離のチオピリジル基の吸光度を測定するなどして求めることができる。

構造単位（Ｂ）の好適な具体例としては、下記式（４）で表される構造単位が挙げられる。

〔式（４）中、
Ｒ¹⁵は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ¹⁶は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁸−＊（Ｒ¹⁸は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（４）中のＲ¹⁷と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ¹⁶が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊である場合、Ｒ¹⁷は、水素原子、又はリガンドと化学結合可能な官能基を有する有機基を示し、Ｒ¹⁶が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁸−＊又はフェニレン基である場合、Ｒ¹⁷は、リガンドと化学結合可能な官能基を有する有機基を示す。〕

式（５）中、Ｒ¹⁶としては、非特異吸着抑制の観点から、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁸−＊が好ましく、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊がより好ましい。Ｒ¹⁸としては、水素原子が好ましい。

また、Ｒ¹⁷としては、簡便な手法で製造できる点や非特異吸着抑制の観点等から、リガンドと化学結合可能な官能基を有する有機基が好ましい。リガンドと化学結合可能な官能基を有する有機基としては、下記式（５）で表される有機基が好ましい。なお、Ｒ¹⁷、Ｙにおけるリガンドと化学結合可能な官能基は、上記リガンドと化学結合可能な官能基と同様であり、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基が好ましく、カルボキシ基がより好ましい。

〔式（５）中、
Ｒ¹⁹は、２価の有機基を示し、
Ｙは、リガンドと化学結合可能な官能基を示す。〕

Ｒ¹⁹で示される２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられ、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が好ましい。

２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜２０が好ましく、１〜１０がより好ましく、１〜８が更に好ましく、１〜６が特に好ましい。
また、２価の有機基が２価の炭化水素基である場合において、当該２価の炭化水素基は、２価の脂肪族炭化水素基、２価の脂環式炭化水素基及び２価の芳香族炭化水素基を含む概念であるが、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。

一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、その合計炭素数としては、２〜２０が好ましく、２〜１６がより好ましく、２〜１２が更に好ましく、２〜８が特に好ましい。
また、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、下記式（６）で表される２価の基が好ましい。

〔式（６）中、
Ｒ²⁰及びＲ²¹は、それぞれ独立して、２価の炭化水素基を示し、
Ｘは、エーテル結合、イミノ基、アミド結合又はエステル結合を示し、
＊は、式（５）中のＹとの結合位置を示す。〕

Ｘとしては、エステル結合が好ましい。
Ｒ²⁰及びＲ²¹で示される２価の炭化水素基は、２価の脂肪族炭化水素基、２価の脂環式炭化水素基及び２価の芳香族炭化水素基を含む概念である。
２価の脂肪族炭化水素基の炭素数としては、１〜１０が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６が特に好ましい。なお、２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
２価の脂環式炭化水素基の炭素数としては、５〜１０が好ましく、５〜７がより好ましい。２価の脂環式炭化水素基としては、シクロアルカンジイル基が好ましく、具体的には、シクロヘキサンジイル基、シクロヘプタンジイル基等が挙げられる。
２価の芳香族炭化水素基の炭素数としては、６〜１８が好ましく、６〜１２がより好ましい。２価の芳香族炭化水素基としては、アリーレン基が好ましく、具体的には、フェニレン基、ナフチレン基等が挙げられる。

また、Ｒ²⁰とＲ²¹との組み合わせとしては、Ｒ²⁰が２価の脂肪族炭化水素基であり、Ｒ²¹が２価の脂肪族炭化水素基、２価の脂環式炭化水素基又は２価の芳香族炭化水素基である組み合わせが好ましく、Ｒ²⁰が２価の脂肪族炭化水素基であり、Ｒ²¹が２価の脂肪族炭化水素基である組み合わせがより好ましい。

リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーとしては、例えば、コハク酸水素１−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル、フタル酸１−（１−（メタ）アクリロイルオキシエチル）、１，２−シクロヘキサンジカルボン酸水素１−［１−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］、コハク酸水素１−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル、１，２−シクロヘキサンジカルボン酸水素１−［１−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル］、コハク酸１−（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）、フタル酸１−（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）、ヘキサヒドロフタル酸水素１−（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）、コハク酸水素２−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル、フタル酸水素１−（２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）、ヘキサヒドロフタル酸水素１−（２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）、コハク酸水素３−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル、フタル酸水素１−（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）、１，２−シクロヘキサンジカルボン酸水素１−［３−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル］等が挙げられ、これらのうち１種を用いてよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

構造単位（Ｂ）の含有量は、共重合体中の全構造単位に対して７０質量％以下である。斯かる構成により、非特異吸着が発生しにくくなり、また、標的物質捕捉性能が向上する。
構造単位（Ｂ）の含有量は、全構造単位に対して、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは１質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、特に好ましくは２０質量％以上であり、また、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、特に好ましくは４０質量％以下である。

また、構造単位（Ａ）と構造単位（Ｂ）の含有量の質量比〔（Ａ）：（Ｂ）〕としては、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、５：９５〜６０：４０が好ましく、１０：９０〜５０：５０がより好ましく、１５：８５〜４０：６０が更に好ましく、１７．５：８２．５〜３５：６５が更に好ましく、１７．５：８２．５〜３０：７０が更に好ましく、１７．５：８２．５〜２５：７５が特に好ましい。

＜構造単位（Ｃ）＞
共重合体（Ｉ）は、上記構造単位（Ａ）及び（Ｂ）以外に、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーに由来する構造単位を含む。斯かる構成により、非特異吸着が発生しにくくなり、また、標的物質捕捉性能が向上する。
なお、本明細書において、水難溶性モノマーとは、水１００ｇに対して１０ｇ以下の溶解性をもつモノマーを意味する。

リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーに由来する構造単位としては、例えば、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性スチレン系モノマーに由来する構造単位が挙げられ、これらのうち１種を含んでいてもよく、２種以上を含んでいてもよい。また、これら構造単位を誘導する水難溶性モノマーは、単官能性モノマーでも多官能性モノマーでもよい。
これらの中でも、非特異吸着抑制の観点等から、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位が好ましく、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位がより好ましい。

構造単位（Ｃ）としては、以下の構造単位（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）が好ましい。なお、共重合体（Ｉ）は、これらのうち１種を含んでいてもよく、２種以上を含んでいてもよい。

（Ｃ−１）重合させてホモポリマーとし自由水を共存させた場合に中間水を保持するモノアクリレートモノマー又は該モノアクリレートモノマーと側鎖の構造が同一のモノメタクリレートモノマーに由来する構造単位

（Ｃ−２）下記式（７）で表されるモノ（メタ）アクリレートモノマーに由来する構造単位

〔式（７）中、
Ｒ²²は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ²³は、炭化水素基を示す。〕

（Ｃ−３）多官能性モノマーに由来する構造単位

（構造単位（Ｃ−１））
構造単位（Ｃ−１）は、重合させてホモポリマーとし自由水を共存させた場合に中間水を保持するモノアクリレートモノマー又は該モノアクリレートモノマーと側鎖の構造が同一のモノメタクリレートモノマーに由来する構造単位である。

ここで、自由水を共存させた場合に中間水を保持するホモポリマーとは、示差走査熱量計（ＤＳＣ）による示差走査熱量分析によって得られるＤＳＣ曲線において、昇温過程で−１０℃未満に水の結晶化による発熱ピークが観測されるホモポリマーをいう。
また、自由水とは、示差走査熱量分析によって得られるＤＳＣ曲線において、昇温過程で０℃付近の融点（吸熱ピーク）として観測される水をいう。
また、中間水とは、示差走査熱量分析によって得られるＤＳＣ曲線において、昇温過程で、−１０℃未満で結晶化による発熱ピークとして観測される水をいう。
また、昇温過程とは、示差走査熱量分析において、−１００℃以下まで冷却したのちの昇温過程をいう。

構造単位（Ｃ−１）としては、下記式（８）又は（９）で表されるモノマーに由来する構造単位が好ましく、下記式（９）で表されるモノマーに由来する構造単位がより好ましい。

〔式（８）中、
Ｒ²⁴は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ²⁵は、炭素数１〜３のアルカンジイル基を示し、
Ｒ²⁶は、炭素数１〜３のアルキル基を示し、
ｎは、１〜５の整数を示す。〕

〔式（９）中、
Ｒ²⁷は、水素原子又はメチル基を示し、
ｍは、１又は２を示す。〕

式（８）中、Ｒ²⁵で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２又は３が好ましく、２がより好ましい。また、アルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
Ｒ²⁶で示されるアルキル基の炭素数としては、１又は２が好ましい。また、アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
ｎは、１〜５の整数を示すが、１〜３の整数が好ましい。
式（９）中、ｍは、１又は２を示すが、１が好ましい。

構造単位（Ｃ−１）を誘導するモノマーとしては、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート、ジ（エチレングリコール）モノメチルエーテルアクリレート、ジ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート、ジ（エチレングリコール）モノエチルエーテルアクリレート、ジ（エチレングリコール）モノエチルエーテルメタクリレート、トリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルアクリレート、トリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート、トリ（エチレングリコール）モノエチルエーテルアクリレート、トリ（エチレングリコール）モノエチルエーテルメタクリレート等が挙げられ、これらのうち１種を用いてよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

（構造単位（Ｃ−２））
構造単位（Ｃ−２）は、下記式（７）で表されるモノ（メタ）アクリレートモノマーに由来する構造単位である。

〔式（７）中、
Ｒ²²は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ²³は、炭化水素基を示す。〕

Ｒ²³で示される炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基を包含する概念である。
Ｒ²³における脂肪族炭化水素基の炭素数としては、１〜２０が好ましく、１〜１２がより好ましく、１〜８が更に好ましい。なお、脂肪族炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
Ｒ²³における脂環式炭化水素基の炭素数としては、６〜１２が好ましく、６〜１０がより好ましい。脂環式炭化水素基は、単環の脂環式炭化水素基と橋かけ環炭化水素基に大別される。単環の脂環式炭化水素基としては、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。また、橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基等が挙げられる。
Ｒ²³における芳香族炭化水素基の炭素数としては、６〜１２が好ましい。芳香族炭化水素基としては、フェニル基等のアリール基が挙げられる。

これら炭化水素基の中でも、Ｒ²³としては、脂環式炭化水素基が好ましく、シクロアルキル基がより好ましい。

構造単位（Ｃ−２）を誘導するモノマーとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等が挙げられ、これらのうち１種を用いてよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

（構造単位（Ｃ−３））
構造単位（Ｃ−３）は、多官能性モノマーに由来する構造単位である。例えば、多官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。これらの中でも、多官能性（メタ）アクリレート系モノマーが好ましい。多官能性（メタ）アクリレート系モノマーとしては、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレート等の二官能性（メタ）アクリレート系モノマー；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等の三官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）メタクリレート等の六官能性（メタ）アクリレート系モノマー等が挙げられる。

また、構造単位（Ｃ）としては、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、構造単位（Ｃ−１）を少なくとも含むもの、構造単位（Ｃ−３）を少なくとも含むものが好ましく、構造単位（Ｃ−１）を少なくとも含むものがより好ましく、構造単位（Ｃ−１）及び（Ｃ−３）を少なくとも含むものが特に好ましい。

構造単位（Ｃ）の合計含有量は、全構造単位に対して、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上、更に好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは５０質量％以上、特に好ましくは５５質量％以上であり、また、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、特に好ましくは７０質量％以下である。

また、構造単位（Ａ）と構造単位（Ｃ）の含有量の質量比〔（Ａ）：（Ｃ）〕としては、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、１：９９〜６０：４０が好ましく、５：９５〜５０：５０がより好ましく、１０：９０〜４０：６０が更に好ましく、１０：９０〜３０：７０が更に好ましく、１０：９０〜２０：８０が特に好ましい。
また、構造単位（Ｂ）と構造単位（Ｃ）の含有量の質量比〔（Ｂ）：（Ｃ）〕としては、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、１：９９〜９９：１が好ましく、１０：９０〜６０：４０がより好ましく、２０：８０〜４５：５５が更に好ましく、２０：８０〜４０：６０が特に好ましい。

また、共重合体（Ｉ）が構造単位（Ｃ−１）を有する場合、構造単位（Ｃ−１）の含有量は、全構造単位に対して、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、更に好ましくは３０質量％以上、更に好ましくは４０質量％以上、特に好ましくは５０質量％以上であり、また、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下、特に好ましくは６０質量％以下である。

また、共重合体（Ｉ）が構造単位（Ｃ−２）を有する場合、構造単位（Ｃ−２）の含有量は、全構造単位に対して、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、特に好ましくは３０質量％以上であり、また、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、特に好ましくは７０質量％以下である。

また、共重合体（Ｉ）が構造単位（Ｃ−３）を有する場合、構造単位（Ｃ−３）の含有量は、全構造単位に対して、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは１質量％以上、より好ましくは３質量％以上であり、また、非特異吸着抑制や標的物質捕捉性能等の観点から、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、特に好ましくは１５質量％以下である。

また、共重合体（Ｉ）は、上記構造単位（Ａ）〜（Ｃ）以外の構造単位（以下、構造単位（Ｄ）とも称する）を有していてもよい。
構造単位（Ｄ）としては、例えば、双性イオン構造を有するモノマー以外の親水性モノマーに由来する構造単位が挙げられる。より具体的には、メトキシポリエチレングリコール＃４００メタクリレート（新中村化学工業）等に由来する構造単位等である。

また、共重合体（Ｉ）が架橋構造を有していない場合、数平均分子量（Ｍｎ）としては、５，０００〜１，０００，０００が好ましく、１０，０００〜５００，０００がより好ましい。
また、共重合体（Ｉ）が架橋構造を有していない場合、重量平均分子量（Ｍｗ）としては、５，０００〜１，０００，０００が好ましく、１０，０００〜５００，０００がより好ましい。
また、共重合体（Ｉ）が架橋構造を有していない場合、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）としては、１．０〜３．０が好ましい。
なお、数平均分子量、重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定したポリエチレングリコール換算の平均分子量を意味する。

また、共重合体（Ｉ）中の構造単位の配列の態様は特に限定されず、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互共重合体のいずれであってもよいが、簡便な手法で製造できる点等から、ランダム共重合体が好ましい。

本発明の固相担体は、上記共重合体（Ｉ）が少なくとも固相の表面を形成するものであれば、固相（基材）そのものが共重合体（Ｉ）を含むものでも、共重合体（Ｉ）で固相（基材）が物理的に被覆されたものでもよい。
また、固相の基材（原料担体）は、有機物でも金属や金属酸化物等の無機物でもよく特に限定されないが、樹脂を含むものが好ましい。樹脂としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。
また、本発明の固相担体の形態は特に限定されるものではなく、粒子、モノリス、膜、繊維、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましく、磁性粒子がより好ましい。本発明の固相担体が、粒子、特に磁性粒子の形態の場合には、優れた再分散性が発揮され、検出・分離等の操作を大幅に簡便化できる。なお、本明細書において「磁性粒子」とは、磁性体を有する粒子を意味する。

また、磁性体は、強磁性、常磁性、超常磁性のいずれであってもよいが、磁場による分離と磁場を取り除いた後の再分散を容易にする観点から、超常磁性であることが好ましい。磁性体としては、フェライト、酸化鉄、鉄、酸化マンガン、マンガン、酸化ニッケル、ニッケル、酸化コバルト、コバルト等の金属、又は合金が挙げられる。
また、磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの粒子の少なくとも表面を、上記共重合体（Ｉ）が形成するものが挙げられる。好ましくは多孔質又は非多孔質の磁性ポリマー粒子である。

（ｉ）樹脂等の非磁性体を含む連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子
（ｉｉ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、樹脂等の非磁性体をシェルとする粒子
（ｉｉｉ）樹脂等の非磁性体で構成される核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層に、樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられた粒子
（ｉｖ）粒子の最外層に樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられていてもよい、樹脂やシリカ等からなる多孔質粒子の孔内に磁性体微粒子が分散している粒子
また、（ｉ）〜（ｉｖ）の粒子の数平均粒子径は、好ましくは０．０５〜２５０μｍであり、より好ましくは０．１〜５０μｍであり、特に好ましくは０．１〜２５μｍである。なお、（ｉ）〜（ｉｖ）の粒子はいずれも公知であり、常法に従い製造可能である。

上記（ｉ）〜（ｉｖ）における樹脂は特に限定されないが、例えば、単官能性モノマー及び多官能性モノマーから選ばれる１種又は２種以上に由来する樹脂が挙げられる。
単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の単官能性芳香族ビニル系モノマー；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、１，４−シクロヘキサンジメタノールモノ（メタ）アクリレート等の単官能性（メタ）アクリレート系モノマーが挙げられる。多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）メタクリレート、アリル（メタ）アクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。

また、本発明の固相担体が粒子の場合の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．０２〜５００μｍであり、より好ましくは０．１〜２５０μｍであり、更に好ましくは０．２〜１００μｍであり、更に好ましくは０．３〜５０μｍである。斯様な範囲とすることにより、固相担体が磁性粒子である場合に集磁速度が速くなりハンドリング性が改善される。また、本発明の固相担体は、平均粒径が０．０５〜０．３μｍ程度の比較的小さい粒子である場合でも、良好な再分散性が得られる。
また、平均粒径の変動係数は、２０％以下程度であればよい。
また、比表面積は、１．０〜２．０ｍ²／ｇ程度であればよい。
なお、上記平均粒径及び比表面積は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。

次に、本発明の固相担体の製造方法について説明する。
本発明の固相担体は、例えば、双性イオン構造を有するモノマー：全モノマーに対して１〜３５質量％と、リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマー：全モノマーに対して７０質量％以下と、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーとを、原料担体（基材）の存在下でラジカル重合させる工程を含む方法により製造できる。

ラジカル重合は、特開２００８−１９１１２８号公報等を参考にして常法に従い行えばよいが、乳化重合、懸濁重合等が好ましく、簡便性及び容易性等の観点から、乳化重合がより好ましく、水中油型（Ｏ／Ｗ）の乳化重合が特に好ましい。具体的には、原料担体を分散させた水系媒体（水等）中に上記モノマーを含むプレエマルジョンを滴下して重合させる方法が挙げられる。

また、ラジカル重合は、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等の重合開始剤；アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等の界面活性剤等を用いて行うのが好ましい。
また、重合温度は、通常４０〜１００℃であり、好ましくは５０〜９０℃である。また、重合時間は通常１〜４８時間である。

そして、本発明の固相担体は、簡便な手法で製造でき、しかも、非特異吸着が発生しにくく、リガンドを結合した場合に優れた標的物質捕捉性能を示すため、本発明の固相担体にリガンドを結合して用いることによって、高感度且つ低ノイズで標的物質の検出等を行うことができる。また、標的物質の分離を高純度化することができる。
したがって、本発明の固相担体をアフィニティー担体とすることで、酵素免疫測定、放射免疫測定、化学発光免疫測定等の抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ；タンパク質、核酸等の検出；細胞、タンパク質、核酸等の生体関連物質のバイオセパレーション；薬物探索；バイオセンサー等をはじめとする、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明の固相担体は、イムノアッセイのため、或いは核酸検出のための使用に特に適する。

〔リガンド結合固相担体〕
本発明のリガンド結合固相担体は、本発明の固相担体にリガンドを結合させてなるものである。
上記リガンドは、標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、抗体；抗原；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；ヌクレオチド；ヌクレオシド；プロテインＡ、プロテインＧ、（ストレプト）アビジン、酵素、レクチン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；アミノ酸；ヘパリン等の糖又は多糖；脂質；ビオチン等のビタミン；薬物；基質；ホルモン；神経伝達物質等が挙げられる。
これらの中でも、診断薬用等に適したリガンド結合固相担体とする観点からは、抗体、抗原が好ましい。抗体、抗原は標的物質と結合するものであればよいが、例えば、抗アンチプラスミン抗体、抗Ｄダイマー抗体、抗ＦＤＰ抗体、抗ｔＰＡ抗体、抗トロンビン・アンチトロンビン複合体抗体、抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＢＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＴＳＨ抗体、抗フェリチン抗体、抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗アポリポタンパク抗体、抗β２−ミクロブロブリン抗体、抗α１―ミクログロブリン抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ジゴキシン抗体、抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗体又はこれに対する抗原；ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ抗原、ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原又はこれに対する抗体；ＤＮＡ抗原、熱変成ヒトＩｇＧ等の自己免疫関連検査用抗原又はこれに対する抗体等が挙げられる。なお、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。

リガンド結合量は、リガンド結合固相担体の固形分１ｍｇあたり、好ましくは１〜２００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、更に好ましくは１〜５０μｇ、特に好ましくは１〜３０μｇである。
リガンド結合量は、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。

リガンドの結合は常法に従い行えばよいが、共有結合法で行うのが好ましい。例えば、リガンドと化学結合可能な官能基がカルボキシ基であり、リガンドがアミノ基を有するものである場合は、脱水縮合剤を用いて結合させればよい。

本発明のリガンド結合固相担体は、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明のリガンド結合固相担体は、イムノアッセイのため、或いは核酸検出のための使用に特に適する。

〔標的物質の検出又は分離方法〕
本発明の試料中の標的物質を検出又は分離する方法は、本発明のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とするものである。

標的物質はリガンドと結合するものであればよいが、具体的には、抗原；モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；細胞（正常細胞、及び大腸がん細胞、血中循環がん細胞等のがん細胞）；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン等の生体関連物質が挙げられ、創薬ターゲットとなる薬物、ビオチン等の小分子化合物でもよい。なお、標的物質は、蛍光物質などにより標識化されたものでもよい。
なお、試料は、上記標的物質を含むもの又は標的物質を含む可能性があるものであればよく、具体的には、血液、血漿、血清、標的物質を含有するバッファー溶液等である。

本発明の検出又は分離方法は、本発明のリガンド結合固相担体を用いる以外は常法にしたがって行えばよい。例えば、本発明のリガンド結合固相担体と標的物質を含む試料を、混合するなどして接触させる工程（接触工程）、及び標的物質を捕捉したリガンド結合固相担体を、磁石などを用いて試料から分離する工程（分離工程）を含む方法が挙げられる。なお、当該分離工程の後に、標的物質を検出する工程、又はリガンドと標的物質を解離させる工程を含んでいてもよい。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例７は参考例である。

＜リガンドと化学結合可能な官能基（反応性官能基）の含有量＞
粒子から遊離させた鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基（カルボキシ基）の含有量を、電気伝導度測定法（Ｍｅｔｒｏｈｍ社、７９４ Ｂａｓｉｃ Ｔｉｔｒｉｎｏ）を用いて測定することで、粒子固形分１ｇあたりの反応性官能基の含有量を求めた。

＜体積平均粒径＞
各粒子の体積平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ１３ ３２０）にて測定した。

〔合成例１〕
油性磁性流体（「ＥＸＰシリーズ、ＥＭＧ」、（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
次いで、ポリスチレン粒子（数平均粒子径：０．７７μｍ）３０ｇ及び上記疎水化処理された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（（株）奈良機械製作所製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６，２００ｒｐｍ）で５分間処理し、磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子（数平均粒子径：１．０μｍ）を得た。

〔実施例１〕
ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液３００ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、次いで、合成例１で得た母粒子１０ｇを加え、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱し温度を保持した。
次に別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム（以下、「ＣＢＭＡ」という。）０．５ｇ、２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸（以下、「ＳＡ」という。）２．０ｇ、テトラヒドロフルフリルメタクリレート（以下、「ＴＨＦＭＡ」という。）３．５ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）０．５ｇ、及びジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（パーロイル３５５−７５（Ｓ） 日油（株）製（以下、「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」という。））０．１５ｇを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、６０℃に保持した上記５００ｍＬセパラブルフラスコに２時間かけて全量滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し２時間撹拌した。次いで、上記５００ｍＬセパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例２〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ１．０ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ＴＨＦＭＡ３．０ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例３〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ２．０ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ＴＨＦＭＡ２．０ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例４〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＳＡ２．０ｇ、シクロヘキシルメタクリレート（以下、「ＣＨＭＡ」という）３．５ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例５〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＳＡ１．０ｇ、ＴＨＦＭＡ４．５ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例６〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＳＡ３．０ｇ、ＴＨＦＭＡ２．５ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例７〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ＴＨＦＭＡ４．０ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例８〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、Ｏ−［２−（メタクリロイルオキシ）エトキシ（オキシラト）ホスフィニル］コリン（以下、「ＭＰＣ」という。）０．５ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ＴＨＦＭＡ３．５ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例９〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート（以下、「ＤＥＧＭＡ」という。）３．５ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔実施例１０〕
ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液３００ｇ、ヘプタン１０ｇに分散した磁性流体ＥＭＧ６ｇ、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＳＡ２ｇ、ＴＨＦＭＡ３．５ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、パーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、分散させてプレエマルジョンを得たのち、６０℃まで昇温して、２時間保持した。次いで、上記５００ｍＬセパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。得られた粒子の体積平均粒径は、０．２μｍであった。

〔比較例１〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ４．５ｇ、ＳＡ２．０ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔比較例２〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ＴＨＦＭＡ４．０ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔比較例３〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ３．０ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ＴＨＦＭＡ１．０ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔比較例４〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液４５ｇ、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＳＡ５．０ｇ、ＴＨＦＭＡ０．５ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、１．２μｍであった。

〔比較例５〕
プレエマルジョンを作製するための原料として、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液３００ｇ、ヘプタン１０ｇに分散した磁性流体ＥＭＧ６ｇ、ＳＡ２．０ｇ、ＴＨＦＭＡ４．０ｇ、ＴＭＰ０．５ｇ、及びパーロイル３５５−７５（Ｓ）０．１５ｇを使用した以外は、実施例１０と同様の操作を行った。得られた粒子の体積平均粒径は、０．２μｍであった。

〔試験例１〕
各実施例及び比較例で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子をＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）９９０μＬに分散させ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、ＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）１ｍＬに分散させ、抗ＴＳＨ抗体（フナコシ社製）２０μｇを加えた。室温で１２時間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄し、抗体結合粒子を得た。抗体結合量をＢＣＡ Ａｓｓａｙにより求めた。結果を表２に示す。

〔試験例２〕
試験例１で得られた抗体結合粒子の分散液５μＬ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）５０μＬが添加された５μＩＵ／ｍＬのＴＳＨ抗原溶液（富士レビオ社製ルミパルスＴＳＨ−ＩＩＩ標準ＴＳＨ溶液）５０μＬを混合し、２５℃で１０分間反応させた。磁気を用いて粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスフォターゼで標識した抗ＴＳＨ抗体（富士レビオ社製ルミパルスＴＳＨ−ＩＩＩ免疫反応カートリッジ付属）４０μＬを添加し、２５℃で１０分間反応させた。磁気を用いて粒子を分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を、５０μＬの０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に分散させ、新しいチューブに移し替えた。アルカリフォスフォターゼの基質液（富士レビオ社製ルミパルス基質液）１００μＬを加え、３７℃で１０分間反応させた後、シグナルとして化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン社製の化学発光測定装置（Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７）を用いた。また上記で、５μＩＵ／ｍＬのＴＳＨ抗原溶液の代わりに、０μＩＵ／ｍＬのＴＳＨキャリブレータとした以外は同様にして、ノイズとして化学発光量を測定した。さらに、シグナル（Ｓ）をノイズ（Ｎ）で割った値Ｓ／Ｎを算出した。結果を表２に示す。

〔試験例３〕
各実施例及び比較例で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させ、分散液をエッペンドルフチューブに投入した。チューブを磁性ビーズ分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ（東洋紡社製））に取り付け、５分間程度静置して粒子がペレット状に集磁されたことを確認した。次いで、スタンドからチューブを取り外して粒子を磁気から解放し、１分間経過後の様子を確認し、以下の基準で評価した。評価結果を表２に示す。
＜評価基準＞
○：ペレットが崩れながらチューブ下部に沈降し、再分散性が良い
×：ペレットがほぼ保持され、再分散性が悪い

各実施例及び比較例で得られた磁性粒子表面の共重合体を構成するモノマーの組成を、表１に示す。

表２に示すとおり、実施例１〜１０の磁性粒子は、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が高く、高感度且つ低ノイズで抗原を検出できた。また、再分散性も良好であった。

Claims (20)

1. 以下の構造単位（Ａ）〜（Ｃ）を含む共重合体が少なくとも固相の表面を形成し、前記共重合体が、構造単位（Ｃ）として、構造単位（Ｃ−３）リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性の多官能性モノマーに由来する構造単位を少なくとも含むことを特徴とする、固相担体。
   （Ａ）双性イオン構造を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して１〜３５質量％
   （Ｂ）リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマーに由来する構造単位：全構造単位に対して７０質量％以下
   （Ｃ）リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーに由来する構造単位
2. 構造単位（Ａ）が、下記式（３）で表される構造単位である、請求項１に記載の固相担体。
   

   

   〔式（３）中、
   Ｒ¹¹は、水素原子又はメチル基を示し、
   Ｒ¹²は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁴−＊（Ｒ¹⁴は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（３）中のＲ¹³と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
   Ｒ¹³は、双性イオン構造を示す。〕
3. 前記双性イオン構造が、下記式（１）又は（２）で表されるものである、請求項１又は２に記載の固相担体。
   

   

   〔式（１）中、
   Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
   Ｒ³は、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ^-又は−ＳＯ₃ ^-を示し、
   Ｒ⁴及びＲ⁵は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
   

   

   〔式（２）中、
   Ｒ⁶及びＲ⁷は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
   Ｒ⁸、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
4. 構造単位（Ｂ）が、カルボキシ基を有するモノマーに由来する構造単位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相担体。
5. 構造単位（Ｂ）が、下記式（４）で表される構造単位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相担体。
   

   

   〔式（４）中、
   Ｒ¹⁵は、水素原子又はメチル基を示し、
   Ｒ¹⁶は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁸−＊（Ｒ¹⁸は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（４）中のＲ¹⁷と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
   Ｒ¹⁶が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊である場合、Ｒ¹⁷は、水素原子、又はリガンドと化学結合可能な官能基を有する有機基を示し、Ｒ¹⁶が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ¹⁸−＊又はフェニレン基である場合、Ｒ¹⁷は、リガンドと化学結合可能な官能基を有する有機基を示す。〕
6. 前記共重合体が、構造単位（Ｃ）として、以下の構造単位（Ｃ−１）を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固相担体。
   （Ｃ−１）重合させてホモポリマーとし自由水を共存させた場合に中間水を保持するモノアクリレートモノマー又は該モノアクリレートモノマーと側鎖の構造が同一のモノメタクリレートモノマーに由来する構造単位
7. 構造単位（Ｃ−１）が、下記式（８）又は（９）で表されるモノマーに由来する構造単位である、請求項６に記載の固相担体。
   

   

   〔式（８）中、
   Ｒ²⁴は、水素原子又はメチル基を示し、
   Ｒ²⁵は、炭素数１〜３のアルカンジイル基を示し、
   Ｒ²⁶は、炭素数１〜３のアルキル基を示し、
   ｎは、１〜５の整数を示す。〕
   

   

   〔式（９）中、
   Ｒ²⁷は、水素原子又はメチル基を示し、
   ｍは、１又は２を示す。〕
8. 前記共重合体が、構造単位（Ｃ）として、以下の構造単位（Ｃ−２）を更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の固相担体。
   （Ｃ−２）下記式（７）で表されるモノ（メタ）アクリレートモノマーに由来する構造単位
   

   

   〔式（７）中、
   Ｒ ²² は、水素原子又はメチル基を示し、
   Ｒ ²³ は、炭化水素基を示す。〕
9. 構造単位（Ｃ）の含有量が、全構造単位に対して１０〜９０質量％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の固相担体。
10. リガンドと化学結合可能な官能基の含有量が、固相担体の固形分１ｇあたり、１〜８００μｍｏｌである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の固相担体。
11. 粒子である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の固相担体。
12. 磁性粒子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の固相担体。
13. 平均粒径が、０．０２〜５００μｍである、請求項１１又は１２に記載の固相担体。
14. 前記共重合体が、乳化重合法で形成されたものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の固相担体。
15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の固相担体にリガンドを結合させてなる、リガンド結合固相担体。
16. 前記リガンドが、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモン又は神経伝達物質である、請求項１５に記載のリガンド結合固相担体。
17. イムノアッセイ用又は核酸検出用である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の固相担体又はリガンド結合固相担体。
18. 請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法。
19. 双性イオン構造を有するモノマー：全モノマーに対して１〜３５質量％と、
    リガンドと化学結合可能な官能基を有するモノマー：全モノマーに対して７０質量％以下と、
    リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーとを、
    原料担体の存在下でラジカル重合させる工程を含み、前記リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性モノマーとして、リガンドと化学結合可能な官能基を有さない水難溶性の多官能性モノマーを少なくとも用いることを特徴とする、固相担体の製造方法。
20. 前記ラジカル重合が、乳化重合である、請求項１９に記載の製造方法。