DE69029908T2 - Magnetische und fluoreszierende polymerteilchen und ihre anwendung - Google Patents
Magnetische und fluoreszierende polymerteilchen und ihre anwendungInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft Verfahren, bei denen magnetisch reagierende fluoreszierende Polymerteilchen verwendet werden.
- Viele biologische Techniken wie etwa Immunoassays, Affinitätsreinigung usw. machen es erforderlich, daß gebundene von freien Fraktionen getrennt werden. Magnetische Teilchen werden verwendet, um die gewünschte Trennung zu erleichtern.
- Magnetische Teilchen werden aus vielen verschiedenen teilchenförmigen und magnetischen Stoffen, die unterschiedliche Eigenschaften haben, unter Anwendung vieler verschiedener Verfahren gebildet. Beispielsweise beschreibt US-A-4 582 622 ein magnetisches Teilchen, das aus Gelatine, wasserlöslichem Polysaccharid, Natriumphosphat und ferromagnetischen Substanzen besteht; US-A-4 628 037 und US-A-4 554 088 beschreiben magnetische Teilchen, die aus einem magnetischen Metalloxidkern bestehen, der von einem Überzug aus polymerem Silan umgeben ist; US-A-4 452 773 beschreibt diskrete Teilchen kolbidaler Größe, die einen Kern aus ferrogmagnetischem Eisenoxid (Fe&sub3;O&sub4;) haben, der mit einem wasserlöslichen Polysaccharid oder einem Derivat davon, das funktionelle Gruppen hat, beschichtet ist; und US-A-4 297 337 beschreibt magnetisches glas- oder kristallhaltiges Material als einen Träger für teilchenförmiges Material.
- WO-A-89/04373 beschreibt monodispergierte magnetische Teilchen mit gleichmäßiger Größenverteilung und Magnetisierung, die einen Polymer-Innenkern und einen Überzug aus magnetisch reagierendem Metalloxid haben, das mit einem Monomer polymerisiert ist. Der Überzug ist imstande, an den Innenkern adsorbiert zu werden.
- Das Dokument beschreibt ferner ein Verfahren zur Verwendung solcher Teilchen zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration eines Analyten und zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Konzentration von speziellen Nukleinsäuresequenzen in Nukleinsäure-Targetmolekülen.
- Die vorliegende Erfindung stellt solche Verfahren bereit, bei denen die Teilchen fluoreszierend sind und zur Kontrolle bzw. Überwachung der während der Verfahren vorhandenen Anzahl von Teilchen verwendet werden. Die Verfahren sind wie in den Ansprüchen 1 und 2 definiert.
- US-A-4 206 094 und US-A-4 707 523 beschreibt magnetische Teilchen, die mit Fluoreszenzfarbstoff markiert werden können.
- Die magnetischen Teilchen können hergestellt werden, indem zunächst ein magnetisch reagierendes Metalloxid, das nachstehend als Metalloxid bezeichnet wird, mit einer mittleren Größe von ca. 1 µm oder weniger hergestellt und dann ein fluoreszierendes polymeres Kernteilchen einer mittleren Größe von 1 bis 100 µm mit einer Metalloxid enthaltendem Polymerschicht beschichtet wird. Die Oberfläche dieser fluoreszie renden magnetischen Teilchen kann ferner mit einer weiteren Schicht aus Polymer oder funktionalisiertem Polymer beschichtet werden, um die gewünschten Oberflächeneigenschaften zu erhalten.
- Die spektralen Eigenschaften dieser fluoreszierenden magnetischen Teilchen können durch Verwendung von Kernteilchen variiert werden in die verschiedene Fluoreszenzfarbstoffen eingebaut sind, und zwar entweder ein einziger Fluoreszenzfarbstoff oder eine Kombination aus mehreren Fluoreszenzfarbstoffen. Alternativ können die fluoreszierenden magnetischen Teilchen hergestellt werden, indem verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe eingebaut werden, und zwar entweder ein einziger Fluoreszenzfarbstoff oder eine Kombination aus mehreren Fluoreszenzfarbstoffen, die in dem Monomer löslich sind und der Polymerisationsbedingung standhalten können, in Anwesenheit von nichtfluoreszierenden polymeren Kernteilchen, Metalloxid und Monomer.
- Das fluoreszierende Material kann aus Nile -Rot, Coumarin 6, Coumarin 4, Rhodamine B, Nile -Blau, Oxazin 725, Oxazin 750 oder einem Gemisch aus einem dieser fluoreszierenden Materialien mit ein oder mehr anderen dieser Materialien ausgewählt sein.
- Die fluoreszierenden magnetischen Teilchen sind größenmäßig monodispergiert und haben rauhe Oberfläche und haben einen Gehalt an magnetischem Metalloxid von ca. 5 % bis 50 %, bevorzugt von 10 % bis 25 %. Die Fluoreszenzintensität dieser fluoreszierenden magnetischen Teilchen kann eingestellt werden, indem der Gehalt an magnetischem Metalloxid geändert wird, um die Farbabstufung aufgrund des Metalloxids zu variieren, und/oder indem die in die fluoreszierenden polymeren Kernteilchen eingebaute Fluoreszenzfarbstoffmenge geändert wird.
- Es ist gefunden worden, daß Teilchen mit diesen Eigenschaften in Immonoassays und bei vielen verschiedenen biomedizinischen Anwendungen brauchbar sind. Diese fluoreszierenden magnetischen Teilchen können zum passiven oder kovalenten Koppeln von biologischem Material wie etwa Antigenen, Antikörpern, Enzymen oder DNA/RNA verwendet werden und können als feste Phase für verschiedene Arten von Immunoassays, DNA/RNA- Hybridisierungsassays, Affinitätsreinigung, Zelltrennung, Phagocytose und andere biomedizinische Anwendungen eingesetzt werden. Diese fluoreszierenden magnetischen Teilchen mit oder ohne Kopplung an biologisches Material können in verschiedenen Verhältnissen zu nichtmagnetischen Teilchen für verschiedene Assays eingebaut werden, um als Marker zu dienen, um sicherzustellen, daß die richtige Anzahl von Teilchen in die Vertiefung abgegeben wird, und um die Teilchenverluste während des Assays zu kontrollieren.
- Es können sowohl vernetzte als auch unvernetzte magnetisch reagierende fluoreszierende Polymerteilchen verwendet werden.
- Es können monodispergierte magnetisch reagierende fluoreszierende Polymerteilchen verwendet werden.
- Die fluoreszierenden magnetischen Teilchen können hergestellt werden, indem zunächst Metalloxid mit einer mittleren Größe von ca. 1 µm oder weniger hergestellt wird. Das Metalloxid wird durch Erwärmen und Abscheiden eines Gemischs aus bivalentem und trivalentem Metallsalz, bevorzugt eines Gemischs aus Eisen(II)-sulfat und Eisen(III)-sulfat oder -chlorid mit Natriumhydroxidlösung, hergestellt. Das Molverhältnis von bivalentem zu trivalentem Metallsalz kann von 0,5 bis 2,0, bevorzugt 0,5 bis 1,0, variiert werden, um die gewünschte Größe und die gewünschten magnetischen Eigenschaften des Metalloxids zu erhalten. Es wird beobachtet, daß das Molverhältnis von bivalentem zu trivalentem Metallsalz die Größe des Metalloxids beeinflußt: je kleiner das Molverhältnis von bivalentem zu trivalentem Metallsalz, desto kleiner die Größe des Metalloxids. Das Molverhältnis von bivalentem zu trivalentem Metallsalz beeinflußt außerdem die Farbe der resultierenden magnetischen Teilchen: je kleiner das Molverhältnis, desto heller die bräunliche Farbe der resultierenden magnetischen Teilchen. Bevorzugt ist das Metalloxid entweder superparamagnetisch oder paramagnetisch, obwohl auch ferromagnetisches Metalloxid verwendet werden kann, vorausgesetzt, daß bei der Reinigung Zentrifugieren anstelle von magnetischer Trennung angewandt wird.
- Andere bivalente Übergangsmetallsalze wie etwa Mangan-, Magnesium-, Cobalt-, Nickel-, Zink- und Kupfersalze können für Eisen(II)-Salz substituiert werden.
- Nachdem das Metalloxid abgeschieden worden ist, wird es mehrmals unter Zentrifugieren mit 250xg gewaschen, bis der Überstand einen neutralen pH hat. Das Metalloxid wird in entionisiertem Wasser erneut suspendiert und mit hoher Geschwindigkeit mechanisch gerührt, um das Aggregat von Metalloxidkristallen aufzubrechen. Weiteres Zentrifugieren mit 250xg pelletiert nicht das gesamte Metalloxid. Der Überstand, der kleinere Metalloxidkristalle enthält, wird aufgefangen, und das Pellet wird in entionisiertem Wasser erneut suspendiert. Dieser Vorgang wird wenigstens dreimal oder solange wiederholt, bis der größte Teil des Metalloxids nicht mehr mit 250xg pelletiert werden kann. Das auf diese Weise erhaltene Metalloxid hat gewöhnlich eine Größe von weniger als 2,0 µm. Langsames Zentrifugieren mit 100xg zum Entfernen größerer Kristalle verringert die Größe auf weniger als 0,8 µm.
- Das Metalloxid mit einer mittleren Größe von 1,0 µm oder weniger wird mit Monomer vermischt und auf die fluoreszierenden polymeren Kernteilchen, bevorzugt Polystyrolteilchen, mit einer Größe von 1 bis 100 µm in Anwesenheit eines mitiators aufgetragen. Die Zugabe einer geringen Emulgatormenge trägt dazu bei, die Teilchen am Agglomerieren zu hindern. Die fluoreszierenden magnetischen Teilchen werden dann mit einer Polymerschutzschicht, bevorzugt Polystyrol, beschichtet, um zu verhindern, daß das Metalloxid abfällt. Wenn funktionalisierte fluoreszierende magnetische Teilchen erwünscht sind, können die magnetischen Teilchen außerdem mit einer weiteren Schicht aus funktionalisiertem Polymer beschichtet werden, um funktionelle Gruppen wie etwa Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen für das kovalente Koppeln von biologischem Material zu bilden.
- Die fluoreszierenden magnetischen Teilchen können in Fig. 1 dargestellt werden, in der 1 das fluoreszierende Kernteilchen, 2 den Metalloxid/Polymerüberzug, 3 den Polymerschutzüberzug und 4 den funktionalisierten Polymerüberzug bezeichnet. Figur II zeigt die Transmissionselektronen-Mikroaufnahme eines 0,08 bis 0,1 µm-Plättchens eines magnetischen Teilchens, das wie vorher beschrieben hergestellt wurde. Figur III zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von 6,8 µm großen magnetischen Teilchen. Figur IIIa zeigt eine 1000fache und Figur IIIb eine 5000fache Vergrößerung.
- Die bei der Erfindung brauchbaren fluoreszierenden polymeren Kernteilchen können aus jedem Polymer bestehen, das als eine Dispersion kleiner Teilchen erhalten werden kann und das ein Monomer absorbieren kann, so das Metalloxid- und Monomergemisch veranlaßt wird, eine Schicht auf der Oberfläche der Kernteilchen zu bilden. Die Kernteilchen können jede Größe und Gestalt haben, bevorzugt eine Größe von 1 bis 100 µm haben und kugelförmig sein. Wenn monodispergierte Kernteil chen verwendet werden, sind die resultierenden magnetischen Teilchen ebenfalls größenmäßig monodispergiert. Die Kernteilchen können durch Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymerisation oder andere Polymerisationsweisen mit oder ohne ein Vernetzungsmittel wie etwa Divinylbenzol oder dergleichen erhalten werden. Zu den Monomeren, die verwendet werden können, um Kernteilchen herzustellen, gehören Styrol, Methylmethacrylat, Vinyltoluol und dergleichen. Ein Gemisch der Monomere kann ebenfalls verwendet werden. Die fluoreszierenden Kernteilchen können erhalten werden, indem der Fluoreszenzfarbstoff in die Kernteilchen eingebaut wird, wobei verschiedene in der Fachwelt bekannte Techniken angewandt werden. Das Monomer, das als der magnetische Metalloxidüberzug oder als der Schutzüberzug verwendet wird, kann vom gleichen Typ wie die fluoreszierenden Kernteilchen sein oder nicht. Das Gewichtsverhältnis von Monomer, das für den Metalloxidüberzugverwendet wird, zu fluoreszierenden Kernteilchen kann in Abhängigkeit von der Dicke der gewünschten Metalloxid/Polymerschicht zwischen 0,1 und 12, bevorzugt zwischen 0,2 und 6 liegen. Wenn das Metalloxid, das aus einem Gemisch aus Eisen(II)- und Eisen(III)-Salzen hergestellt ist, zum Beschichten verwendet wird, wird bevorzugt ein Gewichts verhältnis von Monomer zu fluoreszierenden Kernteilchen von ca. 0,1 bis 0,5 angewandt. Wenn jedoch das Metalloxid, das aus einem Gemisch aus Mangan(II)- und Eisen(III)-Salzen hergestellt ist, zum Beschichten verwendet wird, kann das Gewichtsverhältnis von Monomer zu Kernteilchen zwischen 0,1 und 12 liegen. Wenn vernetzte fluoreszierende magnetische Teilchen, die gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln inert sind, erwünscht sind, wird infolgedessen die Verwendung des Metalloxids bevorzugt, das aus einem Gemisch aus Mangan(II)- und Eisen(III)-Salzen mit Monomer hergestellt ist, das 2 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bevorzugt 8 Gew.-% bis Gew.-%, Vernetzungsmittel enthält und ein Gewichtsverhältnis von Monomer zu Kernteilchen von 3 bis 12, bevorzugt 4 bis 6, und ein Gewichtsverhältnis von Monomer zu Fluoreszenzfarbstoff von 0,1 bis 10 hat. Wenn bei der Metalloxid/Polymerbeschichtung ein kleineres Gewichtsverhältnis von Monomer zu Kernteilchen verwendet wird (d. h. 0,1 bis 0,5), werden die resultierenden fluoreszierenden magnetischen Teilchen bevorzugt mit einer Schutzschicht eines Polymerüberzugs als Deckschicht versehen, um das Metalloxid noch mehr an der Oberfläche der fluoreszierenden magnetischen Teilchen haften zu lassen. Wenn jedoch ein höheres Verhältnis von Monomer zu Kernteilchen verwendet wird (d. h. 3 bis 12), ist kein Polymerschutzüberzug erforderlich. Die Polymerisationstemperatur kann zwischen 50 ºC und 90 ºC, bevorzugt zwischen 55 ºC und 65 ºC, liegen. Der Polymerisationsinitiator kann entweder wasserlöslich sein wie etwa Kaliumpersulfat und dergleichen oder wasserunlöslich sein wie etwa Benzoylperoxid und dergleichen. Es können auch andere Möglichkeiten der Polymerisationsinitiierung wie etwa Bestrahlen, Ionisieren oder dergleichen angewandt werden. Unerwartet wurde gefunden, daß fluoreszierende magnetische Teilchen ohne die Verwendung irgendeines Emulgators hergestellt werden können, wenn das Metalloxid, das aus einem Gemisch aus Mangan(II)- und Eisen(III)-Salzen hergestellt ist, zum Beschichten verwendet wird. Eine geringe Menge Emulgator wie etwa Natriumdodecylsulfat, Aerosol 22, Tween 20 oder Nonidet P-40 (NP 40) hat sich jedoch als nützlich erwiesen, um eine weitgehende Anhäufung der Teilchen bei der Metalloxid/Polymerbeschichtung zu verhindern, wenn das Metalloxid, das aus einem Gemisch aus Eisen(II)- und Eisen(III)-Salzen hergestellt ist, zum Beschichten verwendet wird. Andere Emulgatoren mit der gleichen Fähigkeit können ebenfalls verwendet werden. Der Gehalt an magnetischem Metalloxid kann von 5 % bis 50 %, bevorzugt von % bis 25 %, variiert werden, indem bei der Metalloxid/Polymerbeschichtung unterschiedliche Metalloxidmengen verwendet werden. Es können auch mehrere Metalloxid/Polymerüberzüge verwendet werden, um den Metalloxidgehalt zu erhöhen. Andere Bestandteile, die üblicherweise bei der Polymerisation verwendet werden, können ebenfalls zugegeben werden, solange magnetische Teilchen mit erwünschten Eigenschaften erhalten werden können. Die Bestandteile für den Metalloxid/Polymerüberzug können entweder auf einmal zu Beginn des Metalloxid/Polymerbeschichtungsvorgangs oder schrittweise zugegeben werden. Wenn das Metalloxid, das aus einem Gemisch aus Eisen(II) und Eisen(III)-Salzen hergestellt ist, verwendet wird, wird das schrittweise Zugeben der Bestandteile bevor zugt. Die Bestandteile können durch mechanisches Rühren, Taumeln oder andere Bewegungsarten entweder unter Vakuum oder Inertgas wie etwa Argon vermischt werden. Die funktionellen Gruppen können an der Oberfläche der fluoreszierenden magnetischen Teilchen eingebaut werden, indem entweder ein Gemisch aus Monomer und funktionalisiertem Monomer bei dem Metalloxid/Polymerbeschichten verwendet wird oder am Ende die magnetischen Teilchen mit einer dünnen Schicht aus funktionalisiertem Monomer als Deckschicht versehen werden. Das verwendete funktionalisierte Monomer kann ausgewählt sein aus einem oder einem Gemisch aus den folgenden: 2-Hydroxyethylmethacrylat, 2-Aminoethylmethacrylat, Trimethylammoniumethylmethacrylatmethosulfat, Dimethylaminoethylmethacrylat, Methacrylsäure, Undecylsäure, Methylpropensulfonsäure, Undecylenylalkohol, Oleylamin, Glycidylmethacrylat, Acrolein, Glutaraldehyd und dergleichen. Die magnetischen fluoreszierenden Teilchen können außerdem mit einer Schicht aus einem Polymer, das von dem für den Metalloxid/Polymerüberzug oder den Schutzüberzug verwendeten verschieden ist, als Deckschicht versehen werden, um die Oberflächeneigenschaften dieses Polymers anzunehmen.
- Die Verwendung einer großen Vielfalt von fluoreszierenden magnetischen Teilchen als feste Phase für verschiedene Anwendungen wie etwa Fluoreszenzimmunoassays, Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Zelltrennungen, Enzymimmobilisierungen und Affinitätsreinigungen ist in der Literatur dargelegt, wie beispielsweise durch die folgenden Artikel gezeigt wird: Hirschbein et al., Chemical Technology, März 1982, 172-179 (1982); Pourfarzaneh, The Ligand Quarterly, 5(1): 41-47 (1982); Halling und Dunnill, Enzyme Microbe Technology, 2: 2-10 (1980); Mosbach und Anderson, Nature, 270: 259-261 (1977); Guesdon et al., J. Allergy Clinical Immunology, 61(1), 23-27 (1978). Einige Anwendungen sind ferner beschrieben in den US-PS'en Nr. 4 152 210 und 4 343 901 für Enzymimmobilisierungen; den US-PS'en Nr. 7 3 970 518, 4 230 685 und 4 267 2343 für Zelltrennungen; den US-PS'en Nr. 4 554 088, 4 628 037 und 3 933 997 für Immunoassays.
- Einige magnetische Teilchen können bei der einen Anwendung brauchbar sein, aber nicht bei der anderen. Beispielsweise können die in den US-PS'en Nr. 4 554 088 und 4 628 037 beschriebenen magnetischen Teilchen, die einen superparamagnetischen Metalloxidkern aufweisen, der im allgemeinen von einem Überzug aus polymerem Silan umhüllt ist, aufgrund der großen Oberfläche und der geringeren Sinkgeschwindigkeit beim Immunoassay und bei der Affinitätsreinigung brauchbar sein, sie sind jedoch für die Anwendung zur Zelltrennung wie etwa Knochenmarkreinigung ungeeignet. Aufgrund der geringen Größe der magnetischen Teilchen, die in diesen beiden Patenten beschrieben sind, ist es sehr schwierig, sämtliche magnetischen Teilchen effektiv aus der Zellsuspension zu entfernen. Außerdem wäre die nichtspezifische Bindung von kleineren magnetischen Teilchen an Normalzellen viel höher. Bei der Verwendung magnetischer Teilchen zur Knochenmarkreinigung werden die magnetischen Teilchen mit Antikörper wie etwa Schaf-Anti-Maus-IgG beschichtet, und das Knochenmark wird mit einem Gemisch aus mehreren monoklonalen Antikörpern gegen die Krebszellen-Oberflächenantigene behandelt. Die magnetischen Teilchen binden sich nur an die Krebszellen und bewirken, daß diese von Normalzellen getrennt werden, indem sie durch ein starkes Magnetfeld geleitet werden. Die gereinigten Zellen werden dann in den Patienten zurückgeführt.
- Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Teilchen können hinsichtlich Größe, Oberfläche, Metalloxid gehalt und Oberflächeneigenschaften für eine große Vielfalt von biomedizinischen Anwendungen optimiert werden. Die magnetischen Teilchen können als feste Phase für den Enzymimmunoassay, Fluororeszenzimmunoassay, Radioimmunoassay, DNA/RNA-Hybridisierungsassay und andere diagnostische Anwendungen verwendet werden. Immunoassays können unter Verwendung verschiedener Konfigurationen wie etwa Sandwich- Assays und kompetitiver Bindungsassays usw. durchgeführt werden, die für die Fachwelt offensichtlich sind. Die DNA/RNA-Hybridisierung kann außerdem unter Verwendung ver schiedener Konfiguration wie etwa Festphasenhybridisierung oder Flüssigphasenhybridisierung durchgeführt werden. Bei der Festphasenhybridisierungskonfiguration wird eine DNA- oder RNA-Sonde (Fängersonde) zuerst an dem magnetischen Teilchen immobilisiert. Die immobilisierte Fängersonde wird dann verwendet, um mit einem komplementären DNA-Strang von der Probe (Proben-DNA) zu hybridisieren. Schließlich wird eine andere Sonde (Signalsonde), die mit einem fluoreszierenden, einem radioaktiven oder einem Enzym-Marker markiert und imstande ist, mit einem anderen Teil der Proben-DNA zu hybridisieren, zur Signalerzeugung genutzt. Bei der Flüssigphasenhybridisierungskonfiguration läßt man die Fänger sonde und die Signalsonde zuerst mit der Proben-DNA in der flüssigen Phase hybridisieren, und dann werden sie an den magnetischen Teilchen immobilisiert.
- Alternativ kann die Signalsonde ferner mit ein oder mehr Biotingruppen markiert werden, und das Signal wird nachgewiesen, indem die Biotingruppen mit einem Avidin-markierten fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Marker gebunden werden, um die Empfindlichkeit des Assays zu steigern.
- Die Immunoassays und DNA/RNA-Hybridisierungsassays können verwendet werden, um viele verschiedene Verbindungen wie etwa Arzneimittel, Hormone, Antikörper, Peptide, DNA, RNA, Nudeotide, Virus-Antigene und Kohlenhydrate in biologischen Proben zu messen.
- Magnetische Teilchen können auch für die Affinitätsreinigung, Zelltrennung, Enzymimmobilisierung und für andere biomedizinische Anwendungen verwendet werden. Bei der Zelltrennung werden die magnetischen Teilchen verwendet, um entweder unerwünschte Zellen zu entfernen (negative Selektion) oder um die gewünschten Zellen durch immunologische Reaktionen oder nichtimmunologische Reaktionen anzureichern (positive Selektion). Dieses Prinzip kann angewandt werden, um Krebszellen aus Knochenmark zu entfernen (Knochenmarkreinigung), um Zellpopulationen entweder durch positive oder negative Selektion für die Gewebekultur zu reinigen und um verschiedene zelluläre Immunoassays usw. durchzuführen. Bei der Affinitätsreinigung werden die magnetischen Teilchen anstelle von herkömmlicher fester Phase wie etwa Polyacrylamidgelen, Sepharose-Gelen oder anderen Cellulosekügelchen verwendet, um viele verschiedene biologische Materialien wie etwa Antikörper, Antigene, Enzyme, Inhibitoren, Cofaktoren, einzelsträngiges DNA, Bindungsproteine, Haptene und Kohlenhydrate usw. zu reinigen. Bei einer anderen Anwendung, die der Affinitätsreinigung ähnlich ist, können die magnetischen Teilchen für die Kreuzadsorption und das Entfernen unerwünschter Proteinbestandteile aus den Antiseren oder klinischen Proben verwendet werden. Bei der Enzymimmobilisierung wird das Enzym durch verschiedene Kopplungsarten an den magnetischen Teilchen immobilisiert, um die Enzymaktivität zu konservieren und die Wiederverwendung von immobilisiertem Enzym zu gestatten. Die magnetischen Teilchen mit immobilisiertem Enzym können verwendet werden, um andere Festphasen wie etwa Glaskügelchen, Glas mit kontrollierten Poren, Silicagele und Cellulosekügelchen usw. zu ersetzen, die gewöhnlich bei immobilisierten Enzymsystemen verwendet werden, um viele verschiedene Materialien wie etwa Kohlenhydrate, Aminosäuren und Proteine usw. zu erzeugen.
- Diese fluoreszierenden magnetischen Teilchen mit oder ohne Kopplung an biologischem Material können in verschiedenen Verhältnissen zu nichtfluoreszierenden Teilchen für verschiedene Assays eingebaut werden, wie in den Beispielen 42 und 43 erwähnt ist, um als Marker zu dienen, um sicherzustellen, daß die richtige Anzahl von Teilchen in die Vertiefung abgegeben wird, und um die Teilchenverluste beim Assay zu prüfen.
- Diese Anwendungen werden sämtlich durch die einfache Trennung, schnelle Reaktionsgeschwindigkeit und große Oberfläche, die den meisten magnetischen Teilchen gemeinsam sind, erleichtert. Die nachstehenden Beispiele sollen die Vielseitigkeit und Vorteile der Erfindung weiter erläutern.
- In einen Dreihalskolben mit rundem Boden mit einem mechanischen Rührer, Kondensator, Thermometer, Tropftrichter und Heizmantel wurde ein Gemisch eingebracht, das 0,361 mol Eisen(II)-sulfat und 0,369 mol Eisen(III)-sulfat (Verhältnis Fe&spplus;&spplus;/Fe&spplus;&spplus;&spplus; = 1) in 400 ml entionisiertem Wasser enthielt. Das Gemisch wurde auf 85 bis 90 ºC unter Rühren erwärmt, und 850 ml von 6 N Natriumhydroxid wurden über einen Zeitraum von 90 min tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei 85 bis 90 ºC für eine weitere Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Metalloxidpräzipitate wurden mit 250xg für 10 min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde dekantiert, und das Pellet wurde in 900 ml entionisiertem Wasser unter Verwendung eines mechanischen Rührers erneut suspendiert. Dieser Reinigungsvorgang wurde sechsmal oder solange wiederholt, bis der überstand einen nahezu neutralen pH hatte. Der überstand wurde dekantiert und in 200 ml entionisiertem Wasser erneut suspendiert. Weiteres Zentrifugieren mit 250xg pelletiert nicht die gesamten Metalloxidpräzipitate. Der Überstand, der kleinere Metalloxidkristalle enthielt, wurde aufgefangen, und das Pellet wurde in 200 ml entionisiertem Wasser erneut suspendiert. Dieser Vorgang wurde wenigstens dreimal oder solange wiederholt, bis der größte Teil des Metalloxids nicht mehr mit 250xg pelletiert werden kann. Das auf diese Weise erhaltene Metalloxid hat gewöhnlich eine Größe von weniger als 2,0 µm. Die vereinigte Metalloxid suspension wurde mit 100xg für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde aufgefangen, um 800 ml von 8,6 % (Gew./Vol.) magnetischer Metalloxidsuspension einer Größe von weniger als 0,8 µm zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 1 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 0,235 mol Eisen(II)-sulfat, 0,297 mol Eisen(III)-sulfat (Verhältnis Fe&spplus;&spplus;/Fe&spplus;&spplus;&spplus; = 0,79) in 400 ml entionisiertem Wasser und 480 ml von 6 N Natriumhydroxid eingesetzt wurden, um 2000 ml von 2,86 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 1 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 0,178 mol Eisen(II)-sulfat, 0,298 mol Eisen(III)-sulfat (Verhältnis Fe&spplus;&spplus;/Fe&spplus;&spplus;&spplus; = 0,59) in 400 ml entionisiertem Wasser und 520 ml von 6 N Natriumhydroxid eingesetzt wurden, um 1500 ml von 2,98 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 1 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 0,15 mol Eisen(II)-sulfat, 0,276 mol Eisen(III)-sulfat (Verhältnis Fe&spplus;&spplus;/Fe&spplus;&spplus;&spplus; = 0,54) in 400 ml entionisiertem Wasser und 520 ml von 6 N Natriumhydroxid eingesetzt wurden, um 700 ml von 6,88 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 1 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 0,116 mol Mangan(II)-sulfat, 0,146 mol Eisen(III)-sulfat (Verhältnis Mn&spplus;&spplus;/Fe&spplus;&spplus;&spplus; = 0,79) in 0,225 ml entionisiertem Wasser und 240 ml von 6 N Natriumhydroxid eingesetzt wurden, um 1700 ml von 1,8 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 600 ml entionisiertes Wasser, 6 ml Styrol und 80 ml von 8,6 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für eine Stunde rotiert. Dem Gemisch wurden 12 g Kaliumpersulfat und 850 ml von 5 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 4,0 µm zugegeben. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und für eine Stunde rotiert, und 50 ml von 2 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben. Nach fünf weiteren Stunden wurden dem Gemisch 6 ml Styrol und 10 g Kaliumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere fünfzehn Stunden rotiert, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 1,6 l mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 11 % und einer mittleren Größe von 4,3 µm zu ergeben.
- Die magnetischen Teilchen, und zwar 1,6 l von 2,5 % (Gew./Vol.), die wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt waren, wurden carboxyliert durch Zugabe von 1 g Natriumdodecylsulfat, 10 g Kaliumpersulfat und einer Lösung enthaltend 0,98 ml Undecylensäure und 0,02 ml Divinylbenzol in 4 ml Methanol. Das Gemisch wurde in eine hermetische Flasche eingebracht, evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC- Ofen für fünf Stunden rotiert. Die resultierenden magnetischen Carboxylteilchen wurden magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die magnetischen Carboxylteilchen wurde auf 680 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 5,8 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 11 % und einer mittleren Größe von 4,3 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 600 ml entionisiertes Wasser, 6 ml Styrol und 80 ml von 8,6 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für eine Stunde rotiert. Dem Gemisch wurden 12 g Kaliumpersulfat und 850 ml von 4,78 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 6,1 µm zugegeben. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und für fünf Stunden rotiert, und 6 ml Styrol und g Kaliumpersulfat wurden zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere fünfzehn Stunden rotiert, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisier tem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 1,5 l mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert und durch Zugabe von 1 g Natriumdodecylsulfat, 10 g Kaliumpersulfat und einer Lösung enthaltend 0,98 ml Undecylensäure und 0,02 ml Divinylbenzol in 4 ml Methanol carboxyliert. Das Gemisch wurde in eine hermetische Flasche eingebracht, evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünf Stunden rotiert. Die resultierenden magnetischen Carboxylteilchen wurden magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die magnetischen Carboxylteilchen wurden auf 800 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 4,3 % Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 11,6 % und einer mittleren Größe von 6,8 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 600 ml entionisiertes Wasser, 6 ml Styrol und 60 ml von 8,6 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in einen Dreihalskolben mit rundem Boden eingebracht und bei 67 ºC für eine Stunde unter Argon gerührt. Dem Gemisch wurden 12 g Kaliumpersulfat und 470 ml von 5 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,7 µm von zugegeben. Das Gemisch wurde bei 67 ºC für eine Stunde gerührt, und 30 ml von 2 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben. Nach dem Rühren bei 67 ºC unter Argon für fünf weitere Stunden wurden dem Gemisch 6 ml Styrol und 6 g Kaliumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde bei 67 ºC unter Argon für weitere fünfzehn Stunden gerührt, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 900 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert und durch Zugabe von 0,6 g Natriumdodecylsulfat, 10 g Kaliumpersulfat und einer Lösung enthaltend 0,598 ml Undecylensäure und 0,012 ml Divinylbenol in 2,4 ml Methanol carboxyliert. Das Gemisch wurde in eine hermetische Flasche eingebracht, evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC- Ofen für fünf Stunden rotiert. Die resultierenden magnetischen Carboxylteilchen wurden magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die magnetischen Carboxylteilchen wurden auf 500 ml erneut suspendiert, um eine 6,5 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 14 % und einer mittleren Größe von 4,0 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 600 ml entionisiertes Wasser, 6 ml Styrol und 60 ml von 8,6 % (Gew./Vol.) von magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für eine Stunde rotiert. Dem Gemisch wurden 12 g Kaliumpersulfat und 470 ml von 5 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,7 µm zugegeben. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und für eine Stunde rotiert, und 30 ml von 2 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben. Nach fünf weiteren Stunden wurden dem Gemisch 6 ml Styrol und 10 g Kaliumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere fünfzehn Stunden rotiert, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 500 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 6,8 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 14 % und einer mittleren Größe von 4,0 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 180 ml entionisiertes Wasser, 2 ml Styrol und 20 ml von 8,6 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für eine Stunde rotiert. Dem Gemisch wurden 4 g Kaliumpersulfat und 160 ml von 6,8 % (Gew./Vol.) magnetischen Teilchen (3,0 µm, 14 % Metalloxidgehalt) zugegeben, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt waren. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und für eine Stunde rotiert, und 10 ml von 2 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben. Nach fünf weiteren Stunden wurden dem Gemisch 2 ml Styrol und 2 g Kaliumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere fünfzehn Stunden rotiert, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 160 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 7,78 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 19 % und einer mittleren Größe von 4,2 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 90 ml entionisiertes Wasser, 1 ml Styrol und ml von 8,6 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für eine Stunde rotiert. Dem Gemisch wurden 1 g Kaliumpersulfat und 80 ml von 7,78 % (Gew./Vol.) magnetischen Teilchen (3,2 µm, 19 % Metalloxidgehalt) zugegeben, die wie in Beispiel 11 beschrieben hergestellt waren. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und für vier Stunden rotiert, und ml von 2 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben. Nach fünf weiteren Stunden wurden dem Gemisch 1 ml Styrol und 1 g Kaliumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere fünfzehn Stunden rotiert, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 160 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 4,5 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 23 % und einer mitt leren Größe von 4,5 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 400 ml entionisiertes Wasser, 1,92 ml Styrol, 0,08 ml Divinylbenzol, 4 g Kaliumpersulfat, 20 g Polystyrolkügelchen von 200 bis 400 mesh, vernetzt mit 4 % Divinylbenzol, und 10 ml von 8,6 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Man ließ das Gemisch sich setzen, und der überstand wurde dekantiert. Die resultierenden magnetischen Kügelchen wurden in 200 ml entionisiertem Wasser erneut suspendiert, und man ließ sie erneut sich setzen. Dieser Vorgang wurde mehrfach wiederholt, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Kügelchen wurden in 200 ml entionisiertem Wasser erneut suspendiert, und 0,1 g Natriumdodecylsulfat, 2,0 g Kaliumpersulfat, 0,48 ml Styrol und 0,02 ml Divinylbenzol wurden zugegeben. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für eine Stunde rotiert, und eine Lösung enthaltend 0,098 ml Undecylensäure und 0,002 ml Divinylbenzol in 0,4 ml Methanol wurde zugegeben. Das Gemisch wurde für vier weitere Stunden rotiert und durch Schwerkraftsedimentation gereinigt, wie vorher beschrieben wurde. Das Wasser wurde durch Filtration entfernt, und die magnetischen Carboxylkügelchen wurden getrocknet, um g magnetische Carboxylkügelchen von 200 bis 400 mesh zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 100 ml entionisiertes Wasser, 0,5 ml Styrol, 2 g Kaliumpersulfat, 75 ml von 5 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 4,0 µm und 10 ml von 6,88 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 150 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 14 % und einer mittleren Größe von 4,3 µm zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 14 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 20 ml von 6,88 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid, das wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt war, eingesetzt wurden, um 160 ml einer 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 18 % und einer mittleren Größe von 4,3 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 2000 ml entionisiertes Wasser, 13 ml Styrol und 550 ml von 2,98 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für eine Stunde rotiert. Dem Gemisch wurden 20 g Kaliumpersulfat und 950 ml von 10 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 3,0 µm zugegeben. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und für eine Stunde rotiert, und 60 ml von 2 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben. Nach fünf weiteren Stunden wurden dem Gemisch 8 ml Styrol und 10 g Kaliumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere fünfzehn Stunden rotiert, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisisertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 3000 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 3,38 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 12 % und einer mittleren Größe von 3,2 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 150 ml magnetische Teilchen (3,2 µm, 3,38 % (Gew./Vol.) mit 12 % Metalloxidgehalt), die wie in Beispiel 16 hergestellt waren, 2 ml von 1 % NP 40, 0,5 ml Methylmethacrylat oder Styrol, 1 g Kaliumpersulfat und 2 ml funktionalisiertes Monomer, Trimethylammoniumethyl-Methacrylatmethosulfat (40 % wäßrige Lösung), enthielt, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für vier Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 200 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit funktionellen Trimethylammoniumgruppen an der Oberfläche zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 17 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 1 ml funktionalisiertes Monomer, 2-Aminoethylmethacrylat, eingesetzt wurde, um 200 ml von 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Aminogruppen an der Oberfläche zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 17 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 1 ml funktionalisiertes Monomer, 2-Hydroxyethylmethacrylat, eingesetzt wurde, um 200 ml von 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Hydroxylgruppen an der Oberfläche zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 17 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 1 ml Monomer, 1-Vinyl-2- pyrrolidinon, eingesetzt wurde, um 200 ml von 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Polyvinylpyrrolidinon an der Oberfläche zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 17 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 1 g funktionalisiertes Monomer, Methylpropensulfonsäure, eingesetzt wurde, um 200 ml von 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Sulfonsäuregruppen an der Oberfläche zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 17 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 1 ml funktionalisiertes Monomer, Dimethylaminoethylmethacrylat, eingesetzt wurde, um 200 ml von 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Dimethylaminogruppen an der Oberfläche zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 20 ml von 7,0 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,11 µm, 100 ml von 1,8 % (Gew./Vol.) Metalloxid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt war, 50 ml entionisiertes Wasser und eine Lösung enthaltend 0,15 g Benzoylperoxid in 7,5 ml Styrol enthielt, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden magnetischen Teilchen wurden auf 200 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 5,0 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 16,8 % und einer mittleren Größe von 3,6 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 20 ml von 7,0 % (Gew./Vol.) Polystyrol von 2,11 µm, 100 ml von 1,8 % (Gew./Vol.) Metalloxid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt war, 50 ml entionisiertes Wasser und eine Lösung enthaltend 0,15 g Benzoylperoxid und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol enthielt, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden vernetzten magnetischen Teilchen wurden auf 200 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 5,0 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 16,8 % und einer mittleren Größe von 3,6 µm zu ergeben. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilchen erwiesen sich als gleichmäßig in der Größe und als inert gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln wie etwa Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid.
- Ein Gemisch, das 20 ml von 7,0 % (Gew./Vol.) Polystyrolteil chen von 2,11 µm, 150 ml von 1,8 % (Gew./Vol.) Metalloxid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt war, und eine Lösung enthaltend 0,15 g Benzoylperoxid, 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol enthielt, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden vernetzten magnetischen Teilchen wurden auf 200 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 5,4 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 23 % und einer mittleren Größe von 4,0 µm zu ergeben. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilchen erwiesen sich als gleichmäßig in der Größe und als inert gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln wie etwa Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid.
- Ein Gemisch, das 15 ml von 9,16 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 3,2 µm, 100 ml von 1,8 % (Gew./Vol.) Metalloxid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt war, 55 ml entionisiertes Wasser und eine Lösung enthaltend 0,15 g Benzoylperoxid und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol enthielt, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden vernetzten magnetischen Teilchen wurden auf 200 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 4,7 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 16,8 % und einer mittleren Größe von 5,5 µm zu ergeben. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilchen erwiesen sich als gleichmäßig in der Größe und als inert gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln wie etwa Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid.
- Ein Gemisch, das 30 ml von 4,5 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 4,1 µm, 100 ml von 1,8 % (Gew./Vol.) Metalloxid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt war, 40 ml entionisiertes Wasser und eine Lösung enthaltend 0,15 g Benzoylperoxid und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol enthielt, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC- Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden vernetzten magnetischen Teilchen wurden auf 200 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 415 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 16,9 % und einer mittleren Größe von 6,7 µm zu ergeben. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilchen erwiesen sich als gleichmäßig in der Größe und als inert gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln wie etwa Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid.
- Ein Gemisch, das 20 ml von 7,0 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,11 µm, 100 ml von 1,8 % (Gew./Vol.) Metalloxid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt war, 50 ml entionisiertes Wasser und eine Lösung enthaltend 0,15 g Benzoylperoxid, 0,75 ml Undecylenylalkohol und 0,75 ml Divinylbenzol in 6 ml Styrol enthielt, wurde in eine hermeti sche Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem 55 ºC-Ofen für fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden vernetzten magnetischen Hydroxylteilchen wurden filtriert und getrocknet, um 9 g Pulver mit einem Metalloxidgehalt von ca. 16,8 % und einer mittleren Größe von 3,9 µm zu ergeben. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Hydroxylteilchen erwiesen sich als gleichmäßig in der Größe und als inert gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln wie etwa Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid.
- In eine 80 ml-Flasche wurden 30 ml von 5,0 % (Gew./Vol.) magnetischen Carboxylteilchen von 4,3 µm, die wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt waren, eingebracht. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt und in 50 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 5,5) erneut suspendiert. Der Teilchensuspension wurden 20 mg Rinderserumalbumin und 100 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) zugegeben. Das Gemisch wurde endweise bei Raumtemperatur für zwei Stunden rotiert und magnetisch getrennt. Die Teilchen wurden einmal mit 80 ml Phosphatbuffer gewaschen und auf 75 ml mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,1 M, pH 7,0) erneut suspendiert, um eine 2,0 % (Gew./Vol.) Suspension zu ergeben.
- Um Rinderserumalbumin durch passive Adsorption an magnetische Teilchen zu koppeln, wurden die gleichen Schritte angewandt, mit der Ausnahme, daß kein EDC eingesetzt wurde.
- In ein 4 ml-Vial wurde 1 ml von 5,0 % (Gew./Vol.) magnetischen Carboxylteilchen von 4,3 µm, die wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt waren, eingebracht. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt und einmal mit 2 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 5,5) gewaschen und auf 2 ml mit dem gleichen Puffer erneut suspendiert. Der Teilchensuspension wurden 140 ml von 1,4 mg/ml Ziege(Gt)-Anti-Maus(Ms)-IgG und 10 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid zugegeben. Das Vial wurde endweise bei Raumtemperatur für zwei Stunden rotiert. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt, einmal mit 2 ml Phosphatpuffer gewaschen und auf 2 ml mit phosphatge pufferter Kochsalzlösung (0,1 M, pH 7,0) erneut suspendiert, um 2,5 % (Gew./Vol.) Gt-Anti-Ms-IgG-beschichtete magnetische Teilchen zu ergeben. Eine andere Antikörperart, die entweder monoklonal oder polyklonal ist, könnte unter Anwendung der gleichen Schritte ebenfalls an magnetische Carboxylteilchen gekoppelt werden.
- Um Gt-Anti-Ms-IgG oder eine andere Antikörperart durch passive Adsorption an die magnetischen Teilchen zu koppeln, wurden die gleichen Schritte angewandt, mit der Ausnahme, daß kein EDC eingesetzt wurde.
- In ein 4 ml-Vial wurden 2,5 ml mit Rinderserumalbumin beschichtete magnetische Teilchen (4,3 µm, 2 % (Gew./Vol.)), die wie in Beispiel 29 beschrieben hergestellt waren, eingebracht. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt und auf 2 ml mit Phosphatpuffer (0,1 M, pH 5,5) erneut suspendiert. Dem Gemisch wurden 10 µl Ms-Anti-B-Erythrozyten-Oberflächenantigen (20 mg/ml) und 1 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopopyl)carbodiimid zugegeben. Das Gemisch wurde endweise bei Raumtemperatur für zwei Stunden rotiert. Die Teilchen wurden magnetich getrennt, einmal mit Phosphatpuffer gewaschen und in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,1 M, pH 7,0) erneut suspendiert, um eine 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension zu ergeben.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 31 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß 40 µl Ms-Anti-A-Erythrozyten-Oberflächenantigen (5 mg/ml) eingesetzt wurden, um 2 ml einer 2,5 % (Gew./Vol.) Suspension zu ergeben.
- In ein mit A markiertes, 55 mm x 65 mm großes Teströhrchen wurden 25 µl von 2,5 % (Gew./Vol.) Ms-Anti-A-beschichteten magnetischen Teilchen eingebracht, die wie in Beispiel 32 beschrieben hergestellt waren. In das mit B markierte andere Teströhrchen wurden 25 µl von 2,5 % (Gew./Vol.) Ms-Anti-B beschichteten magnetischen Teilchen eingebracht, die wie in Beispiel 31 beschrieben hergestellt waren. In beide Teströhrchen wurden 50 µl von 1% gepackten Erythrozyten zugegeben, die durch 1:100-Verdünnung von gepackten Erythrozyten in isotonischer gepufferter Kochsalzlösung präpariert waren. Die Teströhrchen wurden durch mehrfaches Klopfen mit dem Finger geschüttelt und auf der Oberseite eines Magneten plaziert. Die Ergebnisse wurden wie folgt zusammengefaßt: BLUTGRUPPE RÖHRCHEN
- wobei + eine positive Reaktion repräsentiert, was bedeutet, daß die Erythrozyten durch die entsprechenden antikörperbeschichteten magnetischen Teilchen agglutiniert waren; infolgedessen war der Überstand in dem Teströhrchen nach magnetischer Trennung klar. Dagegen blieb der Überstand einer negativen Reaktion nach magnetischer Trennung aufgrund der Abwesenheit einer Agglutination zwischen den Erythrozyten und den antikörperbeschichteten magnetischen Teilchen trüb.
- In ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen wurde 1 ml von 6 % (Gew./Vol.) magnetischen Carboxylteilchen von 3 µm eingebracht. Die Teilchen wurden für 3 min mit 10000 U/min zentrifugiert. Der überstand wurde abgesaugt, und die Teilchen wurden durch Verwirbeln mit 1 ml von 5 bis 10.0 µg/ml re kombinantem HBcAG in Acetatpuffer erneut suspendiert. Das Röhrchen wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden rotiert und zentrifugiert, wie vorher beschrieben. Der Überstand wurde abgesaugt, und die Teilchen wurden in 1 ml Deckschichtlösung, die Acetatpuffer und 2 bis 10 % normales Tierserum enthielt, erneut suspendiert. Das Röhrchen wurde bei Raumtemperatur für zwei bis sechzehn Stunden rotiert und zentrifugiert, wie vorher beschrieben. Der Überstand wurde abgesaugt, und die Teilchen wurden dreimal mit 1 ml isotonischer gepufferter Kochsalzlösung (IBS) durch Zentrifugieren und erneute Suspension gewaschen. Schließlich wurden die Teilchen mit 1 ml IBS erneut suspendiert und bei 2 bis 8 ºC aufbewahrt.
- In die ersten zwei Spalten einer Miktrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden 20 µl von 0,25 % (Gew./Vol.) mit Hepatitis-B-Kernantigen (HBcAG) beschichteten magnetischen Teilchen eingebracht, die wie in Beispiel 34 beschrieben hergestellt waren. Das Probenpräparat bestand aus verschiedenen Verdünnungen eines HBcAB-positiven Serums in ein negatives Plasma, gefolgt von einer 1:100-Verdünnung jeder Probe in Probenverdünnungspuffer (SDB). Der SDB enthielt Phosphatpuffer, Proteinstabilisatoren, Detergens und antimikrobielle Mittel. In die Vertiefungen, die die Teilchen enthielten, wurden 50 µl jeder endgültigen Probenverdünnung zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen für 2 min an einem Magnetabscheider getrennt und dreimal mit 200 µl Waschpuffer, der Salze und Detergens enthielt, qewaschen. In jede Vertiefung, die die Teilchen enthielt, wurden 50 µl Ziege-Antihuman-IgG-B-D-Galactosidase Konjugat (0,5 µg/dl) in Verdünner zugegeben, der Salze, Proteinstabilisatoren, Glycerin, Detergens und antimikrobielle Mittel enthielt. Nach 15 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen wie oben beschrieben getrennt und dreimal gewaschen und in 30 µl IBS erneut suspendiert. Die Teilchen wurden in die ersten zwei Spalten einer schwarzen Mikrotiterplatte (Dynatech) überführt. In jede Vertiefung, die die Teilchen enthielt, wurden 100 µl einer Lösung zugegeben, die 4-Methylumbelliferyl-B-Galactopyranosid (MUG, Sigma) enthielt. Die Platte wurde bei 37 ºC inkubiert, und die Fluo reszenzintensität wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzkonzentrationsanalysators (FCA, Pandex) gemessen, der einen 365 nm-Anregungsfilter und einen 450 nm-Emissionsfilter aufwies, und zwar in Abständen von 5 min und mit einer 10fachen Verstärkungseinstellung. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität in einem Abstand von 5 min wurde in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) aufgezeichnet und in Tabelle I aufgeführt. TABELLE I
- Das Koppeln von Maus-Anti-HBsAG an magnetische Carboxylteilchen war ähnlich wie in Beispiel 30.
- In die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte (Dynatech) mit 96 Vertiefungen wurden 20 µl von 0,25 % (Gew./Vol.) mit Maus-Anti-HBsAG beschichteten magnetischen Carboxylteilchen von 3,2 µm im Duplikat zugegeben. In die Vertiefungen, die die magnetischen Teilchen enthielten, wurden 100 µl sauberes Plasma zugegeben, das verschiedene Mengen an HBsAG oder ein HBsAG-negatives Plasma enthielt. Nach 30 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen für 2 min an einem Magnetabscheider getrennt und einmal mit 100 µl Waschpuffer, der Salze und Detergens enthielt, gewaschen. In jede Vertiefung, die die Teilchen enthielt, wurden 20 µl Maus-Anti-HBsAG-B- Galactosidase-Konjugat in Verdünner zugegeben, der Salze, Proteinstabilisatoren, Glycerin, Detergens und antimikrobielle Mittel enthielt. Nach 15 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen wie oben beschrieben getrennt und fünfmal gewaschen. In jede Vertiefung, die die Teilchen enthielt, wurden 50 µl einer Lösung zugegeben, die 4-Methylumbelliferyl-B-D-Galactopyranosid (MUG, Sigma) enthielt. Die Platte wurde bei 37 ºC inkubiert, und die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzkonzentrationsanalysators (FCA, Pandex) gemessen, der einen 365 nm-Anregungsfilter und einen 450 nm-Emissionsfilter aufwies, und zwar in einem Abstand von 5 min und mit einer 10fachen Verstärkungseinstellung. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität in einem Abstand von 5 min wurde in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) aufgezeichnet und ist in Tabelle II aufgeführt. TABELLE II
- Die HIV-1-Antigene von HTLV-IIIB/H-9-Zellen (Gallo-Stamm) wurden an magnetische Carboxylteilchen von 3,6 µm unter Anwendung ähnlicher Schritte wie in Beispiel 34 beschrieben gekoppelt.
- In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden 20 µl von 0,25 % (Gew./Vol.) von HIV-beschichteten magnetischen Teilchen im Duplikat zugegeben. In die Vertiefungen, die die Teilchen enthielten, wurden 50 µl positive, im Grenzbereich liegende und negative Proben zugegeben, die 1:100 in Probenverdünnungspuffer (SDB) verdünnt waren, der Phosphatpuffer, Proteinstabilisatoren, Detergens und antimikrobielle Mittel enthielt. Nach 30 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen für 2 min an einem Magnetabscheider getrennt und dreimal mit 100 µl Waschpuffer, der Salze und Detergens enthielt, gewaschen. In jede Vertiefung, die Teilchen enthielt, wurden 50 µl Konjugat von Ziege-Antihuman-B- Galactosidase (ungefähr 0,5 µg/ml) in Verdünner zugegeben, der Salze, proteinstabilisatoren, Glycerin, Detergens und antimikrobielle Mittel enthielt. Nach 15 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen wie oben beschrieben viermal gewaschen. Die Teilchen wurden auf die schwarze Mikrotiterplatte (Dynatech) überführt. In jede Vertiefung, die Teilchen enthielt, wurden 100 µl einer Lösung zugegeben, die 4-Methylumbelliferyl-B-D-Galactopyranosid (MUG, Sigma) enthielt. Die Platte wurde bei 37 ºC inkubiert, und die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzkonzentrationsanalysators (FCA, Pandex) gemessen, der einen 365 nm-Anregungsfilter und einen 450 nm-Emissionsfilter aufwies, und zwar in Abständen von 5 min und mit einer 25fachen Verstärkungseinstellung. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität in einem Abstand von 5 min wurde in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) aufgezeichnet und in Tabelle III aufgeführt. TABELLE III
- Magnetische Carboxylteilchen von 4,3 µm, die wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt waren, wurden gewaschen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,7) beschallt, in 70 % Ethanol für 10 min sterilisiert, dreimal in PBS gewaschen und für 48 Stunden bei 4 ºC mit affinitätsgereinigtem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper (SAM) mit 0,5 mg/ml und einem Verhältnis von 3,3 mg Antikörper/100 mg Teilchen inkubiert. Vor der Verwendung wurden die antikörperbeschichteten magnetischen Teilchen in PBS gewaschen und in der gewünschten Konzentration in PBS erneut suspendiert.
- cALLa-positive NALM-16-Leukämiezellen von Humangewebekultur wurden gewaschen und in PBS suspendiert. Eine Fraktion wurde nicht mit Antikörper (-MoAb) behandelt. Die andere Fraktion wurde mit zwei monoklonalen Anti-CD10-Antikörpern und einem monoklonalen Anti-CD9-Antikörper (+MoAb) für 30 min bei 4 ºC behandelt, in PBS gewaschen und auf 3,5 x 10&sup6; Zellen/ml in PBS eingestellt. In zwei Röhrchen, von denen eines die antikörperbehandelten Zellen (+MoAb) und das andere unbehandelte Zellen (-MoAb) enthielt, wurden SAM-beschichtete magnetische Teilchen in einem Teilchen/Startzellen-Verhältnis von 45 zugegeben. Die Röhrchen wurden bei 4 ºC für 30 min rotiert. Die Teilchen wurden mit einem Magnetabscheider getrennt. Der überstand wurde aufgefangen und zentrifugiert, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Das Pellet wurde in 100 µl Trypanblau erneut suspendiert und eine Gesamtzellzählung wurde durchgeführt. Die Ergebnisse wurden in Tabelle IV aufgeführt. TABELLE IV
- Ein Gemisch, das 576 ml entionisiertes Wasser, 9 ml Styrol und 288 ml von 3,0 % (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid enthielt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt war, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem Ofen bei 65 ± 4 ºC für eine Stunde rotiert. Dem Gemisch wurden 18 g Kaliumpersulfat und 712 ml von 5 % (Gew./Vol.) fluoreszierenden Nile-Red-Polystyrolteilchen von 4,0 µm zugegeben. Die Flasche wurde erneut verschlossen, evakuiert und für eine Stunde rotiert, und 45 ml von 2,0 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben. Nach fünf weiteren Stunden wurden dem Gemisch 9 ml Styrol und 9 g Kaliumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere fünfzehn Stunden rotiert, durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden fluoreszierenden Teilchen wurden auf 1580 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 3,0 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 11,0 % und einer mittleren Größe von 4,4 µm zu ergeben.
- Die fluoreszierenden magnetischen Nile-Red-Teilchen, und zwar 1,580 l von 3,0 % (Gew./Vol.), die wie in Beispiel 39 beschrieben hergestellt waren, wurden durch Zugabe von 1,23 g Natriumdodecylsulfat, 17,50 g Kaliumpersulfat und einer Lösung enthaltend 1,2 ml Undecylensäure und 0,024 ml Divinylbenzol in 4,8 ml Methanol carboxyliert. Das Gemisch wurde in eine hermetische Flasche eingebracht, evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem Ofen bei 55º bis 65º für fünf Stunden rotiert. Die resultierenden fluoreszierenden magnetischen Nile-Red-Carboxylteilchen wurden magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der überstand klar war. Die fluoreszierenden magnetischen Nile-Red- Carboxylteilchen wurden auf 850 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 5,0 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem magnetischen Metalloxidgehalt von ca. 11,0 % und einer mittleren Größe von 4,4 µm zu ergeben.
- Ein Gemisch, das 12,4 ml von 11,28 % (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,24 µm, 65 ml von 2,78 % (Gew./Vol.) Metalloxid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt war, 75 ml entionisiertes Wasser und eine Lösung enthaltend 0,18 g Benzoylperoxid, 7 mg Nile Red und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol enthielt, wurde in eine hermetische Flasche eingebracht. Die Flasche wurde evakuiert und mit ca. 60 U/min in einem Ofen bei 60º bis 70º für ca. fünfzehn Stunden rotiert. Das Gemisch wurde durch zwei Lagen Gaze filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar war. Die resultierenden fluoreszierenden vernetzten magnetischen Teilchen wurden auf 170 ml mit entionisiertem Wasser erneut suspendiert, um eine 514 % (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von ca. 16,5 % (Gew./Vol.) und einer mittleren Größe von 4,0 µm zu ergeben.
- Das Koppeln von Ziege-Anti-HBsAG an fluoreszierende und nichtfluoreszierende magnetische Carboxylteilchen (die ungefähr den gleichen Metalloxidgehalt hatten) war ähnlich wie in Beispiel 30.
- In die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte (Pandex ) mit 96 Vertiefungen wurden 20 µl von 0,125 % (Gew./Vol.) Ziege-Anti-HBsAG-beschichteten, gründlich vermischten fluoreszierenden und nichtfluoreszierenden magne tischen Carboxylteilchen von 4,0 µm (im Verhältnis 1:1) zugegeben. In die Vertiefungen, die die magnetischen Teilchen enthielten, wurden 100 µl sauberes Plasma, das verschiedene Mengen an HBsAG oder HBsAG-negatives Plasma enthielt, zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen an einem Magnetabscheider getrennt und und zweimal mit 100 µl Waschpuffer gewaschen. In jede Vertiefung, die Teilchen enthielt, wurden 20 µl Maus-Anti-HBsAG, das an B-Galactosidase in Verdünnungspuffer konjugiert war, zugegeben. Nach 15 min Inkubation bei 37 ºC wurden die Teilchen getrennt und wie oben beschrieben sechsmal gewaschen. In jede Vertiefung, die Teilchen enthielt, wurden 50 µl einer Lösung, die 4-Methylumbelliferyl-B-D-Galactopyranosid (MUG, Sigma) enthielt, zugegeben. Die Platte wurde bei 37 ºC inkubiert und die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzkonzentrationsanalysators (FCA, Pandex ) gemessen, der einen 525 nm-Anregungsfilter und einen 580 nm-Emissionsfilter (Kanal C, Bezugskanal) aufwies, und zwar in Abständen von 8 min und mit einer 25fachen Verstärkungseinstellung. Die Fluoreszenzintensität in Kanal C wurde in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) aufgezeichnet und in Tabelle I aufgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß die fluoreszierenden magnetischen Teilchen die leeren Vertiefungen nachweisen können und auch die Vertiefungen mit weniger als einer mittleren Fluoreszenzintensität aufgrund eines Pipettierfehlers oder von Teilchenverlusten während des Assays anzeigen. Tabelle I
- * Die AFU 19458 für eine Vertiefung, verglichen mit der mittleren AFU 31480 für 17 Vertiefungen, zeigt entweder Teilchenverluste aus einer bestimmten Vertiefung oder eine geringere zu Beginn des Assays abgegebene Teilchenanzahl an.
- Die gleichen Schritte wie in Beispiel 42 beschrieben wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß fluoreszierende und nichtfluoreszierende carboxylierte magnetische Teilchen, die mit Ziege-Anti-HBsAG beschichtet waren, gleichzeitig in dem Assay verwendet wurden, um das Assay-Verhalten zu vergleichen. Die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung von Kanal D (Assay-Kanal, 365 nm-Anregungsfilter und 450 nm-Emissionsfilter) gemessen und in Tabelle II aufgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß sowohl die fluoreszierenden als auch die nichtfluoreszierenden Teilchen in dem Assay das gleiche Verhalten hatten. Tabelle II
Claims (1)
1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der
Konzentration eines Analyten, welches folgende
Verfahrensschritte aufweist:
a) Kontaktieren fluoreszierender magnetischer Teilchen,
welche einen für den Analyten spezifischen Liganden,
der an die fluoreszierenden magnetischen Teilchen
gebunden ist, aufweisen, mit einer flüssigen Probe zur
Bildung einer Suspension;
b) Inkubieren der Suspension, bis eine ausreichende
Menge des Analyten mit dem spezifischen Liganden
umgesetzt ist;
c) Abscheiden der magnetischen Teilchen aus der
Suspension;
d) Zusetzen eines markierten zweiten Liganden, der für
den Analyten spezifisch ist, zu den abgeschiedenen
magnetischen Teilchen;
e) Inkubieren der Suspension, bis eine ausreichende
Menge des Analyten mit dem markierten zweiten, für den
Analyten spezifischen Liganden umgesetzt ist;
f) Abscheiden der magnetischen Teilchen aus der
Suspension;
g) Erfassen bzw. Messen der doppelten Komplexbildung an
den magnetischen Teilchen mit Hilfe der Markierung;
und
h) Herstellen einer Beziehung zwischen der gemessenen
Menge des markierten Liganden mit der an einer
Referenzprobe gemessenen Menge des Analyten, wobei die
fluoreszierenden magnetischen Teilchen zur Kontrolle
der während des Verfahrens vorhandenen Anzahl von
Teilchen herangezogen werden.
2. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der
Konzentration spezieller Nukleinsäuresequenzen in
Nukleinsäure-Targetmolekülen, welches folgende Verfahrensschritte
aufweist:
a) Kontaktieren fluoreszierender magnetischer Teilchen,
welche eine zu der Nukleinsäuresequenz des an die
fluoreszierenden magnetischen Teilchen gebundenen
Targetmoleküls komplementäre Nukleinsäure aufweisen,
mit einer flüssigen Probe zur Bildung einer
Suspension;
b) Inkubieren der Suspension unter
Hybridisierungsbedingungen über eine ausreichend lange Zeit, um eine
Hybridisierung zu ermöglichen;
c) Abscheiden der magnetischen Teilchen aus der
Suspension;
d) Zusetzen einer markierten zweiten Nukleinsäure
sequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz des
Targetmoleküls komplementär ist;
e) Inkubieren der Suspension unter
Hybridisierungsbedingungen über eine ausreichend lange Zeit, um eine
Hybridisierung zu ermöglichen;
f) Abscheiden der magnetischen Teilchen aus der
Suspension; und
g) Erfassen bzw. Messen der doppelten Komplexbildung an
den magnetischen Teilchen mit Hilfe der Markierung,
wobei die fluoreszierenden magnetischen Teilchen zur
Kontrolle der während des Verfahrens vorhandenen
Anzahl von Teilchen herangezogen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem das
fluoreszierende Material aus der Gruppe Nile -Rot, Coumarin 6,
Coumarin 4, Rhodamin B, Nile -Blau, Oxazin 725, Oxazin
750 gewählt ist oder ein Gemisch von zwei oder mehr dieser
fluoreszierenden Stoffe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 31 bei welchem die
Anzahl der Teilchen durch Messen der Fluoreszenzintensität
der fluoreszierenden Teilchen kontrolliert wird, ehe die
Teilchen mit der flüssigen Probe in Kontakt gebracht
werden, sowie durch Messen der Fluoreszenzintensität der
fluoreszierenden Teilchen nach Messung der Menge des
markierten Liganden, der dem fluoreszierenden magnetischen
Teilchen zugeordnet ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
welchem die magnetischen Teilchen monodispergierte
fluoreszierende magnetische Teilchen in gleichmäßiger
Größenverteilung und mit gleichmäßiger Magnetisierung umfassen,
bei welchem:
a) ein fluoreszierendes Innenkern-Polymerteilchen
vorgesehen ist, das zur Adsorption eines Monomeren in
der Lage ist, und eine Kombination aus magnetisch
reagierendem Metalloxid und einem Polymer, wobei das
Polymer aus Monomeren besteht, die zur Adsorption an
das Innenkern-Polymerteilchen geeignet sind;
b) wobei die Kombination aus Metalloxid und Polymer das
Innenkernteilchen gleichmäßig umhüllt;
c) wobei die magnetischen Teilchen eine gleichmäßige
Größenverteilung und eine gleichmäßige Magnetisierung
aufweisen und in der Lösung monodispergiert sind, und
d) ein äußeres Polymer vorgesehen ist, welches die
Kombination aus magnetisch reagierendem Metalloxid
und Polymer umhüllt, sowie eine Schicht aus
funktionalisiertem Polymer, welches die äußere
Polymerumhüllung bedeckt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, bei welchem das Polymer
der Kombination aus magnetisch reagierendem metalloxid und
Polymer aus der Gruppe Polystyrol, vernetztem Polystyrol
und funktionalisiertem Polystyrol gewählt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 71 bei welchem
das funktionalisierte Polymer aus der Gruppe von
Verbindungen gewählt ist, bei welchen Carboxyl-, Amino- oder
Hydroxyl-Funktionsgruppen zur Ankopplung an biologisches
Material vorgesehen sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, bei welchem
das Polymer in der Kombination aus Metalloxid und Polymer
einen fluoreszierenden Färbemittel oder eine Kombination
aus fluoreszierenden Färbemitteln enthält.
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