DE69021309T2

DE69021309T2 - Magnetische Teilchen verwendender Immunotest.

Info

Publication number: DE69021309T2
Application number: DE69021309T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Ashihara; Toshiomi Nakamura; Masao Oishi; Masahisa Okada; Akira Yano; Katsuaki Yoshioka
Original assignee: Fujirebio Inc; Nippon Paint Co Ltd
Current assignee: Fujirebio Inc; Nippon Paint Co Ltd
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-26
Publication date: 1996-02-01
Anticipated expiration: 2010-09-27
Also published as: JPH03115862A; EP0420186B1; AU641687B2; US5320944A; KR100206159B1; KR910006725A; CA2026515A1; EP0420186A3; EP0420186A2; DE69021309D1; JP2979414B2; CA2026515C; AU6328690A; ES2077618T3

Description

Die Erfindung betrifft einen Immunoassay, der magnetische Teilchen verwendet, insbesondere einen Enzymimmunoassay, der magnetische Teilchen verwendet, in welchen der Kern ein organisches Polvmer umfasst, und die Oberfläche eine aus Eisenoxid zusammengesetzte Perritbeschichtung umfasst, an die ein Antigen oder ein Antikörper gebunden ist, wobei die Teilchengrösse 0,2 bis 3 um beträgt.
US-A-4 177 253 offenbart magnetische Teilchen in Form eines Komposits, das einen Kern mit einer Dichte von weniger als 1,5 g/cm³ umfasst, wobei zumindest ein Teil der Oberfläche des Kerns mit einem Überzug aus einem magnetischen Material und die Oberfläche des Kerns und/oder des Überzugs mit einer biologisch aktiven Komponente beschichtet ist. Die biologisch aktive Komponente kann ein Antigen oder ein Antikörper sein. Vorzugsweise ist der Kern eine Kugel, wobei der Kugeldurchmesser zwischen 10&supmin;&sup4; cm und 1 cm liegt.
WO 83/03920 offenbart ein verbessertes Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerteilchen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Lösungen von Eisensalzen und, falls gewünscht, Salzen anderer Metalle, die in der Lage sind, magnetische Ferrite zu bilden, in Wasser oder in einer Mischung aus Wasser und wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln oder in organischen Lösungsmitteln, mit Polymerteilchen, die in trockener Form, in Wasser dispergiert oder in einer Mischung mit Wasser und wasserlöslichen organischen Flüssigkeiten, oder in organischen Flüssigkeiten vorliegen, gemischt werden, die Metalle dann als Hydroxide gefällt werden und die Teilchen, falls gewünscht, erhitzt werden.
EP-A-0 234 083 offenbart einen Träger für eine biologisch aktive Komponente für Immunoassays oder enzymatische Reaktionen. Der Träger ist dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst:
ein thermoplastisches Harzkügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,05 bis 20 mm;
1 bis 25 Gew.%, bezogen auf das Gewicht der Kügelchen, eines an das Kügelchen gebundenen magnetischen Pulvers; und
eine in einer Dicke von 2 bis 30 um darauf aufgebrachte Polymerbeschichtung, wobei das Polymer ein Zahlengewichtsmittel von 20 bis 5000 hat und funktionelle Gruppen aufweist, die in der Lage sind, die biologisch aktive Komponente zu binden, oder sich aktivieren lassen, um jene zu binden.
In einem Immunoassay, insbesondere in einem Enzymimmunoassay ist es von Vorteil, die Immunoreaktion mit hoher Empfindlichkeit auszuführen und daher in einem Festphasenlatex Teilchen mit geringeren Teilchengrössen anstelle grösserer Kügelchen einzusetzen. Verwendet man jedoch Teilchen kleinerer Grösse, sollte man bei der Durchführung der B/F-Trennung (Bound/Free, Gebunden/Frei) eine Zentrifuge einsetzen oder sie über einen Filter abfiltrieren. Man kann das Verfahren somit nicht als einfach bezeichnen.
WO 89/04373 offenbart magnetische Polymerteilchen, die einen polymeren Kern umfassen, der gleichmässig mit einer ein magnetisches Metalloxid enthaltenden Polymerschicht überzogen ist.
Der Kern der Teilchen liegt in einem Bereich von 1 bis 100 um. Das in der Beschichtung enthaltene magnetische Metalloxid beträgt etwa 1 um oder weniger.
US-PS 4 438 239 offenbart ein kugelförmiges Substrat aus einem synthetischen organischen Harz, wobei das Harz dazu in der Lage ist, unter hochenergetischer Bestrahlung kovalente Bindungen auszubilden; eine zusammenhängende Schicht von aneinandergrenzenden, tangentialen, einzelnen Mikrokügelchen mit einem einheitlichen Durchmesser zwischen 100 und 2000 Angström, die mittels hochenergetischer Strahlung auf die Oberfläche des Harzsubstrats aufgepfropft und kovalent gebunden sind, wobei die Mikrokügelchen im wesentlichen aus einem Polymer bestehen, das bei der Additionspolymerisation eines ungesättigten Aldehyds, der 4 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, gewonnen wird. Die Mikrokügelchen werden bei der Additionspolymerisation eines flüssigen Polymerisationssystems, das wahlweise eine Dispersion von Metallteilchen einschliesst, hergestellt. Antikörper können an dieses mit Mikrokügelchen überzogene Produkt gebunden werden.
Man hat ein Verfahren zur effektiven und einfachen DURCHFÜHRUNG DER B/F-Trennung vorgeschlagen, bei dem magnetische Teilchen geringerer Grösse verwendet werden. Unter diesen Verfahren ist ein Immunoassay bekannt, der Teilchen mit 1,0 bis 10,0 um verwendet, bei denen ein Magnetitkern mit einem Silan überzogen wird (siehe auch vorläufige japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 141670/1980 und 122997/1975), sowie ein Immunoassay, der Teilchen mit 0,1 bis 1,5 um einsetzt, bei denen ein magnetischer Metalloxidkern mit einem Silan überzogen wird (siehe auch vorläufige japanische Patentveröffentlichung Nr. 1564/1985). Bei beiden magnetischen Teilchen umfasst der Kern ein magnetisches Metall, und ein Silan wird zu dessen Beschichtung verwendet.
Bei Teilchen, die magnetische Metalle als Kern umfassen, taucht das Problem auf, dass die Teilchengrösse nicht ausreichend einheitlich ist, und die Teilchen auch eine geringe Langzeitstabilität besitzen, da Eisen herausgelöst wird. Die Reproduzierbarkeit der Messungen bei Immunoassays, die derartige Teilchen verwenden, ist gering, und die zur Messung verwendeten Reagenzien können nicht über einen längeren Zeitraum haltbar gemacht werden.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diese Schwierigkeiten zu überwinden und ein Immunoassayverfahren mit hoher Empfindlichkeit bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch das Bereitstellen eines Immunoassayverfahrens, wie in Anspruch 1 offenbart, gelöst.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass man exzellent reproduzierbare Messergebnisse erhalten konnte, wenn man magnetische Teilchen mit einer Partikelgrösse von 0,2 bis 3 um, die einen ein organisches Polymer umfassenden Kern und eine ferritartige Überzugsschicht, und wahlweise eine weitere aus dem Auftragen einer hochmolekularen Verbindung oder einem Silan darauf erhaltenen Beschichtung, umfassen, an die ein Antigen oder ein Antikörper gebunden wird, für ein Immunoassayverfahren einsetzt. Dies beruht unter anderem auf der Tatsache, dass die magnetischen Teilchen langzeitstabil sind, so dass Haltbarkeit über lange Zeiträume erzielt werden kann.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung, die die Ergebnisse eines CEA-Assays zeigt, bei dem mit Ferrit überzogene Teilchen und von Advanced Magnetics Inc. hergestellte Teilchen verwendet wurden; und
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung, die die Geschwindigkeit der magnetischen Abtrennung für Ferritteilchen zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN:

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben werden.

HERSTELLUNG DER MAGNETISCHEN TEILCHEN:

Die erfindungsgemäss zu verwendenden magnetischen Teilchen können hergestellt werden, indem man ein organisches Polymer als Kern verwendet und es einer Beschichtung mit einem Eisenoxid vom Ferrittyp unterzieht und dann ein Antigen oder einen Antikörper an die resultierenden magnetischen Teilchen bindet. Als organisches Polymer kann man mindestens ein Polymer, ausgewählt aus Polystyrol und (Meth)acrylat verwenden.
Beispiele der (Meth)acrylate schliessen 2-Hydroxyethyl(meth)acrylat, 2-Hydroxypropyl(meth)acrylat, 1-Methyl-2- hydroxyethyl(meth)acrylat, Glycerinmonomethacrylat, 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, 2-Sulfoethylmethacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylatsäurephosphat, (3-Chlor-2- hydroxypropylmethacrylat)säurephosphat, 2-Propensäure-2- methyl-3-(phosphonooxy)propylester, Ethyl(meth)acrylat, n-Butyl(meth)acrylat, Isobutyl(meth)acrylat, 2-Ethylhexyl(meth)acrylat, Laurylmethacrylat, Cyclohexylmethacrylat, (Meth)acrylamid, N-Methylolacrylamid, N-Butoxymethylacrylamid, Glycidyl(meth)acrylat und Methylglycidyl(meth)acrylat.
Als Verfahren zur Polymerisation dieser Monomere kann man die Emulsionspolymerisation und die Mehrstufen- Emulsionspolymerisation verwenden. Als Emulsionspolymerisation kennt man ein Verfahren, bei dem die Polymerisation ausgeführt wird, indem man gleichzeitig die ganze Monomerzusammensetzung zugibt, ein Monomerzugabeverfahren, bei dem ein Teil der Monomere und andere Bestandteile vorpolymerisiert werden und die Polymerisation dann unter kontinuierlicher Zugabe der restlichen Monomere zum Präpolymer fortgesetzt wird, und ein Emulsionszugabeverfahren, bei dem Polymerzusammensetzungen zuvor emulgiert werden, um einen Teil vorzupolymerisieren, und die restlichen Emulsionen dann kontinuierlich zugeführt werden, um die Polymerisation fortzuführen. Man kennt weiterhin ein Mehrstufen-Polymerisationsverfahren, bei dem man Latexteilchenkeime schrittweise wachsen lässt, ohne neue Latexteilchen zu erzeugen.
Zur Durchführung dieser Polymerisationsreaktion werden zur Klasse der organischen Peroxide gehörende Initiatoren, wie Benzoylperoxid, Lauroylperoxid, Cumolhydroperoxid, Di-t- butylperoxid und Acetylperoxid, sowie Nitrile, wie α,α'-Azobisisobutyronitril, bekanntermassen als radikalische Polymerisationsinitiatoren verwendet.
Es können auch unter Pyrolyse verwendbare Verbindungen&sub1; wie Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat und Wasserstoffperoxid eingesetzt werden. Man kann ferner Polymerisationskatalysatoren vom Redox-Typ verwenden. Als das bei der Emulsionspolymerisation zu verwendende Emulgiermittel kann man ionenaktive Mittel, wie anionenaktive Mittel, kationenaktive Mittel, amphoter aktive Mittel und nicht-ionisch wirksame Mittel, aufführen,
Im nächsten Schritt wird der durch die oben beschriebenen Methoden erhaltene Kern aus organischem Polymer mit Ferrit beschichtet, wobei sich ferritbeschichtete Teilchen bilden.
Man führt die Ferritbeschichtung in einer die Kernteilchen enthaltenden wässrigen Lösung aus. Die wässrige Lösung enthält Eisen(II)ionen, die für die Bildung der Ferritschicht wesentlich sind. Die Eisen(II)ionen werden in der Form von Eisen(II)salzen, wie dem Hydrochlorid, dem Sulfat und dem Acetat, der wässrigen Lösung zugeführt. Enthält die wässrige Lösung nur Eisen(II)ionen als Metallion, kann man eine Beschichtung mit einem Spinellferrit, der nur Eisen als metallisches Element enthält, d.h. als Magnetit Fe&sub3;O&sub4;, erhalten. Neben den Eisen(II)ionen kann die wässrige Lösung auch andere Übergangsmetallionen Mn+ zusätzlich enthalten. Die andere Metallionenspezies schliesst Zink, Kobalt, Nickel, Mangan, Kupfer, Vanadium, Antimon, Lithium, Molybdän, Titan, Rubidium, Aluminium, Silicium, Chrom, Zinn, Calcium, Cadmium und Indium ein. Wenn Mn+ Kobalt ist, kann man Beschichtungen mit Kobaltferrit (CoxFe3-xO&sub4;) und Nickelferrit (NixFe3-xO&sub4;) erhalten, und wenn Mn+ für mehrere Spezies steht, kann man Mischkristallferrite gewinnen. Diese von Eisen(II)ionen verschiedene Metallionenspezies kann in der Form ihrer Salze in der wässrigen Lösung formuliert werden.
Durch Zugabe einer Lösung eines Oxidationsmittels zu einer Eisen(II)ionen und Kernteilchen enthaltenden dehydrogenierten Lösung, startet man erfindungsgemäss die Bildung der Ferritbeschichtung. Beispiele des Oxidationsmittels schliessen Nitrite, Nitrate, Wasserstoffperoxid, organische Peroxide, Perchlorate und in Wasser gelösten Sauerstoff ein. Vorzugsweise tropft man eine wässrige Lösung des Oxidationsmittels in einem konstanten Verhältnis, wie bei Titrationsverfahren der analytischen Chemie, zu der Lösung. Durch die tropfenweise Zugabe in einem konstanten Verhältnis kann man die Dicke der Ferritbeschichtung leicht einstellen.
Abhängig von der Art der in der wässrigen Lösung anwesenden Anionen und Metallionen kann man wahlweise den pH-Wert der wässrigen Lösung einstellen und kontrollieren, er befindet sich jedoch vorzugsweise im Bereich von 6 bis 11, besser 7 bis 11. Zur Stabilisierung des pH-Werts kann man einen Puffer, wie Ammoniumacetat oder ein Salz mit Puffereffekt, zugeben.
Die Temperatur, bei der die erfindungsgemässe Reaktion durchgeführt wird, kann im Bereich vom Siedepunkt der wässrigen Lösung oder niedriger liegen, man führt die Reaktion jedoch vorzugsweise im Bereich von 60 bis 90ºC durch. Die Reaktion wird auch in einer im wesentlichen sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt. Ist die Sauerstoffmenge gross, schreitet die Oxidationsreaktion in unerwünschtem Masse voran. Es ist insbesondere bevorzugt, die Reaktion in einer Stickstoffatmosphäre durchzuführen. Gleichermassen entfernt man den Sauerstoff aus der wässrigen Lösung, um diese sauerstoff frei zu verwenden.
In einem geeigneten erfindungsgemässen Verfahren suspendiert man zuerst die partikelhaltigen Stoffe in sauerstofffreiem Wasser. Dabei kann man die Benetzbarkeit der partikelhaltigen Stoffe mit Wasser dadurch verbessern, dass man gegebenenfalls ein Additiv, wie z.B. ein Tensid, zugibt. Dann kann man zur Einstellung des pH-Werts gegebenenfalls einen pH-Puffer, etc. zusetzen und dazu gibt man dann die Eisen(II)ionen in Salzform. Gegebenenfalls können gleichzeitig auch andere Metallionen zusammen mit den Eisen(II)ionen zugegeben werden. Nach der Zugabe aller Komponenten startet man die Reaktion, indem man die Lösung eines Oxidationsmittels zu der Mischlösung mit der oben erwähnten Titrationsmethode zugibt. Diese Vorgehensweise ist besonders bevorzugt, da man die Dicke der Ferritbeschichtung über die Konzentration der Metallionenspezies oder des Oxidationsmittels kontrollieren kann. Die so gewonnenen, einer Ferritbeschichtung unterzogenen Partikel werden mittels Filtration abgetrennt und getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhält.

HERSTELLUNG VON BIT EINER HOCHNOLEKULAREN VERBINDUNG ODER EINEN SILAN BEHANDELTEN TEILCHEN:

Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden magnetischen Teilchen können nach der Behandlung mit einer hochmolekularen Verbindung oder einem Silan verwendet werden. Als hochmolekulare Verbindung kann man z.B. Nylon (Handelsname) oder ein Polystyrol verwenden. Als Verfahren zur Silanbehandlung kann man z.B. die Silylierung unter sauren wässrigen Bedingungen verwenden. Diese kann man ausführen, indem man zuerst die ferritbeschichteten Teilchen und das Silanmonomer in einer wässrigen Lösung mischt und dann diese Mischung bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95ºC unter Erwärmen behandelt. Als Silanmonomer kann man z.B. ein Organosilan, wie p-Aminophenyltrimethoxysilan, 3-Aminopropyltrimethoxysilan, N-2-Aminoethyl-3- aminopropyltrimethoxysilan, Triaminosilane [H&sub2;NCH&sub2;CH&sub2;-NHCH&sub2;CH&sub2;-NHCH&sub2;CH&sub2;-Si-(OCH&sub3;)&sub3;], n-Dodecyltriethoxysilan und n-Hexyltrimethoxysilan verwenden. Um die Amino-Endgruppe des Silans zu einer Carboxylgruppe umzusetzen, kann man ferner die silanbehandelten Teilchen bei Raumtemperatur mit einem Säureanhydrid umsetzen. Bei der Polyamidbehandlung werden die ferritbeschichteten Teilchen in einer 1 %-igen wässrigen Natriumcarbonatlösung suspendiert, in der man die erforderliche Menge Hexamethylendiamin löst. Zu dieser Lösung gibt man die 5-fache Menge einer Lösungsmittelmischung aus Hexan und Chloroform (3:1), die 8 % Tween 80 (Handelsname, hergestellt von Kao Corporation) und unterzieht diese dann einer Ultraschallbehandlung, um eine Emulsion zu bilden. Indem man tropfenweise die erwähnte Hexan-Chloroform- Lösungsmittelmischung zugibt, die Sebacyldichlorid in äquimolarer Menge zum Hexamethylendiamin enthält, kann man die gewünschten Teilchen erhalten. Auch im Fall der Polystyrolbehandlung können die dem Fachmann geläufigen Verfahren eingesetzt werden. Ferner kann man die magnetischen Teilchen auch durch Besprühen mit oder Eintauchen in eine Polymerharzlösung aus z.B. Nylon (Handelsname) oder Polystyrol direkt beschichten.
Die vorliegende Erfindung betrifft magnetische Teilchen, die durch das Binden eines Antigens oder eines Antikörpers an ferritbeschichtete Teilchen, oder nach diesem Verfahren gewonnene Teilchen, die mit einer hochmolekularen Verbindung oder einem Silan weiterbehandelt wurden erhalten werden. Als zu verwendender Antikörper können z.B. aufgezählt werden: chemische Verbindungen, wie Theophyllin, Phenytoin und Valpronsäure; niedermolekulare Hormone, wie Thyroxin, Östrogen und Östradiol; Krebsmarker, wie CEA und AFP; Virus-Antigene, wie HIV, ATLA und HBV; hochmolekulare Hormone, wie TSH und Insulin; ein Cytokine, wie IL-1, IL-2 und IL-6; verschiedene Arten von Wachstumsfaktoren, wie EGF und PDGF; und ferner ein Antikörper für geeignete DNA, RNA, etc. obiger Viren. Als zu verwendendes Antigen können auch Viren, wie HIV, ATLA und HBV; DNA obiger Viren; und hochmolekulare Hormone, wie Insulin und TSH angeführt werden.
Als Bindungsverfahren kann man die physikalische Absorption oder chemische Bindungsverfahren einsetzen. Die physikalische Absorption führt man in einer geeigneten Pufferlösung durch, indem man obige Teilchen und das Antigen oder den Antikörper umsetzt. Als die Pufferlösung, die in dieser Reaktion verwendet wird, kann man Phosphatpuffer, Tris-Hydrochloridpuffer und Carbonatpuffer anführen. Beim Mischen beider Komponenten bei Raumtemperatur schreitet die Reaktion schnell voran und man erhält das gewünschte Produkt. Bei chemischen Bindungsverfahren kann man das Carbodiimidverfahren als sogenanntes Peptidbindungsverfahren einsetzen. Das Binden kann z.B. ausgeführt werden, indem man die gleiche Menge (equiamount) eines wasserlöslichen Carbodiimids zu einer Dispersion von 0,1 bis 5 % silylierter Teilchen unter sauren Bedingungen (pH 4 bis 6) gibt, bei Raumtemperatur 10 Minuten bis 1 Stunde lang reagieren lässt, die überstehende Flüssigkeit entfernt und dann 0,01 bis 10,0 mg/ml vorzugsweise 0,1 bis 5 mg/ml einer Antikörperoder Antigenlösung zugibt. Der in diesem Fall verwendete Puffer ist vorzugsweise ein Phosphatpuffer. Man kann als Verfahren zur chemischen Bindung die Reaktion auch in Gegenwart eines divalenten Crosslinking-Reagens, wie Glutaraldehyd und Cyanurchlorid durchführen (siehe "Peptide Synthetic Method", veröffentlicht von Maruzen K.K., 1975 veröffentlicht; und Enzyme Immunoassay Method", veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan K.K., "Protein, Nucleic acid, Enzyme", Sonderausgabe Nr. 31 (1987)).
Die nach den oben aufgeführten Verfahren hergestellten Teilchen besassen eine konstante Partikelgrösse. Diese Partikel hatten sich auch dann nicht verändert, nachdem sie in einer geeigneten Proteinlösung, wie BSA oder Globulin, 1 Jahr lang aufbewahrt wurden.
Die erfindungsgemässen Magnetteilchen besitzen eine Partikelgrösse von 0,2 um oder mehr bis zu 3 um oder weniger. Übersteigt die Partikelgrösse 3 um, ist ihre Schwebezeit bei der Verwendung in einer Immunoreaktion kurz, so dass sie nicht ausreichend reagieren. Ist sie jedoch weniger als 0,2 um, verschlechtert sich der Wirkungsgrad der magnetischen Abtrennung nach dem Immunoassay.

INMUNOASSAYVERFAHREN:

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann man Radioimmunoassays und Enzymimmunoassays verwenden. Zu diesen Verfahren zählen die Immunoassays, die einen Marker und ein Antigen oder den zu testenden Antikörper verwenden, wobei der Assay im Sandwich- oder Verdrängungsverfahren durchgeführt werden kann.
Der erfindungsgemässe Enzymimmunoassay wird beispielsweise ausgeführt, indem man die an einen Antikörper gebundenen Magnetteilchen und enzymmarkierte Antikörper 10 Minuten bis 3 Stunden lang umsetzt. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 4 bis 40ºC, vorzugsweise 25 bis 38ºC, durchgeführt. Nachdem man die nicht-umgesetzten enzymmarkierten Antikörper gewaschen hat, kann man die Ligandenmenge in der Probe über die an die feste Phase gebundene Menge der antigengebundenen Enzyme bestimmen, indem man ein Enzymsubstrat zugibt und dessen Aktivität misst. Die im erfindungsgemässen Verfahren zu verwendenden Enzyme schliessen Peroxidase, Alkalische Phosphatase, β- Galactosidase und Glucoseoxidase ein. Es versteht sich von selbst, dass das zu verwendende Substrat für das eingesetzte Enzym geeignet sein sollte. Als Substrat kann man beispielsweise ABTS, Luminol-H&sub2;O&sub2; (für Peroxidase), 3-(2'-Spiro-tricyclo[3.3.1.13,7]decan)-4-methoxy-4-(3"- phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan-dinatriumsalz, p-Nitrophenylphosphatase und Methylumbelliferylphosphat (für alkalische Phosphatase), p-Nitrophenyl-β-D-galactosid und Methylumbelliferyl-β-D-galactosid (für β-Galactosidase) verwenden. Man kann die Messung ausführen, indem man bei Raumtemperatur bis 40ºC 1 Minute bis 18 Stunden lang reagieren lässt, und dann die entstehende Farbe, Fluoreszenz oder Lumineszenz misst. Ein anderes Verfahren, das sogenannte Geschwindigkeitsverfahren (rate method), das in einem Temperaturbereich von 4 bis 40ºC unter Erwärmen durchgeführt wird, kann eingesetzt werden.
Der Radioimmunoassay ist ein Immunoassay, bei dem mit einem Radioisotop, wie z.B. ¹²&sup5;I anstelle des obigen Enzyms markiert wird. Die Verfahrensschritte sind nahezu die gleichen wie in obigem Enzymimmunoassay, mit der Ausnahme, dass man die Radioaktivität misst.
Das Antigen oder der Antikörper können leicht mittels des bereits erhältlichen Bolton-Hunter-Reagens radiomarkiert werden. Die Radiomarkierung kann beispielsweise durch Zugabe des Bolton-Hunter-Reagens zu einer Antigen- oder Antikörperlösung, die in einer 0,1 M wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst wurde, und nach 1 bis 2 Stunden durch Entfernen des nicht-umgesetzte Bolton- Hunter-Reagens unter Verwendung einer Entsalzungssäule mit G-25, etc., eingeführt werden. Weiterhin kann man das Radiomarkieren mit ¹²&sup5;I unter Verwendung des Chloramin T- Verfahrens oder Iododinverfahrens leicht durchführen. Zur Durchführung der Immunoreaktion gibt man eine Probe zu den erfindungsgemässen Magnetteilchen, und lässt bei 4 bis 40ºC, vorzugsweise 20 bis 38ºC, 1 bis 18 Stunden lang reagieren. Danach wäscht man mit einer physiologischen Salzlösung oder destilliertem Wasser, gibt radiomarkierten Antikörper zu den Magnetteilchen und lässt bei 4 bis 40ºC, vorzugsweise 20 bis 38ºC, 1 bis 18 Stunden lang reagieren, wäscht mit einer physiologischen Salzlösung oder destilliertem Wasser, und misst dann die Radioaktivität. Für die Messung kann man einen Szintillationszähler verwenden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch in einem Chemilumineszenzassay, bei dem mit Isoluminol oder Acridinester markiert wird, oder in einem Fluoreszenzimmunoassay, bei dem mit Fluorescein oder Rhodamin markiert wird, ausgeführt werden. In diesen Verfahren kann man das "Active Ester"-Verfahren oder Isocyanatverfahren (siehe "Enzyme Immunoassay Method", veröffentlicht von Igaku Shoin, 1987) zur Markierung einsetzen.
Unter Verwendung der erfindungsgemässen Magnetteilchen werden die Antikörper auf ähnliche Weise gemessen, indem man diese Teilchen mit einer Probe mischt und dann bei Raumtemperatur bis 37ºC 1 Minute bis 18 Stunden lang reagieren lässt, mit einer physiologischen Salzlösung oder destilliertem Wasser wäscht, dann markierte antihumane Immunoglobulin-Antikörper zugibt, bei Raumtemperatur bis 37ºC 1 Minute bis 18 Stunden lang reagieren lässt, wäscht und die Aktivität der markierten Verbindung misst.
Die vorliegende Erfindung ist ein Enzymimmunoassay, der Teilchen verwendet, die magnetische Teilchen, die aus einem organischen Polymer als Kern und einer auf dessen Oberfläche abgeschiedenen Ferritschicht bestehen, und ein an die Oberfläche der Ferritschicht gebundenes Antigen oder Antikörper umfassen. Diese Teilchen können als Festphase des Immunoassays verwendet werden.

Beispiele:

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Hinweis auf die Beispiele detaillierter erläutert.

BEISPIEL 1

Herstellung der organischen Polymerteilchen:

In einen Polymerisationsapparat mit Rührer, Thermometer, Monomer-Tropftrichter, Rückflusskühler, einer Vorrichtung zum Erhitzen und einem Stickstoffeinlassrohr, wurden 230 Teile deionisiertes Wasser gefüllt, gefolgt von einem Teil einer Monomermischung (A), bestehend aus Styrol, 2-Ethylhexylacrylat und Ethylenglykoldimethacrylat (80:10:10) und von 10 Teilen einer 10 %-igen wässrigen Ammoniumpersulfatlösung, worauf man dann tropfenweise 99 Teile der Monomermischung (A) über 3 Stunden hinweg zugab und ein Latex erhielt. Die Beobachtung der Teilchen unter dem Elektronenmikroskop zeigte, dass diese im wesentlichen monodispers waren und eine Partikelgrösse von 0,3 um aufwiesen.

Herstellung von ferritbeschichteten Teilchen:

In einen Apparat zur Herstellung magnetischer Teilchen, der einen Rührer, ein Thermometer, einen Tropf trichter für das Oxidationsmittel, eine Vorrichtung zum Erhitzen und ein Stickstoffeinlassrohr besass, füllte man 100 Teile der obigen Emulsion (30 % Feststoffgehalt) und machte die Emulsion der Kerne durch das Einleiten von N&sub2;-Gas sauerstofffrei.
Dann gab man 100 Teile (Feststoffgehalt: 40 Teile) einer zuvor hergestellten Eisen(II)chlorid-Lösung und 150 Teile (Feststoffgehalt: 75 Teile) Ammoniumacetat in den Apparat und rührte die Mischung ausreichend bei 70ºC unter Erwärmen. Danach wurde der pH-Wert der Mischung bei fortgesetztem Rühren mittels wässrigem Ammoniak auf 7,2 eingestellt.
Zu der Lösung gab man tropfenweise 150 Teile (Feststoffgehalt: 15 Teile) einer Natriumnitritlösung innerhalb 1 Stunde. Während der tropfenweisen Zugabe bzw. während der Reaktion wurde die Temperatur der Mischung bei 70ºC und der pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,2 gehalten, wobei man kontinuierlich Stickstoffgas zuführte und rührte, während sich die Ferritbeschichtung auf den Oberflächen der Partikel ausbildete. Nach etwa 20 Minuten wurde die Lösung abgekühlt und die ferritbeschichteten Teilchen mehrfach abfiltriert und mit deionisiertem Wasser gewaschen und schliesslich herausgenommen.

BEISPIEL 2

Herstellung von Anti-TSH-Maus-IgG-gebundenen magnetischen Teilchen:

Zu 4 ml einer 5 %-igen wässrigen Dispersion (20 mM Phosphatpuffer, pH 3,5), der in Beispiel 1 hergestellten ferritbeschichteten Teilchen gab man 1 ml Anti-TSH-Maus- IgG (5 mg/ml) und rührte die Mischung mit einem "End-Over- End"-Mischer über Nacht bei Raumtemperatur. Nachdem man diese Teilchendispersion mit einem 3000 Gauss-Magneten an dessen Oberfläche in überstehende Flüssigkeit und Teilchen aufgetrennt hatte, wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und die Teilchen fünfmal mit einer 2 %-igen BSA- Lösung (0,1 M Tris-HCl, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid, pH 7,5) gewaschen. Die hergestellten magnetischen Teilchen wurden in 5 ml einer ähnlichen BSA- Lösung dispergiert.

BEISPIEL 3

Herstellung von Anti-CEA-Maus-IgG-gebundenen magnetischen Teilchen:

Zu 4 ml einer 5 %-igen wässrigen Dispersion (20 mM Phosphatpuffer, pH 3,5) der in Beispiel 1 hergestellten ferritbeschichteten Teilchen gab man 1 ml Anti-CEA-Maus- IgG (5 mg/ml) und rührte die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur mit einem "End-Over-End"-Mischer. Nachdem man diese Teilchendispersion mit einem 3000 Gauss-Magneten an dessen Oberfläche in überstehende Flüssigkeit und Teilchen aufgetrennt hatte, wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und die Teilchen wurden fünfmal mit einer 2 %-igen BSA-Lösung (0,1 M Tris-HCl, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1 mM Zinkchlorid, pH 7,5) gewaschen. Dann wurden die magnetischen Teilchen in 5 ml einer ähnlichen BSA-Lösung dispergiert.

BEISPIEL 4

Herstellung von carboxylierten Ferritteilchen:

Carboxylierte Ferritteilchen kann man erhalten, indem man 50 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan zu 5 g Ferritteilchen (Polystyrol, das eine mittlere Kernteilchengrösse von 0,3 um hat) des Beispiels 1 gibt, die zuvor fünfmal für jeweils 60 Sekunden in einer Ultraschall-Waschvorrichtung (vom Typ Batt, hergestellt von Nippon Seiki Seisakusho K.K.) mit destilliertem Wasser gewaschen wurden, weiterhin 30 ml Eisessig zugibt und bei Raumtemperatur 3 Stunden lang reagieren lässt, gefolgt von Waschen und Umsetzen mit Glutarsäureanhydrid. Der Eisessig wurde tropfenweise unter Eiskühlung und Rühren zugegeben, und das Waschen wurde jeweils dreimal mit destilliertem Wasser, Methanol und destilliertem Wasser, und ferner fünfmal mit jeweils 300 ml einer 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeführt. Beim Ausführung der Reaktion mit Glutarsäure gab man 2,85 g Glutarsäureanhydrid zu 100 ml mit 5 Gew.% (0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung) Teilchen und liess 10 Minuten lang reagieren. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung dreimal mit jeweils 300 ml einer 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung und ferner fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die so gewonnenen Teilchen wurden als carboxylierte Ferritteilchen eingesetzt.

BEISPIEL 5

Herstellung von Anti-TSH-gebundenem carboxylierten Ferrit:

50 mg der in Beispiel 4 hergestellten carboxylierten Ferritteilchen wurden in 5 ml 20 mM Phosphatpuffer (pH 4,5) dispergiert, gefolgt von der Zugabe von 50 mg wasserlöslichem Carbodiimid. Nach einer 20-minütigen Reaktion bei Raumtemperatur wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und 5 ml Anti-TSH-Maus-IgG-Lösung (1 mg/ml, 0,02 M Phosphatpufferlösung, pH 4,5) wurden hinzugegeben, und die Mischung wurde mit einem "End-Over- End"-Mischer gerührt. Nach 2 Stunden wurden diese Teilchen fünfmal mit 2 %-iger BSA-Lösung (0,1 M Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, pH 7,5) gewaschen und in einer ähnlichen BSA-Lösung dispergiert, und man erhielt so Anti-TSH-Maus-IgG- sensitivierte carboxylierte Ferritteilchen.

BEISPIEL 6

TSH-Assay mit Anti-TSH-sensitivierten Ferritteilchen:

Zu einer Probe, die 15 ul TSH (0,10 uU/ml) enthielt, mischte man 20 ul alkalische Phosphatase-Konjugat (Konjugatkonzentration: 0,5 ug/ml, 0,1 M Tris-HCl, 2 % BSA, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 7,5), gebunden an Anti-TSH-Fab', und dann wurden 500 ul (0,02 %-ige Lösung) der in Beispiel 2 hergestellten Ferritteilchen, die mit Anti- TSH-Maus-IgG beschichtet wurden, zu obiger Mischung hinzugegeben, und man liess die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 20 Minuten lang stehen. Das diese Mischung enthaltende Rohr wurde mit einem Magnet, der an der Oberfläche ein Magnetfeld von 3000 Gauss aufwies, in Kontakt gebracht, um die Ferritteilchen anzuziehen, und man entfernte die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren. Danach gab man 1 ml einer 0,04 %-igen physiologischen Salzlösung zu den Teilchen und rührte die Mischung. Das Rohr wurde wiederum mit dem oben erwähnten Magnet in Kontakt gebracht, um Teilchen und überstehende Flüssigkeit zu trennen, und man entfernte die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren. Diese Vorgänge wurden dreimal wiederholt. In das die Teilchen enthaltende Rohr gab man 200 ul einer Substratlösung (0,1 M Tris-HCl, 1 uM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 9,8), die 100 ug/ml 3-(2'-Spirotricyclo[3.3.1.13,7]decan)-4-methoxy-4-(3"- phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan-dinatriumsalz (AMPPD) enthielt, und liess die Mischung bei Raumtemperatur reagieren. Nach 17 Minuten wurde die Probe in einem Luminometer (hergestellt von Belthold Co.) gemessen.
In Tabelle 1 ist das S/N-Verhältnis des über 5 Minuten integrierten Werts gezeigt. Zum Vergleich werden auch die Ergebnisse, in denen von Advanced Magnetics, Inc. hergestellte Teilchen [magnetischer Träger für Affinitätschromatografie (Carboxyl-Endgruppen)] verwendet wurden, aufgeführt. TABELLE 1 S/N-Verhältnis Verrösserun Ferritbeschichtete Teilchen Teilchen, hergestellt von Advanced Magnetics, Inc.

BEISPIEL 7

TSH-Assay unter Verwendung carboxylierter Teilchen:

Zu einer Probe, die 15 ul TSH (0,10 uU/ml) enthielt, mischte man 20 ul alkalische Phosphatase-Konjugat (Konjugatkonzentration: 0,5 ug/ml, 0,1 M Tris-HCl, 2 % BSA, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 7,5), gebunden an Anti- TSH-Fab', und dann gab man 500 ul (0,02 %-ige Lösung) der in Beispiel 5 hergestellten carboxylierten Ferritteilchen, die mit Anti-TSH-Maus-IgG beschichtet wurden, zu obiger Mischung und liess die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 20 Minuten lang stehen. Das die obige Mischung enthaltende Rohr wurde mit einem Magnet mit einem Oberflächenmagnetfeld von 3000 Gauss in Kontakt gebracht, um die Ferritteilchen anzuziehen und man entfernte die überstehende Lösung. Danach gab man 1 ml 0,04 %-ige physiologische Salzlösung zu den Teilchen und rührte die Mischung. Das Rohr wurde wiederum mit dem oben erwähnten Magnet in Kontakt gebracht um in Teilchen und überstehende Flüssigkeit aufzutrennen, und man entfernte die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren. Diese Vorgänge wurden dreimal wiederholt. Zu dem die Teilchen enthaltenden Rohr gab man 200 ul einer Substratlösung (0,1 M Tris-HCl, 1 uM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 9,8), die 100 ug/ml AMPPD enthielt, und man liess die Mischung bei Raumtemperatur reagieren. Nach einer Reaktionszeit von 17 Minuten wurde die Probe in einem Luminometer (hergestellt von Belthold Co.) gemessen.
In Tabelle 2 ist das S/N-Verhältnis der über 5 Minuten integrierten Werte aufgeführt. Zum Vergleich sind ebenfalls Ergebnisse, bei denen von Advanced Magnetics, Inc. [magnetischer Träger für die Affinitätschromatografie (Carboxyl-Endgruppen)) hergestellte Teilchen verwendet wurden, gezeigt. TABELLE 2 S/N-Verhältnis Verrösserun Ferritbeschichtete Teilchen Teilchen, hergestellt von Advanced Magnetics, Inc.

BEISPIEL 8

CEA-Assay unter Verwendung von Anti-CEA-sensibilisierten Ferritteilchen:

Zu einer Probe, die 15 ul CEA (0, 25, 50 ng/ml) enthielt, mischte man 20 ul alkalische Phosphatase-Konjugat (Konjugatkonzentration: 0,2 ug/ml, 0,1 M Tris-HCl, 2 % BSA, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 7,5), gebunden an Anti- CEA-Fab', und dann gab man 500 ul (0,02 %-ige Lösung) der in Beispiel 3 hergestellten Ferritteilchen, die mit Anti- CEA-Maus-IgG beschichtet wurden, zu obiger Mischung und liess die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 20 Minuten lang stehen. Das die obige Mischung enthaltende Rohr wurde mit einem Magnet mit einem Oberflächenmagnetfeld von 3000 Gauss in Kontakt gebracht, um die Ferritteilchen anzuziehen, und man entfernte die überstehende Lösung durch Dekantieren. Danach gab man 1 ml 0,04 %-ige physiologische Salzlösung zu den Teilchen und rührte die Mischung. Das Rohr wurde wieder mit dem oben erwähnten Magnet in Kontakt gebracht, um die Teilchen und die überstehende Lösung zu trennen, und man entfernte die überstehende Lösung durch Dekantieren. Diese Vorgänge wurden dreimal wiederholt. Zu dem die Teilchen enthaltenden Rohr gab man 200 ul einer Substratlösung (0,1 M Tris-HCl, 1 um MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 9,8), die 100 ug/ml AMPPD enthielt, und liess die Mischung bei Raumtemperatur reagieren. Nach einer Reaktionszeit von 17 Minuten wurde die Probe in einem Luminometer (hergestellt von Belthold Co.), gemessen.
In Fig. 1 ist das S/N-Verhältnis der über 5 Minuten integrierten Werte gezeigt. Zum Vergleich wurden die Ergebnisse, bei denen von Advanced Magnetics Inc. [magnetischer Träger für die Affinitätschromatografie (Carboxyl-Endgruppen)] hergestellte Teilchen verwendet wurden, ebenfalls gezeigt.

BEISPIEL 9

Vergleich der magnetischen Abtrennrate von Ferritteilchen:

Man füllte 500 ul einer 0,02 %-igen Lösung von Anti-TSH- Maus-IgG-gebundenen Ferritteilchen (2 % BSA, 0,1 M Tris- HCL, 1 mM MgCl&sub2;, pH 9,8) in ein Rohr und brachte das Rohr mit einem Magnet mit einem Oberflächenmagnetfeld von 3000 Gauss in Kontakt.
Nach einer Kontaktdauer von 0, 10, 20, 30, 40 und 60 Sekunden trennte man die überstehende Flüssigkeit ab und mass die Absorption bei einer Wellenlänge von 660 nm. Die Ergebnisse hinsichtlich der Abtrennrate sind in Fig. 2 dargestellt.

BEISPIEL 10

Untersuchung des Schwebeverhaltens der Teilchen:

In ein 1000 ul-Rohr gab man Anti-TSH-Maus-IgG-gebundene Ferritteilchen (0,02 %) und liess die Mischung bei Raumtemperatur stehen.
Nach 0 Minuten und nach 30 Minuten wurden Proben der überstehenden Flüssigkeit gezogen und die Absorption bei einer Wellenlänge von 660 nm gemessen.
Die relative Trübung ist in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Relative Trübun Ferritbeschichtete Teilchen Teilchen, hergestellt von Advanced Magnetics, Inc. (Relative Trübung bedeutet Trubung nach 30 Minuten, wenn die Trübung zum zeitpunkt "0 Minuten nach dem Stehenlassen" gleich "100 %" gesetzt wird)
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Enzymimmunoassay unter Verwendung von Teilchen, die aus einem magnetischen Teilchen, das ein organisches Polymer als Kern und eine auf dessen Oberfläche aufgebrachte Ferritbeschichtung umfasst, und aus einem an die Oberfläche des magnetischen Teilchens gebundenen Antigen oder Antikörper, zusammengesetzt sind. Die erfindungsgemässen Teilchen haben eine einheitliche Teilchengrösse und zeichnen sich durch den Bindungszustand des an die Teilchen gebundenen Antigens oder Antikörpers aus. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemässen Teilchen ist ihre Langzeitstabilität und somit ihre Haltbarkeit. Der erfindungsgemässe Enzymimmunoassay kann unter Verwendung dieser Teilchen schnell und mit hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.

Claims

1. Immunoassay-Verfahren unter Verwendung von magnetischen Teilchen, die einen Kern, der ein organisches Polymer umfasst, und eine Beschichtung, die eine auf die Oberfläche des Kerns aufgebrachte ferritartige Beschichtung, und wahlweise eine weitere aus dem Auftragen mit einer hochmolekularen Verbindung oder einem Silan darauf erhaltene Beschichtung umfasst, umfassen, wobei an die Oberfläche der ferritartigen Beschichtung oder der weiteren Beschichtung der magnetischen Teilchen ein Antigen oder ein Antikörper gebunden ist; dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, die einen Kern und eine Beschichtung, die eine ferritartige Beschichtung und wahlweise eine weitere Beschichtung umfasst, umfassen, eine Grösse von 0,2 bis 3 um haben.

2. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 1, worin magnetische Teilchen verwendet werden, die einen Kern, der ein organisches Polymer umfasst, und eine Beschichtung umfassen, die eine ferritartige Beschichtung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Magnetit, Kobaltferrit, Nickelferrit und Manganferrit, umfasst.

3. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Immunoassay-Verfahren ein Enzymimmunoassay ist.

4. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die hochmolekulare Verbindung Nylon oder ein Polystyrol ist.

5. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das organische Polymer ein Polystyrol oder ein aus mindestens einem (Meth)acrylat zusammengesetztes Polymer ist.

6. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die ferritartige Beschichtung ein Spinellferrit oder ein Flüssigkristallferrit ist.

7. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 3, worin der Enzymimmunoassay ausgeführt wird, indem eine Probe mit antikörpergebundenen magnetischen Teilchen und einem enzymmarkierten Antikörper gemischt wird, nicht-umgesetzte enzymmarkierte Antikörper abgetrennt werden, die nicht-umgesetzten enzymmarkierten Antikörper gewaschen werden, ein Enzymsubstrat zugegeben wird und die Aktivität des antikörpergebundenen Enzyms gemessen wird.

8. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 7, worin das Enzymsubstrat ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus dem Diammoniumsalz der 2,2'-Azino-bis- (3-ethyl-2,3-dihydro-1,3-benzthiazol-6-sulfonsäure und Luminol-H&sub2;O&sub2; für Peroxidase; 3-(2'- Spirotricyclo[3.3.1.13,7]decan)-4-methoxy-4-(3"phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan-dinatriumsalz, p-Nitrophenylphosphat und Methylumbelliferylphosphat für alkalische Phosphatase; p-Nitrophenyl-β-D- galactosid und Methylumbelliferyl-β-D-galactosid für β-Galactosidase.

9. Immunoassay-Verfahren gemäss Anspruch 8, worin das Enzymsubstrat 3-(2'-Spiro-tricyclo[3.3.1.13,7]decan)- 4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetandinatriumsalz ist.

10. Verfahren zur Herstellung magnetischer Teilchen mit einer Teilchengrösse von 0,2 bis 3 um, die Schritte umfassend: das Auftragen einer ferritartigen Beschichtung auf ein organisches Polymer als Kern und wahlweise das Beschichten der ferritartig beschichteten Teilchen mit einer hochmolekularen Verbindung oder einem Silan, um eine weitere Schicht auszubilden, und das Binden eines Antigens oder eines Antikörpers an die ferritartig beschichteten Teilchen oder an besagte weitere Schicht.