JP2589618B2 - 磁気応答性螢光ポリマー粒子及びその利用 - Google Patents

磁気応答性螢光ポリマー粒子及びその利用

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、磁気応答性螢光ポリマー粒子に関する。
発明の背景 本発明は、1987年10月26日に提出された米国出願番号
第113294号の一部継続である。
イムノアッセイ，アフィニティー精製等のような多く
の生物学的技術においては、遊離の画分から結合した画
分を分離する必要がある。磁性粒子が所望の分離を促進
するために使用されてきた。
磁性粒子は、種々の工程を用いて種々の粒子状の磁性
体から作られており、様々な特徴を有する。例えば、イ
ケダ等の米国特許第582622号にはゼラチン，水溶性多糖
類、リン酸ナトリウム及び強磁性体物質よりなる磁性粒
子が開示されており、米国特許第4628037号及び第45540
88号にはポリマー性シランの被膜に囲まれた磁性金属酸
化物コアよりなる磁性粒子が開示されており、米国特許
第4452773号には水溶性多糖類又は官能基を有するその
誘導体で被覆された強磁性酸化鉄（Fe3O4）のコアを有
する離散コロイドサイズの粒子が開示されており、そし
てMansfieldの米国特許第4297337号には粒子状担体とし
ての磁性ガラス又は結晶含有材料が開示されている。
発明の概要 本発明は、磁気応答性螢光ポリマー粒子（以下、磁性
螢光粒子という）を、形状および組成に関りなく直径で
約１乃至100μｍの平均サイズを有する螢光ポリマー性
粒子から製造する新規の方法を提供する。本発明の螢光
磁性粒子は、平均サイズ約１μｍ以下の磁気応答性金属
酸化物（以下、金属酸化物という）を先ず製造し、次い
で螢光ポリマー性コア粒子を金属酸化物を含有するポリ
マー層で被覆することによって調製することができる。
これらの螢光磁性粒子の表面は、所望の表面特性を与え
るために、ポリマー又は官能基を有するポリマーよりな
る別の層で更に被覆することができる。
これらの螢光磁性粒子のスペクトル特性は、単一の螢
光染料又は数種の螢光染料の組合せになる、種々の螢光
染料を組み込んだコア粒子を使用することにより変化さ
せることができる。別に、本発明の螢光磁性粒子は、モ
ノマーに可溶で且つ非螢光ポリマー性コア粒子，金属酸
化物及びモノマーの存在下にて重合条件に耐えることが
できる単一の螢光染料又は数種の染料の組合せになる、
種々の螢光染料を組み込むことによって調製することが
できる。
本発明により製造される螢光磁性粒子はサイズにおい
て単分散性であり、粗い表面を有し、そして５％乃至50
％，好ましくは10％乃至25％の磁性金属酸化物含量を有
する。これらの螢光磁性粒子の螢光強度は、金属酸化物
による陰影を変化させるために磁性金属酸化物含量を変
えることにより、及び／又は螢光ポリマーコア粒子に組
み込む螢光染料の量を変えることにより、調整すること
ができる。
これらの特徴を有する粒子は、イムノアッセイ及び広
範な種類の生物医学的用途に有用であることが見い出さ
れている。これらの螢光磁性粒子は、抗原，抗体，酵素
又はDNA/RNAのような生物学的材料の受動的又は共有結
合による結合に使用することができ、また種々のタイプ
のイムノアッセイ,DNA/RNAハイブリダゼーションアッセ
イ，アフィニティー精製，細胞分離，食作用及び他の生
物医学的用途のための固相として使用することができ
る。生物学的材料を結合した又は結合していないこれら
の螢光磁性粒子は、ウエル中に正しい数の粒子が放出さ
れていることを確認するための、及びアッセイ中におけ
る粒子の損失をチェックするためのマーカーとして働か
されるために、種々のアッセイ用の非磁性粒子に対して
種々の比率で組み込むことができる。
目的及び利点 本発明の目的は次の通りである。
直ちに入手し得るポリマー粒子より磁気応答性螢光ポ
リマー粒子を容易に製造する方法を開発すること。
中等度の沈降と速い磁気分離を有する磁気応答性螢光
ポリマー粒子の製造方法を開発すること。
生物学的材料を受動的吸着又は共有結合により結合さ
せるための種々の表面電荷と官能基を有する磁気応答性
螢光ポリマー粒子の製造方法を開発すること。
これらの磁気応答性螢光ポリマー粒子を用いた医学
的，生物学的，診断的及び産業的用途を開発すること。
本発明の利点は次のものを含む。
約１乃至100μｍのサイズの広範な種類の螢光ポリマー
コア粒子を容易に磁気応答性粒子に変えることができ
る。
用途に応じて金属酸化物の含量を変化させることがで
きる。
共有結合のために表面を誘導体化して種々の官能基を
導入することができる。
得られるポリマーに種々の表面特性を与えるために、
種々のモノマーを最終的な被覆に用いることができる。
架橋された又は架橋されていない磁気応答性螢光ポリ
マー粒子のいずれをも製造することができる。
単分散性の磁気応答性螢光ポリマー粒子を製造するこ
とができる。
発明の詳細な記述 本発明の螢光磁性粒子は、先ず約１μｍ以下の平均サ
イズの金属酸化物を製造することにより調製することが
できる。金属酸化物は、２価又は３価の金属塩の混合
物，好ましくは第１鉄及び第２鉄の硫酸塩又は塩化物と
水酸化ナトリウム溶液との混合物を加熱し沈澱させるこ
とにより製造する。金属酸化物の所望のサイズ及び磁気
特性を得るためには、２価の金属塩の３価の金属塩に対
するモル比は0.5乃至2.0,好ましくは0.5乃至1.0の範囲
で変化させることができる。２価の金属塩の３価の金属
塩に対するモル比が金属酸化物のサイズに影響すること
が観察されている。すなわち、２価の金属塩の３価の金
属塩に対するモル比が小さい程、金属酸化物のサイズは
小さくなる。２価の金属塩の３価の金属塩に対するモル
比はまた得られる磁性粒子の色にも影響する。すなわ
ち、モル比が小さい程得られる磁性粒子の褐色がかった
色は明るくなる。好ましくは、金属酸化物は超常磁性又
は常磁性であるが、強磁性金属酸化物もまた使用するこ
とができる。ただしこの場合は洗浄の際磁気分離の代わ
りに遠心が用いられる。
他の２価の遷移金属塩，例えばマンガン，マグネシウ
ム，コバルト，ニッケル，亜鉛及び銅の塩で第１鉄塩を
置き換えてもよい。
金属酸化物が沈澱した後、上澄のpHが中性となるま
で、250×ｇの遠心で数回それを洗浄する。金属酸化物
を脱イオン水に再懸濁し、高速で機械的に撹拌して金属
酸化物結晶の凝集物を破砕する。更に250×ｇで遠沈し
ても金属酸化物の全部がペレット状になってしまうこと
はない。小さいサイズの金属酸化物結晶を含有する上澄
を集め、ペレットは脱イオン水に再懸濁する。この操作
を少なくとも３回又は大部分の金属酸化物が250×ｇで
はもはやペレット状にならなくなる迄繰り返す。この方
法で得られる金属酸化物のサイズは通常2.0μｍ未満で
ある。大きい結晶を除くための100×ｇの低速遠心によ
り、サイズが0.8μｍ未満となる。
平均サイズ1.0μｍ以下の金属酸化物をモノマーと混
合し、開始剤の存在下に１乃至100μｍのサイズの螢光
ポリマーコア粒子，好ましくはポリスチレン粒子上に被
覆する。少量の乳化剤の添加は粒子が膠着するのを防止
する助けとなろう。次いで螢光磁性粒子を、金属酸化物
の脱落を防止するために、ポリマー，好ましくはポリス
チレンの保護層で被覆する。官能基を有する螢光磁性粒
子を望む場合には、生物学的材料を共有結合により結合
させるためのカルボキシル基，アミノ基又はヒドロキシ
ル基のような官能基を付与するため、官能基を有するポ
リマーよりなる別の層で磁性粒子を更に被覆することが
できる。
本発明に従って調製される螢光磁性粒子は図１に示す
ことができる。ここにおいて１は螢光コア粒子を表し、
２は金属酸化物／ポリマー被覆を表し、３は保護ポリマ
ー被覆を表しそして４は官能基を有するポリマー被覆を
表す。図２は、本発明に従って調製される磁性粒子の0.
08乃至0.1μｍの切片の透過型電子顕微鏡写真を示す。
図３は、本発明に従って調製される6.8μｍの磁性粒子
の走査型電子顕微鏡写真を示す。図3aは、1000倍，図3b
は5000倍の拡大である。
本発明において有用な螢光ポリマー性コア粒子は、小
さい粒子の分散系として得ることのできるものであって
モノマーを吸収しそれによって該コア粒子表面上への金
属酸化物とモノマーとの混合物の被覆を生ずることので
きるものであれば、いかなるポリマーよりなるものでも
よい。コア粒子はいかなるサイズ及び形状でもよいが、
好ましくは１乃至100μｍのサイズであり球形の形状に
なるものである。単分散性コア粒子を使用するときは、
得られる磁性粒子もまたサイズにおいて単分散性となろ
う。コア粒子は、ジビニルベンゼン等の架橋剤を用い又
は用いない乳化重合，懸濁重合又は他の重合手段によっ
て得ることができる。コア粒子を調製するのに使用する
ことができるモノマーには例えば、スチレン，メタクリ
ル酸メチル，ビニルトルエン等がある。モノマーの混合
物もまた使用することができる。螢光コア粒子は、当業
者に知られている種々の技術を用いて螢光染料をコア粒
子に組み込むことによって得ることができる。磁性金属
酸化物による被覆又は保護被覆に使用されるモノマー
は、螢光コア粒子と同じタイプのものであってもなくて
もよい。金属酸化物による被覆に使用するモノマーの螢
光コア粒子に対する重量比は、所望の金属酸化物／ポリ
マー層の厚さに応じて0.1乃至12,好ましくは0.2乃至６
とすることができる。第１鉄塩及び第２鉄塩の混合物か
ら調製される金属酸化物を被覆に使用する場合には、螢
光コア粒子に対しモノマーを重量比約0.1乃至0.5にて使
用するのが好ましい。しかしながら、マンガン（２価）
塩及び第２鉄塩の混合物から調製される金属酸化物を被
覆に使用する場合には、コア粒子に対するモノマー重量
比は0.1乃至12とすることができる。結果として、通常
の有機溶媒には不活性な架橋された螢光磁性粒子を求め
る場合には、マンガン（２価）塩及び第２鉄塩の混合物
から調製される金属酸化物を、２％乃至10％，好ましく
は８％乃至10％の重量比で架橋剤を含有し、コア粒子に
対するモノマー重量比が３乃至12,好ましくは４乃至６
であり、螢光染料に対するモノマー重量比が0.1乃至10
であるモノマーとともに使用するのが好ましい。金属酸
化物／ポリマー被覆の際にコア粒子に対し一層低いモノ
マー重量比（すなわち0.1乃至0.5）を使用する場合に
は、螢光磁性粒子表面上に金属酸化物を一層固く付着さ
せるためにポリマー被覆による保護層で、得られる螢光
磁性粒子を保護被覆するのが好ましい。しかしながら、
コア粒子に対し高いモノマー比（すなわち３乃至12）を
使用する場合には、保護ポリマーによる被覆は不要であ
る。重合温度は55℃乃至90℃，好ましくは55℃乃至65℃
でもよい。重合開始剤は、過硫酸カリウム等のような水
溶性のものでも、過酸化ベンゾイル等のような水に不溶
性のものでもよい。照射，イオン化等の他の重合開始手
段もまた使用することができる。意外なことに、被覆に
マンガン（２価）塩及び第２鉄塩の混合物より調製され
る金属酸化物を使用した場合には、何ら乳化剤を使用す
ることなく螢光磁性粒子を製造できることが見出され
た。しかしながら、被覆に第１鉄塩と第２鉄塩との混合
物より調製された金属酸化物を使用した場合には、ドデ
シル硫酸ナトリウム,Aerosol 22,Tween 20又はNonidet
P−40（NP 40）のような乳化剤の少量が金属酸化物／ポ
リマー被覆の間の粒子の過剰な凝集を防止するのに有用
であることが見出された。同じ能力を有する他の乳化剤
もまた使用することができる。金属酸化物／ポリマー被
覆の間種々の量の金属酸化物を使用することにより、磁
性金属酸化物の含量を５％乃至50％，好ましくは10％乃
至25％の範囲で変化させることができる。金属酸化物の
含量を高めるために、金属酸化物／ポリマー多重被覆を
行うこともできる。所望の特性を有する磁性粒子が得ら
れる限り、重合に通常使用される他の成分を加えてもよ
い。金属酸化物／ポリマー被覆のための成分は、金属酸
化物／ポリマー被覆工程の最初に全部一度加えてもよ
く、又は段階的に加えてもよい。第１鉄塩と第２鉄塩と
の混合物より製した金属酸化物を使用する場合には、成
分を段階的に加えるのが好ましい。成分は真空下又はア
ルゴン等の不活性ガス下において、機械的撹拌、ゆする
ことその他の撹拌手段により混合することができる。官
能基は、金属酸化物／ポリマー被覆の間モノマーと官能
基を有するモノマーとの混合物を用いることによって又
は官能基を有するモノマーの薄層で磁性粒子を最後に再
被覆することによって螢光磁性粒子の表面上に組み込む
ことができる。使用する官能基を有するモノマーは、次
のものの一又は混合物から選ぶことができる：メタクリ
ル酸２−ヒドロキシエチル，メタクリル酸２−アミノエ
チル，メタクリル酸トリメチルアンモニウムメチルメト
サルフェート，メタクリル酸ジメチルアミノエチル，メ
タクリル酸，ウンデシレン酸，メチルプロペンスルホン
酸，ウンデシレンアルコール，オレイルアミン，メタク
リル酸グリシジル，アクロレイン，グルタルアルデヒド
等。磁性螢光粒子はまた、金属酸化物／ポリマー被覆又
は保護被覆に使用したのとは異なるポリマーの層で再被
覆してそのポリマーの表面特性を帯びさせることもでき
る。
螢光磁性粒子の利用 螢光イムノアッセイ，ラジオイムノアッセイ，エンザ
イムイムノアッセイ，細胞分離，酵素固定化及びアフィ
ニティー精製等の種々の用途のための固相としての種々
の螢光磁性粒子の使用は、次の論文に例示するように、
文献にて検討されている:Hirschbein et al,Chemical T
echnology,March 1982,172−179（1982）;Pourfarzane
h,The Ligand Quarterly,5（１）:41−47（1982）;Hall
ing and Dunnill,Enzyme Microbe Technology,2:2−10
（1980）;Mosbach and Anderson,Nature,270:259−261
（1977）;Guesdon et al,J,Allergy Clinical immunolo
gy,61（１）,23−27（1978）．いくつかの利用について
はまた、酵素固定化について米国特許第4152210号及び
第4343901号に、細胞分離について米国特許第3970518
号、第4230685号及び第42672343号に、イムノアッセイ
について米国特許第4554088号、第4628037号及び第3933
997号に夫々開示されている。
ある用途には有用であるが他の用途には有用でない磁
性粒子もある。例えば、米国特許第4554088号及び第463
8037号に開示されている磁性粒子は、通常ポリマー性シ
ランの被覆に囲まれた超常磁性金属酸化物コアよりなる
が、その大きな表面積と緩慢な沈澱速度のためイムノア
ッセイとアフィニティー精製には有用であるが、骨髄洗
浄のような細胞分離への利用には適さない。これら２つ
の特許に開示された磁性粒子はサイズが小さいため、細
胞懸濁液から全ての磁性粒子を効果的に除去することは
非常に困難である。更に、小さい磁性粒子ほど正常な細
胞への非特異的結合がずっと高くなる。骨髄細胞の精製
のための磁性粒子の使用においては、磁性粒子はヒツジ
抗マウスIgGのような抗体で被覆され、骨髄は癌細胞の
表面抗原に対する数種のモノクローナル抗体の混合物で
処理される。磁性粒子は癌細胞にのみ結合し、強力な磁
場を通過させることにより癌細胞を正常細胞から分離す
ることができる。洗浄された細胞は次いで患者に戻され
る。
本発明の方法を用いることにより、広範な種類の生物
医学的な利用のために、磁性粒子のサイズ，表面積，金
属酸化物含量及び表面特性を最適にすることができる。
本発明により製造される磁性粒子は、エンザイムイムノ
アッセイ，螢光イムノアッセイ，ラジオイムノアッセ
イ,DNA/RNAハイブリダイゼーションアッセイその他の診
断用途のための固相として使用することができる。イム
ノアッセイは、サンドイッチアッセイや競合的結合アッ
セイ等の当業者に明らかな種々の形態で行うことができ
る。DNA/RNAハイブリダイゼーションもまた、固相ハイ
ブリダイゼーション又は液相ハイブリダイゼーション等
の種々の形態で行うことができる。固相ハイブリダイゼ
ーションの形態では、DNA又はRNAプローブ（キャッチャ
ープローブ）は磁性粒子に最初に固定化される。固定化
されたキャッチャープローブは、サンプル（サンプルDN
A）からの相補的DNA鎖とハイブリッド化するのに使用さ
れる。最後に、螢光性，放射性又は酵素トレーサーで標
識されDNAサンプルの別の部分とハイブリッド化するこ
とのできる別のプローブ（シグナルプローブ）がシグナ
ル発生に使用される。液相ハイブリダイゼーション形態
においては、キャッチャープローブとシグナルプローブ
は最初に液相でサンプルDNAとハイブリッド化され、次
いで磁性粒子に固定化される。
代わりに、アッセイの感度を高めるために、シグナル
プローブを１個又は数個のビオチン基で標識することも
でき、その場合ビオチン基を螢光性，放射性又は酵素ト
レーサーで標識したアビジンと結合させることにより、
シグナルが検出される。
イムノアッセイ及びDNA/RNAハイブリダイゼーション
アッセイは、生物学的サンプル中の薬物，ホルモン，抗
体，ペプチド,DNA,RNA,核酸、ウイルス抗原及び炭水化
物等の広範な種類の物質を測定するのに使用することが
できる。
本発明によって製造される磁性粒子もまた、アフィニ
ティー精製，細胞分離，酵素固定その他の生物医学的用
途に使用することができる。細胞分離においては、磁性
粒子は、免疫反応又は非免疫反応による望まない細胞の
除去（ネガティブ選別）のため又は望む細胞の濃縮（ポ
ジティブ選別）のために使用される。この原理は、骨髄
から癌細胞を除去（骨髄洗浄）し、組織培養のためにポ
ジティブ又はネガティブ選別によって細胞集団を精製し
及び種々の細胞イムノアッセイを行うのに使用すること
ができる。アフィニティー精製においては、磁性粒子
は、抗体，抗原，酵素，阻害剤，コファクター,1本鎖DN
A,結合タンパク，ハプテン及び炭水化物等の広範な種類
の生物学的材料の精製に、ポリアクリルアミドゲル，セ
ファロースゲル又は他のセルロースビーズのような慣用
の固相に代えて使用される。アフィニティー精製に類似
の他の用途においては、磁性粒子は、抗血清又は臨床サ
ンプルから望ましくないタンパク質成分を交差吸着して
除去するのに使用することができる。酵素固定化におい
ては、酵素活性を保持し固定化酵素の再使用を可能にす
るよう、種々の結合手段によって磁性粒子上に酵素が固
定化される。固定化酵素を担持した磁性粒子は、炭水化
物，アミノ酸及びタンパク質等の広範な種類の材料を製
造するための固定化酵素システムに通常使用されるガラ
スビーズ，制御された多孔性ガラス，シリカゲル及びセ
ルロースビーズ等の他の固相に代えて使用することがで
きる。
生物学的材料を担持した又は担持しないこれらの螢光
磁性粒子は、正しい数の粒子がウエル中に放出されてい
ることを確認するため及びアッセイ中の粒子の損失をチ
ェックするためのマーカーとして役立てるために、実施
例42及び43に述べた種々のアッセイのための非磁性粒子
に対し種々の比率で組み込むことができる。
これらの利用はいずれも、磁性粒子の大部分に共通な
分離容易性，速い反応速度及び大きな表面積によって効
率化される。以下の実施例は本発明の多能性と利点とを
更に説明するために提供するものであり、その詳細を制
限的に解釈してはならない。本発明の精神と範囲から逸
脱することなく種々の均等物，変更物及び修飾物の実施
をなし得ることは明らかであり、そのような均等の具体
例は本発明に含められることが意図されているからであ
る。
金属酸化物の調製の一般的方法 実施例１ 機械的攪拌機、冷却器、温度計、滴下ロート及び加熱
マントルを備えた三つ口丸底フラスコに、400mlの脱イ
オン水中に0.361molの硫酸第１鉄及び0.369molの硫酸第
２鉄（Fe++／Fe+++比＝１）の混合物を加えた。混合物
を攪拌しつつ85乃至90℃に加熱し、850mlの6N水酸化ナ
トリウムを90分かけて滴下して加えた。混合物を85乃至
90℃にて更に１時間攪拌し、室温まで冷却した。金属酸
化物の沈澱を250×ｇにて10分間遠心した。透明な上澄
を傾斜して捨てペレットを90mlの脱イオン水中に機械的
攪拌機を用いて再懸濁させた。この洗浄工程を６回又は
上澄のpHが殆ど中性となるまで繰り返した。上澄を傾斜
して捨て、200mlの脱イン水に再懸濁させた。250×ｇで
更に遠心しても金属酸化物の沈澱の全てがペレットにな
ることはない。小さいサイズの金属酸化物結晶を含む上
澄を集め、ペレットは200mlの脱イオン水に再懸濁させ
た。この工程は少なくとも３回又は金属酸化物の殆どが
250×ｇではもはやペレットを生じなくなるまで繰り返
した。この方法で得られる金属酸化物は通常2.0μｍ未
満のサイズを有する。金属酸化物の懸濁液を合わせ100
×ｇで10分間遠心した。上澄を回収し、0.8μｍ未満の
サイズの磁性金属酸化物の8.6％w/v懸濁液800mlを得
た。
実施例２ 400mlの脱イオン水中0.235molの硫酸第１鉄,0.297mol
の硫酸第２鉄（（Fe++／Fe+++比＝0.79）及び480mlの6N
水酸化ナトリウムを使用して磁性金属酸化物の2.8％w/v
懸濁液2000mlを得た以外は、実施例１の記載と同一の手
順に従った。
実施例３ 400mlの脱イオン水中0.178molの硫酸第１鉄,0.298mol
の硫酸第２鉄（（Fe++／Fe+++比＝0.59）及び520mlの6N
水酸化ナトリウムを使用して磁性金属酸化物の2.98％w/
v懸濁液1500mlを得た以外は、実施例１の記載と同一の
手順に従った。
実施例４ 400mlの脱イオン水中0.15molの硫酸第１鉄,0.276mol
の硫酸第２鉄（（Fe++／Fe+++比＝0.54）及び520mlの6N
水酸化ナトリウムを使用して磁性金属酸化物の6.88％w/
v懸濁液700mlを得た以外は、実施例１の記載と同一手順
に従った。
実施例５ 255mlの脱イオン水中0.116molの硫酸マンガン,0.146m
olの硫酸第２鉄（（Mn++／Fe+++比＝0.79）及び240mlの
6N水酸化ナトリウムを使用して磁性金属酸化物の1.8％w
/v懸濁液1700mlを得た以外は、実施例１の記載と同一の
手順に従った。
磁性粒子の調製 実施例６ 600mlの脱イオン水,6mlのスチレン及び、実施例１の
記載に従って調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物80mlの
混合物を密封された瓶に加えた。瓶を吸引して約60rpm
で55℃のオーブン中１時間回転した。混合物に12gの過
硫酸カリウム及び５％w/vの4.0μｍポリスチレン粒子85
0mlを加えた。瓶を再び密封し、吸引して１時間回転
し、そして２％のドデシル硫酸ナトリウム50mlを加え
た。更に５時間経過後、混合物に6mlのスチレン及び10g
の過硫酸カリウムを加えた。混合物を更に15時間回転
し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し
て上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。得
られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて1.6lとし、
約11％の磁性金属酸化物含量を有し4.3μｍの平均サイ
ズを有する2.5％w/v懸濁液を得た。
実施例７ 実施例６の記載に従って調製した2.5％w/vの磁性粒子
1.6lを、1gのドデシル硫酸ナトリウム,10gの過硫酸カリ
ウム及び、4mlのメタノール中に0.98mlのウンデシレン
酸と0.02mlのジビニルベンゼンとを含有する溶液を加え
ることによりカルボキシ化した。混合物を密封した瓶中
に加え、吸引して約60rpmで55℃のオーブン中５時間回
転した。得られたカルボキシル磁性粒子を磁気的に分離
し、上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。カ
ルボキシル磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて680ml
とし、約11％の磁性金属酸化物含量を有し4.3μｍの平
均サイズを有する5.8％w/v懸濁液を得た。
実施例８ 600mlの脱イオン水,6mlのスチレン及び、実施例１の
記載に従って調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物80mlを
密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約60rpmで55℃の
オーブン中１時間回転した。混合物に12gの過硫酸カリ
ウム及び4.78％w/vの6.1μｍポリスチレン粒子850mlを
加えた。瓶を再び密封し、吸引して５時間回転し、そし
て6mlのスチレン及び10gの過硫酸カリウムを加えた。混
合物を更に15時間回転し、２層にしたチーズクロスで濾
過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になるまで脱イ
オン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を1.5lの脱イ
オン水に再懸濁させ、1gのドデシル硫酸ナトリウム,10g
の過硫酸カリウム及び、4mlのメタノール中に0.98mlの
ウンデシレン酸と0.02mlのジビニルベンゼンとを含有す
る溶液を加えることによりカルボキシル化した。混合物
を密封した瓶中に加え、吸引して約60rpmで55℃のオー
ブン中５時間回転した。得られたカルボキシル磁性粒子
を磁気的に分離して上澄が透明になる迄脱イオン水で数
回洗浄した。カルボキシル磁性粒子を脱イオン水に再懸
濁させて800mlとし、約11.6％の磁性金属酸化物含量を
有し6.8μｍの平均サイズを有する4.3％懸濁液を得た。
実施例９ 600mlの脱イオン水,6mlのスチレン及び、実施例１の
記載に従って調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物60mlを
含む混合物を三つ口丸底フラスコに加え、アルゴン雰囲
気下67℃にて１時間攪拌した。混合物に12gの過硫酸カ
リウム及び５％w/vの2.7μｍポリスチレン粒子470mlを
加えた。混合物を67℃にて１時間攪拌し、２％のドデシ
ル硫酸ナトリウム30mlを加えた。アルゴン雰囲気下67℃
にて更に５時間攪拌した後、混合物に6mlのスチレン及
び6gの過硫酸カリウムを加えた。混合物をアルゴン雰囲
気下67℃にて更に15時間攪拌し、２層にしたチーズクロ
スで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になるま
で脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イ
オン水に再懸濁させて90mlとし、0.6gのドデシル硫酸ナ
トリウム,10gの過硫酸カリウム及び、2.4mlのメタノー
ル中に0.598mlのウンデシレン酸と0.012mlのジビニルベ
ンゼンとを含有する溶液を加えることによりカルボキシ
ル化した。混合物を密封した瓶中に加え、吸引して約60
rpmで55℃のオーブン中５時間回転した。得られたカル
ボキシル磁性粒子を磁気的に分離しそして上澄が透明に
なるまで脱イオン水で数回洗浄した。カルボキシル磁性
粒子を再懸濁させて500mlとし、約14％の磁性金属酸化
物含量を有し4.0μｍの平均サイズを有する6.5％w/vの
懸濁液を得た。
実施例10 600mlの脱イオン水,6mlのスチレン及び、実施例１の
記載に従って調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物60mlを
含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を吸引して約60rp
mで55℃のオーブン中１時間回転した。混合物に12gの過
硫酸カリウム及び５％w/vの2.7μｍポリスチレン粒子47
0mlを加えた。瓶を再び密封し、吸引して１時間回転し
そして２％のドデシル硫酸ナトリウム30mlを加えた。更
に５時間経過の後、6mlのスチレン及び10gの過硫酸カリ
ウムを混合物に加えた。混合物を更に15時間回転し、２
層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し、上澄
が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁
性粒子を脱イオン水に懸濁させて500mlとし、約14％の
磁性金属酸化物含量を有し4.0μｍの平均サイズを有す
る6.8％w/vの懸濁液を得た。
実施例11 180mlの脱イオン水,2mlのスチレン及び、実施例１の
記載に従って調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物20mlを
含む混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約60
rpmで55℃のオーブン中１時間回転した。混合物に4gの
過硫酸カリウム及び、実施例10の記載に従って調製した
6.8％w/vの磁性粒子（3.0μm,金属酸化物含量14％）160
mlを加えた。瓶を再び密封し、吸引して１時間回転しそ
して２％のドデシル硫酸ナトリウム10mlを加えた。更に
５時間の後、2mlのスチレン及び2gの過硫酸カリウムを
混合物に加えた。混合物を更に15時間回転し、２層にし
たチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が
透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性
粒子を脱イオン水に懸濁して160mlとし、約19％の金属
酸化物含量を有し4.2μｍの平均サイズを有する7.78％w
/vの懸濁液を得た。
実施例12 90mlの脱イオン水,1mlのスチレン及び、実施例１の記
載に従って調製した8.6％w/vの磁性金属酸化物10mlを含
有する混合物を、密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して
約60rpmで55℃のオーブン中１時間回転した。混合物に1
gの過硫酸カリウム及び、実施例11の記載に従って調製
した7.78％w/vの磁性粒子（3.2μm,金属酸化物含量19
％）80mlを加えた。瓶を再び密封し、吸引して４時間回
転し、２％のドデシル硫酸ナトリウム5mlを加えた。更
に５時間経過の後、1mlのスチレン及び1gの過硫酸カリ
ウムを混合物に加えた。混合物を更に15時間回転し、２
層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして
上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られ
た磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて160mlとし、約2
3％の金属酸化物含量を有し4.5μｍの平均サイズを有す
る4.5％の懸濁液を得た。
実施例13 400mlの脱イオン水,1.92mlのスチレン、0.08mlのジビ
ニルベンゼン,4gの過硫酸カリウム、20gの200〜400メッ
シュの４％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ及
び、実施例１に従って調製した8.6％w/vの磁性金属酸化
物10mlを含有する混合物を密封された瓶中に加えた。瓶
を吸引して約60rpmで55℃のオーブン中15時間回転し
た。混合物を沈澱させ上澄を傾斜して捨てた。得られた
磁性ビーズを200mlの脱イオン水に再懸濁させ再度沈澱
させた。上澄が透明になる迄数回この工程を繰り返し
た。得られた磁性ビースを200mlの脱イオン水に再懸濁
させ、0.1gのドデシル硫酸ナトリウム,2.0gの過硫酸カ
リウム,0.48mlのスチレン及び0.02mlのジビニルベンゼ
ンを加えた。瓶を再び密封し、吸引して約60rpmで55℃
のオーブン中１時間回転しそして、0.4mlのメタノール
中に0.098mlのウンデシレン酸と0.002mlのジビニルベン
ゼンとを含有する溶液を加えた。混合物を更に４時間回
転し、前述のように重量により沈降させることによって
洗浄した。水を濾過により除去しカルボキシル磁性ビー
ズを乾燥して200〜400メッシュのカルボキシル磁性ビー
ズ20gを得た。
実施例14 100mlの脱イオン水,0.5mlのスチレン、2gの過硫酸カ
リウム、５％w/vの4.0μｍポリスチレン粒子75ml及び、
実施例４の記載に従って調製した6.88％w/vの磁性金属
酸化物10mlを含有する混合物を密封した瓶中に加えた。
瓶を吸引して約60rpmで55℃のオーブン中15時間回転し
た。混合物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気
的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回
洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させ
て150mlとし、約14％の金属酸化物含量を有し4.3μｍの
平均サイズを有する2.5％w/v懸濁液を得た。
実施例15 実施例４の記載に従って調製した6.88％w/vの磁性金
属酸化物20mlを使用して約18％の金属酸化物含量を有し
4.3μｍの平均サイズを有する2.5％w/vの懸濁液160mlを
得た以外は、実施例14の記載と同じ手順に従った。
実施例16 2000mlの脱イオン水,13mlのスチレン及び、実施例３
の記載に従って調製した2.98％w/vの磁性金属酸化物550
mlを含有する混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引
して約60rpmで55℃のオーブン中１時間回転した。混合
物に20gの過硫酸カリウム及び10％w/vの3.0μｍポリス
チレン粒子950mlを加えた。瓶を再び密封し、吸引して6
0rpmで１時間回転しそして２％のドデシル硫酸ナトリウ
ム60mlを加えた。更に５時間経過の後、8mlのスチレン
及び10gの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を
更に15時間回転し、２層にしたチーズクロスで濾過し、
磁気的に分離しそして上澄が透明になるまで脱イオン水
で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸
濁して3000mlとし、約12％の磁性金属酸化物含量を有し
3.2μｍの平均サイズを有する3.38％w/vの懸濁液を得
た。
実施例17 実施例16の記載に従って調製した磁性粒子（3.2μm,
3.38％w/v,金属酸化物含量12％）150ml,2mlの１％ NP4
0,0.5mlのメタクリル酸メチル又はスチレン、1gの過硫
酸カリウム及び、官能基を有するモノマーであるメチル
硫酸メタクリル酸トリメチルアンモニウムエチル（40％
水溶液）を含有する混合物を密封した瓶中に加えた。瓶
を約60rpmで55℃のオーブン中４時間回転した。混合物
を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し
そして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。
得られた磁性粒子を脱イオン水中に再懸濁させて200ml
とし、表面上にトリメチルアンモニウム官能基を有する
磁性粒子の2.5％w/vの懸濁液を得た。
実施例18 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−アミ
ノエチル1mlを使用して表面上にアミノ基を有する磁性
粒子の2.5％w/vの懸濁液200mlを得た以外は、実施例17
に記載されたと同じ手順に従った。
実施例19 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−ヒド
ロキシエチル1mlを使用して表面上にヒドロキシル基を
有する磁性粒子の2.5％w/v懸濁液200mlを得た以外は、
実施例17に記載されたと同じ手順に従った。
実施例20 モノマーとして１−ビニル−２−ピロリジノン1mlを
使用して表面上にポリビニルピロリジノンを有する磁性
粒子の2.5％w/v懸濁液200mlを得た以外は、実施例17の
記載と同じ手順に従った。
実施例21 官能基を有するモノマーであるメチルプロペンスルホ
ン酸1gを使用して表面上にスルホン酸基を有する磁性粒
子の2.5％w/v懸濁液200mlを得た以外は、実施例17に記
載と同じ手順に従った。
実施例22 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸ジメチル
アミノエチル1mlを使用して表面上にジメチルアミノ基
を有する磁性粒子の2.5％w/v懸濁液200mlを得た以外
は、実施例17の記載と同じ手順に従った。
実施例23 7.0％w/vの2.11μｍポリスチレン粒子20ml,実施例５
の記載に従って調製した1.8％w/vの金属酸化物100ml,50
mlの脱イオン水及び、7.5mlのスチレン中に0.15gの過酸
化ベンゾイルを含む溶液を含有する混合物を密封した瓶
に加えた。瓶を吸引して60rpmで55℃のオーブン中15時
間回転した。混合物を、２層にしたチーズクロスで濾過
し、磁気的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン
水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再
懸濁させて200mlとし、約16.8％の金属酸化物含量を有
し3.6μｍの平均サイズを有する5.0％w/vの懸濁液を得
た。
実施例24 7.0％w/vの2.11μｍポリスチレン粒子20ml,実施例５
の記載に従って調製した1.8％w/vの金属酸化物100ml,50
mlの脱イオン水及び、6.75mlのスチレン中に0.15gの過
酸化ベンゾイルと0.75mlのジビニルベンゼンとを含む溶
液を含有する混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引
して約60rpmで55℃のオーブン中15時間回転した。混合
物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離
しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄し
た。得られた架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて
200mlとし、約16.8％の金属酸化物含量を有し3.6μｍの
平均サイズを有する5.0％w/vの懸濁液を得た。こうして
調製した架橋磁性粒子はサイズが均一であり通常の有機
溶媒例えば、アセトン，アセトニトリル及びジメチルホ
ルムアミド等に対して不活性であることが判明した。
実施例25 7.0％w/vの2.11μｍポリスチレン粒子20ml,実施例５
の記載に従って調製した1.8％w/vの金属酸化物150ml及
び、6.75mlのスチレン中に0.15gの過酸化ベンゾイルと
0.75mlのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合
物を密封された瓶中に加えた。瓶を吸引して約60rpmで5
5℃のオーブン中15時間回転した。混合物を、２層にし
たチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が
透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた架橋
磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて200mlとし、約23
％の金属酸化物含量を有し4.0μｍの平均サイズを有す
る5.4％w/vの懸濁液を得た。こうして調製した架橋磁性
粒子はサイズが均一で通常の有機溶媒例えば、アセト
ン，アセトニトリル及びジメチルホルムアミド等に対し
て不活性であることが判明した。
実施例26 9.16％w/vの3.2μｍポリスチレン粒子15ml,実施例５
の記載に従って調製した1.8％w/vの金属酸化物100ml,55
mlの脱イオン水及び、6.75mlのスチレン中に0.15gの過
酸化ベンゾイルと0.75mlのジビニルベンゼンとを含む溶
液を含有する混合物を密封した瓶に加えた。瓶を吸引し
て約60rpmで55℃のオーブン中15時間回転した。混合物
を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し
そして上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄し
た。得られた架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸濁して20
0mlとし、約16.8％の金属酸化物含量を有し5.5μｍの平
均サイズを有する4.7％w/vの懸濁液を得た。こうして調
製した架橋磁性粒子はサイズが均一であり通常の有機溶
媒例えば、アセトン，アセトニトリル及びジメチルホル
ムアミド等に対して不活性であることが判明した。
実施例27 4.5％w/vの4.1μｍポリスチレン粒子30ml,実施例５の
記載に従って調製した1.8％w/vの金属酸化物100ml,40ml
の脱イオン水及び、6.75mlのスチレン中に0.15gの過酸
化ベンゾイルと0.75mlのジビニルベンゼンとを含む溶液
を含有する混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引し
て約60rpmで55℃のオーブン中15時間回転した。混合物
を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し
そして上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄し
た。得られた架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸濁して20
0mlとし、約16.9％の金属酸化物含量を有し6.7μｍの平
均サイズを有する4.5％w/vの懸濁液を得た。こうして調
製された架橋磁性粒子はサイズが均一で通常の溶媒例え
ば、アセトン，アセトニトリル及びジメチルホルムアミ
ド等に対して不活性であることが判明した。
実施例28 7.0％w/vの2.11μｍポリスチレン粒子20ml,実施例５
の記載に従って調製した1.8％w/vの金属酸化物100ml,50
mlの脱イオン水及び、6mlのスチレン中に0.15gの過酸化
ベンゾイルと0.75mlのウンデシレニルアルコールと0.75
mlのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を
密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約60rpmで55℃の
オーブン中15時間回転した。混合物を、２層にしたチー
ズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明に
なるまで脱イオン水で数回洗浄した。得られた架橋ヒド
ロキシル磁性粒子を濾過し乾燥して約16.8％の金属酸化
物含量を有し3.9μｍの平均サイズを有する9gの粉末を
得た。こうして調製された架橋ヒドロキシル磁性粒子は
サイズが均一で通常の溶媒例えば、アセトン，アセトニ
トリル及びジメチルホルムアミド等に対して不活性であ
ることが判明した。
磁性粒子への生物学的材料の結合 実施例29 80mlの瓶中に、実施例17の記載に従って調製した4.3
μｍの5.0％w/vカルボキシル磁性粒子30mlを加えた。粒
子を磁気的に分離し50mlのリン酸緩衝液（0.1M,pH5.5）
に再懸濁させた。粒子懸濁液に20mgのウシ血清アルブミ
ン及び100mgの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（EDC）を加えた。混合物を
室温にて２時間回転しそして磁気的に分離した。粒子を
80mlのリン酸緩衝液で１回洗い、そしてリン酸緩衝食塩
水（0.1M,pH7.0）に再懸濁させて75mlとし、2.0％w/vの
懸濁液を得た。
ウシ血清アルブミンを受動的吸着により磁性粒子に結
合させるためにはEDCを使用しないこと以外は同じ手順
に従った。
実施例30 4mlのバイアル中に、実施例７の記載に従って調製し
た4.3μｍの5.0％w/vカルボキシル磁性粒子1mlを加え
た。粒子を磁気的に分離し2mlのリン酸緩衝液（0.1M,pH
5.5）で１回洗いそして2mlの同緩衝液で再懸濁させた。
粒子懸濁液に、1.4mg/mlのヤギ（Gt）抗マウス（Ms）Ig
G 140ml及び10mgの１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドを加えた。バイアルを室
温にて２時間回転した。粒子を磁気的に分離し、2mlの
リン酸緩衝液で１回洗いそして2mlのリン酸緩衝食塩水
（0.1M,pH7.0）で再懸濁させて2mlとし2.5％w/vのヤギ
抗マウスIgG被覆磁性粒子を得た。モノクローナルな又
はポリクローナルな他の種類の抗体もまた同じ手順によ
ってカルボキシル磁性粒子に結合させることができる。
ヤギ抗マウスIgGその他の種類の抗体を受動的吸着に
よって磁性粒子に結合させるためには、EDCを使用しな
いこと以外は同じ手順に従った。
実施例31 4mlのバイアル中に、実施例29の記載に従って調製し
たウシ血清アルブミン被覆磁性粒子（4.3μm,2％w/v）
2.5mlを加えた。粒子を磁気的に分離し、2mlのリン酸緩
衝液（0.1M,pH5.5）に再懸濁させて2mlとした。混合物
に10μｌのマウス抗Ｂ赤血球表面抗原（20mg/ml）及び1
mgの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミドを加えた。混合物を室温にて２時間回転
した。粒子を磁気的に分離し、リン酸緩衝液で１回洗い
そして2mlのリン酸緩衝食塩水（0.1M,pH7.0）に再懸濁
させ、2.5％w/vの懸濁液を得た。
実施例32 40μｌのマウス抗Ａ赤血球表面抗原（5mg/ml）を使用
して2.5％w/vの懸濁液2mlを得た以外は、実施例31の記
載と同じ手順に従った。
磁性粒子を用いた血液型判定 実施例33 Ａとラベルした5mm×65mmの試験管中に、実施例32の
記載に従って調製した2.5％w/vのマウス抗Ａ被覆磁性粒
子25μｌを加えた。Ｂとラベルした別の試験管中には、
実施例31の記載に従って調製した2.5％w/vのマウス抗Ｂ
被覆磁性粒子25μｌを加えた。双方の試験管に、パック
赤血球を等張緩衝食塩水で１対100に希釈して調製した
１％パック赤血球50μｌを加えた。指で数回軽くたたい
て試験管を振り磁石の上に置いた。結果は以下に要約し
た通りであった。
血液型 Ａ Ｂ Ｏ AB 試験管 Ａ ＋ − − ＋ 試験管 Ｂ − ＋ − ＋ ここに＋は陽性反応を示す。すなわち、赤血球は対応す
る抗体を被覆した磁性粒子によって凝集し、その結果磁
気分離後は試験管の上澄は透明であった。他方、陰性反
応の上澄は、赤血球と抗体被覆磁性粒子との間での凝集
がないため、磁気分離後も濁ったままである。
磁性粒子を用いたイムノアッセイ 実施例34 2mlの微量遠心管中に、６％w/vの３μｍカルボキシル
磁性粒子1mlを加えた。粒子を1000rpmで３分間遠心し
た。上澄を吸引し、粒子を酢酸緩衝液中で５乃至100μg
/mlの組み換えHBcAg 1mlとともに振り混ぜることによっ
て再懸濁させた。管を室温にて２時間回転させそして前
記のように遠心した。上澄を吸引し、粒子を、酢酸緩衝
液と２乃至10％の正常動物血清とを含む再被覆溶液1ml
に再懸濁させた。管を室温にて２乃至16時間回転させそ
して前記のように遠心した。上澄を吸引し、遠心と再懸
濁とにより1mlの等張緩衝食塩水（IBS）で３回洗浄し
た。最後に、粒子を1mlのIBSで再懸濁させ２乃至８℃に
て貯蔵した。
実施例35 96ウエルのミクロ滴定板の最初の２列に、実施例34の
記載に従って調製した0.25％w/vのＢ型肝炎コア抗原（H
BcAg）被覆磁性粒子20μｌを加えた。サンプルの調製
は、HBcAg陽性血清を陰性血漿で種々に希釈し、更に各
サンプルを標本希釈緩衝液（SDB）で1:100に希釈するこ
とにより行った。SDBは、リン酸緩衝液，タンパク質安
定化剤，界面活性剤，及び抗菌剤を含有するものであっ
た。粒子を含有するウエルに、各最終のサンプル希釈液
50μｌを加えた。37℃で30分間インキュベーションの
後、粒子を磁気分離機で２分間分離し、塩類と界面活性
剤とを含有する洗浄用緩衝液200μｌで３回洗浄した。
粒子を含む各ウエルに、塩類，タンパク質安定化剤，グ
リセロール，界面活性剤及び抗菌剤を含有する希釈液中
のヤギ抗ヒトIgG−Ｂ−Ｄガラクトシダーゼ結合体（0.5
μg/ml）50μｌを加えた。37℃で15分間のインキュベー
ションの後、粒子を分離し上記のようにして３回洗浄
し、30μｌのIBSに再懸濁させた。粒子を黒いミクロ滴
定板（Dynatech）の最初の２列に移した。粒子を含む各
ウエルに、４−メチルウンベリフェリル−Ｂ−ガラクト
ピラノシド（MUG,Sigma）を含有する溶液100μｌを加え
た。板を37℃にてインキュベートし、螢光強度を、励起
側365nm及び螢光側450nmのフィルターを備えた螢光濃度
分析機（FCA,Pandex）を用い５分間隔で10倍利得にセッ
トして測定した。５分間隔での螢光強度の増大を任意に
定めた螢光単位（AFU）にて記録して表Ｉに示した。
実施例36 マウス抗HBsAgのカルボキシル磁性粒子への結合は実
施例30と同様であった。
黒の96ウエルのミクロ滴定板（Dynatech）のウエル
に、0.25％w/vの3.2μｍマウス抗HBsAg被覆カルボキシ
ル磁性粒子20μｌを２列に加えた。磁性粒子に含むウエ
ルに、種々の量のHBsAgを含有する無処理血漿又はHBsAg
陰性血漿100μｌを加えた。37℃にて30分間インキュベ
ーションした後、磁気分離機により粒子を２分間分離
し、塩類と界面活性剤とを含有する洗浄用緩衝液100μ
ｌで１回洗った。粒子を含む各ウエルに、塩類，タンパ
ク質安定化剤，グリセロール，界面活性剤及び抗菌剤を
含有する希釈液中のマウス抗HBsAg−Ｂ−ガラタトシダ
ーゼ結合体20μｌを加えた。37℃にて15分間インキュベ
ーションの後、粒子を分離し上記のようにして５回洗浄
した。粒子を含む各ウエルに、４−メチルウンベリフェ
リル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（MUG,Sigma）を含
有する溶液50μｌを加えた。板を37℃でインキュベート
し、螢光強度を、励起側365nm及び螢光側450nmのフィル
ターを備えた螢光濃度分析機（FCA,Pandex）により５分
間隔で10倍利得に設定して測定した。５分間隔での螢光
強度の増大を任意に定めた螢光単位（AFU）にて記録
し、表IIに示した。
実施例37 HTLV−IIIB/H−９細胞（Gallo株）からのHTV−１抗原
を、実施例34の記載と同様の手順により3.6μｍのカル
ボキシル磁性粒子に結合させた。
96ウエルのミクロ滴定板のウエルに、0.25％w/vのHIV
被覆磁性粒子20μｌを２列に加えた。粒子に含むウエル
に、リン酸緩衝液、タンパク質安定化剤，界面活性剤及
び抗菌剤を含有する標本希釈緩衝液（SDB）に1:100に希
釈した陽性，境界及び陰性の各標本50μｌを加えた。37
℃にて30分間のインキュベーションの後、磁気分離機に
より２分間粒子を分離しそして塩類と界面活性剤とを含
有する洗浄用緩衝液100μｌで３回洗浄した。粒子を含
む各ウエルに、塩類，タンパク質安定化剤，グリセロー
ル，界面活性剤および抗菌剤を含有する希釈液中のヤギ
抗ヒト−Ｂ−ガラクトシダーゼ（約0.5μg/ml）結合体5
0μｌを加えた。37℃にて15分間インキュベーションし
た後、上記のようにして粒子を４回洗浄した。粒子を黒
のミクロ適当板（Dynatech）に移した。粒子を含む各ウ
エルに、４−メチルウンベリフェリル−Ｂ−Ｄ−ガラク
トピラノシド（MUG,Sigma）を含有する溶液100μｌを加
えた。板を37℃にてインキュベートし、螢光強度を、励
起側365nm及び螢光側450nmのフィルターを備えた螢光濃
度分析機（FCA,Pandex）を用いて５分間隔で25倍利得に
設定して測定した。５分間隔での螢光強度の増大を任意
に定めた螢光単位（AFU）にて記録し表IIIに示した。
磁性粒子を用いた細胞分離 実施例38 実施例７の記載に従って調製した4.3μｍのカルボキ
シル磁性粒子を、リン酸緩衝食塩水（PBS,pH7.7）で洗
浄し超音波処理し、70％エタノールで10分間滅菌し、PB
Sで３回洗浄し、0.5mg/mlのアフィニティ精製ヒツジ抗
マウスイムノグロブリン抗体（SAM）とともに3.3mg抗体
/100mg粒子の比率で４℃にて48時間インキュベートし
た。使用前に、抗体被覆磁性粒子をPBSで洗浄し、PBS中
に所望の濃度に再懸濁させた。
ヒト組織培養cALLa陽性NALM−16白血病細胞をPBSで洗
い懸濁させた。一部は抗体による処理をしなかった（−
MoAb）。他の部分を２つの抗CD10モノクローナル抗体及
び１つの抗CD9モノクローナル抗体で４℃にて30分間処
理し（＋MoAb）,PBSで洗い、PBSにて3.5×106個/mlに調
整した。一方には抗体処理細胞（＋MoAb）を含み他方に
は無処理細胞（−MoAb）を含む２本の試験管に、SAM被
覆磁性粒子を開始時の細胞に対する粒子の比率が45とな
るように加えた。管を４℃にて30分間回転した。粒子を
磁気分離機で分離した。上澄を回収し遠心して残存細胞
を回収した。ペレットを100μｌのトリパンブルーに再
懸濁させて全細胞数を数えた。結果を表IVに示した。
実施例39 576mlの脱イオン水,9mlのスチレン及び、実施例１の
記載に従って調製した3.0％w/vの磁性金属酸化物288ml
を含有する混合物を密封した瓶に加えた。瓶を吸引して
約60rpmで65±４℃のオーブン中１時間回転した。混合
物に、18gの過硫酸カリウム及び５％w/vの4.0μｍ螢光
ナイル赤ポリスチレン粒子712mlを加えた。瓶を再び密
封し、吸引して１時間回転し、そして2.0％のドデシル
硫酸ナトリウム45mlを加えた。更に５時間経過の後、9m
lのスチレン及び9gの過硫酸カリウムを混合物に加え
た。混合物を更に15時間回転し、２層にしたチーズクロ
スで濾過し、磁気的に分離し、そして上澄が透明になる
まで脱イオン水で数回洗浄した。得られた螢光磁性粒子
を脱イオン水に懸濁して1580mlとし、約11.0％の磁性金
属酸化物含量を有し4.4μｍの平均サイズを有する3.0％
w/v懸濁液を得た。
実施例40 実施例39の記載に従って調製した3.0％w/vの螢光ナイ
ル赤磁性粒子1.580lを、1.23gのドデシル硫酸ナトリウ
ム,17.50gの過硫酸カリウム及び、4.8mlのメタノール中
に1.2mlのウンデシレン酸と0.024mlのジビニルベンゼン
とを含有する溶液の添加によりカルボキシル化した。混
合物を密封した瓶に加え、吸引して約60rpmで55〜65℃
のオーブン中５時間回転した。得られた螢光ナイル赤カ
ルボキシル磁性粒子を磁気的に分離し、そして上澄が透
明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。螢光ナイル赤
カルボキシル磁性粒子を脱イオン水に懸濁させて850ml
とし、約11.0％の磁性金属酸化物含量を有し4.4μｍの
平均サイズを有する5.0％w/v懸濁液を得た。
実施例41 11.28％w/vの2.24μｍポリスチレン粒子12.4ml,実施
例５の記載に従って調製した2.78％w/vの金属酸化物65m
l,75mlの脱イオン水及び、6.75mlのスチレン中に0.18g
の過酸化ベンゾイルと7mgのナイル赤と0.75mlのジビニ
ルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を密封した瓶
に加えた。瓶を吸引して約60rpmで60〜70℃のオーブン
中約15時間回転した。混合物を、２層にしたチーズクロ
スで濾過し、磁気的に分離し、そして上澄が透明になる
まで脱イオン水で数回洗浄した。得られた螢光架橋磁性
粒子を脱イオン水に懸濁させて170mlとし、約16.5％w/v
の金属酸化物含量を有し4.0μｍの平均サイズを有する
5.4％w/vの懸濁液を得た。
実施例42 螢光及び無螢光カルボキシル磁性粒子（ほぼ同じ金属
酸化物含量を有する）へのヤギ抗HBsAgの結合は実施例3
0と同様であった。
黒の96ウエルのミクロ滴定板〔Pandex（登録商標）〕
のウエルに、4.0μｍの，ヤギ抗HBsAgを被覆した螢光及
び無螢光カルボキシル磁性粒子の完全な混合物（比率1:
1），濃度0.125％w/v,の20μｌを加えた。磁性粒子を含
むウエルに、種々の量のHBsAgを含む無処理血漿又はHBs
Ag陰性血漿の100μｌを加えた。37℃にて30分間インキ
ュベーションした後、粒子を磁気分離機により分離し10
0μｌの洗浄用緩衝液で２回洗浄した。粒子を含む各ウ
エルに希釈緩衝液中のマウス抗HBsAgとＢ−ガラタトシ
ダーゼとの結合体20μｌを加えた。37℃で15分間のイン
キュベーションの後、粒子を分離し上記のようにして６
回洗浄した。粒子を含むウエルに、４−メチルウンベリ
フェリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（MUG,Sigma）
を含有する溶液50μｌを加えた。板を37℃でインキュベ
ートし、螢光強度を、励起側525nm及び螢光側580nmのフ
ィルター（チャンネルC,対照チャンネル）を備えた螢光
濃度分析機〔FCA,Pandex（登録商標）〕を用い、８分間
隔で25倍利得に設定して測定した。チャンネルＣの螢光
強度を任意に定めた螢光単位（AFU）にて記録し表
（１）に示した。結果は、螢光磁性粒子が空のウエルを
検出し、また平均螢光強度に満たないウエルをも表示し
ていることを示している。これはピペット操作の誤りか
アッセイ中の粒子の損失によるものである。
＊17ウエルの平均AFU 31480に対しけ１個のウエルのAFU
が19458であることは、当該ウエルの粒子の損失又はア
ッセイ当初に少ない数の粒子しか放出されなかったこと
を示す。
実施例43 アッセイ能力の比較のためヤギ抗HBsAgで被覆した螢
光及び無螢光カルボキシル磁性粒子を同時にアッセイに
おいて使用した以外は、実施例42の記載と同じ手順に従
った。螢光強度はチャンネルＤ（定量チャンネル、励起
側365nm及び螢光側450nmフィルター）を用いて測定し、
表（２）に示した。結果は、螢光及び無螢光の粒子のい
ずれもアッセイにおいて同等の成績をあげたことを示し
ている。
表 （２） AFU HBsAg濃度 螢光粒子 無螢光粒子 高 27238 30059 中等度 5820 5976 低 1688 1816 陰性 326 403
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ４５２，０９９ (32)優先日 1989年12月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (56)参考文献 米国特許4707523（ＵＳ，Ａ) 米国特許4369226（ＵＳ，Ａ) 米国特許4206094（ＵＳ，Ａ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単
    分散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子
    と磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せからなる
    被覆層とからなり、該被覆層ポリマーは前記内側コアポ
    リマー粒子に吸着され得るモノマーを前記内側コアポリ
    マー粒子表面上で重合したポリマーよりなるものであ
    り、 （ｂ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側
    コア粒子を均一に被覆しており、そして、 （ｃ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性
    含量とを有し溶液中で単分散性のものであることを特徴
    とする粒子。
  2. 【請求項２】該内側螢光コアポリマー粒子が螢光染料を
    組み込んだポリスチレン又は架橋ポリスチレンよりなる
    ものである、請求項１に記載の粒子。
  3. 【請求項３】前記磁性応答性金属酸化物及びポリマーの
    組合せに係るポリマーが、ポリスチレン，架橋ポリスチ
    レン又は官能基を有するポリスチレンよりなる群より選
    ばれるものである、請求項１に記載の粒子。
  4. 【請求項４】均一サイズ分布と磁性含量とを有する単分
    散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子
    と磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せからなる
    被覆層とからなり、該被覆層ポリマーは前記内側コアポ
    リマー粒子に吸着され得るモノマーを前記内側コアポリ
    マー粒子表面で重合したポリマーよりなるものであり、 （ｂ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側
    コア粒子を均一に被覆しており、 （ｃ）前記磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せ
    からなる被覆層を被覆する外側ポリマーを有し、そして （ｄ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性
    含量とを有し溶液中で単分散性のものであることを特徴
    とする粒子。
  5. 【請求項５】前記螢光コアポリマー粒子が螢光染料を組
    み込んだポリスチレン，架橋ポリスチレン又は官能基を
    有するポリスチレンよりなるものである、請求項４に記
    載の粒子。
  6. 【請求項６】前記磁気応答性金属酸化物及びポリマーの
    組合せに係るポリマーが、ポリスチレン，架橋ポリスチ
    レン又は官能基を有するポリスチレンよりなる群より選
    ばれるものである、請求項４に記載の粒子。
  7. 【請求項７】均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単
    分散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子
    と磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せからなる
    被覆層とからなり、該被覆層ポリマーは前記内側コアポ
    リマー粒子に吸着され得るモノマーを前記内側コアポリ
    マー粒子表面上で重合したポリマーよりなるものであ
    り、 （ｂ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側
    コア粒子を均一に被覆しており、 （ｃ）前記磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せ
    よりなる被覆層を被覆する外側ポリマーを有し、 （ｄ）前記外側ポリマー被覆を覆う官能基を有するポリ
    マー層を有し、そして、 （ｅ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性
    含量とを有し溶液中で単分散性のものであることを特徴
    とする粒子。
  8. 【請求項８】前記螢光コアポリマー粒子が、螢光染料を
    組み込んだポリスチレン又は架橋ポリスチレンよりなる
    ものである、請求項７に記載の粒子。
  9. 【請求項９】前記官能基を有するポリマーが、生物学的
    材料と結合するためのカルボキシル，アミノ又はヒドロ
    キシル官能基を提供する物質群より選ばれるものであ
    る、請求項７に記載の粒子。
  10. 【請求項１０】均一なサイズ分布と磁性含量とを有する
    単分散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側螢光コアポリマー粒子
    と磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せからなる
    被覆層とからなり、該被覆層ポリマーは前記内側コアポ
    リマー粒子に吸着され得るモノマーを前記内側コアポリ
    マー粒子表面で重合したポリマーよりなるものであり、 （ｂ）前記金属酸化物とポリマーとの組合せは前記内側
    コア粒子を均一に被覆しており、そして、 （ｃ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せよりなる被
    覆層を覆う官能基を有するポリマーの層を有し、前記磁
    性粒子が均一なサイズ分布と均一な磁性含量を有し溶液
    中で単分散性のものであることを特徴とする粒子。
  11. 【請求項１１】前記螢光コアポリマー粒子が螢光染料を
    組み込んだポリスチレン又は架橋ポリスチレンよりなる
    ものである、請求項10に記載の粒子。
  12. 【請求項１２】均一なサイズ分布と磁性含量とを有する
    単分散性の螢光磁性粒子であって、 （ａ）モノマーを吸着し得る内側コアポリマー粒子と、 （ｂ）磁気応答性金属酸化物及びポリマーの組合せから
    なる被覆層とからなり、該被覆層ポリマーは前記内側コ
    アポリマー粒子に吸着され得るモノマーを前記内側コア
    ポリマー粒子表面上で重合したポリマーであって螢光染
    料又は螢光染料の組合せを含有しており、 （ｃ）前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内側
    コア粒子を均一に被覆しており、 （ｄ）前記磁性粒子が、均一なサイズ分布と均一な磁性
    含量とを有し溶液中で単分散性のものであることを特徴
    とする粒子。
  13. 【請求項１３】均一なサイズ分布と磁性含量とを有する
    単分散性の螢光磁性粒子の製造方法であって、 （ａ）螢光コアポリマー粒子を磁気応答性金属酸化物及
    びポリマーの組合せで均一に被覆することよりなり、 （ｂ）前記被覆ポリマーが前記内側コアポリマー粒子に
    吸着され得るモノマーを前記コアポリマー表面上で重合
    したものであることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】前記磁気応答性金属酸化物が、超常磁
    性、常磁性又は強磁性金属酸化物よりなる群より選ばれ
    るものである、請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記磁気応答性金属酸化物及びポリマー
    の組合せに係るポリマーが、ポリスチレン，架橋ポリス
    チレン又は官能基を有するポリスチレンよりなる群より
    選ばれるものである、請求項13に記載の方法。
  16. 【請求項１６】均一なサイズ分布と磁性含量とを有する
    単分散性の螢光磁性粒子の製造方法であって、 （ａ）コアポリマー粒子を、磁気応答性金属酸化物と、
    前記内側コアポリマー粒子に吸着し得るモノマーと、螢
    光染料又は螢光染料の組合せを含有する混合物を前記コ
    アポリマー粒子表面上で重合して均一に被覆し、そし
    て、 （ｂ）前記磁気応答性金属酸化物を含むポリマー層の外
    側をポリマーで被覆することよりなる方法。
  17. 【請求項１７】前記外側のポリマー被覆が、ポリスチレ
    ン，架橋ポリスチレン又は官能基を有するポリスチレン
    よりなる群より選ばれるものである、請求項16に記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】均一なサイズ分布と磁性含量とを有する
    単分散性の螢光磁性粒子の製造方法であって、 （ａ）螢光コアポリマー粒子を、磁気応答性金属酸化物
    と、前記内側コアポリマー粒子に吸着し得るモノマーと
    の混合物を前記コアポリマー粒子表面上で重合して均一
    に被覆し、そして、 （ｂ）前記磁気応答性金属酸化物を含むポリマー層の外
    側をポリマーで被覆することよりなる方法。
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