JP2736467B2 - 磁気応答ポリマー粒子の製造法およびその応用 - Google Patents

磁気応答ポリマー粒子の製造法およびその応用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、磁気応答ポリマー粒子の製造法と、それら
のイムノアッセイ、生医学および産業用途における使用
に関する。

本発明の背景 イムノアッセイ、アフィニティ精製等の多数の生物学
的技術は結合分画の遊離分画からの分離を必要とする。
磁性粒子が所望の分離を容易にするために使用されてい
る。

磁性粒子は種々のプロセスを用いて種々の特性を有す
る種々の粒状および磁性物質から形成されている。例え
ば、池田らの米国特許第4,582,622号はゼラチン、水溶
性ポリサッカライド、リン酸ナトリウムおよび強磁性物
質からなる磁性粒子を開示し、米国特許第4,628,037号
および第4,554,088号は高分子シランのコートによって
囲まれた磁性金属酸化物よりなる磁性粒子を開示し、米
国特許第4,452,773号は水溶性ポリサッカライドもしく
は官能基を有するその誘導体によって被覆された強磁性
酸化鉄(Fe2O3)のコアを有する別々のコロイドサイズ
の粒子を開示し、そしてマンスフィールドの米国特許第
4,297,337号は磁性ガラスもしくは結晶含有材料を粒子
状担体として開示する。

本発明の概要 本発明は、形状および組成に関係なく、直径約1ない
し100ミクロンの平均サイズを有する、以後磁性粒子と
呼ぶ磁気応答ポリマー粒子の新規製造法を提供する。

本発明の磁性粒子は、約1ミクロン以下の平均サイズ
を持った、以下金属酸化物と呼ぶ磁気応答金属酸化物を
最初製造し、次に高分子コア粒子を金属酸化物を含んで
いるポリマーの層で被覆することによって製造すること
ができる。これら磁性粒子の表面は所望の表面特性を与
えるためポリマーもしくは官能化したポリマーの他の層
でさらに被覆することができる。

本発明によって製造される磁性粒子はあらい表面をも
ってサイズが単分散され、そして約5%ないし50%,好
ましくは10%ないし25%の磁性金属酸化物含量を有す
る。これら特性を持っている粒子はイムノアッセイおよ
び多種類の生医学用途に有用であることがわかった。こ
れら磁性粒子は抗原、抗体、酵素またはDNA/RNAのよう
な生物学的材料の受動的もしくは共有結合カップリング
のために使用し、そして種々のタイプのイムノアッセ
イ、DNA/RNAハイブリッド化アッセイ、アフィニティー
精製、細胞分離および他の生医薬学的用途のための固相
として使用することができる。この磁性粒子はまた、産
業廃棄物の処理のような産業用途にも使用することがで
きる。

目的および利益 本発明の目的は、 磁気応答ポリマー粒子を容易に入手し得るポリマー粒
子から容易に製造する方法を開発すること、 緩和な沈降と速い磁気分離を有する磁気応答ポリマー
粒子を製造する方法を開発すること、 種々の表面電荷、および生物学的材料の受動的吸着も
しくは共有結合のための官能基を有する、磁気応答ポリ
マー粒子の製造法を開発すること、 これら磁気応答ポリマー粒子を使用する医学的、生物
学的、診断および産業用途を開発することである。

本発明の利益は、 約1ないし100ミクロンのサイズを有する多種類のポ
リマーコアを磁気応答粒子へ変換できること、 金属酸化物を用途に応じて変えることができること、 表面を共有結合のための多種類の官能基へ誘導体化で
きること、 多種類のモノマーを生成するポリマーの異なった表面
特性を得るように最終コーティングに使用できること、 架橋および架橋ないし磁気応答粒子を製造できるこ
と、 単分散磁気応答ポリマー粒子を製造できることであ
る。

本発明の詳細な説明 本発明の磁性粒子は、約1ミクロン以下の平均サイズ
を持った金属酸化物を最初に製造することによって製造
することができる。金属酸化物は2価および3価の金属
塩の混合物、好ましくは硫酸もしくは塩化第一鉄もしく
は第二鉄の混合物を水酸化ナトリウムと加熱しそして沈
澱させることによって製造される。3価金属塩に対する
2価金属塩のモル比は、金属酸化物の所望のサイズおよ
び磁気特性を得るため、0.5から2.0,好ましくは0.5から
1.0まで変化させることができる。3価金属塩に対する
2価金属塩のモル比は金属酸化物のサイズに影響し、3
価の金属塩に対する2価の金属塩のモル比が小さいほど
金属酸化物のサイズが小さくなる。3価金属塩に対する
2価金属塩のモル比は得られる磁性粒子の色相にも影響
を及ぼし、このモル比が小さいほど得られる磁性粒子の
褐色が明るくなる。好ましくは金属酸化物は超常磁性ま
たは常磁性であるが、磁気分離でなく遠心をクリーンア
ップの間使用する限り強磁性金属酸化物も使用できる。

マンガン、マグネシウム、コバルト、ニッケル、亜鉛
および銅のような他の2価遷移金属塩を2価鉄塩に代え
てもよい。

金属酸化物が沈澱した後、上清がpH中性になるまで25
0×gにおいて遠心して数回洗浄する。金属酸化物は脱
イオン水中に再懸濁し、そして金属酸化物結晶の塊を破
砕するため高速度で機械的にかきまぜる。小さい寸法の
金属酸化物結晶を含んでいる上清を集め、そしてペレッ
トを脱イオン水中に再懸濁する。このプロセスは少なく
とも3回、または金属酸化物の大部分が250×gでペレ
ット化しなくなるまで繰返す。大きな結晶を除去するた
めの100×gにおける低速遠心はサイズを0.8ミクロン以
下に減らすであろう。

1.0ミクロン以下の平均サイズを有する金属酸化物は
モノマーと混合し、開始剤の存在下1ないし100ミクロ
ンのサイズのポリマーコア粒子、好ましくはポリスチレ
ン粒子上に被覆される。少量の乳化剤の添加は粒子の凝
集防止を助けるであろう。磁性粒子は次に金属酸化物の
落下を防止するためポリマー、好ましくはポリスチレン
の保護層で被覆される。もし官能化した磁性粒子を望む
ならば、磁性粒子は生物学的材料の共有結合のためのカ
ルボキシル、アミノまたはヒドロキシのような官能基を
与える官能化したポリマーの他の層でさらに被覆するこ
とができる。

本発明によって製造される磁性粒子は第1図に図示す
ることができ、該図においてAはコア粒子を表し、Bは
金属酸化物/ポリマーコーティングを表し、Cは保護ポ
リマーコーティングを表し、そしてDは官能化ポリマー
コーティングを表す。第2図は本発明によって製造され
た磁性粒子の0.08ないし0.1ミクロンスライスの透過型
電子顕微鏡写真を示す。第3図は本発明によって製造さ
れた6.8ミクロン磁性粒子の走査型電子顕微鏡写真を示
す。第3a図は1000倍であり、第3b図は5000倍である。

本発明において有用なポリマーコア粒子は、小粒子の
分散液として得ることができ、そしてモノマーを吸収し
それによって金属酸化物およびモノマー混合物をコア粒
子の表面に被覆することができる任意のポリマーのもの
でよい。コア粒子は任意の寸法および形状、好ましくは
寸法が1ないし100ミクロンで形状が球形のものがよ
い。単分散コア粒子を使用するときは、生成する磁性粒
子も寸法が単分散であろう。コア粒子は、ジビニルベン
ゼン等のような架橋剤の存在または不存在下、乳化重
合、懸濁重合または他の重合手段によって得ることがで
きる。コア粒子を製造するために使用できるモノマーの
中にはスチレン、メタクリル酸メチル、ビニルトルエン
等がある。モノマーの混合物も使用できる。磁性金属酸
化物被覆または保護被覆のために使用するモノマーはコ
ア粒子と同じタイプでも同じタイプでなくてもよい。コ
ア粒子に対する金属酸化物被覆に使用するモノマーの重
量比は、所望する金属酸化物/ポリマー層の厚みに応
じ、0.1ないし12,好ましくは0.2ないし6でよい。第一
鉄塩および第二鉄塩の混合物から製造した金属酸化物を
被覆に使用する時は、コア粒子に対するモノマー重量比
約0.1ないし0.5を使用するのが好ましい。しかしながら
マンガン(II)および第二鉄塩の混合物から製造した金
属酸化物を被覆に使用するときは、コア粒子に対するモ
ノマーの重量比は0.1ないし12でよい。通常の有機溶媒
に不活性な架橋した磁性粒子が望ましい結果、架橋剤2
ないし10重量%、好ましくは8ないし10重量%を含み、
コア粒子に対するモノマー重量比3ないし12,好ましく
は4ないし6のモノマーをもってマンガン(II)および
第二鉄塩の混合物からつくった金属酸化物を使用するの
が好ましい。金属酸化物/ポリマー被覆の間低い(すな
わち0.1ないし0.5)モノマー対コア粒子重量比を使用す
る時は、磁性粒子の表面へ金属酸化物をさらに付着する
ため生成する磁性粒子をポリマー被覆の保護層でさらに
被覆することが好ましい。しかしながら高いモノマー対
コア粒子比(すなわち3ないし12)を使用する時は、保
護ポリマーコーティングは不必要である。重合温度は50
℃ないし90℃,好ましくは55℃ないし65℃でよい。重合
開始剤は過硫酸カリウム等のような水溶性でも、過酸化
ベンゾイル等のような水不溶性のどちらでもよい。放射
線,イオン化等のような他の重合開始手段も使用し得
る。予想外にも、この磁性粒子はマンガン(II)および
第二鉄塩混合物からつくった金属酸化物を被覆に使用す
る時は乳化剤を少しも使用することなく製造できること
がわかった。しかしながら第一および第二鉄塩混合物か
らつくった金属酸化物を被覆のために使用する時は、ド
デシル硫酸ナトリウム、Aerosol 22,Tween 20またはNon
iclet P−40(NP 40)のような乳化剤の少量は金属酸化
物/ポリマーコーティングの間粒子の広汎な凝集を防止
するのに有用であることが判明した。同じ能力を有する
他の乳化剤も使用し得る。磁性金属酸化物含量は、金属
酸化物/ポリマーコーティングの間の金属酸化物の異な
る量を使用することにより、5%から50%,好ましくは
10%から25%まで変えることができる。金属酸化物含量
を増すため多層金属酸化物/ポリマー被覆を採用するこ
ともできる。重合に通常使用される他の成分も所望の特
性を持った磁性粒子を得ることができる限り添加しても
よい。金属酸化物/ポリマーコーティングのための成分
は、金属酸化物/ポリマーコーティングプロセスの始め
に全部一時に加えることも、または段階的に加えること
もできる。第一および第二鉄塩混合物からつくった金属
酸化物を使用するときは、成分は段階的に加えるのが好
ましい。成分は真空もしくはアルゴンのような不活性ガ
スのもとに機械的にかきまぜ、転倒または他のかきまぜ
手段によって混合することができる。官能基は、金属酸
化物/ポリマーコーティングの間モノマーと官能化モノ
マーの混合物を使用するか、または終わりに磁性粒子を
官能化モノマーの薄い層でオーバーコートすることによ
り、磁性粒子の表面へ取込むことができる。使用する官
能化モノマーは、メタクリル酸2−ヒドロキシエチル、
メタクリル酸2−アミノエチル、トリメチルアンモニウ
ムメチルメタクリレートメトサルフェート、ジメチルア
ミノエチルメタクリレート、メタクリル酸、ウンデシレ
ン酸、メチルプロペンスルホン酸、ウンデシレニルアル
コール、オレイルアミン、グリシジルメタクリレート、
アクロレイン、グルタルアルデヒド等の1種または混合
物から選ぶことができる。磁性粒子は金属酸化物/ポリ
マーコーティングまたは保護コーティングに使用したも
のと異なるポリマーの層でオーバーコーティングし、該
ポリマーの表面特性を取入れることができる。

磁性粒子の用途 螢光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素イ
ムノアッセイ、細胞分離、酵素固定化およびアフィニテ
ィ精製のような種々の応用のための固相としての磁性粒
子の種々の用途は、以下の論文によって例示される文献
に解説されている。Hirschbein et al,Chenical Techno
logy,March 1982,172−179(1982);Halling and Dunni
ll,Enzyme Microbe Technology,2:2−10(1980);Mosba
ch and Anderson,Nature,270:259−261(1977);Guedso
n et al,J.Allergy Clinical Immunology,61(1),23
−27(1978).いくつかの応用についても、酵素固定化
について米国特許第4,152,210号および第4,343,901号、
細胞分離について米国特許第3,970,518号、第4,230,685
号、第4,267,234号、イムノアッセイについて米国特許
第4,554,088号、第4,628,037号および第3,933,997号に
開示されている。

ある磁性粒子は一つの用途に有用であっても、他の用
途においてはそうでないことがある。例えば、高分子シ
ランの被覆によって一般に取囲まれた超常磁性金属酸化
物コアを含む、米国特許第4,554,088号および第4,628,0
37号に開示されている磁性粒子は、大きい表面積と遅い
沈降速度のためイムノアッセイおよびアフィニティ精製
において有用かも知れないが、しかし骨髄追放のような
細胞分離用途においては適当でない。これら二つの特許
に開示されている磁性粒子の小寸法のため、細胞懸濁液
から磁性粒子のすべての効果的に除去することは非常に
困難である。さらに、正常細胞への小さい磁性粒子の非
特異的結合が高くなるであろう。骨髄追放のための磁性
粒子の使用においては、磁性粒子はヒツジ抗マウスIgG
のような抗体で被覆され、そして骨髄はがん細胞表面抗
原に対するいくつかのモノクローナル抗体の混合物で処
理される。磁性粒子はがん細胞のみに結合し、それらを
強い磁場を通過させることにより正常細胞から分離させ
るであろう。浄化された細胞は次に患者へ戻される。

本発明方法を使用することにより、磁性粒子は多種の
生医学的応用のために寸法、表面積、金属酸化物含量お
よび表面特性について最適化されることができる。本発
明によって製造された磁性粒子は酵素イムアッセイ、螢
光イムアッセイ、ラジオイムアッセイ、DNA/RNAハイブ
リダイゼーションアッセイ、および他の診断用途に対す
る固相として使用することができる。イムアッセイは、
当業者には自明なサンドイッチアッセイおよび競合的結
合アッセイのような種々の形態を使用して実行すること
ができる。DNA/RNAハイブリダイゼーションも固相ハイ
ブリダイゼーションまたは液相ハイブリダイゼーション
のような種々の形態を使用して実行することができる。
固相ハイブリダイゼーション形態においては、DNAもし
くはRNAプローブ(